PHYSIQUE CELLULAIREIntroduction à la Neurobiologie

-3-L’amont du potentiel d’action: « l’input » neuronal

Jean-Pierre HENRY 18 Mars 2010

Résumé du cours précédent

• Le potentiel d’action est l’élément électrique de base:– Il est « quantique »– Il se propage sans affaiblissement

• Il est engendré à partir du potentiel de repos pardépolarisation

• Cette dépolarisation induit une ouverture des canauxNa+, suivie d’une ouverture de canaux K+, permettantla régénération du potentiel de repos

• Ces canaux ont été purifiés et leur structure résolue àl’échelle atomique

• Ils forment la famille des canaux dépendants dupotentiel (voltage-dependent), comprenant plus de140 membres

Comment est « physiologiquement »engendré un potentiel d’action?

Origine de la modulation du potentiel de repos

Comment est « physiologiquement »engendré un potentiel d’action?

• Il y a modulation du potentiel de repos de l’extrémitédendritique (potentiel synaptique)

• Cette modulation se fait sous l’influence d’un élément« amont » qui représente « l’input »

• Cet amont peut être la terminaison axonale d’unneurone: le neurone amont est présynaptique, l’avalpostsynaptique

• Cet amont peut aussi être un organe sensoriel

Les deux types « d’input »

Input sensoriel

Input synaptique

La transmission synaptique

La synapse chimique

La synapse chimique

• La terminaison axonale du neurone amontlibère une molécule:neuromédiateur/neurotransmetteur

• L’espace entre les deux neurones (fentesynaptique) est petit: ≈ 50 nm

• La molécule se lie à un récepteur sur lamembrane du neurone aval (dendrite, corpscellulaire)

• Le récepteur induit un changement dupotentiel de repos:– Dépolarisation: synapse excitatrice– Hyperpolarisation: synapse inhibitrice

Définition d’un neurotransmetteur

• C’est un composé présent dans le neurone présynaptique et synthétisé par lui

• Il est libéré au cours de la transmission• Appliqué sur le neurone post synaptique à une

concentration équivalente, il produit les mêmes effetsque la stimulation électrique du neurone présynaptique

• Il existe des mécanismes physiologiques permettantde l’extraire rapidement de le fente synaptique

Principaux neurotransmetteurs ducerveau des mammifères

UbiquitaireAcide aminéAcide glutamique

UbiquitaireAcide aminéglycine

Acide aminé acide γ-aminobutyrique(GABA)

PlaquettesIndolamineSérotonine (5-HT)

Système sympathiqueCatécholamineNoradrénaline (NA)

CatécholamineDopamine (DA)

Jonctionneuromusculaire

Acétylcholine (Ach)

Présence hors ducerveau

Famille chimiqueNeurotransmetteur

Neurotransmetteurs et communication cellulaire

• Certaines molécules ne fonctionnent quecomme neurotransmetteurs (Ach)

• Les acides aminés (Gly et Glu) sont descomposants des protéines

• Certaines monoamines (NA, Adrénaline)fonctionnent comme des hormones: ellessont libérées comme des neurotransmetteurs,mais dans le flux sanguin, et les cellulescibles, portant les mêmes récepteurs sonteloignées

Peptides neuroactifs

Pour ces composés, les 4 critères ne sont généralement pas remplis; ilspeuvent co-libérés avec les neurotransmetteurs classiques

Les récepteurs ionotropes

« Ligand-gated channels »

Le récepteur de l’ACh de la jonctionneuromusculaire

• La fibre nerveuse est équivalenteà un neurone: elle a un potentielde repos (- 90 mV) et elle estexcitable

• On stimule le motoneurone et onenregistre la différence depotentiel au niveau de laterminaison synaptique

Potentiel d’action dans la fibre musculaire

• La stimulation du nerf produit dans le muscle unedépolarisation: Excitatory Post Synaptic Potential,EPSP), jusqu’à - 20 mV

• Cette dépolarisation induit un potentiel d’action(spike)

• Le curare inhibe le récepteur et l’EPSP n’atteint plusle seuil

Nature des conductances ouvertes à unesynapse excitatrice

• On excite le corps cellulairedu neurone amont

• On mesure le courant entrantdans le neurone cible àpotentiel imposé (voltage-clamp)

