BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN HÓA HỌC

PHẠM ĐỨC THỊNH

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN,

CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN

CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI

RONG NÂU Ở VỊNH NHA TRANG

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 62.44.01.18

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hướng dẫn khoa học:

1. PGS. TS. Bùi Minh Lý

2. PGS. TS. Lê Lan Anh

Hà Nội, 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu nêu

trong luận án là trung thực. Những kết luận khoa học của luận án là chưa từng

được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, 2015

Tác giả

Phạm Đức Thịnh

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được rất

nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học thuộc nhiều

lĩnh vực cùng bạn bè và đồng nghiệp.

Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS

Bùi Minh Lý và PGS.TS Lê Lan Anh đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt

nhất giúp tôi hoàn thành bản luận án này.

Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ Nafosted (Đề tài nghiên cứu khoa

học cơ bản, mã số: 104.01.59.09) và Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam (Đề tài hợp

tác quốc tế, mã số: VAST.HTQT.NGA. 06/13-14) đã hỗ trợ kinh phí cho việc thực

hiện Luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của các cô

chú, các anh chị em của phòng:

- Phòng Hóa phân tích và Triển khai công nghệ nói riêng cũng như Viện Nghiên

cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang nói chung.

- Phòng Hóa phân tích, Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa

học. Phòng thử nghiệm hoạt tính sinh học - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.

- Phòng Hóa enzym, Phòng cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ- Viện Hóa sinh

Hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Chi nhánh Viễn Đông,

Liên Bang Nga.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, Phòng Quản lý

Đào tạo sau Đai học - Viện Hóa học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn

thành các học phần của luận án và mọi thủ tục cần thiết.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn

bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn

thành luận án.

Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2015

Tác giả Luận án

Phạm Đức Thịnh

i

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC...................................................................................................................i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................iv

DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ.................................................................................viii

DANH MỤC PHỤ LỤC............................................................................................ix

MỞ ĐẦU................................................................................................................1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN..................................................................................3

2.3. RONG BIỂN..................................................................................................3

1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển .....................................................................3

1.1.2 Phân loại và phân bố của rong biển ............................................................4

1.1.3 Thành phần hóa học có trong rong biển .....................................................5

1.2 FUCOIDAN ...................................................................................................6

1.2.1 Giới thiệu chung về fucoidan ......................................................................6

2.3.1. Thành phần của fucoidan trong rong nâu ..................................................7

1.2.3. Đa dạng cấu trúc của fucoidan....................................................................9

1.2.4. Các phương pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu...................................13

1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan ..........................................15

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN.....20

1.3.1 Phương pháp phân tích thành phần đường ..............................................20

1.3.2 Phương pháp phân tích liên kết.................................................................21

1.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)............................................................22

1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)..................................23

ii

1.3.5 Phương pháp phổ khối lượng (MS)...........................................................26

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN

QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN...............................32

1.4.1. Tình hình nghiên cứu fucoidan trên thế giới. ...........................................32

1.4.2. Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam. ............................................34

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................36

VÀ THỰC NGHIỆM ..........................................................................................36

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.....................................................................36

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................................................37

2.2.1 Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan .......................................37

2.2.2 Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường ...............38

2.2.3 Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate ...............................................38

2.2.4 Phương pháp khử sulfate ..........................................................................38

2.2.5 Phương pháp phân tích hàm lượng uronic axít ........................................38

2.2.6 Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa .....................................38

2.2.7 Phương pháp thủy phân tạo oligosacarit...................................................39

2.2.8 Phương pháp phổ hồng ngoại IR ..............................................................39

2.2.9 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ....................................39

2.2.10 Phương pháp phổ khối lượng MS .............................................................39

2.2.11 Phương pháp thử hoạt tính sinh học và xử lý số liệu................................39

2.3. THỰC NGHIỆM.........................................................................................40

2.3.1. Chiết tách và phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu ...........................40

2.3.2. Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường ...............41

2.3.3. Phân tích hàm lượng sulfate .....................................................................41

2.3.4. Phân tích hàm lượng uronic axít...............................................................42

2.3.5. Khử sulfate.................................................................................................42

2.3.6. Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa .....................................42

iii

2.3.7. Thủy phân tạo fucoidan oligosacarit .........................................................43

2.3.8. Phổ khối MALDI-TOF/MS và ESI-MS của fucoidan oligosacarit ...........43

2.3.9. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan ........................................44

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................47

3.1. CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU................47

3.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN ..................48

3.3. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CỦA CÁC PHÂN

ĐOẠN FUCOIDAN.............................................................................................51

3.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN ............................................62

3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của fucoidan.........................................62

3.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn fucoidan được phân lập từ

rong Sargassum swartzii và Sargassum mcclurei ................................................64

3.5. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN.........69

3.5.1. Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ IR................................................69

3.5.2. Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ NMR ...........................................72

3.6. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN SmF3 ĐƯỢC

CHIẾT TÁCH TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI .........................77

3.7. ĐÁNH GIÁ MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC VÀ

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN ....................................................97

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................99

1

MỞ ĐẦU

Trong đa dạng và vô tận của thảm thực vật đại dương, rong nâu là một trong

số các loài thực vật biển có thể tự tái tạo đáng lưu ý nhất mà con người đã phát hiện

ra. Rong nâu chứa rất nhiều polysacarit sinh học quí như alginate, laminaran,

fucoidan với khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn [29,103].

Trong số đó fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do có

nhiều hoạt tính sinh học quý như: hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối,

chống virus, chống ung thư và điều biến miễn dịch, chống viêm, giảm lipid máu,

chống oxy hóa và các đặc tính chống bổ thể (anticomplementary), chống lại các

bệnh về gan, về đường tiết niệu (uropathy renalpathy), tác dụng bảo vệ dạ dày và

khả năng điều trị trong phẫu thuật [69,88]. Fucoidan là một sulfate polysacarit có

cấu trúc hóa học rất phức tạp bởi tính đa dạng của liên kết glycoside và khả năng

phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate được sắp xếp không theo quy luật trên mạch

polymer. Thành phần của nó bao gồm nhiều loại đường, chủ yếu là fucose và một

số các gốc đường khác như galactose, glucose, manose, xylose..., đôi khi còn có axít

uronic [23,36,69,71].

Mặc dù có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết

của fucoidan, nhưng các kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu

trúc của chúng về trật tự liên kết giữa các gốc đường, sự phân nhánh và vị trí các

gốc sulfate vẫn còn rất hạn chế [23,34,35,36,48]. Mặt khác, mối quan hệ giữa cấu

trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ

[88,36,38,48,69]. Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên các

tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng fucoidan để làm dược liệu thì việc xác định chính

xác thành phần và cấu trúc hóa học của fucoidan là điều tiên quyết và đang thu hút

sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới.

Nước ta có hơn 3.200 km bờ biển trải dài từ Bắc xuống Nam, với diện tích

mặt nước rộng hơn 1.000.000 km2 được thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên

rong nâu rất đa dạng và phong phú, hiện tại đã có khoảng 147 loài rong nâu được

phân loại [1,8], trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất

2

với hơn 60 loài và sản lượng ước tính đạt tới 10.000 tấn rong khô/năm [58]. Tuy

nhiên cho đến nay ở nước ta vẫn chưa có một công trình nghiên cứu có tính hệ

thống về thành phần hóa học, cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan rong nâu

Việt Nam.

Do vậy, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu

trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh

Nha Trang” nhằm hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về fucoidan của rong nâu

Việt Nam theo định hướng tìm kiếm những nguồn dược liệu mới phục vụ sức khỏe

cộng đồng và phát triển kinh tế xã hội.

Mục tiêu của luận án:

Chiết tách và phân đoạn fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam. Phân

tích thành phần, xác định đặc điểm cấu trúc và mối quan hệ giữa cấu trúc với hoạt

tính sinh học của fucoidan.

Để đạt được mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm:

- Thu thập các loài rong nâu có trữ lượng lớn ở vùng biển vịnh Nha Trang.

- Tách chiết và phân đoạn fucoidan từ các loài rong thu được.

- Phân tích thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của fucoidan

và các phân đoạn của chúng.

- Xác định cấu trúc của fucoidan có hoạt tính quan tâm.

- Đánh giá mối tương quan giữa hoạt tính sinh học với đặc trưng cấu trúc

của fucoidan

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

2.3 RONG BIỂN

1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển

Hàng năm đại dương cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong biển.

Nhiều nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon trên trái đất được tổng hợp nhờ

quang hợp, trong đó 20% có nguồn ngốc từ rong biển [83,97]

Việc tiêu thụ sản phẩm từ rong biển (tảo đa bào ở biển) đã trải qua thời kì

lịch sử rất lâu dài. Các dấu vết khảo cổ học cho thấy, người Nhật đã dùng rong biển

từ hơn 10.000 năm trước. Trong nền văn hoá Trung Quốc cổ đại, rong biển được coi

là đặc sản dùng trong các món ăn của triều đình và chỉ hoàng tộc hay khách của

hoàng thân, quốc thích mới được thưởng thức. Dù rong biển được coi là món ăn đặc

trưng của châu Á, nhưng trên thực tế các quốc gia có bờ biển trên thế giới như

Scotland, Ireland, Newzealand, quần đảo nam Thái Bình Dương và các nước Nam

Mỹ ven biển cũng đã sử dụng rong biển từ rất lâu.

Rong biển cũng được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác. Chúng là nguồn

nguyên liệu tự nhiên cho công nghiệp thực phẩm (Cải biển Ulva lactuca, bột rong

biển, chất tạo gel E400, E401 Alginate–Agar E406, E407, Carrageenan...), mỹ

phẩm (chất tạo kết cấu và hoạt hóa), công nghiệp (Phycocolloids, hydrocolloids tạo

độ sánh, gel hoặc chất ổn định), thức ăn gia súc, nông nghiệp ... Qua các tài liệu

tham khảo trong lịch sử và trong thời gian sử dụng lâu dài, không có nguy cơ gây

hại sức khỏe nào được đề cập đến rong biển. Vì vậy, rong biển được xếp vào loại

thực phẩm chức năng ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thế giới.

Hiện nay, Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc là những nước tiêu thụ rong

biển thực phẩm lớn nhất và nhu cầu của họ là cơ sở của một nghề nuôi trồng thủy

sản với sản lượng hằng năm trên toàn thế giới khoảng 6 triệu tấn rong tươi, trị giá

lên đến 5 tỉ USD [97]. Các nước và lãnh thổ cung cấp rong biển thực phẩm chính là

Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan. Các nước cung cấp chính rong biển

cho công nghiệp là Đan Mạch, Pháp, Na Uy, Tây Ban Nha, Mỹ và Nhật.

4

1.1.2 Phân loại và phân bố của rong biển

* Phân loại và phân bố của rong biển trên thế giới

Dựa vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái và màu sắc, rong biển có thể

được chia thành 3 ngành rong chính [30]:

1. Ngành rong nâu (Phaeophyta)

2. Ngành rong đỏ (Rhodophyta)

3. Ngành rong lục (Chlorophyta)

Trong số 03 ngành rong trên, rong nâu là ngành rong có trữu lượng lớn nhất

và phân bố đa dạng nhất với hơn 1800 loài đã được phân loại. Trên thế giới hiện

nay chỉ riêng các loài rong thuộc họ Sargassaseae, bộ Fucales đã phân loại được

khoảng hơn 400 loài [1, 8].

Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là

Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chile,

Achentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha. Trong đó bộ

Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ

Sargassaceae với hai loài Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận

nhiệt đới. Sản lượng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên

667.000 tấn khô, với 3 chi chính là Laminaria, Udaria, Ascophyllum. Hàn Quốc

khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria. Nhật Bản khoảng 51.000

tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng

27.000 tấn [5].

* Phân loại và phân bố các loài rong nâu ở Việt Nam

Ở Việt Nam đến nay có khoảng 147 loài rong nâu đã được phân loại, trong

đó các loài rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất với khoảng 68 loài phân

bố dọc ven biển Việt Nam và sản lượng ước tính trên 10.000 tấn khô/năm [9]. Theo

điều tra tới năm 2011 có 39 loài rong nâu thuộc chi Sargassum phân bố ở vùng biển

Khánh Hòa, tập trung nhiều nhất và có trữ lượng lớn nhất là ở vịnh Nha Trang với

21 loài phổ biến và sản lượng ước tính gần 4.800 tấn khô/năm [1].

Rong nâu phân bố phổ biến ở các vùng biển Đà Nẵng (chân đèo Hải Vân,

bán đảo Sơn Trà), Quảng Nam (Cù Lao Chàm, Núi Thành), Quảng Ngãi (Bình

5

Châu, đảo Lý Sơn, Sa Huỳnh), Bình Định (Phù Mỹ, Qui Nhơn), Phú Yên (vịnh

Xuân Đài, Cù Mông), Khánh Hòa (vịnh Vân Phong, Hòn Khói, vịnh Nha Trang,

vịnh Cam Ranh), Ninh Thuận (huyện Ninh Hải, Ninh Phước). Trong khi đó vùng bờ

biển từ Bình Thuận đến Bà Rịa-Vũng Tàu không phát hiện sự có mặt của rong nâu.

Đoạn bờ biển Tây Nam Bộ thuộc tỉnh Kiên Giang từ Hòn Chông, Hòn Trẹm (xã

Bình An) đến thị xã Hà Tiên, Mỹ Đức, giáp biên giới Campuchia là vùng biển có

nhiều điều kiện thuận lợi cho rong nâu phát triển [1].

Nhìn một cách tổng quan hai khu vực ở ven biển phía Nam Việt Nam rong

nâu phân bố tập trung là vùng ven biển và đảo từ Đà Nẵng đến Vũng Tàu và huyện

Hà Tiên (từ xã Bình An đến Mỹ Đức Hà Tiên) [8].

1.1.3 Thành phần hóa học có trong rong biển

Rong biển có chứa đa dạng các thành phần hoá học, chúng đều là các thành

phần rất có giá trị về mặt dinh dưỡng cũng như dược liệu bao gồm: các axít amin,

các axít béo nhiều nối đôi, các vitamin và khoáng chất, polyphenol, các hợp chất

chứa iốt, laminaran, alginat và fucoidan (bảng 1.1). Trong số các hợp chất

polysacarit của rong biển thì fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên

cứu do chúng sở hữu rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị (kháng u, kháng đông tụ

máu, kháng virus, kháng viêm, chống oxi hóa,…) với tiềm năng ứng dụng rất lớn để

làm dược liệu [69, 132]. Từ kết quả các số liệu trong bảng 1.1, ta thấy fucoidan chỉ

có trong thành phần của ngành rong nâu mà không có trong thành phần của hai

ngành rong đỏ và rong lục [5].

Bảng 1.1: Thành phần hoá học (%) của một số loài rong biển.

Ascophyllum

nodosum

Laminaria

digitata

Alaria

esculenta

Palmaria

palmata

Porphyra

sp.

Porphyra

yezoensis

Ulva

sp.

Ngành rong Nâu Nâu Nâu Đỏ Đỏ Đỏ Lục

Nước 70-85 73-90 73-86 79-88 86 Nd 78

Tro 15-25 73-90 73-86 15-30 8-16 7,8 13-22

Alginic axít 15-30 20-45 21-42 0 0 0 0

Xylan 0 0 0 29-45 0 0 0

6

Laminaran 0-10 0-18 0-34 0 0 0 0

Mannitol 5-10 4-16 4-13 0 0 0 0

Fucoidan 4-10 2-4 nd 0 0 0 0

Floridosid 0 0 0 2-20 nd nd 0

Protein 5-10 8-15 9-18 8-25 33-47 43,6 15-25

Chất béo 2-7 1-2 1-2 0,3-0,8 0,7 2,1 0,6-0,7

Tannin 2-10 0,1 0,5-6,0 nd nd nd nd

Kali 2-3 1,3-3,8 nd 7-9 3,3 2,4 0,7

Natri 3-4 0,9-2,2 nd 2,0-2,5 Nd 0,6 3,3

Magie 0,5-0,9 0,5-0,8 nd 0,4-0,5 2,0 nd nd

Iod 0,01-0,1 0,3-1,1 0,05 0,01-0,1 0,0005 nd nd

1.2 FUCOIDAN

1.2.1 Giới thiệu chung về fucoidan

Fucoidan là một anion polysacarit sulfate hóa nằm trong thành tế bào của

rong nâu, hợp chất này được phân lập và mô tả lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913

[67], khi đó nó được đặt tên là “fucoidin” theo tên gọi của gốc đường fucose là

thành phần chính cấu tạo nên polysacarits này. Nhưng theo danh pháp carbohydrate

nghiêm ngặt, thuật ngữ này là không chính xác, vì các polysacarit được tạo nên bởi

fucose và sulfate được đặt tên là sulfate fucan. Các polysacarit như vậy trên thực tế

chỉ có mặt trong ngành Da gai, cụ thể là cầu gai và hải sâm [125]. Ngược lại, thành

phần và cấu trúc của các polysacarit rong nâu phức tạp hơn nhiều. Ngoài hai thành

phần chính là fucose và sulfate, trong phân tử của fucoidan còn có thể chứa thêm

các đường đơn khác như: galactose, xylose, manose, glucuronic axít , đồng thời có

thể bị acetyl hóa một phần. Cấu trúc hóa học chi tiết của các polyme sinh học phức

tạp này trong nhiều trường hợp còn chưa được biết đến. Chính vì vậy, tên gọi phổ

thông “fucoidan” là thích hợp nhất nhằm dùng cho tất cả các polysacarit sulfate hóa

7

của rong nâu, nó không liên quan đến thành phần của chúng, nhưng hiển nhiên

không được sử dụng cho fucan sulfate hóa có nguồn gốc động vật [125].