• On mesure aussi le potentielà courant imposé (current-clamp)

Nature des conductances ouvertes à unesynapse excitatrice

• Pre: potentiel d’action duneurone amont

• Le neurone est à son potentielde repos: - 55mV

• La stimulation produit à - 55 mVun courant entrant (C2) et doncune dépolarisation (C1)

• La dépolarisation n’amène pasla cellule au potentiel d’équilibredu Na+ 55 mV

• Le courant est nul à 0 mV• Le récepteur est associé avec

une conductance cationique,passant Na+ et K+

Le canal ionique associé avec lerécepteur à l’Ach, étude en patch-clamp

• L’étude est faite en conformationcell-attached; la cellule est unecellule musculaire (grenouille)

• L’enregistrement est fait à - 92mV en présence de 100 nMd’ACH

• On voit un canal osciller entredeux états, ouvert (courantentrant) et fermé

• La conductance élémentaire estde 30 pS

Dépendance vis à vis du potentiel

• Le potentiel est varié depuis+ 70 mV jusqu’à - 70 mV

• Comme la conductancemacroscopique, le courantest nul à 0 mV

• On peut montrer que Na+ etK+ ont des perméabilitéséquivalentes

• Le canal est imperméableaux anions

Canal unique et conductance macroscopique

• On soumet la cellule à unpulse bref d’Ach (flèches),comme c’est le cas dansune stimulation dumotoneurone

• Les différents récepteurss’ouvrent de manièresynchrone (canal 1 à 6)

• Leur fermeture est aléatoire• La somme des canaux

ouverts reproduit le courantentrant macroscopique

Résumé

Synapse inhibitrice: les récepteurs auGABA et à la glycine

• Le dispositif expérimental est celui décritpour la synapse excitatrice

• Une électrode est introduite dans lacellule amont; elle permet de dépolarisercelle-ci et de créer un potentiel d’action

• Dans la cellule cible, on a 2 électrodes etun montage current-clamp

• Au potentiel de repos (-55 mV), lastimulation hyperpolarise légérement

• Le potentiel d’inversion (-60 mV) est lepotentiel de Nernst de Cl-

• Le ligand (GABA ou glycine) ouvreune conductance Cl-

Comparaison des récepteurs ACh et GABA

• Le récepteur activé parl’ACh (2 µM) de cellulemusculaire a son potentield’inversion à 0 mV

• Le récepteur activé par leGABA (5 µM) de neuronede l’hippocampe de rats’inverse à - 60 mV

Principaux récepteurs ionotropes

Conclusions sur les récepteurs ionotropes

• Il existe des canaux ioniques activés par des ligands(neurotransmetteurs) comme il existe des canauxioniques activés par le potentiel

• Dans le système nerveux central, les principauxneurotransmetteurs excitateurs sont l’Ach et surtoutle Glutamate

• Les neurotransmetteurs inhibiteurs sont la glycine etsurtout le GABA

Données moléculaires sur les récepteursionotropes

1. Le(s) récepteur(s) de l’Ach2. Le(s) récepteur du Glutamate

Un système modèle: l’organe électriquede la torpille

• L’organe électrique est équivalent à un muscle; ses cellules (électrocytes)sont empilées et innervées sur une face

• A la stimulation nerveuse, décharges des cellules en série (50-100 V, 10 A)

Purification du récepteur de l’Ach detorpille

• La purification a été faite à partir dela face innervée de l’organeélectrique

• Protéine membranaire difficile àpurifiée

• Test: liaison de l’α-bungarotoxine,un peptide du venin de serpents

• Première purification d’un récepteurdans le laboratoire de Jean-PierreChangeux (1970)

• Premier clonage Shosaku Numa(1983)

Organisation générale du récepteur AChR

• Le récepteur est unhétéropentamère (α2βγδ)

• Les sous-unités sonthomologues et il existedes homopentamères

• Chaque sous-unité a 4segments trans-membranaires

• Il y a 2 sites de liaison del’Ach, entre des sous-unités

• Le canal est au centre

(Karlin A (2002) Nature Rev Neurosc,3, 103)