Nhờ sự đa dạng về thành phần và cấu trúc mà fucoidan sở hữu nhiều hoạt

tính sinh học thú vị như: kháng đông tụ máu, kháng huyết khối, kháng virut, chống

kết dính tế bào, chống tạo mạch (antiangiogenic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ

thể (anticomplementary), điều biến hệ miễn dịch, v.v... [69]. Nhờ vậy, fucoidan đã

trở thành đối tượng thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa

học trên thế giới với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực như thực phẩm

chức năng, thực phẩm bổ dưỡng và dược liệu. Cùng với đó số các công trình nghiên

cứu về fucoidan đã tăng vọt trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây (Hình 1.1) [81]

Hình 1.1 Số các công trình công bố có liên quan đến fucoidan từ năm 1980-2010

Thành phần của fucoidan trong rong nâu

Hàm lượng của fucoidan phụ thuộc vào loài rong, địa điểm và thời gian thu

hoạch rong. Năm 1997, Park và cộng sự đã công bố hàm lượng fucoidan từ 1-20%

trọng lượng rong khô và phụ thuộc vào loài rong [100]. Trước đó, công bố của

Stewart và cộng sự (1961) cho rằng hàm lượng fucoidan của rong nâu không thay

đổi nhiều khi thu rong ở các mùa vụ khác nhau [120]. Tuy nhiên, sau đó công bố

8

này đã được hiệu chỉnh lại trong nhiều nghiên cứu, theo các công bố [100,126] hàm

lượng fucoidan phụ thuộc vào vùng địa lý, loài rong và thời điểm thu hoạch. Năm

1994, Koo đã công bố hàm lượng fucoidan được phân lập từ các loài rong

L. religiosa, U. pinnatifida, H. fusiforme và S. fulvellum lần lượt là 2,7%; 6,7%;

2,5% và 1,6% [66].

Bảng 1.2. Thành phần hóa học của một số fucoidan [69]

Rong nâu Thành phần hóa học (tỉ lệ mol)

F. vesiculosus Fucose/sulfate (1/1,20)

F. evanescens Fucose/sulfate/acetate (1/1,23/0,36)

F. distichus Fucose/sulfate/acetate (1/1,21/0,08)

F. serratus L. Fucose/sulfate/acetate (1/1/0,1)

Lessonia vadosa Fucose/sulfate (1/1,12)

Macrocytis pyrifera Fucose/galactose (18/1)

Pelvetia wrightii Fucose/galactose (10/1)

Undaria pinnatifida (Mekabu) Fucose/galactose (1/1,1)

Ascophyllum nodosum Fucose/xylose/GlcA (4,9/1/1,1)

Himanthalia lorea

và Bifurcaria bifurcate

Fucose/xylose/GlcA (2,2/1,0/2,2)

Padina pavonia Fucose/xylose/mannose/glucose/galactose (1,5/1,5/1,2/1,2/1)

Laminaria angustata Fucose/galactose/sulfate (9/1/9)

Ecklonia kurome Fucose/galactose/mannose/xylose (1/0,67/0,03/0)

Sargassum stenophyllum Fucose/galactose/mannose/xylose (1/0,2/0,02/0,24)

Adenocytis utricularis Fucose/galactose/mannose (1/0,38/0,15)

Hizikia fusiforme Fucose/galactose/mannose/xylose/GlcA (1/0,72/0,72/0,2/0,25)

Dictyota menstrualis Fucose/xylose/uronic acid/galactose/sulfate (1/0,8/0,7/0,8/0,4) và (1/0,3/0,4/1,5/1,3)

Spatoglossum schroederi Fucose/xylose/galactose/sulfate (1/0,5/2/2)

Fucoidan là một sulfate polysacarit dị thể với thành phần cấu tạo hết sức

phức tạp. Lần đầu tiên thành phần của fucoidan trong dịch chiết nước được xác định

là một polysacarit có chứa L-fucose và D-xylose, trong khi đó D-galactose và

9

uronic axít được xem là các tạp chất [102]. Tuy nhiên, trong cô bố của Percival và

Ross (1950) cho thấy fucoidan trong dịch chiết nước nóng của các loài rong Fucus

vesiculosus, Fucus spiralis and Himanthalia lorea có chứa 38% ester sulfate, 56,7%

fucose, 4% galactose, 1,5% xylose, 3% uronic axít và 8% khoáng [103]. Tỉ lệ

fucose/galactose trong phân tử fucoidan cũng phụ thuộc vào các loài rong

[80,92,102]. Dillon và cộng sự. (1953) đã phân lập được fucoidan từ loài rong

Ascophyllum nodosum có tỉ lệ fucose: galactose là 8:1 [43], trong khi fucoidan được

phân lập từ rong Macrocystis pyrifera có tỉ lệ fucose:galactose = 18:1 [69]. Ngoài

ra, các thành phần đường khác (như xylose, mannose,...) cũng được xác nhận là hợp

phần của fucoidan [102]. Thành phần của fucoidan từ rong F. vesiculosus là 44,1%

fucose, 26,3% sulfate, 31,1% tro và một lượng nhỏ amino-glucose [69,103]. Như

vậy, thành phần của fucoidan phụ thuộc vào các loài rong (bảng 1.2) [69,81]. Ngoài

ra phương pháp chiết cũng có thể ảnh hưởng tới thành phần của fucoidan [81]. Theo

công bố [81], tác giả Percival (1968) đã phân lập fucoidan từ rong Ascophyllum

nodosum bằng cách chiết với nước nóng và dung dịch kiềm loãng nóng, kết quả thu

được fucoidan có thành phần gồm fucose, xylose, sulfate và uronic axít , trong khi

đó cũng với loài rong Ascophyllum nodosum tác giả Marais và Joseleau (2001) đã

tiến hành chiết bằng dung dịch 0,01% NaCl và 1% CaCl2 thu được fucoidan có

thành phần là fucose, glucose, galactose và sulfate [80].

1.2.3. Đa dạng cấu trúc của fucoidan

Việc phân tích cấu trúc của các polysacarit nói chung và fucoidan nói riêng

là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc đường. Cấu

trúc của fucoidan rong biển là vô cùng phức tạp và không đồng nhất [23] với những

thay đổi về mô hình liên kết (linkages), sự phân nhánh (branching), vị trí nhóm

sulfate cũng như các gốc đường trong polysacarit này phụ thuộc vào nguồn gốc của

chúng [25,34,35]. Vì vậy, việc phân tích cấu trúc của chúng vẫn còn là vấn đề nan

giải, ngay cả khi sử dụng các kỹ thuật phổ NMR phân giải cao mới nhất [88]. Đã có

nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết của fucoidan được công

bố, nhưng mới chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong

cấu trúc của fucoidan.

10

-L-fucp-4(SO3-)

3 2)--L-fucp-(12)--L-fucp-(12)--L-fucp-(12)--L-fucp-(12) 4 4 4 4

SO3

- SO3- SO3

- SO3-

Hình 1.2. Cấu trúc của fucoidan từ F. vesiculosus được mô tả vào năm 1950 [103]

Percival và Ross (1950) đã mô tả cấu trúc fucoidan từ rong Fucus

vesiculosus là một polysacarit có bộ khung mạch chính là -L-fucose(12), vị trí

mạch nhánh là gốc đường -L-fucose(13) và nhóm sulfate chủ yếu gắn ở vị trí C-

4 của gốc đường L-fucospynanose (hình 1.2) [103]. Mô hình cấu trúc fucoidan này

tồn tại hơn 40 năm. Năm 1993, cấu trúc fucoidan của rong F.vesiculosus đã được

nghiên cứu lại bởi Patankar và công sự, kết quả cho thấy có sự khác nhau ở bản chất

liên kết glycoside của fucoidan này với mạch chính là -L-fucose(13) thay vì -

L-fucose(12), nhóm sulfate được tìm thấy chủ yếu ở vị trí 4, phù hợp với mô hình

đã công bố trước [101]. Sự khác nhau về cấu trúc fucoidan so với công bố của

Percival và Ross được Pantakar giải thích như sau: đầu tiên là kỹ thuật chiết tách

khác nhau, fucoidan được Percival và Ross chiết trong dung môi nước nóng, thay vì

được chiết trong dung môi axít như Pantakar; thứ hai là sự khác nhau về phương

pháp methyl hóa và cuối cùng là sự khác nhau về phương pháp phân tích cấu trúc.

Percival và Ross phân tích cấu trúc fucoidan dựa trên các tính chất về sắc ký và hóa

học của sản phẩm methyl hóa, trong khi đó các sản phẩm methyl hóa được Patankar

phân tích bằng phương pháp GC-EI/MS.

Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ascopphyllum nodosum (A. nodosum) đã

được công bố trong các nghiên cứu [34,35,40,42]. Năm 2001, Chevolt và cộng sự

đã phân lập được fucoidan từ rong nâu Ascorphylum nodosum [35], cấu trúc

fucoidan oligosacarit (bậc polyme hóa từ 8-14) của loài rong này được cấu thành

bởi các liên kết luân phiên (13) và (14) (hình 1.3) [35].

Cấu trúc fucoidan từ A.nodosum cũng đã được Daniel và cộng sự nghiên cứu

11

khi sử dụng các enzym đặc hiệu làm xúc tác sinh học để thủy phân tạo fucoidan

oligosacarit, kết quả cho thấy sự có mặt của lượng lớn các liên kết glycoside của

gốc -L-fucose(13) và -L-fucose(14) [40].

Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ecklonia kurome đã được công bố năm 1991

bởi Nishino và Nagumo. Do tính dị thể trong phân tử của fucoidan nên phổ NMR

của chúng quá phức tạp để có thể giải thích cấu trúc một cách trực tiếp. Cấu trúc

phân tử trung bình của fucoidan này chủ yếu được tạo thành bởi liên kết α-L-

fucose(13) với phần lớn nhóm sulfate gắn ở vị trí C-4 và một phần ở C-2 hoặc vị

trí C-2 là các điểm chẻ nhánh (hình 1.4) [91].

Năm 1999, cấu trúc fucoidan của 3 loài rong Cladosiphon Okamuranus

(Chordariales) [89], Chorda filum (Laminariales) và Ascophyllum nodosum

(Fucales) [34,41] đã được công bố. Cấu trúc fucoidan của rong Cladosiphon

[3)-α-L-Fucp (2SO3-)-(14)-α-L-Fucp (2,3SO3

-)-1]n

1 -O3SO

H

H

H

H

H

CH3

HO

3

1 -O3SO

H

H

H

H

H

CH3

4

OSO3-

Hình 1.3. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan tách và phân lập từ rong nâu A. nodusum.

Hình 1.4. Cấu trúc fucoidan có sulfat ở vị trí 4 và liên kết 3-O-linked của loài rong E.kurome

CH3

-O3SO

H

H

H

H

H

CH3

OH

-O3SO

H

H

H

H

H OH

12

okamuranus và Chorda filum được tạo thành bởi các gốc α-L-fucose(13) lặp lại

đều đặn, với một số nhóm sulfate ở vị trí C-2 (2-O-sulfateation) hoặc vị trí C-4 (4-

O-sulfateation) (hình 1.5). Sự xuất hiện của các nhóm O-acetyl và các mạch nhánh

trong phân tử fucoidan càng làm tăng thêm tính dị thể về cấu trúc của chúng.

Năm 2002, cấu trúc fucoidan trọng lượng phân tử cao được phân lập từ rong

Fucus evanescens đã được nghiên cứu bởi Bilan và cộng sự, kết quả họ đã phát hiện

thấy có sự tương đồng giữa cấu trúc fucoidan này với cấu trúc fucoidan của rong

A.nodosum [23]. Sau đó vào các năm 2004 và 2006, nhóm tác giả này tiếp tục công

bố thêm hai cấu trúc fucoidan từ rong Fucus distichus L và Fucus serratus được tạo

thành bởi các gốc 1→3)α-L-Fucp và 1→4)α-L-Fucp liên kết lặp lại một cách tuần

tự, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C-2 và C-2,4 (hình 1.6 và hình 1.7) [24,25].

Hình 1.5. Cấu trúc trung bình của fucoidan được phân lập từ rong Chorda filum [36]

CH3

R2O

H

H

H

H

H

CH3

R1O

R2O

H

H

H

H

H R3O

CH3

R2O

H

H

H

H

H

CH3

R1O

R2O

H

H

H

H

H R1O

H R2O

H

H

H

H

CH3

R1O

CH3

H R2O

H

H

H

H

R1O

OH

R1 = SO3- hoặc H hoặc

COCH3

R2 = SO3- hoặc H-

13

[3)--L-Fucp-(2,4 SO3-)-(14)--L-Fucp-(2SO3

-)-(1]n

Như vậy, mặc dù có mối liên hệ rõ ràng giữa các loài rong và cấu trúc

fucoidan, nhưng chưa đủ bằng chứng để thiết lập bất cứ mối tương quan hệ thống

giữa cấu trúc fucoidan với các Bộ rong (algal order). Hầu hết các công bố về cấu

trúc của fucoidan được phân lập từ các loài rong ở vùng ôn đới, thành phần hóa học

của các loại fucoidan này nhìn chung là đơn giản với chỉ một gốc đường fucose và

sulfate. Tuy nhiên, fucoidan của các loài rong ở vùng nhiệt đới thì thành phần hóa

học của chúng phức tạp hơn nhiều khi trong phân tử của chúng thường tồn tại đồng

thời nhiều gốc đường khác nhau điều đó gây ra rất nhiều khó khăn cho việc phân

tích cấu trúc của những loại fucoidan này. Đó cũng là lý do tại sao không có nhiều

công bố về cấu trúc của fucoidan rong biển ở vùng nhiệt đới, cho dù hoạt tính sinh

học của chúng vô cùng thú vị.

1.2.4. Các phương pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu

Một số quy trình khác nhau đã được sử dụng để chiết fucoidan. Mối bận tâm

chính trong quy trình tách chúng là nhiễu gây bởi các polysacarit khác như

Hình 1.6. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan được phân lập từ rong Nâu Fucus distichus L.

H

1

OSO3-

H H

CH3 HO

4

1

-O3SO

H

H H H H

CH3

3

OSO3-

2

2

3)--L-Fucp(2R1,4R2)-(14)--L-Fucp(2SO3-)-(1

Trong đó:

R1 = SO3-, R2 = H chiếm 50% và

R1 = H, R2 = -L-fucp-(14)--L-fucp(2SO3-)-(13)-L-fucp(2SO3

-)-(1 chiếm 50%

Hình 1.7. Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus.

14

laminaran và alginat. Những thử nghiệm chiết đầu tiên được tiến hành với dung môi

là nước.

Năm 1950, fucoidan từ rong Fucus vesiculosus và Fucus spiralis đã được

Percival và Ross chiết tách bằng nước sôi trong 24 giờ, sau đó loại bỏ alginate và

protein bằng Pb-acetate, tiếp theo fucoidan được kết tủa dưới dạng phức hydroxide

khi cho phản ứng với Ba(OH)2. Phức thu được, đem thủy phân trong dung dịch

H2SO4 loãng, fucoidan được tách ra và làm sạch bằng màng thẩm tách [103].

Năm 1952, Black đã khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian chiết và

tỷ lệ dung dịch chiết với rong nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi fucoidan. Kết quả

cho thấy điều kiện tối ưu để chiết fucoidan bao gồm khuấy huyền phù rong với

dung dịch HCl ở pH: 2,0-2,5 (tỷ lệ 1:10) tại 70oC trong 1h. Bằng cách xử lý này chỉ

1 lần chiết có thể phân lập được cỡ 50% fucoidan trong khi 3 lần chiết có thể tách ra

được hơn 80% fucoidan. Fucoidan còn có thể được chiết bằng đun nóng một phần

rong khô với 10 phần H2O tại 100oC trong 3-7,5h, bằng cách này có thể thu được

55-60% fucoidan. Khi tăng tỉ lệ H2O : rong, thời gian chiết hoặc số lần chiết có thể

tăng được hiệu suất chiết. Theo tác giả chiết nước đôi khi không thích hợp do khó

tách cặn rong khỏi dung dịch nước. Fucoidan thô được tách khỏi dịch chiết axít

bằng trung hòa và cho bay hơi đến khô, hòa tan lại trong nước và kết tủa thu các

phân đoạn fucoidan với cồn ở nồng độ 30% và 60% (v/v). Phân đoạn 60%, fucoidan

thô có chứa 30-36% fucose. Có thể tách được fucoidan với hàm lượng fucose lớn

hơn 40% từ sản phẩm thô bằng cách xử lý rong nguyên liệu với formaldehyde [29].

Những nỗ lực đầu tiên nhằm đưa ra một phương pháp chiết fucoidan có hệ

thống đã được thực hiện bởi Mian và Percival [84]. Họ đã tiến hành chiết tuần tự,

đầu tiên là xử lý rong nguyên liệu với formaldehyde, tiếp theo xử lý với cồn ở nồng

độ 80% để loại bỏ mannitol, các hợp chất màu và các sản phẩm khối lượng phân tử

thấp, sau đó rong được chiết bằng cách khuấy trộn với dung dịch CaCl2 2% (ở nhiệt

độ phòng và 70oC) để phân lập laminaran và fucoidan (alginate được cố định dưới

dạng muối Ca-alginat không tan). Fucoidan được chiết tiếp với dung dịch HCl

loãng (pH: 2). Sau cùng bã rong được chiết với 3% Na2CO3 để thu lại alginate dưới

dạng muối tan Na-alginat. Hai dung môi bổ sung cuối cùng nhằm chiết ra thêm các

15

phân đoạn fucoidan. Quy trình chiết tuần tự phức tạp này hầu như không được sử

dụng về sau, nhưng đã trở thành cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.