Sélectivité de l’AChR

• La cristallisation 3D et la résolutionatomique n’ont toujours pas étéréussies

• Des protéines bactériennesvoisines ont été cristallisées

• Les meilleures structures (4 Ä) ontété obtenues par cristallisation 2Det microscopie électronique

• Dans cette représentation, le rougeindique les charges négatives et lebleu les positives

• Cette distribution électrostatiqueexplique la sélectivité cationique

(Unwin N (2005) J Mol Biol,346, 967)

Mécanisme de l’ouverture: le AChR, uneprotéine allostérique

• Allostérie: théorie proposée en1964 par Monod, Wyman etChangeux pour expliquerl’action sur une enzyme d’unemolécule étrangère (nisubstrat, ni produit)

• La protéine est un oligomère• Elle existe en différentes

conformations• Le ligand allostérique I fait

passer la protéine d’uneconformation à une autre

Mécanisme de l’ouverture: le AChR, uneprotéine allostérique

• Structure modélisée d’unAChR homopentamérique

• 5 sites de liaison identiquesentre les parties extra-cellulaires des sous-unités

• A- une sous-unité; B-partieextra-cellulaire (2 sous-unités); C- protéine entièrede face; D- de profil,extérieur en haut

(Taly et al (2009) Nature Drug Discov Rev,8, 733)

Mécanisme de l’ouverture: le AChR, uneprotéine allostérique

• Le AChR est une protéine avec 2 conformations (ouverte etfermée)

• Les agonistes (Ach, Nicotine) stabilisent la conformation ouverte• Les molécules qui stabilisent la conformation fermée

(bungarotoxine) sans entrer dans le canal sont des antagonistes• Le curare bloque directement le canal

Les récepteurs ionotropes du glutamate

Propriétés et structure

Propriétés des GluR

• Les GluR sont les principaux récepteurs des synapsesactivatrices du cerveau

• Activés, ils laissent passer les cations (Na+,K+,Ca2+)• Trop de glutamate tue: l’excitotoxicité (ischémie cérébrale): une

entrée massive de Ca2+ par les GluR induit une mort cellulaire• Le patch-clamp a montré l’existence de 3 familles de GluR,

chacune caractérisée par sa pharmacologie (ligands nonphysiologiques ouvrant le canal par liaison au site du Glu) et sacinétique

• Les 3 familles comportent plusieurs membres• Les GluR sont des tétramères (homo ou hétéro); toutes les

sous-unités sont apparentées (gènes différents, maishomologues); environ (5 à 600 acides aminés)

Le « scoop »: structure atomique de GluR

(Sobolevsky et al (Dec2009) Nature,462, 745)

Structure GluR: 4 sous-unités identiques

• Le GluR cristallisé est un homo-tétramère

• Chaque sous-unité est composéede 3 domaines

• Le domaine transmembranaire(TMD) est dans la membrane etson assemblage forme le canalionique

• Dans l’espace extra-cellulaire setrouve d’abord le domaine liant leligand (glutamate) LBD

• Puis le domaine amino-terminal(ATD)

La liaison du ligand module l’activité du canal

• Le domaine de liaison du ligand (LBD) comporte une poche(clamshell) accueuillant le ligand

• En présence du ligand, il y a un changement de conformationqui ouvre le canal

(Madden DR, 2002, Nature Rev Neurosc, 3, 91)

L’ouverture du canal

• La protéine est untétramère; les sous-unitéssont assemblées par desinteractions au niveau desdomaines ATD et LBD

• La liaison du glutamate surle domaine LBD esttransmise au domaine TM(canal)

• Protéine allostérique

(Jin R et al (2009) EMBO J,28, 1812°

Le canal de GluR est semblable à un canal K+

• On a superposé lastructure du canal de GluR(fermé) en bleu sur celled’un canal K+ fermé dont aenlevé le filtre de sélectivité(en gris)

• En a, vue en coupe dans lamembrane, en b, vuedepuis le milieu extra-cellulaire, en c, hélicesinternes