Các tách giả Zvyagintseva và Duarte [48,143] đã sử dụng các phương pháp

chiết fucoidan đơn giản nhưng lại áp dụng các bước làm sạch phức tạp tốn nhiều

công sức.

Fucoidan từ rong Adenocystis utricularis đã được phân lập bởi Ponce và

cộng sự [96] như sau: đầu tiên rong được xử lý với cồn 80%. Sau đó để thu nhận

fucoidan, rong được chiết riêng biệt với ba dung môi khác nhau thường được sử

dụng để thu nhận fucoidan là nước cất, dung dịch CaCl2 2% và dung dịch HCl

loãng (pH: 2). Trong cả 3 trường hợp việc chiết được thực hiện ở nhiệt độ phòng và

sau đó ở 70oC. Hiệu suất chiết và đặc tính của các sản phẩm thu được trong ba

trường hợp là tương tự nhau với chỉ một số ít khác biệt. Các dung dịch chiết ở nhiệt

độ phòng cho ra sản phẩm fucoidan giàu L-fucose, D-galactose và ester sulfate

được gọi đặt tên là “galactofucan”, thể hiện đặc tính ức chế chống lại herpes

simplex virus 1 và 2 nhưng không gây độc tế bào. Sản phẩm khác là thành phần

chính của dịch chiết thu được ở 70oC, bao gồm chủ yếu là fucose cùng với các

monosacarit khác (phần lớn là Man, nhưng đồng thời có cả Glc, Xyl, Rha, Gal), một

lượng đáng kể axít uronic và lượng nhỏ sulfate ester, được gọi chung là

“uronofucoidan”, không thể hiện hoạt tính kháng virus, nhưng lại thể hiện hoạt tính

gây độc tế bào.

Như vậy có thể thấy phương pháp chiết có ảnh hưởng rất lớn đến thành phần,

cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của fucoidan. Hiện nay vẫn chưa có phương

pháp chuẩn áp dụng để chiết tách fucoidan từ các loài rong khác nhau. Hầu hết các

phương pháp chiết fucoidan hiện nay đều hướng đến mục tiêu bảo toàn cấu trúc tự

nhiên vốn có của fucoidan, đồng thời hạn chế tối đa sự nhiễm tạp của các thành

phần không mong muốn.

1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan

a. Hoạt tính kháng đông tụ máu và kháng huyết khối

Fucoidan có phổ hoạt tính sinh học rộng và đa dạng, nhưng hoạt tính chống

đông máu của chúng được nghiên cứu sớm nhất. Nishino và cộng sự, đã thử nghiệm

16

hoạt tính chống đông máu của fucoidan được phân lập từ các loài rong E. Kurome,

H.fusiforme, L.angustata var. longissima kết quả cho thấy chúng có hoạt tính kháng

đông tụ máu cao hơn so với Heparin [92]. Hàm lượng sulfate có ảnh hưởng lớn đến

hoạt tính kháng đông tụ máu của fucoidan từ một số loài rong (E.kurome,

H.fusiforme, vv…), hàm lượng sulfate càng cao thì hoạt tính kháng đông tụ càng

lớn [31,38,70,91,93,108]. Vị trí của các nhóm sulfate trên các gốc đường cũng rất

quan trọng với hoạt tính kháng đông tụ của fucoidan. Theo các nghiên cứu

[34,35,48,118,137] fucoidan sulfate hóa ở vị trí C-2 hoặc C-2, C-3 thể hiện hoạt

tính kháng đông tụ, trong khi đó nhóm sulfate ở vị trí C-4 không thể hiện hoạt tính

này.

Trọng lượng phân tử fucoidan cũng có ảnh hưởng lên hoạt tính kháng đông

tụ máu của chúng. Fucoidan tự nhiên từ Lessonia vadosa (Phaeophyta) có khối

lượng phân tử (320.000 Da MW) cho thấy hoạt tính chống đông máu tốt hơn các

fucoidan đề polymer hóa có khối lượng phân tử (32.000 MW) [31,35].

Một số nghiên cứu khác cho thấy thành phần đường (fucose, galactose, v.v)

của fucoidan có ảnh hưởng đến hoạt tính chống đông máu [44,95,104,105,106].

Thành phần axít uronic không ảnh hưởng trực tiếp lên hoạt tính chống đông máu,

nhưng nó gián tiếp làm tăng hoạt tính chống đông máu của fucoidan thông qua việc

làm cho chuỗi đường trở nên linh động hơn [70].

Hoạt tính chống huyết khối của fucoidan cũng đã được thử nghiệm in vivo

theo mô hình ngẽn tĩnh mạch và động mạch ở động vật thí nghiệm [87]. Sulfate

galactofucan được phân lập từ rong Spatoglossum schroederi không thể hiện hoạt

tính chống đông máu trên một số thử nghiệm in vitro. Tuy nhiên, nó lại thể hiện

hoạt tính kháng huyết khối mạnh khi thực hiện thí nghiệm in vivo, điều này có thể

được giải thích do ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hoạt tính kháng huyết khối

của fucoidan [110].

Như vậy có thể thấy rằng fucoidan có tiềm năng rất lớn để sử dụng làm thuốc

chống đông máu, thuốc chống huyết khối hoặc thực phẩm chức năng và dược liệu

mà hầu như không có tác dụng phụ [33,70,87].

17

b. Hoạt tính chống virus

Trong những năm gần đây, các thử nghiệm về hoạt tính kháng virus của

fucoidan đã được thực hiện bằng cả “in vitro” và “in vivo” yếu tố gây độc tế bào

thấp của chúng so với các thuốc kháng virus khác đang được quan tâm xem xét sử

dụng trong y học lâm sàng. Fucoidan từ các loài rong Laminaria japonica [75],

Adenocytis utricularis [107], Undaria pinnatifida (Mekabu) [68], Stoechospermum

marginatum [13], Undaria pinnatifida [55], Cystoseira indica [79] và Undaria

pinnatifida [54] cho thấy hoạt tính kháng virus HSV-1 và HSV-2 mà không gây độc

cho tế bào Vero [79]. Hơn nữa, fucoidan còn cho thấy hoạt tính ức chế chống lại sự

tái tạo nhiều loại virus màng bao gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch của người và

cytomegalovirus [107]. Hoạt tính antiprion và kìm hãm sự khởi phát bệnh khi bị

nhiễm trùng prion đường ruột của fucoidan đã được công bố bởi Doh-ura và cộng

sự [46].

c. Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch

Hoạt tính kháng u của nhiều polysacarit đã được công bố trong những năm

gần đây. Fucoidan từ rong Eisenia bicyclics và Laminaria japonica có tác dụng

chống u báng 180 [115,119,127]. Fucoidan được phát hiện có khả năng ức chế sự

tăng sinh và gây chết tế bào trong dòng tế bào u lympho HS-Sultan của người [14].

Fucoidan từ các loài rong L. saccharina, L. digitata, F. serratus, F. distichus và F.

vesiculosus có tác dụng khóa chặt tế bào ung thư vú MDA-MB-231 ngăn kết dính

với các tiểu cầu, tác dụng này có ý nghĩa quan trọng trong quá trình di căn khối u

[38, 52, 82].

Khả năng phục hồi các chức năng miễn dịch của fucoidan từ rong

L. japonica đã được thử nghiệm in vivo [131]. Fucoidan giúp thúc đẩy sự phục hồi

chức năng miễn dịch trên các con chuột bị chiếu xạ [133,134]. Fucoidan có thể làm

tăng khả năng sản xuất interleukin-1 (IL-1) và interferon-γ (IFN-γ) trong các thử

nghiệm in vitro, tăng cường các chức năng của tế bào lympho T, tế bào B, đại thực

bào, tế bào giết tự nhiên (NK tế bào) và thúc đẩy các kháng thể chính phản ứng lại

với tế bào hồng cầu máu cừu (SRBC) trong thí nghiệm in vivo [136]. Fucoidan

trọng lượng phân tử cao được điều chế từ Okinawa Mozuku (Cladosiphon

18

okamuranus) thúc đẩy sự gia tăng tỷ lệ gây độc tế bào T ở chuột [117]. Fucoidan từ

rong F.vesiculosus có các tác dụng lên sự trưởng thành và điều hòa miễn dịch trên

các tế bào tua (DCs), đây là các tế bào có kháng nguyên mạnh mẽ, thông qua con

đường liên quan ít nhất đến yếu tố nhân tế bào (Nuclear factor - κB (NF- κB)) [65].

d. Hoạt tính chống oxy hóa

Rất nhiều công bố cho thấy rằng fucoidan thể hiện hoạt tính chống oxy hóa

quan trọng trong các thí nghiệm in vitro. Nó là một chất chống oxy hóa tự nhiên

tuyệt vời để ngăn ngừa các bệnh gây ra bởi các gốc tự do [139]. Tác dụng ức chế sự

hình thành các gốc tự do hydroxyl và gốc peoxit của fucoidan (homofucan) từ

F.vesiculosus và fucan (heterofucans) từ Padina gymnospora đã được nghiên cứu

bởi Micheline và cộng sự, kết quả cho thấy fucan có hoạt tính chống oxy hóa thấp

so với fucoidan [85].

Hoạt tính chống oxy hóa liên quan đến trọng lượng phân tử và hàm lượng

sulfate của fucoidan [23]. Các phân đoạn fucoidan từ L. japonica có khả năng làm

mất gốc peoxit và axít hypochlorous tuyệt vời [140]. Cả khối lượng phân tử và hàm

lượng sulfate của fucoidan đều đóng vai trò rất quan trọng trong việc tác động lên

các gốc azo 2-2'-Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) gây ra quá

trình oxy hóa LDL [76].

e. Giảm lipid máu

Fucoidan là hợp chất có hoạt tính tương tự như axít sialic, nó có thể làm

tăng các điện tích âm của bề mặt tế bào đến mức có hiệu lực với sự tích tụ của

cholesterol trong máu, kết quả làm giảm lượng cholesterol trong huyết thanh. Các

nghiên cứu [73,74,77,130] cho thấy fucoidan từ rong L. japonica giảm đáng kể

cholesterol toàn phần, triglyceride và LDL-C mà không có tác dụng phụ gây tổn hại

cho gan và thận. Hoạt tính giảm lipid máu của fucoidan phụ thuộc vào trọng lượng

phân tử của chúng, trọng lượng phân tử càng thấp thì hoạt tính càng cao [51].

f. Chống viêm

Năm 2007, Cumashi và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống viêm của

fucoidan thu nhận được từ chín loài rong nâu. Kết quả cho thấy tất cả fucoidan của

9 loài rong đều có khả năng ức chế sự tăng số lượng bạch cầu trên mô hình chuột bị

19

viêm, hiệu quả chống viêm của fucoidan trong mô hình này không bị ảnh hưởng

nhiều bởi hàm lượng của gốc fucose và sulfate cũng như các đặc tính cấu trúc khác

của bộ khung mạch polysacarit của chúng [38]. Ngoài ra hoạt tính kháng viêm của

fucoidan cũng đã được nghiên cứu bởi các tác giả [82,135].

g. Bảo vệ dạ dày

Fucoidan từ Cladosiphon okamuranus tokida là một chất an toàn với khả

năng bảo vệ dạ dày [116]. Fucoidan như là một tác nhân chống viêm loét và ức chế

kết dính với vi khuẩn Helicobacter pyroli (một loại vi khuẩn gây viêm loét dạ dày)

[59]. Fucoidan từ rong Cladosiphon okamuranus có khả năng ức chế sự tăng trưởng

của tế bào ung thư dạ dày nhưng không cho thấy bất kỳ ảnh hưởng nào lên tế bào

bình thường [62].

h. Chống lại bệnh về gan

Fucoidan ngăn chặn tổn thương gan gây ra bởi concanavalin A bằng việc

gián tiếp sinh ra interleukin (IL)-10 nội sinh và ức chế yếu tố tiền viêm

(proinflammatory cytokine) ở chuột [113]. Một số nghiên cứu [54,63,64] thấy cho

fucoidan có thể là một chất chống xơ rất tốt năng nhờ sở hữu chức năng kép, cụ thể

là: bảo vệ tế bào gan và ức chế sự tăng sinh tế bào gan hình sao.

i. Các ứng dụng của fucoidan

Những nghiên cứu trong suốt thập niên vừa qua đã đưa ra số lượng lớn bằng

chứng khoa học về những lợi ích sức khỏe của fucoidan, một loại polysacarit sulfat

hóa giàu fucose từ rong nâu. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của fucoidan chiết

xuất từ rong nâu đã mở ra những cơ hội tiềm năng cho ngành công nghiệp dược

phẩm, thực phẩm dinh dưỡng, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng. Hiện nay, trên thị

trường đã xuất hiện nhiều loại fucoidan với thành phần, tác dụng và nhãn mác khác

nhau như: LCR fucoidan của Larson Century Ranch, INC, Mỹ có tác dụng điều trị

các bệnh ung thư vú, ruột kết, buồng trứng, cũng như tác dụng chống dị ứng, chống

lão hóa, chống đái tháo đường, giảm cholesterol, loét dạ dày,… Fucoidan Tongan

Limu Moui của công ty AHD International, LLC, Mỹ có tác dụng trị tim mạch,

chống lão hóa, tăng cường miễn dịch, … U-Fucoidan sản phẩm của tập đoàn

Pharmaceutical Grade Nutritional & Dietary Anti-aging Supplements, Mỹ gây ra

20

sự giáng hóa các tế bào ung thư,… Fucoidan của tập đoàn Qingdao Yijia Huayi

Import & Export Co.,Ltd., Trung Quốc được sử dụng để phục hồi khả năng kháng

ung thư, sản phẩm thuốc kháng virut, điều trị ung thư và tim mạch,… [5]. Sản phẩm

Best fucoidan 70% của công ty Doctor’best INC., Mỹ có tác dụng hỗ trợ điều trị

ung thư, ngăn ngừa lão hóa, tăng cường hệ miễn dịch,…[57].

Ở nước ta hiện nay, các sản phẩm fucoidan từ rong nâu Việt Nam đã xuất

hiện trên thị trường dưới dạng thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư và

viêm loét dạ dày do Công ty Cổ phần Fucoidan Việt Nam sản xuất là: FucoUmi,

FucoAntiK và Fucogastro. Ngoài ra, fucoidan cũng được sử dụng như một thành

phần chức năng trong sản phẩm sữa chua fucoidan và nước yến fucoidan của Công

ty Sannet Khánh Hòa.

Như vậy có thể thấy, fucoidan với rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị cũng

như tiềm năng ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống đang

ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu mạnh mẽ của các nhà khoa học trên toàn

thế giới.

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN

Việc phân tích cấu trúc của các polysacarit nói chung và fucoidan nói riêng

là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc đường. Cấu

trúc của fucoidan chiết từ rong biển thường hết sức phức tạp, bao gồm nhiều vấn đề

như thành phần các đường đơn, các dạng đồng phân của đường, mức độ phân nhánh

và polyme hóa của chúng. Vì vậy, để xác định được cấu trúc của fucoidan cần phải

phân tích, xác định được các thông số sau:

- Thành phần các gốc đường và hàm lượng sulfate

- Vị trí nhóm sulfate trong các gốc đường

- Vị trí liên kết giữa các gốc đường

- Trật tự sắp xếp của các gốc đường

1.3.1 Phương pháp phân tích thành phần đường

Phân tích thành phần các đường đơn của fucoidan là bước quan trọng đầu

tiên trong nghiên cứu cấu trúc của fucoidan. Quy trình chung để xác định các đường

đơn là thủy phân fucoidan thành các monosacarit (hình 1.8) và sau đó phân tích

21

thành phần của từng monosacarit bằng phương pháp sắc ký. Hai phương pháp sắc

ký phổ biến nhất được sử dụng để phân tích thành phần các đường đơn là phân tích

trực tiếp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phân tích gián tiếp thông qua

các dẫn xuất acetyl hóa của chúng bằng sắc ký khí (GC): Fucoidan được thủy phân

→ Khử → Acetyl hóa → Sắc ký [12].

Hình 1.8. Quy trình phân tích thành phần đường đơn của fucoidan

1.3.2 Phương pháp phân tích liên kết

Xác định vị trí của các liên kết trong polysacarit (fucoidan) chủ yếu được

thực hiện bằng phương pháp metyl hóa [44]. Nguyên tắc của phương pháp dựa vào

xác định dạng và số lượng dẫn xuất metyl eter của các đại lượng đường sau khi

metyl hóa các nhóm hydroxy tự do trong chúng [44], phản ứng này luôn thực hiện

trong dung môi DMSO. Ví dụ: nếu sản phẩm thủy phân sau khi metyl hóa là dạng

2,3,6 tri-O-methyl α-D-glucopyranose (hình 1.9) có nghĩa là các gốc glucose liên

kết với nhau qua liên kết (1→4) [12].

22

Hình 1.9. Quy trình methyl hóa phân tích liên kết glycoside trong polysacarit

1.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)

Dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trưng của nhóm sulfate trong phổ hồng ngoại

mà ta có thể xác định được vị trí liên kết của nhóm sulfate trong các gốc đường ở vị

trí axial hay equatorial (bảng 1.3) [12]. Với axial ta chỉ có một vị trí là C4, còn với

23

equatorial có hai vị trí là C2 và C3, do vậy cần phải dựa vào phổ NMR để xác định

các vị trí này.

Bảng 1.3. Các đỉnh phổ đặc trưng của fucoidan trên phổ hồng ngoại

Đỉnh Dao động

775 Dao động dãn vòng của - anome

802-810 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí C6

822 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí

equatorial

845 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí axial

847 Dao động của liên kết C1-H của -anome

893 Dao động của liên kết C1-H của anomer

917 Dao động vòng của -anome

1030-1167 Dao động hoá trị của hemiacetal

1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C

1255-1264 Dao động hoá trị của S=O

1420 Dao động hoá trị đối xứng của COO

1430 Dao dộng gấp của C-H

1730 Dao động hoá trị của C=O

3300-3440 Dao động hoá trị của O-H

1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton, tất cả proton của carbohydrate

(bao gồm cả mono-, oligo- và polysacarit-) có độ dịch chuyển hóa học nằm trong

khoảng từ 1-6 ppm. Các proton anomeric của mỗi monosacarit có độ dịch chuyển

hóa học phụ thuộc vào cấu dạng α- hoặc β- của chúng. Ví dụ, hầu hết các proton của

α-anomeric xuất hiện trong vùng từ 5-6 ppm, trong khi đó các proton β-anomeric

xuất hiện ở vùng 4-5 ppm.

24

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton được coi như một phương pháp đặc

trưng để nhận biết fucoidan dựa vào nhóm methyl ở vị trí C6 với tín hiệu từ 1,2

đến 1,4 ppm là vùng là vùng đặc trưng H-6 của nhóm methyl, các tín hiệu có độ

dịch chuyển hóa học từ 5,0 đến 5,5ppm là vùng của H-1 (H-) của fucoidan.

Mặc dù phổ 13C-NMR có tín hiệu yếu hơn nhiều, nhưng lại có nhiều thuận

lợi hơn phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc của polysacarit do các tín hiệu trong

phổ 13C-NMR có độ dịch chuyển hóa học rộng hơn (0-220 ppm) so với phổ 1H-

NMR. Vì vùng giá trị lớn nên các tín hiệu ít chồng lấp lên nhau như trong phổ

proton NMR. Các tín hiệu của C-anomeric trong phổ 13C-NMR thường xuất hiện

trong vùng từ 90-100 ppm, trong khi đó các tín hiệu của C-nonanomeric xuất hiện

trong vùng từ 60-85 ppm. Với fucoidan thì vùng tín hiệu đặc trưng để nhận biết

trong phổ 13C-NMR là vùng trường cao từ 15-20 ppm thuộc về nhóm methyl (C-6)

của vòng α-L-fucopyranose. Các tín hiệu của cacbon α-anomeric thường xuất hiện

trong vùng từ 95-103 ppm, trong khi cacbon của β-anomeric xuất hiện trong vùng

từ 101-105 ppm. Với nguyên tử cacbon carboxyl của axít uronic các tín hiệu sẽ

xuất hiện ở vùng trường thấp hơn từ 170-180 ppm (hình 1.10). Các tín hiệu của

nguyên tử cacbon có gắn với nhóm -OH, như C-6 của vòng pyranose và C-5 của

vòng furanose xuất hiện trong vùng trường cao hơn từ 60-64 ppm, trong khi các tín

Hình 1.10. Độ dịch chuyển hóa học trong phổ NMR của polysacarit

25

hiệu của các nguyên tử cacbon với nhóm hydroxyl thứ cấp (C2,3,4 trong vòng

pyranose và C2,3 trong vòng furanose) xuất hiện trong vùng 65-87 ppm.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 13C và 1H của polysacarit thường có

độ phân giải thấp, các tín hiệu trùng lấp nhau khi trong phân tử của chúng có chứa

nhiều gốc đường tương tự nhau. Điều này gây ra rất nhiều khó khăn trong việc giải

thích chi tiết cấu trúc của polysacarit. Khi đó, phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

sẽ giúp xác định thêm những thông tin về các liên kết trong phân tử, thông qua các

tương tác giữa proton với proton và giữa proton với cacbon. Phổ 1H, 1H-COSY

(Correlation spectroscopy) biểu diễn mối tương quan giữa 1H và 1H của hạt nhân

cùng loại, phổ 1H, 13C-COSY (hay cũng được gọi là phổ HMQC (Heteronuclear

Multiple Quantum Correlation) hay HECTOR (Heteronuclear Correlated

Spectroscopy)) biểu diễn mối tương quan giữa 1H và 13C của các hạt nhân khác loại.

Phổ hai chiều 2D-NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) thể hiện sự

tương tác về mặt không gian của các proton nằm trên các nguyên tử cacbon ở cách

xa nhau nhưng khoảng cách không gian giữa chúng nhỏ hơn 4Å. Phổ 2D-HMBC

(Hecteronuclear Multiple Bond Coherence) thể hiện mối tương quan của tín hiệu 1H

ở một nguyên tử 13C với tín hiệu của nguyên tử 13C khác cách xa nó 2 hoặc 3 liên

kết, ngược lại phổ 13C-1H HMQC hay HETCOR thể hiện mối tương tác của 1H với

13C liên kết trực tiếp với nhau. Phổ 2D-TOCSY (Totally Correlated Spectroscopy)

là phổ tương quan toàn phần biểu diễn sự tương quan của các proton liên kết và

không liên kết trực tiếp nhưng trong cùng một hệ spin giống nhau. Ví dụ: tất cả

proton của một gốc đường là thuộc cùng một hệ spin giống nhau. Tóm lại, phổ cộng

hưởng từ hạt nhân hai chiều sẽ cho ta thêm những thông tin để xác định trình tự và

vị trí của các liên kết trong phân tử polysacarit thông qua các tương tác giữa proton

với proton và proton với cacbon trong các liên kết trực tiếp đồng hạt nhân hoặc các

liên kết dị hạt nhân không trực tiếp.

Như vậy, có thể thấy việc phân tích cấu trúc của các polysacarit là rất khó

khăn, nhưng với polysacarit sulfate hóa từ rong biển còn khó khăn hơn rất nhiều do

chúng có cấu trúc rất phức tạp, có mạch nhánh và chuỗi liên kết có mức độ lặp lại

không cao nên việc phân tích cấu trúc chỉ dựa vào phổ 1H-NMR và 13C-NMR là

26

không đủ và đôi khi không mang lại hiệu quả. Để phân tích cấu trúc các polysacarit

phức tạp này các tác giả [5,12,23,24,34,48] thường kết hợp các phương pháp hóa

học như chiết phân đoạn hoặc tách phân đoạn dựa vào sắc ký trao đổi ion, sau đó

làm đơn giản hóa cấu trúc bằng các phản ứng đề sulfate hóa, metyl hóa, đề acetyl

hóa, tiếp theo kết hợp các phương pháp phổ NMR, đôi khi cả phương pháp khối phổ

(MS) để phân tích cấu trúc.

1.3.5 Phương pháp phổ khối lượng (MS)

Phổ khối là kỹ thuật phân tích dựa trên việc xác định số khối của các phân tử

hoặc các mảnh phân tử mang điện tích. Nó là một trong những phương pháp quan

trọng trong phân tích cấu trúc của các polysacarit. Việc ứng dụng các phương pháp

phân tích khối phổ hiện đại trong phân tích cấu trúc của hợp chất carbohydrate phức

tạp đã dẫn đến những tiến bộ nhanh chóng trong lĩnh vực khoa học sự sống suốt hai

thập kỷ qua của thế kỷ 21. Các kỹ thuật ion hóa truyền thống như: ion hóa bằng va

chạm điện tử, ion hóa hóa học,… là những kỹ thuật ion hóa chỉ sử dụng được cho

các hợp chất dễ bay hơi. Các kỹ thuật ion hóa mới như: bắn phá nguyên tử nhanh

(fast atom bombardment-FAB), ion hóa phun mù điện tử (electrospray ionization-

ESI) và gần đây là kỹ thuật ion hóa phản hập thụ laser được hỗ trợ bởi chất nền

(matrix-assisted laser desorption ionization-MALDI) đã được phát triển để ứng

dụng phân tích cấu trúc của các hợp chất không bay hơi như các oligosacarit, các

hợp chất polysacarit trọng lượng phân tử nhỏ, protein, glycoprotein và các

glycolipid. Các kỹ thuật ion hóa mới có khả năng ứng dụng phân tích được nhiều

hợp chất hơn với độ nhạy và độ chính xác khối cao hơn các kỹ thuật ion hóa truyền

thống. Hiện nay, cấu trúc của nhiều hợp chất polymer sinh học phức tạp đã được

phân tích thành công nhờ ứng dụng các kỹ thuật phân tích khối phổ hiện đại này

[17-20,32,42,53,60,86,124,138,141].

a. Kỹ thuật ESI (ElectroSpray Ionization - ion hóa phun mù điện tử): trong

kỹ thuật phun mù điện tử, dung dịch có chứa phân tử mẫu được phun ra khỏi đầu

của mao quản mảnh vào buồng nhiệt ở áp suất giảm (gần bằng áp suất khí quyển).

Mao quản mà dung dịch mẫu đi qua có điện thế cao dọc theo bề mặt của nó và

những giọt nhỏ tích điện được tách ra, đi vào buồng ion hóa. Các giọt tích điện nhập

27

với dòng khí khô (thường là khí nitơ), làm bay hơi các phân tử dung môi ra khỏi

giọt mẫu. Do vậy, mật độ điện tích của mỗi giọt tăng lên cho đến khi lực đẩy tĩnh

điện trội hơn sức căng bề mặt (giới hạn Rayleigh), làm cho các giọt mẫu bị vỡ ra

thành các giọt nhỏ hơn. Quá trình này tiếp tục cho đến khi các ion mẫu không còn

dung môi ở lại trong pha khí.

b. MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization): Kỹ thuật MALDI sử

dụng các chất nền hỗ trợ để ion hóa mẫu dưới tác dụng của năng lượng laser lớn.

Trong kỹ thuật này, mẫu cần phân tích được hòa tan hay phân tán trong một chất

nền (mạng lưới) được đặt trên đường đi của chùm photon có cường độ cao. Hầu hết

các máy MALDI đều sử dụng nguồn laser nitơ phát xạ ở 337 nm, có một số ứng

dụng sử dụng nguồn laser hồng ngoại (laser IR) để phân tích trực tiếp các mẫu chứa

trong gel hay trong bản sắc ký lớp mỏng. Sự va chạm của các photon với mẫu sẽ ion

hóa một vài phân tử mẫu và tách chúng ra khỏi bề mặt với chất nền (mạng lưới-

matrix). Các ion bị tách ra sau đó được tăng tốc về phía bộ phận phân tích khối

lượng (hình 1.11). Các hợp chất nền được sử dụng trong MALDI được chọn để sao

cho chúng có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại từ xung laser nitơ (337 nm). Các

hợp chất của axít nicotinic, picolinic, 2,5-Dihydroxybenzoic,… thường được sử

dụng làm chất nền. Chất nền hấp thu phần lớn năng lượng từ xung laser, do vậy cho

phép tạo ra các ion mẫu nguyên vẹn được tách ra khỏi mạng lưới chất nền. Phép đo

phổ MALDI-MS dùng để phân tích một khoảng rộng trọng lượng phân tử, từ

polymer với trọng lượng phân tử vài ngàn dalton (Da) cho tới các oligosacarit,

oligonucleotit và polypeptit, kháng thể và các protein nhỏ với trọng lượng phân tử

vào khoảng 300.000 Da. Hơn nữa, kỹ thuật MALDI đòi hỏi chỉ vài femtomol mẫu

chất (1.10-15 mol).

Hình 1.11. Nguyên lý hoạt động của phổ khối MALDI-MS

28

Cho đến nay một số cấu trúc của oligo-fucoidan đã được xác định bằng

phương pháp khối phổ [5,17-20,141]. Với những đoạn mạch ngắn, có thành phần

monosacarit và nhóm sulfate đã biết thì việc xác định trật tự liên kết giữa các gốc

đường, số nhóm sulfate trên mỗi gốc đường hầu như có thể giải quyết được bằng

phương pháp khối phổ. Trong phương pháp khối phổ người ta thường sử dụng hai

chế độ đo khác nhau cho mục đích phân tích cấu trúc của polysacarit là chế độ ion

dương (Positive mode) và chế độ ion âm (Negative mode). Với chế độ ion dương

mức năng lượng chủ yếu đủ để cắt đứt các liên kết đường và hạn chế không phá vỡ

nó thành các mảnh nhỏ hơn, chế độ đo này được sử dụng để xác định thành phần và

trật tự các liên kết đường [61]. Trong khi đó chế độ ion âm với mức năng lượng lớn

hơn để phá vỡ các vòng đường, được sử dụng để xác định vị trí nhóm sulfate trên

các gốc đường. Cơ chế phân mảnh carbohydrate và hệ thống danh pháp các ion

mảnh được đề xuất bởi Domon và Costello (hình 1.12) [47].

Hình 1.12. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate

* Cơ chế phân mảnh trong khối phổ:

Các ion mảnh có chứa đầu cuối không khử được miêu tả bởi các chữ cái

viết hoa đầu tiên trong hệ thống bảng chữ cái alphabet (A, B, C,…).

Các ion mảnh có chứa đầu cuối khử của oligosacarit hoặc aglycon được

miêu tả bởi các chữ cái từ cuối bảng hệ thống chữ cái alphabet (X, Y, Z,…).

ROOOH

OH

OH

CH2OH

O

O

OH

OH

CH2OH

O

O

OH

OH

CH2OH

Y2 Z21.5X1 Y1 Z1 Z0Y0

0.2A1 B1 C12.4A2

2.5A3B2 C2 B3 C3

Đầu khử

Đầu không khử

29

Các ion dạng A và X được sinh ra bởi sự phân mảnh cắt ngang vòng

đường và ký hiệu phía trên bên trái của ion được quy định theo số mỗi liên kết vòng

và được tính theo chiều kim đồng hồ như được miêu tả trên hình 1.12.

Các ion được sinh ra từ sự phân cắt lần lượt các gốc đường được ký hiệu là

Am, Bm, Cm với m = 1 tính từ phía đầu không khử và Xn, Yn, Zn với n = 1 được tính

từ phía đầu khử.

Y0 và Z0 được quy ước cho sự phân mảnh của liên kết được liên kết với

aglycone.

* Các đặc trưng phân mảnh: Theo hệ thống danh pháp, quy tắc sau đây được

áp dụng chung cho sự phân mảnh của các oligosacarit:

Ở sự phân cắt liên kết glycoside sinh ra các ion Bn, Cn, Yn, Zn dễ xảy ra ở

mức năng lượng thấp và đây là sự phân mảnh phổ biến nhất, chúng biểu lộ chi tiết

về trình tự và sự phân nhánh của các hợp phần monosacarit.

Sự phân cắt ngang vòng đường thường xảy ra bởi sự va chạm ở mức năng

lượng cao hơn. Sự phân mảnh này mang đến những thông tin về kiểu liên kết.

Các dẫn xuất có mang nhóm methyl tạo ra phổ mang nhiều thông tin nhất,

sự phân tách cũng đặc trưng hơn và các tín hiệu cũng phong phú hơn. Thêm nữa,

mức độ bẻ gẫy liên kết phức tạp trong trường hợp này là thấp. Các oligosacarit có

chứa nhóm methyl có thể tăng độ nhạy lên gấp 10 lần. Các ion thường được quan

sát thấy ở dạng [M+Na]+

Việc phân tích các carbohydrate không được chuyển hóa cho ra kết quả

phổ phức tạp hơn, trường hợp này được thực hiện khi khối lượng mẫu bị hạn chế.

Các gốc đường chứa nhóm sulfate thường bị cắt đến monomer trước khi

vòng đường bị phá vỡ. Theo Tissot và cộng sự, vị trí nhóm sulfate có ảnh hưởng

đến sự phân mảnh cắt ngang vòng đường. Tùy theo vị trí các gốc sulfate trong vòng

đường chiếm vị trí C-2, C-3 hoặc C-4 sẽ xuất hiện một số mảnh đặc trưng tương

ứng. Cơ chế phân mảnh các gốc đường xảy ra như trình bày trên hình 1.13. Các

mảnh đặc trưng được sinh ra do sự phân mảnh cắt vòng fucose sulfate được thể hiện

trong bảng 1.4 [124].

30

Bảng 1.4. Các mảnh đặc trưng cho các sulfate fucose có nhóm sulfate

ở các vị trí khác nhau trong phổ khối dạng ion âm

Vị trí sulfate

0,2A 0,3A 0,4A 0,2X 0,3X 0,4X

2-O- 103 73 43 139 169 199

3-O- 183 73 43 59 169 199

4-O- 183 153 43 59 89 199

n,mA, n,mX: cắt theo liên kết n,m của vòng đường như hình 1.13

● Trong trường hợp có mặt của ion kim loại, các oligosacarit sẽ phân mảnh

theo các cơ chế sau (hình 1.14) [60].

HO

O

OSO3OH

OH

CH3

H

OH

O

OSO3

O

OH

CH3

OH

O

OH

CH3

H O

OSO-3

O

OO

-H

O

OH

OO

OH

CH3

S

O

OH

O

OH

CH3

HSO-4

O

OH

OHOH

O3SO

CH3

H

OH

O

OH

O

O3SO

CH3

OH

O

O3SO

CH3

H O

OH

Hình 1.13. Sơ đồ phân mảnh của fucose sulfate

0,2X m/z 139

m/z 183

m/z 97

31

c. Các phương pháp phân tích khối

Vai trò của bộ phận phân tích khối là phân tách hỗn hợp ion sinh ra bởi bộ

phận ion hóa thành từng loại riêng biệt theo số khối m/z để đưa các ion này đến

detector. Có 05 kỹ thuật phân tích khối chính là: Tứ cực (Quadrupol-Q), Bẫy ion

(Ion Trap-IT), Thời gian bay (Time of Flight-TOF), Cung từ (Magnetic Sector),

Cộng hưởng bằng gia tốc ion biến đổi Fourie (Fourier Transform Ion Cyclotron

Resonance-FT-ICR). Trong đó hai phương pháp phân tích khối chủ yếu được sử

dụng trong phân tích cấu trúc của polymer và các hợp chất có khối lượng phân tử

lớn là IT và TOF

* Phương pháp bẫy ion (Ion trap):

Hệ phân tích khối gồm 3 điện cực: điện cực xuyến và hai điện cực đáy có

biên dạng hyperbol. Điện cực ở giữa là điện cực xuyến được đặt điện áp dao động

chính là 730 Hz dùng để tạo hố thế 2 chiều để ion đi vào và chuyển động ở tâm của

Trap. Hai điện cực đáy có tần số bổ sung có tác dụng cô lập ion, phân rã ion bằng

va chạm (CID) và phóng ion theo cộng hưởng phi tuyến. Khí He được đưa vào bên

trong Trap có tác dụng đệm cho chuyển động của ion trong quá trình bẫy ion, CID

và phân giải khối. Ion Trap có khả năng tích lũy các ion, phân tích khối, phân lập

ion và phân rã ion bằng va chạm do vậy đây là phương tiện rất thuận lợi cho việc

nghiên cứu cơ chế phân mảnh.