GluR, une organisation originale des sous-unités

• Les 4 sous-unités sontassociées en 2 dimères

• En a, vue en coupe• En b, vue en face au niveau

ATD: on a un dimère A-B etun autre C-D

• En c, au niveau LBD, on amaintenant des dimères A-Det B-C

• En d, au niveau du canal,symétrie d’ordre 4

Transmission du changement deconformation depuis LBD jusqu’à TM

• On voit en coupe 2 domaines LBD et les TM correspondants• Les hélices (cylindres) de LBD en violet correspondent à la

conformation fermée du canal; en vert, déplacement induit parle glutamate: on tire sur les hélices M3, ce qui ouvre le canal

Les récepteurs métabotropes

La notion de second messager la signalisation

Notions générales

• Nous n’avons pas parlé des récepteurs à certainsneurotransmetteurs (monoamines, peptides)

• Pour la majorité, les récepteurs correspondants nesont pas associés directement avec des canaux

• Pendant leur activation (liaison du ligand), cesrécepteurs changent de conformation

• Ce changement est perçu par une protéineintracellulaire (protéine G), qui le transmet à uneprotéine effectrice

• Celle-ci va affecter (souvent indirectement) un canalionique, qui va modifier le potentiel synaptique local

Exemple de cascade de signalisation

• Le récepteur de la sérotonineest activé par son ligand

• Il transmet son activation à laprotéine G sur la faceintérieure de la membrane

• A son tour, celle-ci active uneenzyme, l’adénylate cyclase

• Son produit, l’AMP cyclique,active une protéine kinase

• Cette dernière phosphoryleun canal K+

• Le canal se ferme et induitune dépolarisation

Kinase: enzyme qui introduit un groupe phosphate dans une protéine

Caractérisation biochimique des récepteursmétabotropes et des protéines G

• Ces récepteurs sont desprotéines traversant lamembrane 7 fois

• C’est une très grande famille(plus de 700 membres), ciblede la majorité des drogues

• Elle n’est pas limitée ausystème nerveux

• Les protéines G sontfaiblement liées à lamembrane

• Il en existe plusieurs dizaines• Elles sont trimériques• La sous-unité α lie le GTP ou

le GDP(Alberts et al, Molec Biol Cell)

Effet de l’activation du récepteur

• L’activation du récepteurentraîne un changement deconformation

• La protéine G diffuse sur lamembrane: sa rencontreavec le récepteur induit unchangement de conformation

• Celui-ci permet la liaison duGTP, qui induit unedissociation des sous-unités

• la sous-unité α liée au GTPpeut activer d’autresprotéines

Vue plus générale de la signalisation:l’horreur de la biologie

• Un même récepteur peutactiver différentesprotéines G, qui peuventavoir des effets différents

• Il faut arrêter l’activation dusystème: phosphorylationdu récepteur, hydrolyse duGTP par la sous-unité αelle-même

(Rosenbaum et al (2009) Nature,459, 356)

Nouveaux « scoops »: structures derécepteurs à 7 hélices

• Structure du récepteur β1-adrénergique de dinde• Passage de l’organisation postulée à la structure

3D atomique• Depuis 2007, trois structures ont été décrites qui

s’ajoutent à la rhodopsine

(Warne et al (2008) Nature, 454, 486)

Les changements de conformation liés àl’activation

• Changement deposition des hélicestrans-membranaires TM6 et 7 lors de l’activationdu récepteur β2-adrénergique

• Le ligand est figuré envert clair; la formeactivée est en gris

(Bokoch et al (2010) Nature, 463, 108)

Activation « sensorielle »

Récepteurs olfactifsRécepteurs visuels

Récepteurs olfactifs

• Sur les neurones, il y ade multiples récepteursà 7 hélices

• Leur activation par unodorant active uneprotéine G, puis uneAMP-cyclase

• L’AMPc formé ouvre uncanal cationique

• L’entrée de Na+ permetla dépolarisation et lepotentiel d’action

Récepteur visuel(d’après S Picaud, INSERM U592, Institut de la vision)

• Les récepteurs visuels (bâtonnet et cônes) tapissentle fond de l’œil

• De manière surprenante, les neurones sensorielssont devant les récepteurs

• Les récepteurs et les neurones sensoriels forment 3couches bien identifiables

Organisation des récepteurs

• Les récepteurs (bâtonnets) sont photosensibles sur lesegment externe: augmentation de la surface, disques

• La membrane des disques à une protéine majoritaire, larhodopsine, de la famille des récepteurs à 7 hélices