Hình 1.14. Cơ chế phân mảnh oligosacarit với sự có mặt của ion kim loại

MÊt ion kim lo¹i

Ph©n c¾t vßng

Ph©n c¾t liªn kÕt glycoside

32

* Phương pháp thời gian bay (Time of Flight-TOF):

Bộ phân tích khối lượng theo thời gian bay (TOF) dựa trên ý tưởng đơn giản

là tốc độ của hai ion được tạo ra trong cùng thời điểm với động năng như nhau sẽ

thay đổi phụ thuộc vào khối lượng của các ion: Ion nhẹ hơn sẽ có tốc độ cao hơn và

chuyển động về phía detector của phổ kế nhanh hơn, chạm tới detector sớm hơn. Sự

phân tách ion trong bộ phân tích TOF dựa theo nguyên lí là các ion có năng lượng

ban đầu như nhau sẽ có tốc độ tỉ lệ với giá trị m/z của chúng. Phổ kế TOF hiện nay

được sử dụng rất phổ biến. Vì thời gian giữa các xung ion ở nguồn ion có thể điều

chỉnh theo mong muốn, nên các thiết bị TOF có thể phân tích các ion có giá trị m/z

hầu như bất kì. Khi ghép với nguồn ion hóa sung laser như MALDI, phổ kế TOF có

các ứng dụng phổ biến trong phân tích cấu trúc của các oligosacarit, protein, các

mảnh DNA, các phân tử sinh học và các polymer với khối lượng cỡ kDa.

Tóm lại: Phân tích cấu trúc của oligosacarit bao gồm xác định thành phần

monosacarit, kiểu liên kết, mô hình phân nhánh và trật tự liên kết giữa các gốc

đường. Vì vậy, không có phương pháp khối phổ duy nhất nào có thể giúp xác định

được tất cả các thông số trên. Tuy nhiên, phổ khối kết hợp với một số phương pháp

khác có thể giúp phân tích thành công cấu trúc của các oligosacarit phức tạp.

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN

QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN.

1.4.2. Tình hình nghiên cứu fucoidan trên thế giới.

Qua tham khảo các tài liệu đã công bố về nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính

sinh học của fucoidan trên thế giới, chúng tôi nhận thấy fucoidan từ rong nâu là một

polymer sinh học có cấu trúc rất phức tạp bởi tính đa dạng và sự không đồng nhất

về thành phần đường cũng như vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường [2,4,5,23-27].

Vì vậy, dù đã có rất nhiều công trình công bố về cấu trúc của fucoidan, nhưng chỉ

có một số công bố đưa ra được cấu trúc một cách rõ ràng mà phần lớn chỉ đưa ra

cấu trúc của một phân đoạn có độ lặp lại cao của chúng. Cho đến nay những công

bố về cấu trúc của fucoidan một cách rõ ràng nhất là fucoidan được phân lập từ các

loài rong nâu sinh trưởng ở vùng ôn đới như Fucus evnescens C.Ag, Fucus

vesiculosus, Fucus distichus, Ascophyllum nodosum,… trong thành phần đường của

33

fucoidan từ những loài rong này hầu như chỉ có 01 gốc đường là fucose và một

lượng rất nhỏ các gốc đường pyranose khác. Trong khi đó các công trình nghiên

cứu về cấu trúc fucoidan từ các loài rong nâu sinh trưởng ở vùng nhiệt đới không

nhiều và phần lớn chỉ dừng lại ở việc đưa ra thành phần hóa học và vị trí của nhóm

sulfate trên các gốc đường, thành phần hóa học của chúng tương đối phức tạp ngoài

fucose và sulfate, còn có các gốc đường khác như galactose, xylose, mannose,

rhamnose, glucose,… và cả gốc acetyl

Trong số các công bố về cấu trúc của fucoidan, đáng lưu ý nhất là nhóm

nghiên cứu do Giáo sư Usov đứng đầu thuộc Viện Hóa Hữu cơ, Viện Hàn lâm Khoa

học Nga đi tiên phong trong việc sử dụng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt

nhân một chiều (1-D) và hai chiều (2-D) để nghiên cứu cấu trúc của fucoidan. Kết

quả đã có 04 loại cấu trúc của fucoidan từ các loài rong nâu Laminaria saccharina,

Fucus evanescen, Fucus serratus, Fucus distichus L. của Nga được công bố [23-

26]. Gần đây, với việc áp dụng các phương pháp phân tích khối phổ hiện đại

MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS để phân tích cấu trúc của các polysacarit nói

chung và fucoidan nói riêng đã tạo ra một bước đột phá mới trong phân tích cấu trúc

phức tạp của polysacarit rong biển. Một trong những điểm mạnh của phương pháp

này là khả năng phân tích nhanh và chính xác vị trí của nhóm sulfate cũng như trật

tự giữa các gốc đường trong phân tử fucoidan. Việc áp dụng thành công phương

pháp này nhóm nghiên cứu của Anastyuk ở Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình

Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga đã

công bố lại cấu trúc fucoidan từ loài rong Fucus evanescens [18] và thêm 03 loại

cấu trúc fucoidan mới từ các loài rong Costaria costata, Laminaria cichorioides và

Coccophora langsdorfii đã được công bố [17, 19, 20].

Do sự đa dạng về cấu trúc và hoạt tính sinh học với khả năng ứng dụng rất

lớn trong lĩnh vực công nghiệp dược liệu [69,81,88]. Nên mặc dù đã được bắt đầu

nghiên cứu từ hơn 100 năm trước, hiện nay fucoidan vẫn luôn thu hút được sự quan

tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới nhằm tìm kiếm các loại thuốc

mới. Cho đến nay, phần lớn các công bố về hoạt tính sinh học của fucoidan được

thực hiện trên các sản phẩm fucoidan thương mại hoặc chiết thô nên mối quan hệ

34

giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế vẫn chưa được nghiên cứu

một cách rõ ràng. Vì vậy, để có thể sử dụng fucoidan làm thuốc thì yếu tố tiên quyết

và quan trọng nhất là phải xác định được cấu trúc chi tiết của chúng.

1.4.2. Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam.

Ở trong nước, fucoidan mới chỉ được biết đến và nghiên cứu trong khoảng

hơn 10 năm trở lại đây bởi các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng

công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Năm 2006,

lần đầu tiên tại Việt Nam, Phân viện Khoa học Vật liệu tại Nha Trang (nay là Viện

Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang) đã đưa ra quy trình công nghệ

chiết xuất và phân lập fucoidan từ rong nâu Việt Nam. Đây là một quy trình công

nghệ cao, sử dụng màng siêu lọc cho phép đồng thời cô đặc và loại bỏ tạp chất khỏi

dung dịch fucoidan tại nhiệt độ phòng, nhờ vậy giữ nguyên được hoạt tính sinh học

tự nhiên vốn có của chúng [2].

Nước ta với nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và phong phú, riêng

chi Sargassum đã phát hiện được trên 60 loài với sản lượng ước tính tới 10.000 tấn

khô/năm [58], hàm lượng fucoidan trong các loài rong chi Sargassum từ 1-2,5%

trọng lượng rong khô, đây có thể được coi là nguồn dược liệu tiềm năng rất lớn của

biển Việt Nam. Tuy nhiên, các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của

fucoidan rong nâu Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Các nghiên cứu công bố về

fucoidan từ rong nâu Việt Nam chủ yếu đưa ra các đặc điểm về cấu trúc như thành

phần đường, vị trí nhóm sulfat và phần lớn chúng thực hiện trên các mẫu fucoidan

chiết thô [4,5]. Cho tới nay mới chỉ có 03 công bố về cấu trúc tương đối rõ ràng của

fucoidan từ các loài rong Sargassum swartzii, Sargassum polycystum và Turbinaria

ornata ở Việt Nam cụ thể là:

Năm 2008, tác giả Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự, đã công bố thành phần và

cấu trúc của phân đoạn fucoidan F20 được phân lập từ rong Sargassum swartzii với

thành phần chủ yếu là fucose (> 45%), bên cạnh đó các đường đơn khác như

rhamnose, mannose và galactose cũng chiếm hàm lượng đáng kể (10,81-22,07%),

tác giả chỉ đưa ra trình tự liên kết giữa các gốc đường hexose, uronic axít và fucose,

nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4 trong phân đoạn F20 [4].

35

Năm 2013, Bilan và các cộng sự đã công bố cấu trúc của fucoidan từ rong

Sargassum polycystum có thành phần chủ yếu L-fucose, D-galactose và sulfate. Cấu

trúc phân tử của fucoidan F4- S.polycystum chứa bộ khung chủ yếu được tạo bởi các

gốc 3-linked α-L-fucopyranose 4- sulfate, giữa các chuỗi tương đối ngắn của các

gốc này được đặt nằm rải rác bởi các gốc 2-linked α-D-galactopyranose, cũng

sulfate hóa ở vị trí số 4 [27].

Cũng trong năm 2013, Thành Thị Thu Thủy và cộng sự đã công bố cấu trúc

của fucoidan từ rong Turbinaria ornata có hàm lượng sulfate cao và thành phần

đường rất đơn giản chỉ gồm fucose và galactose theo tỉ lệ 3:1, đây là một dạng

galactofucan sulfate hóa. Cấu trúc bộ khung của chúng là các gốc α-L-Fucp liên kết

3, sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4. Nhóm sulfate cũng được phát

hiện thấy chiếm ưu thế ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4 của gốc galactose trong

mạch nhánh được tạo nên bởi các gốc galactose liên kết 4 [122].

Các công bố về hoạt tính sinh học cũng mới chỉ được thử nghiệm với hoạt

tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các mẫu fucoidan

chiết thô. Mặc dù hoạt tính sinh học của fucoidan dạng sulfated galactofucan được

dự đoán là rất đa dạng như hoạt tính kháng vi rút, chống nghẽn mạch, bảo vệ dạ dày,

kháng ung thư,… nên việc nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và hoạt tính của fucoidan

theo định hướng làm thuốc là hết sức cần thiết.

Kết luận:

Tổng quan cho thấy, Việt Nam mặc dù có nguồn tài nguyên rong nâu vô

cùng đa dạng và phong phú [1]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu

Việt Nam mới chỉ bắt đầu từ hơn một thập kỉ nay và số các công bố về thành phần,

cấu trúc và hoạt tính của fucoidan phân lập từ các loài rong nâu Việt Nam vẫn còn

rất hạn chế [2,5,27,122]. Do vậy, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu phân tích

thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài

rong nâu ở vịnh Nha Trang” nhằm hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về cấu trúc

và hoạt tính sinh học của fucoidan từ rong biển Việt Nam để định hướng sử dụng

chúng làm dược liệu hoặc thực phẩm chức năng.

36

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Dựa vào danh mục thành phần loài và trữ lượng các loài rong nâu phân bố ở

Việt Nam đã công bố [1, 3, 8], chúng tôi đã chọn 08 loài rong thuộc 3 chi rong khác

nhau trong ngành rong nâu để nghiên cứu (bảng 2.1). Đây là những loài rong phổ

biến, có trữ lượng lớn, có giá trị kinh tế cao và có thể khai thác ở quy mô công

nghiệp ở vùng biển vịnh Nha Trang tỉnh Khánh Hòa. Việc nghiên cứu thành phần

và cấu trúc của fucoidan có hoạt tính sinh học từ các loài rong này có ý nghĩa quan

trọng trong việc tìm kiếm nguồn dược liệu mới từ tài nguyên rong biển, từ đó làm

cơ sở cho việc khai thác và sử dụng một cách hợp lý nguồn tài nguyên rong biển ở

Nha Trang nói riêng và ở khu vực Nam Trung Bộ của Việt Nam nói chung.

Các mẫu rong biển được thu ngay sau thời kỳ sinh sản. Thời gian thu hoạch

tùy thuộc vào từng loài rong nhưng thông thường vào khoảng thời gian từ tháng 3

đến tháng 6 hàng năm. Các mẫu rong được thu thập và phân loại bởi TS. Lê Như

Hậu, chuyên gia phân loài rong biển thuộc Phòng Vật liệu hữu cơ từ tài nguyên biển

của Viện Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang. Khi thu, dùng liềm cắt sát

gốc cây rong, rửa sạch khỏi tạp chất bằng nước biển và phơi khô tự nhiên ở nhiệt độ

phòng. Khối lượng mỗi mẫu thu tối thiểu là 10kg rong tươi. Các mẫu rong dạng tiêu

bản ép khô được lưu trữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang.

Bảng 2.1. Các loài rong nâu được thu nghiên cứu

Stt Tên loài rong Địa điểm thu mẫu

01 Sargassum mcclurei Sông Lô-Nha Trang

02 Sargassum polycystum Bãi Nam-Nha Trang

03 Sargassum oligocystum Sông Lô-Nha Trang

04 Sargassum denticapum Sông Lô-Nha Trang

05 Sargassum swartzii Bãi Tiên-Nha Trang

06 Sargassum binderi Hòn Tre-Nha Trang

07 Turbinaria ornata Hòn Rùa-Nha Trang

08 Padina australis Hòn Chồng-Nha Trang

37

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan

* Phương pháp chiết tách [143]:

Dựa trên cơ sở tham khảo tài liệu đã công bố về các phương pháp chiết tách

fucoidan cho mục đích nghiên cứu cấu trúc [98,103,104,143]. Chúng tôi tiến hành

chiết theo phương pháp sử dụng dung dịch axít loãng (sơ đồ hình 2.1) vì phương

pháp này ít ảnh hưởng đến cấu trúc phân tử tự nhiên của fucoidan, đơn giản và dễ

thực hiện. Phương pháp này cũng đã được chọn làm phương pháp chính để chiết

fucoidan có hoạt tính theo Patent của Nga (Patent WO 2005/014657) [98].

Hình 2.1. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan từ rong nâu.

Rong tươi

Rong đã loại chất béo

Dịch chiết rong

Polysacarit (thô)

Chiết với (Cồn; Aceton, Chloroform) Polyphenol, chất màu, các hợp chất trọng lượng phân tử thấp

Chiết với HCl 0,1N, 60oC, t = 2 giờ (3lần)

Bã rong

Trung hòa với NaHCO3 8% Cô đặc, thẩm tách bằng màng 10kDa Tủa với 4 lần thể tích cồn 98 hoặc đông khô

Hòa tan trong HCl 0,04N, ly tâm Sắc ký trao đổi anion (DEAE-Cellulose) Rửa giải với HCl 0,04N và gradient nồng độ của NaCl (0 - 2 N)

Polyuronic axit (PA)

L F1 F2 F3 F4

0,04N HCl a N NaCl b N NaCl c N NaCl d N NaCl

38

* Tách phân đoạn fucoidan [143]

Fucoidan được tiến hành phân đoạn tinh chế bằng sắc ký trao đổi anion trên

cột DEAE-cellulose (hình 2.1). Mẫu bột fucoidan thô (gồm fucoidan, laminaran và

polyuronan) được hòa tan trong dung dịch 0,04N HCl, ly tâm tách phần không tan

(polyuronan), phần dịch trong được cho chạy qua cột sắc ký DEAE-cellulose. Hợp

chất laminaran (hợp chất không có nhóm mang điện tích) không bị hấp thụ trên cột

sẽ được rửa giải đầu tiên bằng dung dịch HCl loãng (0,04N) hoặc nước cất. Tiếp

theo các phân đoạn fucoidan sẽ được rửa giải bằng dung dịch muối NaCl ở các nồng

độ khác nhau.

2.2.2 Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường

* Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate: Hàm lượng đường tổng được xác

định bằng phương pháp phenol-axít sulfuric [49].

* Phân tích thành phần đường đơn của fucoidan: Thành phần đường đơn

được xác định bằng phương pháp HPLC, sau khi fucoidan được thủy phân axít về

các monomer [98].

2.2.3 Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate

Hàm lượng sulfate được phân tích bằng phương pháp đo độ đục với

BaCl2/gelatine (Dodgson., 1962), sử dụng K2SO4 làm chất chuẩn [45].

2.2.4 Phương pháp khử sulfate

Khử sulfate (desulfation) được thực hiện theo phương pháp solvolistic trong

hỗn hợp (dimethyl sulfoxide và methanol) sử dụng pyridin làm xúc tác [23].

2.2.5 Phương pháp phân tích hàm lượng uronic axít

Hàm lượng uronic axít được xác định sử dụng phương pháp Carbazole, sử

dụng D-glucuronic axít làm chất chuẩn [28].

2.2.6 Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa

Methyl hóa (methylation) thực hiện theo phương pháp được mô tả bởi

Chizhov và cộng sự (1999) [36], nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào việc

xác định dạng và số lượng của các loại đường sau khi methyl hóa các nhóm (-OH)

tự do của chúng.

39

2.2.7 Phương pháp thủy phân tạo oligosacarit

Thủy phân fucoidan để tạo oligosacarit được thực hiện theo phương pháp tự

thủy phân “autohydrolysis”, bằng phương pháp này nhóm (SO3Na) của fucoidan

được chuyển về dạng axít (SO3H) và quá trình thủy phân axít polysacarit dưới điều

kiện rất nhẹ nhàng do các nhóm SO3H của hợp chất fucoidan đóng vai trò như là

nguồn axít [18].

2.2.8 Phương pháp phổ hồng ngoại IR

Mẫu fucoidan được ép viên với KBr theo tỉ lệ 10 mg mẫu/20 mg KBr. Phổ

hồng ngoại FT-IR của fucoidan được ghi trên máy Carl Zeiss IR-75 spectrometer

(đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn lâm Khoa học Nga -

Chi nhánh Viễn Đông, L.B.Nga), trong vùng số sóng 4000-400 cm-1 [98]. Dựa vào

phổ IR trong vùng từ 800 đến 1732 cm-1 ta có thể xác định được các nhóm sulfate

trong các phân tử đường nằm ở vị trí axial hay equatorial [23,36,98].

2.2.9 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR được ghi trên máy

Brucker Advance DPX- 500 NMR spectrometer (Đức) (đo tại Viện Hóa sinh Hữu

cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đông,

L.B.Nga và Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Mẫu

fucoidan được pha trong D2O với nồng độ 20 μg/ml, đo ở tần số 75.5 MHz tại nhiệt

độ 35oC.

2.2.10 Phương pháp phổ khối lượng MS

Phổ MALDI-TOF/MS/MS được ghi trên thiết bị khối phổ Ultra Flex III

MALDI-TOF/TOF (Bruker, Đức) với nguồn laser nitrogen (337 nm).

Phổ ESI-MS/MS được ghi trên máy quang phổ ESI Q-TOF (Agilent 6510

LC Q-TOF, Mỹ) với nguồn ion hóa phun mù điện tử.

2.2.11 Phương pháp thử hoạt tính sinh học và xử lý số liệu

* Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào

Hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan trên các dòng tế bào ưng thư người

được thực hiện theo phương pháp của Likhitwitaywid [78] và Svetlana [121].

40

* Phân tích số liệu

Tất cả các con số chỉ ra trong nghiên cứu này là đại diện của ít nhất 3 thí

nghiệm độc lập với kết quả tương tự. Sự khác nhau thống kê được đánh giá sử dụng

Student’s t-test, và sự khác nhau được coi là có ý nghĩa ở p ≤ 0.05.

2.3 THỰC NGHIỆM

2.3.1 Chiết tách và phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu

* Chiết tách fucoidan từ rong nâu

Các mẫu rong được cắt nhỏ (2-3 cm), xử lý loại màu và các phân đoạn trọng

lượng phân tử thấp với hỗn hợp (96% EtOH : Cloroform : H2O = 89 : 1 : 10) theo tỉ

lệ w/v= 1/10 trong thời gian 10-15 ngày, hỗn hợp được lọc tách, rong được phơi

khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.

Mẫu rong sau khi đã loại chất béo và các hợp chất màu (500 g) được tiến

hành chiết 3 lần với 20 lít dung dịch 0,1N HCl (pH 2-3) ở nhiệt độ 60oC trong thời

gian 2h với mỗi lần chiết. Dịch chiết được lọc tách thô qua vải lọc, dịch chiết chứa

các polysacarit tan trong nước của 3 lần chiết được gộp lại và trung hòa bằng dung

dịch NaHCO3 8% đến pH = 6-7. Dịch chiết sau trung hòa thay vì được cô đặc bằng

cô quay chân không ở nhiệt độ 50-60 oC sau đó thẩm tách loại muối và các tạp chất

trọng lượng phân tử thấp bằng màng thẩm tách trong thời gian kéo dài (48 giờ) theo

phương pháp [98], chúng tôi tiến hành cô đặc và làm sạch dịch chiết bằng màng

siêu lọc kích thước 10kDa. Với màng siêu lọc cho phép loại nước, loại muối, các

hợp chất màu, các hợp chất trọng lượng phân tử thấp ở nhiệt độ phòng trong thời

gian chỉ từ 8-10 giờ, điều đó sẽ giúp bảo toàn được cấu trúc tự nhiên của fucoidan

không bị ảnh hưởng bởi yếu tố nhiệt độ và thời gian.

Dịch chiết sau khi được làm sạch và cô đặc tới 1/10 thể tích ban đầu được kết

tủa bằng EtOH 98% theo tỉ lệ thể tích Vdịch chiết : Vethanol = 1:4 hoặc đông khô sử

dụng máy đông khô chân không thu được bột polysacarit dạng thô chứa fucoidan.

* Phân đoạn tinh chế fucoidan bằng sắc ký trao đổi anion [98]

Bột polysacarit thô gồm (fucoidan, laminaran và polyuronan) (0,5g) được

hòa tan trong dung dịch 0,04N HCl, ly tâm tách phần tủa không tan ta loại được

polyuronan (PA) dưới dạng kết tủa axít polyuronic, phần dịch trong đưa lên cột

41

DEAE-Cellulose (dạng Cl-, 3,0 x 32 cm). Đầu tiên rửa cột với dung dịch 0,04N HCl

đến khi thử âm tính với hydrat cacbon bằng phương pháp phenol-axít sulfuric [49]

ta thu được phân đoạn laminaran, tiếp theo rửa giải cột bằng muối NaCl theo

gradient tuyến tính liên tục nồng độ tăng dần từ 0-2N, các phân đoạn fucoidan (F1,

F2, F3,…) được tách ra theo các nồng độ rửa giải khác nhau của dung dịch muối

NaCl, mỗi phân đoạn thu được cho thẩm tách loại muối bằng màng thẩm tách kích

thước 10kDa trong nước cất sau thời gian 24h, sau đó đem đông khô để thu các

phân đoạn fucoidan dạng bột

2.3.2. Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường

* Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate [49]

Lấy 200 µl dung dịch cần xác định có hàm lượng carbohydrate trong khoảng

20-100 µg/ml, thêm vào 200µl thuốc thử phenol 5% lắc đều đến khi dung dịch trở

nên trong suốt thêm tiếp 1ml axít sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy

trong thời gian 5 phút, lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 490

nm. Sử dụng glucose làm chất chuẩn.

* Phân tích thành phần đường [98]

Mẫu fucoidan (5 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn dung tích 5ml, thêm 1ml

TFA (Triflorua acetic axít ) 2M lắc đều cho tan, đem thủy phân ở 100oC trong 6 giờ

sau đó cho bay hơi đến gần khô bằng máy cô quay chân không, rửa lặp lại 3 lần với

MeOH để đuổi hết TFA dư. Phần cặn còn lại hòa tan với 1 ml nước đề ion, dung

dịch này được dùng để phân tích thành phần đường trên thiết bị phân tích

carbohydrate IC-500 Biotronik (Germany), sử dụng cột Shim-pack ISA- 07/S2504

(0.4 x 25 cm), pha động là đệm borat kali, tốc độ rửa giải 0,6 ml/phút. Đường đơn

được phát hiện bằng phương pháp bicinchorinate trên hệ phân tích Shimadzu C-R2

AX. Các đường đơn fucose, glucose, galactose, mannose, xylose, rhamnose được sử

dụng làm chất chuẩn. Hàm lượng các đường đơn được tính theo % mol dựa vào các

chất chuẩn.

2.3.3. Phân tích hàm lượng sulfate [45]

Cân khoảng 5 (mg) mẫu trong một lọ thủy tinh có nút vặn dung tích 5ml,

thêm vào 2 ml HCl 1N, đem thủy phân ở nhiệt độ 100oC, trong thời gian 6 giờ. Lấy

42

10 μl dung dịch mẫu sau thủy phân, thêm vào 100 μl TCA (trichlorua acetic axít )

và 100 μl hỗn hợp (0,5% gelatin + 0,5% BaCl2) lắc đều rồi đo độ hấp thụ quang ở

bước sóng λ= 360 nm. Hàm lượng sulfate được tính dựa vào đường chuẩn dựng từ

dung dịch K2SO4 với khoảng nồng độ từ 0,25-1 μg/ml.

2.3.4. Phân tích hàm lượng uronic axít [28]

Lấy 250 μl dung dịch mẫu (mẫu fucoidan và mẫu so sánh (mẫu carbohydrate

không chứa uronic axít )) cho vào ống nghiệm, thêm vào 1,5 ml dung dịch A (0,9 g

NaBH4 hòa tan trong 10 ml nước cất, thêm vào từ từ 90 ml dung dịch axít sulfuric

98% đã được làm lạnh), phản ứng được tiến hành ở 100 oC trong thời gian 10 phút.

Làm lạnh nhanh phản ứng trong cốc nước đá, thêm tiếp 50 μl dung dịch B (100 mg

Carbazole được hòa tan trong 100 ml cồn tuyệt đối) lắc đều và cho phản ứng lại ở

100oC trong 15 phút, làm lạnh nhanh phản ứng đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo

quang ở bước sóng λ = 525 nm. Sử dụng D-glucuronic axít làm chất chuẩn.

2.3.5. Khử sulfate [23]

100 ml dung dịch fucoidan (1 mg/ml) được cho qua cột trao đổi ion (dạng

H+; CG-120, 200–400 mesh, Serva, Germany). Rửa giải cột với 200 ml nước cất.

Dung dịch sau rửa giải được cô tới gần khô bằng máy cô quay chân không, mẫu sau

đó được hòa tan lại trong 20ml dung dịch hỗn hợp dimethylsulfoxide (DMSO) và

methanol (MeOH) có tỉ lệ [DMSO (19ml) : MeOH (1ml)] thêm vào 0,5ml Pyridin,

toàn bộ dung dịch được chuyển sang một ống thủy tinh có nút vặn kín và cho phản

ứng ở 100 oC trong thời gian 6h. Hỗn hợp sau phản ứng được thẩm tách trong nước

cất bằng màng thẩm tách 10 kDa trong thời gian 48h, hỗn hợp sau thẩm tách được

đông khô ta thu được mẫu fucoidan khử sulfate ở dạng bột.

2.3.6. Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa [36]

1mg mẫu fucoidan đã khử sulfate (dSF) được hòa tan trong 1ml Me2SO

(Dimethyl sulfoxide-DMSO) trong một lọ vial có nút vặn ở nhiệt độ 40oC trong thời

gian 10 phút, thêm tiếp vào 100 mg bột NaOH và 0,2ml methyl iodua (MeI). Hỗn

hợp phản ứng được lắc liên tục trong thời gian 20 phút ở 40 oC. Sau đó một lượng

tương tự NaOH và MeI được thêm vào. Hỗn hợp tiếp tục được lắc trong thời gian

1h, sau đó làm lạnh và thêm vào 1ml nước. Lượng methyl iodua dư được loại bỏ

43

bằng cô quay chân không, phần dung dịch còn lại được đưa qua cột C18, đầu tiên

rửa giải bằng nước cất, tiếp theo được rửa giải với 50% methanol (MeOH). Phần

dung dịch được rửa giải với MeOH được cho bay hơi trên máy cô quay chân không

tới gần khô. Mẫu sau khi cho bay hơi được hòa tan lại trong 1ml TFA 4N và cho

thủy phân ở nhiệt độ 100 oC trong thời gian 6h, mẫu sau thủy phân được khử với

NaBH4 và Methyl hóa với Ac2O/pyridin. Các methylate alditol acetate riêng phần

được phân tích bằng GLC-MS.

2.3.7. Thủy phân tạo fucoidan oligosacarit [18]

20 ml dung dịch fucoidan (5 mg/ml pha trong nước cất) được chuyển về

dạng H+ sử dụng cột trao đổi ion minicolumn Timberlite CG-120 (200-400 mesh,

Serva, Germany) và để yên 48h ở 37oC. Hỗn hợp sau đó được trung hòa với dung

dịch amoniac 5% và đông khô lạnh. Phân đoạn khối lượng phân tử thấp của

fucoidan (LWF-AH) được thu nhận bằng tách phân đoạn trong hỗn hợp

H2O/Ethanol 98% (1:5 v/v). Lớp bên trên chứa fucoidan oligosacarit được thu lại và

đông khô lạnh. Sản phẩm fucoidan trọng lượng phân tử thấp này sẽ được sử dụng

cho phân tích khối phổ (MS).

2.3.8. Phổ khối MALDI-TOF/MS và ESI-MS của fucoidan oligosacarit

Phổ MALDI-TOF/MS và ESI-MS được đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái

Bình Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga.

Phổ MALDI-TOF/MS được đo theo chế độ ion âm sử dụng chất nền là

arabioosazone. Dung dịch nền được điều chế theo phương pháp của Chen và cộng

sự [32] bằng cách trộn dung dịch arabioosazone 10 mg/ml trong ethanol và

10mg/ml L-fucose trong nước để làm giảm sự phân mảnh trong nguồn ion hóa [18].

Dung dịch mẫu (0,01 mg/ml trong nước cất) được chuẩn bị từ mẫu đã đông khô. Kỹ

thuật “lớp mỏng” được sử dụng để điều chế mẫu đo. Cụ thể như sau: 1μl dung dịch

nền được phủ lên một mặt thép không rỉ và để cho khô. Sau đó, 11μl dung dịch mẫu

được phủ lên lớp thứ 2 và làm khô trong không khí. Thiết bị được hiệu chỉnh trước

sử dụng nền và các tín hiệu angiotensin-II (Sigma, Mỹ).

Phổ ESI-MS được đo theo cả hai chế độ ion âm và ion dương và việc hiệu

chỉnh trước được tiến hành sử dụng chuẩn “HP-mix”. Thế mao dẫn được đặt tới

44

4000 v, và nhiệt độ khi sấy khô là 325 oC. Thế buồng phân đoạn được đặt ở 160V.

Cửa sổ phân lập cho các thí nghiệm MS/MS được đặt đến 1,3 đơn vị khối lượng cho

các ion điện tích đơn và 4 đơn vị khối lượng cho các ion nhiều điện tích. Năng

lượng va chạm được tối ưu hóa giữa 10 và 45V để đạt tới cường độ nhiều nhất của

các ion mảnh. Các mẫu sấy khô được hòa tan trong 1:1 acetonitrile-nước (nồng độ

mẫu là gần bằng 0.01 mg/ml) và nó được đưa vào phổ khối ở tốc độ dòng 5 μl/phút

sử dụng bơm syringe (KD Scientific, USA).

2.3.9. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan

1)- Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp của Likhitwitaywid

và cộng sự, phương pháp này hiện đang được sử dụng tại Viện Nghiên cứu Ung thư

Quốc gia Mỹ [78] (thí nghiệm được thực hiện tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên

nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Fucoidan được thử

nghiệm gây độc trên các dòng tế bào ung thư của người như LU (ung thư phổi),

Hep-G2 (ung thư gan), RD (ung thư màng tim) và MDA-MB-231 (ung thư vú).

Các dòng tế bào ung thư người được lấy từ Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc

gia Mỹ (NCI) và hiện đang được lưu giữ tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Tế bào ung thư được giữ trong nitơ lỏng, khi sử dụng chúng được đánh thức

và duy trì trong các môi trường dinh dưỡng MEME hoặc DMME có bổ sung thêm

huyết thanh bê tươi 7-10%. Tế bào nuôi cấy cho phát triển tới mức 60-70%, thay

môi trường sạch để hoạt hóa tế bào từ 18 đến 24 giờ, lúc đó tế bào đã sẵn sàng để sử

dụng cho thí nghiệm.

Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: Hòa mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100%

(4 mg/ml) cho bước sàng lọc sơ bộ. Pha 10 thang nồng độ cho bước 2 để tính giá trị

IC50.

Chuẩn bị mẫu đối chứng: Pha chất chuẩn có khả năng diệt tế bào (Elipitine

hoặc Colchicine) trong DMSO với nồng độ 0,01 mM. Nhỏ vào mỗi giếng 10 μl mẫu.

Các bước tiến hành: Tế bào sau khi xử lý với Tripsin 0,1% được tách khỏi

đáy bình. Pha loãng dung dịch huyền phù tế bào bằng môi trường sạch, rửa và đếm

số lượng, pha dung dịch huyền phù tế bào nồng độ cỡ (4x104 tế bào/ml). Thêm vào

45

các giếng đã có chất chuẩn bị sẵn ở trên 190 μl dung dịch huyền phù tế bào. Phiến

được ủ trong tủ CO2 thêm 3 ngày.

Đọc kết quả: Tế bào sau khi ủ 3 ngày, được cố định bằng dung dịch TCA

(trichlorua acetic axít ) lạnh (30-50%). Rửa, để khô, nhuộm SRB 0,4% trong axít

acetic 1% và rửa lại bằng axít acetic 1% để loại bỏ mẫu thừa, để khô, hòa lại bằng

dung dịch đệm Tris base 10 mM. Đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495 - 515 nm.

a. Sàng lọc sơ cấp tìm giá trị CS:

Giá trị CS (% Cell Survival) là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào

đó mà chất thử tính theo % so với mẫu đối chứng. Mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% ở

nồng độ mẫu 20 μg/ml đối với mẫu thô và 4 μg/ml đối với mẫu tinh chế được đánh

giá có hoạt tính. Dựa trên các kết quả đo độ hấp thụ quang của chúng là OD (ngày

0), OD (DMSO 10 %) và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%)

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS ≤ 50%) sẽ được chọn và tiếp tục tiến

hành tìm giá trị IC50.

b. Tìm giá trị IC50:

Dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve

theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để

tính giá trị IC50. Chất có hoạt tính thì giá trị IC50 ≤ 20 μg/ml đối với chất thô và ≤ 4

μg/ml đối với chất sạch.