• Un pigment, le rétinaldehyde, est lié à la lysine 296

Lys296Lys296

Segment externe: disques

Segment interne:mitochondries

Noyau

Terminaisonsynaptique

Effet de la lumière sur les récepteurs

• Le précurseur durétinaldéhyde est la vitamine

• Le rétinaldéhyde est lié parune base de Schiff sur unelysine

• A l’obscurité, il est sous laforme 11-cis

• A la lumière, il s’isomériseen trans

• Ce changement induit unchangement deconformation de la protéine

• La structure atomique des 2conformations a été résoluerécemment

All-trans-retinaldehyde

11-cis-retinaldehyde

CHO1

2

34

5

6

7

89

10

11

1213

14

15

12

1

2

34

5

6

7

89

10

11

1314

15CHO

CH 2 OH1

2

34

5

6

7

8 9 10

11

12 13 14

15

All-trans-retinol (vitamin A)

Surprise: pas de potentiel d’action dansles récepteurs

• L’illumination du récepteur neproduit pas un potentiel d’actiondans les cellules réceptrices

• Ces cellules sont « dépolarisées »à l’obscurité (- 30 mV)

• A la lumière, elles se polarisent à- 70 mV

• Ce n’est que deux cellules plusloin (neurones ganglionnaires) qu’apparaît un potentiel d’action

• Ce potentiel d’action transmetl’information au cerveau

La cascade de signalisation visuelle

• La rhodopsine activéeactive une protéine G, latransducine

• La sous-unité α, liée auGTP, active unephosphodiestérase quiclive le GMP cyclique

• Le cGMP est requis par uncanal cationique; sonhydrolyse ferme le canal

• Cette fermeture polarise lacellule

Le comportement paradoxal desrécepteurs rétiniens

• A l’obscurité, la rhodopsineinactive conduit à uneouverture de canaux Na+ et àune libération forte deneurotransmetteur

• La lumière ferme ces canauxet hyperpolarise la cellule

• La libération deneurotransmetteur estinhibée

Les récepteurs visuels, un exemple « bizarre »

• L’entrée du signal ne produit pas un signal positif,mais l’inhibition d’un signal positif

• C’est une solution coûteuse: la dépolarisation àl’obscurité tend à diminuer le gradient ionique, d’oùune dépense énergétique (ATP, oxygène)

• La transduction visuelle est lente• La cascade amplifie énormément le signal:

– Une rhodopsine activée peut activer plusieurs transducines(protéine G)

– Une phosphodiestérase hydrolyse de nombreux cGMP

La cascade est un amplificateur

Une molécule de rhodopsine absorbe un photon

500 molécules de transducinesont activées

500 molécules de phosphodiestérase sontactivées

105 molécules de cGMP sonthydrolysées

250 canaux Na+ sont fermés

La membrane s’hyperpolarise de 1 mV

106 ions Na+/s ne rentrent pasdans la cellule

(d’après Alberts, Molec Biol Cell)

Pour terminer: une idée folle

• A partir d’une algue verte,une protéine, « channelrhodopsine-2 » a été isolée

• C’est un canal cationiqueassocié avec le cis-rétinal

• L’illumination ouvre le canal• Pourquoi ne pas exprimer

cette protéine dans lesneurones ganglionnaires,capables de potentield’action?

Expression de channel rhodopsin-2 dansdes rétines sans récepteurs

• La protéine est couplée à la GFP: les cellules vertesexpriment ChR2; l’expérience est faite sur des rétines desouris sans récepteurs

• On mesure le courant et le potentiel dans ces cellules, àdifférentes illuminations

• Des potentiels d’actions sont visibles (fig E)(Bi et al (2006) Neuron, 50, 23)

Message final

• Les potentiels d’actions sont engendrés après unemodification du potentiel de repos synaptique

• Celle-ci peut être produite par une entrée sensorielleou un neurotransmetteur

• Les récepteurs aux neurotransmetteurs peuventouvrir directement un canal ionique ou être coupléspar des seconds messagers

• Dans ce second cas, le couplage est plus lent, mais ilpermet des effets beaucoup plus diversifiés

• Il peut aussi y avoir une amplification importante