2)- Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư theo phương pháp [121] (thực

hiện tại Phòng Hóa Enzyme, Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn

lâm Khoa học Nga, chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga).

a. Nuối cấy tế bào

Dòng tế bào ung thư kết tràng người DLD-1 (ATCC # CCL-221TM) được

phát triển như một lớp đơn trong môi trường RPMi-1640 được bổ sung thêm 10%

(v/v) FBS đã bất hoạt bằng nhiệt, 2 mM L-glutamine và 1% penicilin-streptomycin

trong không khí được làm cho ẩm ướt chứa 5% CO2

b. Thử nghiệm gây độc tế bào

Để đánh giá độc tố tế bào, tế bào được nuôi cấy ở nồng độ (3x104 tế bào/ml)

trong các đĩa 96 giếng trong 200 μl dung dịch 10% FBS RPMI-1640 ở 37oC trong

46

tủ ấm chứa 5% CO2. Sau 24h, môi trường được chuyển và thay thế với môi trường

mới có chứa fucoidan với các nồng độ khác nhau (50, 100, 200 μg/ml) và tế bào

được ủ thêm 24h và 48h ở 37oC trong tủ ấm chứa 5% CO2. Sau khi ủ, 10 μl muối

nội (thuốc thử MTS)3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxylphenyl)-2-

(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium được đưa vào từng giếng và tế bào được ủ thêm 4h

ở 37oC và 5% CO2. Sau đó đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 490/630 nm.

c. Thử nghiệm gen dòng đơn tính (clonogenic) trên agar mềm

Phương pháp thử nghiệm trên môi trường agar mềm được thực hiện sử dụng

dòng tế bào ung thư ruột kết người (DLD-1). Cụ thể là, các tế bào (2,4 x 104 tế

bào/ml) được xử lý với fucoidan (100 μg/ml) hoặc được kích hoạt và phát triển

trong 1ml môi trường agar có chứa 0,3% BME (Basal Medium Eagle) và 10% FBS,

như được mô tả bởi Colburn và cộng sự [121]. Môi trường nuôi cấy được giữ ở

37oC trong tủ ấm chứa 5% CO2 khoảng 3 tuần, các khuẩn lạc thu được, được đếm

trên kính hiển vi sử dụng phần mềm máy tính ImageJ.

47

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU

Với mục đích chiết tách fucoidan cho nghiên cứu hoạt tính sinh học và cấu

trúc, fucoidan được chúng tôi chiết trong môi trường axít loãng, ở nhiệt độ 60oC,

chiết lặp lại 3 lần để đảm bảo hiệu quả chiết fucoidan cao nhất [143]. Kết quả thu

được hàm lượng fucoidan trong 08 loài rong nâu thuộc 3 chi rong Sargassum,

Padina và Turbinaria được trình bày trong bảng 3.1. Kết quả cho thấy hàm lượng

fucoidan dao động từ 0,82 % (Sargassum swartzii) đến 2,57 % (Sargassum

polycystum), hàm lượng fucoidan trong hai loài rong Padina australis và Turbinaria

ornata tương ứng là 1,93 % và 1,23 %. Như vậy, ta thấy hàm lượng fucoidan trong

các loài rong thuộc các chi khác nhau là khác nhau và trong cùng một chi

(Sargassum) cũng không giống nhau. So với các kết quả về hàm lượng fucoidan đã

được công bố trước đó của các loài rong S.swartzii, S.oligocystum, S.denticapum,

S.mcclurei, S.polycystum, Turbinaria ornata [5] lần lượt là 2,88 %, 3,92 %, 3,74 %,

3,56 %, 2,94 %, 4,22 % có thể thấy hàm lượng fucoidan trong cùng một loài rong

cũng khác nhau, theo các tác giả [84,100,126] sự khác nhau về hàm lượng fucoidan

trong các loài rong này có thể được giải thích là do sự khác nhau về thời gian thu

rong, vị trí địa lý và phương pháp chiết. So với các loài rong nâu thuộc họ

Sargassum của các nước khác trên thế giới như Mexico, Brazil, Nhật Bản, Ấn Độ,

Trung Quốc,… hàm lượng fucoidan của rong nâu Việt Nam cao hơn so với loài

rong Sargassum stenophyllum (Brazil) 0,4 % [48] và các loài rong Sargassum

ringgoldianum 0,13 % [56], Sargassum thunbergii 0,88 % [39], Sargassum

fusiformis còn được gọi là Hizikia fusiformis 1,30 % [109]của Nhật Bản và thấp

hơn các loài rong, Sargassum myriocystum 5,34 %, Sargassum wightii 6,72 % (Ấn

Độ) [50], Sargassum horneri 4,3 % (Mexico) [128].

Tóm lại, sự khác biệt về hàm lượng fucoidan trong các loài rong rất khó để

đưa ra so sánh, bởi hàm lượng fucoidan thu được nhìn chung thay đổi rất nhiều

(0,1-20%) phụ thuộc vào điều kiện địa lý, quá trình sinh trưởng và phát triển, cũng

như phương pháp chiết tách để thu nhận fucoidan.

48

Bảng 3.1. Hàm lượng và thành phần monosacarit của fucoidan

từ 08 loài rong nâu Việt Nam

Thành phần đường đơn của

fucoidan (mol %)

Stt Loài rong Ký hiệu

mẫu

fucoidan

Hàm

lượng

fucoidan

%*

Fuc Man Gal Xyl Glc

SO42-

% w/w**

Axít

uronic

% w/w

1 S.swartzii SwF 0,82 35,8 19,2 32,3 9,9 2,8 20,40 14,28

2 S.oligocystum SoF 1,78 42,3 8,9 38,3 7,1 3,4 22,46 21,54

3 S.denticapum SdF 2,00 40,1 15,9 38,7 5,3 nd 25,69 21,20

4 S.mcclurei SmF 2,37 38,5 4,2 33,1 3,6 20,6 33,15 17,87

5 S.polycystum SpF 2,57 42,4 12,6 23,5 1,3 10,2 25,60 23,74

6 S.binderi SbF 1,13 42,2 10,3 38,0 9,5 nd 21,47 5,35

7 T.ornata ToF 1,23 55,8 9,2 24,8 9,0 1,2 25,30 7,50

8 Padina australis PaF 1,93 47,1 2,5 22,3 11,5 16,6 21,90 21,02

* Hàm lượng tính theo khối lượng rong khô đã loại chất béo

** Hàm lượng tính theo khối lượng của fucoidan; nd: không phát hiện thấy

Gần đây có rất nhiều công trình công bố về hoạt tính sinh học hết sức có giá

trị của fucoidan [48,70,69,93,98,123]. Vì vậy, để tìm hiểu các đặc trưng cấu trúc và

hoạt tính của fucoidan trong các loài rong nâu của Việt Nam nhằm mục đích tìm

kiếm những hoạt chất mới có khả năng ứng dụng làm thực phẩm chức năng và dược

liệu chúng tôi tiến hành phân tích thành phần hóa học, đặc trưng cấu trúc và khảo

sát một số hoạt tính sinh học của chúng.

3.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN

Phân tích xác định thành phần của các monosacarit là việc quan trọng đầu

tiên trong nghiên cứu cấu trúc của các polysacarit nói chung và của fucoidan nói

riêng.

49

Fucoidan là một polymer dị thể có thành phần hóa học phức tạp, ngoài hai

thành phần chính là fucose và sulfate, chúng còn chứa các đường đơn khác như

galactose, mannose, xylose, glucose,... và uronic axít [69]. Vì vậy, để xác định

thành phần hóa học của fucoidan chúng tôi tiến hành thủy phân fucoidan thành các

monomer trong môi trường axít. Việc thủy phân hoàn toàn để xác định thành phần

các đường đơn của fucoidan trên thực tế rất khó xảy ra, do đó chúng tôi tiến hành

xác định tỉ lệ mol giữa các gốc đường đã được thủy phân và dựa vào tổng

carbohydrate để tính thành phần của mỗi đường đơn trong mẫu fucoidan. Sắc ký đồ

của các mẫu đường chuẩn được trình bày trên hình 3.1. Kết quả phân tích thành

phần monosacarit, hàm lượng sulfate và uronic axít của các mẫu fucoidan được

trình bày trên bảng 3.1

Kết quả bảng 3.1 cho thấy fucose chiếm hàm lượng đáng kể từ 35,8-55,8 %

trong tất cả các mẫu fucoidan, trong đó hàm lượng fucose cao nhất là fucoidan chiết

từ rong Turbinaria ornata (55,8%) và thấp nhất là fucoidan chiết từ rong S.swartzii

(35,8%). Hàm lượng galactose của fucoidan chiết từ các loài rong thuộc chi

Sargassum chiếm tỉ lệ gần bằng hàm lượng fucose, ngoại trừ fucoidan chiết từ rong

S.polycystum có tỉ lệ fucose : galactose = 2 : 1. Trong khi đó, các mẫu fucoidan

chiết từ hai chi rong khác là Turbinaria ornata và Padina australis cũng giống như

fucoidan của loài rong S.polycystum có hàm lượng galactose gần bằng một nửa so

với fucose. Ngoài hai thành phần chính là fucose và galactose, tất cả các mẫu

fucoidan của 08 loài rong nghiên cứu đều có thêm các đường đơn khác với hàm

lượng nhỏ hơn là mannose (2,5-19,2%), xylose (1,3-11,5%) và glucose (0-20,6%).

Hàm lượng các gốc đường này biến đổi theo từng chi rong và từng loài rong khác

nhau, tuy nhiên trong cùng chi rong chúng biến đổi không nhiều. Các kết quả này

cũng hoàn toàn phù hợp với các công bố trước đó về sự đa dạng của thành phần hóa

học của fucoidan [5, 69]. Bên cạnh thành phần là các gốc đường, trong phân tử của

fucoidan còn chứa các gốc sulfate và axít uronic. Hàm lượng sulfate của các mẫu

fucoidan khác nhau không nhiều (bảng 3.1), dao động trong khoảng 20,40-33,15%

so với lượng mẫu phân tích, trong đó lớn nhất là fucoidan của rong S.mcclurei

(33,15%) và nhỏ nhất là fucoidan chiết từ rong S.swartzii (20,40%), theo các tài liệu

50

đã công bố về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và các đặc điểm cấu trúc của

fucoidan như thành phần đường đơn, kiểu liên kết giữa các gốc đường, hàm lượng

và vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường,... trong đó hàm lượng các gốc sulfate và

vị trí của chúng trên các gốc đường là những yếu tố có ảnh hưởng quan trọng nhất

lên hoạt tính sinh học của fucoidan [34,38,69].

So với fucoidan chiết từ các loài rong nâu khác trên thế giới như Nga, Nhật

Bản, Hàn Quốc,... [23,24,48,92,129,142] thì fucoidan chiết từ rong nâu Việt Nam

có sự khác biệt lớn về thành phần các đường đơn. Đó là hàm lượng fucose thấp hơn

và hàm lượng uronic axít cao hơn. Fucoidan phân lập từ rong Turbinaria ornata có

hàm lượng fucose cao nhất là 55,8%, trong khi đó fucoidan phân lập từ một số loài

rong nâu của vùng Viễn Đông, L.B.Nga có hàm lượng fucose cao hơn rất nhiều như

fucoidan chiết tách từ rong Fucus evanescens, Laminaria japonica và Laminaria

cichorioides có hàm lượng fucose lần lượt là 88%, 86% và 100% [142], hay

fucoidan chiết từ rong Hizikia fusiformis (Nhật Bản) hàm lượng fucose chiếm 80%

[109], fucoidan của từ rong Sargassum stenophyllum (Brasil) hàm lượng fucose

chiếm 67,8%, hiện nay loại fucoidan duy nhất được bán thương mại bởi hãng hóa

chất Sigma (Mỹ) được chiết từ rong Fucus vesiculosus có hàm lượng fucose chiếm

100% [69]. Điều này cho thấy sự đa dạng về thành phần hóa học của fucoidan trong

các loài rong khác nhau, thậm chí là trong cùng một chi rong Sargassum của Việt

Nam và của Brasil cũng có thành phần rất khác nhau. Nhìn chung fucoidan của rong

nâu sinh trưởng ở vùng biển ôn đới thường có thành phần đường tương đối đơn giản,

chúng hầu như chỉ có một gốc đường fucose và một lượng rất nhỏ các đường đơn

khác [23-25,42,142]. Trong khi đó fucoidan của rong nâu ở biển nhiệt đới nói chung

và biển Việt Nam nói riêng phần lớn thuộc nhóm galactofucan, trong thành phần

chủ yếu chứa hai gốc đường fucose và galactose cùng với một lượng nhỏ các gốc

đường khác như rhamnose, xylose, mannose, glucose, …

[27,48,55,56,72,96,110,122]. Sự khác nhau về thành phần và hàm lượng các đường

đơn của fucoidan từ các loài rong khác nhau một lần nữa khẳng định rằng điều kiện

môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp polysacarit của rong

nâu.

51

Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đường đơn chuẩn

Fucoidan chiết từ hai loài rong S.denticapum và S.binderi có tỉ lệ các gốc

đường fucose/galactose/mannose/xylose gần giống nhau và không có gốc đường

glucose trong phân tử điều này có thể dự đoán về khung monosacarit trong hai loại

fucoidan này là giống nhau, các mẫu fucoidan đều có chứa đồng thời cả 5 gốc

đường với các tỉ lệ khác nhau chứng tỏ các fucoidan này có cấu trúc rất phức tạp và

độ lặp lại không cao. Theo cách phân loại mới nhất về fucoidan thì các mẫu

fucoidan này được gọi là fucogalactose sulfate [69,98,109]. Do sự phức tạp trong

thành phần cũng như cấu trúc, nên việc xác định các đặc trưng cấu trúc của

fucoidan là hết sức khó khăn. Phân đoạn tinh chế fucoidan là một bước quan trọng

làm đơn giản hóa việc phân tích các đặc trưng cấu của chúng.

3.3. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CỦA CÁC

PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN

05 loại fucoidan được phân lập từ các loài rong Sargassum swartzii,

Sargassum mcclurei, Sargassum polycystum, Sargassum denticapum và Turbinaria

ornata được chúng tôi lựa chọn để tiến hành phân đoạn và phân tích các đặc trưng

52

cấu trúc của chúng. Vì đây là những loài rong phổ biến, có trữ lượng lớn và có khả

năng khai thác ở quy mô công nghiệp.

Kết quả phân đoạn tinh chế các mẫu fucoidan bằng sắc ký trao đổi anion trên

cột DEAE-cellulose (3,2x32 cm) (hình 2.1) được chỉ ra trên hình 3.2-hình 3.6.

Bảng 3.2. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong

S.denticapum thu được bằng sắc ký trao đổi anion

Thành phần monosacarit ,

mol%

Phân đoạn

fucoidan

Hàm

lượng

(%)*

Tổng

carbohydrate

(%)*

SO42-

(%)*

Fuc Man Gal Xyl Glc

SdF1-0,5 М NaCl 17,2 48,04 23,67 38,6 22,1 24,6 14,7 nd

SdF2-1,0 М NaCl 45,7 54,12 27,64 48,6 12,8 28,2 10,4 nd

SdF3-1,5 М NaCl 15,3 54,09 39,14 51,9 5,8 33,4 8,9 nd

*: tính theo khối lượng mẫu fucoidan

nd: không phát hiện thấy

Kết quả phân đoạn fucoidan của rong S.denticapum trên hình 3.2 cho thấy có

03 phân đoạn SdF1, SdF2 và SdF3 được tách ra theo các gradient nồng độ muối

NaCl khác nhau tương ứng là 0,5M; 1,0M và 1,5M. Hàm lượng mỗi phân đoạn

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

V, ml

DO

, 4

90

nm

0

0,5

1

1,5

2

Na

Cl,

M

SdF1

SdF2 SdF3

Hình 3.2. Phân đoạn fucoidan được chiết từ rong S.denticapum bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose

53

được tính theo khối lượng mẫu fucoidan đưa lên cột tách, trong đó phân đoạn cao

nhất là SdF2 chiếm 45,7% và thấp nhất là phân đoạn SdF3 15,3%. Kết quả phân

tích thành phần hóa học của các phân đoạn này (bảng 3.2) cho thấy cả 03 phân

đoạn đều chứa 4 gốc đường đơn là fucose, mannose, galactose, xylose với các tỉ lệ

khác nhau trong đó fucose chiếm hàm lượng cao nhất trong thành phần của cả 3

phân đoạn, chúng dao động trong khoảng 38,6-51,9% cao nhất là phân đoạn SdF3

(51,9%) và thấp nhất là phân đoạn SdF1 (38,6%), các gốc đường rhamnose và

glucose không được phát hiện thấy trong các phân đoạn của loại fucoidan này, hàm

lượng mannose và xylose giảm dần từ phần đoạn SdF1 đến SdF3. Hàm lượng

sulfate tăng dần từ phân đoạn SdF1 đến SdF3 chúng dao động từ 23,67% - 39,14%

điều này có thể được giải thích là do hàm lượng sulfate càng lớn thì khả năng liên

kết với nhựa trao đổi anion DEAE-Cellulose (Diethylaminoethyl-cellulose) càng

mạnh, nên để giải phóng phân đoạn fucoidan này cần dung dịch rửa giải có nồng độ

muối cao hơn. Với kết quả này, ta thấy fucoidan của rong S.denticapum có thể tồn

tại 03 loại cấu trúc khác nhau, phân đoạn SdF3 chứa lượng lớn sulfate, fucose,

galactose và một lượng nhỏ hơn mannose, xylose phân đoạn này được gọi là sulfate

galactofucan. Hai phân đoạn SdF1 và SdF2 ngoài 2 thành phần chính là sulfate và

fucose, chúng còn chứa một hàm lượng đáng kể galactose, mannose và xylose nên

có thể gọi với tên chung là fucoidan.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

V, ml

DO

, 4

90

nm

0

0,5

1

1,5

2

Na

Cl,

M

SwF1

SwF2

SwF3

SwF4 SwF5

Hình 3.3. Phân đoạn fucoidan được chiết từ rong S.swartzii bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose

54

Kết quả tách phân đoạn fucoidan từ rong S.swartzii (hình 3.3) ta thấy có 05

phân đoạn SwF1, SwF2, SwF3, SwF4 và SwF5 được tách ra với các nồng độ rửa

giải khác nhau của muối NaCl lần lượt là 0,5M; 0,8M; 1,0M; 1,2M và 1,5M. So với

kết quả 03 phân đoạn thu được của fucoidan từ rong S.denticapum có thể thấy mỗi

loài rong khác nhau sẽ tổng hợp lên các loại fucoidan với nhiều dạng cấu trúc khác

nhau. Các phân đoạn fucoidan được tách ra bằng sắc ký trao đổi anion chủ yếu phụ

thuộc vào mật độ nhóm mang điện tích (nhóm sulfate). Chính vì lý do này mà các

phân đoạn fucoidan từ mỗi loài rong khác nhau sẽ được rửa giải ra ở các nồng độ

muối NaCl khác nhau.

Bảng 3.3. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong

S.swartzii thu được bằng sắc ký trao đổi anion

Thành phần monosacarit , mol% Phân đoạn fucoidan Hàm

lượng

(%)

SO42-

(%) Fuc Man Gal Xyl Rham Glc

SwF1-0,5 М NaCl 2,0 5,6 nd nd nd nd nd nd

SwF2-0,8 М NaCl 20,2 14,6 49,5 4,7 29,4 2,7 2,7 3,0

SwF3-1,0 М NaCl 33,3 18,4 56,0 3,0 28,9 1,9 1,9 3,2

SwF4-1,2 М NaCl 26,2 28,0 55,6 3,6 27,9 2,4 3,3 2,8

SwF5-1,5 М NaCl 16,0 42,3 57,1 4,0 27,4 0,9 2,0 2,0

Hàm lượng và thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan rong

S.swartzii được trình bày trong bảng 3.3. Kết quả cho thấy hàm lượng của các phân

đoạn fucoidan SwF1-SwF5 dao động từ 2,0-33,3%, trong đó cao nhất là phân đoạn

SwF3 (33,3%) và thấp nhất là phân đoạn SwF1 (2,0%). Với 05 phân đoạn thu được

sau khi tách sắc ký cho thấy khả năng rong nâu S.swartzii sinh tổng hợp nên 5 loại

fucoidan khác nhau, kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đó đã

được công bố cho loài rong này của tác giả (Nguyễn Duy Nhất) [5]. Kết quả phân

tích thành phần hóa học (bảng 3.3) cho thấy thành phần đường đơn chính của các

55

phân đoạn là fucose (4,95-57,1 %) tăng dần từ phân đoạn SwF2 đến SwF5 và

galactose giảm dần tỉ lệ nghịch với chiều tăng của fucose từ (27,4-29,4%), riêng

phân đoạn SwF1 do hàm lượng thu được rất thấp (2%) nên chúng tôi không tiến

hành phân tích thành phần hóa học của phân đoạn này. Hàm lượng sulfate cũng tăng

dần từ phân đoạn SwF2 đến SwF5 (14,6-42,3%). Phân đoạn SwF5 được rửa giải với

nồng độ muối NaCl (1,5M) có hàm lượng sulfate 42,3% cao hơn rất nhiều so với

phân đoạn được rửa giải với cùng nồng độ muối NaCl của fucoidan phân lập từ

rong S.swartzii đã được công bố trước đó của tác giả (Nguyễn Duy Nhất, Luận án

Tiến sĩ) hàm lượng sulfate chỉ đạt 25,24% [5]. Điều này có thể được giải thích là do

sự khác nhau về phương pháp phân đoạn cũng như phương pháp chiết tách. Chúng

tôi tiến hành tách phân đoạn fucoidan trên cột sắc ký trao đổi anion DEAE-

Cellulose, trong khi đó tác giả Nguyễn Duy Nhất đã sử dụng phương pháp tách

phân đoạn bằng nhựa lỏng Cetavlon, sự khác nhau này cũng tương tự với các loài

rong khác của thế giới đã công bố trước đó [21,55,101,103].

Như vậy, thành phần của các phân đoạn của fucoidan được phân lập từ rong

nâu S.swartzii tồn tại đồng thời cả 6 gốc đường với các tỉ lệ mol khác nhau chứng tỏ

fucoidan này có cấu trúc rất phức tạp, độ lặp lại không cao. Điều này sẽ gây ra

nhiều khó khăn cho việc phân tích cấu trúc chi tiết của chúng.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 100 200 300 400 500 600 700

V, ml

A, 4

90

nm

0

0,5

1

1,5

2

Na

Cl,

M

SpF1

SpF2 SpF3

Hình 3.4. Phân đoạn fucoidan được chiết từ rong S.polycystum bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose

56

Với fucoidan được chiết từ rong nâu S.polycystum, kết quả tách phân đoạn

cho ra 03 phân đoạn SpF1, SpF2 và SpF3 tương ứng với nồng độ tăng dần của dung

dịch rửa giải muối NaCl lần lượt là 0,5M; 1,0M và 1,5M (hình 3.4). Kết quả phân

tích thành phần đường và hiệu suất thu các phân đoạn được đưa ra trong bảng 3.4.

Phân đoạn SpF2 đạt hiệu suất cao nhất chiếm (42,3%) và thấp nhất là phân đoạn

SpF1 (18,3%). Kết quả phân tích thành phần đường cho thấy có sự khác biệt rất lớn

trong tỉ lệ thành phần các đường đơn giữa 03 phân đoạn, với phân đoạn SpF1 hàm

lượng fucose (28,0%) và mannose (26,7%) gần tương đương nhau và chiến tỉ lệ gấp

2 lần so với hàm lượng của galactose (12,7%), xylose (11,3%) và rhamnose (13,1%),

hàm lượng glucose thấp nhất (8,2%). Với phân đoạn SpF2 hàm lượng fucose và

galactose cao hơn gấp 2 lần so với phân đoạn SpF1 lần lượt là 59,2% và 26,6%, hai

thành phần mannose và xylose chỉ chiếm một lượng nhỏ, trong khi đó glucose

không được tìm thấy trong phân đoạn này. Phân đoạn SpF3 có thành phần

monosacarit đơn giản hơn nhiều so với hai phân đoạn SpF1 và SpF2, ngoài fucose

và glactose là hai thành phần chính với tỉ lệ fucose : glactose = 2 : 1 thành phần

đường đơn còn lại là xylose chỉ chiếm 4,5%, các gốc đường đơn khác như mannose,

rhamnose và xylose không tồn tại trong phân đoạn fucoidan này. Tương tự như các

phân đoạn fucoidan từ các loài rong S.denticapum và S.swartzii, hàm lượng sulfate

trong các phân đoạn của fucoidan từ rong nâu S.polycystum cũng tăng dần (tăng

tuyến tính với nồng độ của dung dịch rửa giải NaCl) từ phân đoạn SpF1 đến SpF2

(20,11 - 33,9 %) (bảng 3.4).

Bảng 3.4: Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong

S.polycystum thu được bằng sắc ký trao đổi anion

Thành phần monosacarit

của fucoidan, mol %

Phân đoạn

fucoidan

Hàm

lượng

(%)

Tổng

carbohydrate

(%)

SO42-

(%)

Fuc Man Gal Xyl Rham Glc

SpF1-0,5 М NaCl 18,3 56,43 20,11 28,0 26,7 12,7 11,3 13,1 8,2

SpF2-1,0 М NaCl 43,2 59,15 25,67 59,2 6,0 26,6 0,2 8,0 nd

SpF3-1,5 М NaCl 21,0 54,97 33,99 68,6 nd 26,9 4,5 nd nd

57

Như vậy, với 03 phân đoạn thu được bằng tách sắc ký và kết quả phân tích

thành phần đường cho thấy fucoidan được phân lập từ loài rong nâu S.polycystum

có thể tồn tại 3 dạng cấu trúc với bộ khung monosacarit rất khác nhau. So với kết

quả đã được công bố về fucoidan của loài rong này, Bilan và cộng sự đã thu nhận

được 04 phân đoạn fucoidan khi tách trên cột DEAE-Sephacel [27]. Theo nhóm tác

giả này, thành phần đường của các phân đoạn của fucoidan rong S.polycystum

không chứa gốc đường rhamnose, trong khi đó thành phần của hai phân đoạn SpF1

và SpF2 đã phân tích ở trên gốc đường rhamnose chiếm từ 8,0-13,1%. Tuy nhiên, tỉ

lệ thành phần giữa các gốc đường cũng như hàm lượng sulfate trong phân đoạn F4

có sự tương đồng so với phân đoạn SpF3. Phân đoạn F4 ngoài fucose và galactose

là hai thành phần chính với tỉ lệ fucose : galactose ≈ 2 : 1, chỉ còn lại hàm lượng rất

nhỏ đường xylose. Hàm lượng sulfate chiếm 33,70% so với 33,99% trong phân

đoạn SpF3.

Sự khác nhau về kết quả tách phân đoạn cũng như thành phần của các phân

đoạn fucoidan rong S.polycystum so với công bố [27] có thể được giải thích do sự

khác nhau về vị trí và thời gian thu mẫu, cũng như phương pháp chiết tách và phân

tích thành phần đường của fucoidan. Tác giả Bilan và cộng sự tiến hành chiết rong

trong dung môi chứa 2% CaCl2 ở 85oC để thu nhận fucoidan, thành phần đường của

chúng được phân tích bằng phương pháp GC sau khi thủy phân và aditol hóa. Trong

khi đó fucoidan được chúng tôi thu nhận bằng cách chiết rong trong dung môi axít

HCl loãng ở 60oC, thành phần đường của chúng được phân tích bằng phương pháp

HPLC. Các kết quả tương tự cũng đã được công bố với fucoidan chiết từ các loài

rong nâu khác trên thế giới [101,125].

Fucoidan từ rong nâu S. mcclurei được tách phân đoạn bằng sắc ký trên cột

trao đổi anion DEAE-MacroPrep (Diethylaminoethyl-MacroPrep) (hình 3.5) 03

phân đoạn fucoidan SmF1, SmF2 và SmF3 được thu nhận tương ứng với các nồng

độ rửa giải của muối NaCl là 0,8M; 1,2M va 1,6M; về bản chất không có sự khác

nhau giữa loại nhựa này so với nhựa trao đổi anion DEAE-cellulose với chung tâm

hoạt động là nhóm amin mang điện tích dương (+1). Sự khác nhau về nồng độ dung

dịch rửa giải muối NaCl so với các phân đoạn fucoidan từ rong S.denticapum,

58

S.swartzii và S.polycystum như đã được giải thích ở trên có thể là do sự khác nhau

về đặc điểm cấu trúc của mỗi loại fucoidan. Kết quả phân tích hàm lượng và thành

phần hóa học của các phân đoạn SmF1, SmF2 và SmF3 được đưa ra trong bảng 3.5.

Hàm lượng của phân đoạn SmF1 là 8,4%, phân đoạn SmF2 chiếm 18,2% và phân

đoạn SmF3 là 10,5%. Kết quả phân tích thành phần đường trong bảng 3.5 cho thấy

hàm lượng fucose và galactose tăng dần theo nồng độ muối rửa giải NaCl, ngược lại

các gốc đường mannose, xylose, glucose hàm lượng giảm dần và không xuất hiện

trong phân đoạn SmF3. Tỉ lệ phần trăm mol của các gốc đường trong các phân đoạn

cũng rất khác nhau, nhưng đều có đặc điểm chung là hàm lượng fucose và galactose

là hai thành phần chiếm hàm lượng chủ yếu và đây cũng là đặc điểm chung của

fucoidan rong nâu Việt Nam [5,27,122]. Phân đoạn SmF1 và SmF2 có thành phần

đường đơn phức tạp hơn khi trong phân tử có chứa đồng thời cả 05 gốc đường khác

nhau, hàm lượng sulfate tương ứng là 16,8 và 25,7% điều này cho thấy mức độ

phức tạp trong cấu trúc của các phân đoạn fucoidan này. Phân đoạn SmF3 có thành

phần đường đơn giản nhất khi chỉ chứa hai gốc đường là fucose (58,5%) và

galactose (41,5%), hàm lượng sulfate (35%) với thành phần như vậy nó được xếp

vào nhóm galactofucan sulfate hóa cao.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

V (ml)

A 4

90

nm

0

0,5

1

1,5

2

Na

Cl,

M

SmF1

SmF2

SmF3

Hình 3.5. Phân đoạn fucoidan được chiết từ rong S.mcclurei bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-Macroprep

59

Bảng 3.5. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong

S.mcclurei thu được bằng sắc ký trao đổi anion

Thành phần monosacarit,

(% mol)

Phân đoạn fucoidan -

NaCl

Hàm

lượng

(%)*

Tổng

carbohydrate

(%)*

SO42-

(%)*

Fuc Man Gal Xyl Gluc

SmF1-(0,8M NaCl) 8,4 44,65 16,8 27,2 34,0 19,6 6,4 12,8

SmF2-(1,2M NaCl) 18,2 64,59 25,7 44,8 5,4 34,1 5,3 10,4

SmF3-(1,6M NaCl) 10,5 55,62 35,0 58,5 nd 41,5 nd nd

* % tính theo trọng lượng của mẫu fucoidan

* nd: không phát hiện thấy

Kết quả tách phân đoạn fucoidan của rong Turbinaria ornata trên cột sắc ký

trao đổi anion DEAE-cellulose 04 phân đoạn ToF1, ToF2, ToF3 và ToF4 được thu

nhận tương ứng với các nồng độ giải hấp của muối NaCl là 1,15M, 1,25M, 1,50M

và 1,80M (hình 3.6), kết quả này cho thấy fucoidan từ loài rong này tồn tại các kiểu

cấu trúc rất khác so với fucoidan từ các loài rong S.denticapum, S.polycystum,

S.mcclurei và S.swartzi thuộc chi rong Sargassum. Kết quả phân tích hàm lượng và

thành phần đường của các phân đoạn fucoidan này được đưa ra trong bảng 3.6.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 100 200 300 400 500 600 700 800

V, ml

A, 4

90

nm

0

0,5

1

1,5

2

Na

Cl,

N

ToF1

ToF2 ToF3

ToF4

Hình 3.6. Phân đoạn fucoidan được chiết từ rong Turbinaria ornata bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose

60

Bảng 3.6. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong

Turbinaria ornata thu được bằng sắc ký trao đổi anion

Thành phần monosacarit ,

mol%

Phân đoạn fucoidan Hàm

lượng

(%)

SO42-

(%)

Fuc Man Gal Rham

ToF1-1,15 М NaCl 6,6 23,87 71,9 4,5 23,6 nd

ToF2-1,25 М NaCl 29,7 43,26 69,6 nd 27,7 2,7

ToF3-1,50 М NaCl 10,3 38,75 82,1 2,4 9,4 6,1

ToF4-1,80 М NaCl 18,4 32.36 75,6 2,9 18,8 2,7

Kết quả cho bảng 3.6 cho thấy hàm lượng của các phân đoạn fucoidan ToF1-

ToF4 dao động trong khoảng từ 6,6-29,7 %, trong đó cao nhất là phân đoạn ToF2

chiếm 29,7%, thấp nhất là phân đoạn ToF1 (6,6%), hai phân đoạn ToF3 và ToF4

lần lượt chiếm 10,3% và 18,4%. Kết quả phân tích thành phần đường cho thấy, tất

cả các phân đoạn của fucoidan rong Turbinaria ornata đều có hàm lượng fucose rất

lớn dao động từ 69,6% (ToF2) đến 82,1% (ToF3), hàm lượng galactose dao động từ

9,4% (ToF3) đến 27,7% (ToF2) và chỉ chứa một hàm lượng nhỏ các gốc đường

mannose và rhamnose, đặc biệt các gốc đường xylose và glucose không có mặt

trong tất cả các phân đoạn fucoidan của loài rong này. Hàm lượng rhamnose lớn

nhất ở phân đoạn ToF3 (6,1%) và nhỏ nhất ở hai phân đoạn ToF2 và ToF4 cùng

chiếm 2,7%, rhamnose không có trong phân đoạn ToF1. Hàm lượng mannose lớn

nhất trong phân đoạn ToF1 (4,5%) và nhỏ nhất trong phân đoạn ToF3 (2,4%), phân

đoạn ToF2 không tồn tại gốc đường này. Hàm lượng sulfate tăng dần từ phân đoạn

ToF1 đến ToF2, dao động trong khoảng 23,87% - 43,26%. Như vậy, các phân đoạn

fucoidan của rong nâu Turbinaria ornata với thành phần đường chính là fucose và

galactose cùng một lượng lớn sulfate được gọi là các galactofucan sulfate hóa.

Trong khi đó fucoidan của một số loài rong nâu khác thuộc cùng bộ Fucales sống ở

61

vùng ôn đới như Fucus evanescens, Fucus vesiculosus trong thành phần của chúng

chỉ chứa fucose và sulfate được gọi là các fucan sulfate hóa [23,92].

So với công trình đã được công bố [11] về kết quả nghiên cứu fucoidan của

loài rong này khi tách trên cột trao đổi aion dạng DEAE-Sephadex, các tác giả đã

thu được 5 phân đoạn fucoidan khác nhau, phân đoạn rửa giải ở cùng nồng độ (1,5

M NaCl) cho thấy sự khác nhau đáng kể về tỉ lệ mol giữa fucose : galactose ≈

(1:0,28) và hàm lượng sulfate (28,2%) so với fucose : galactose ≈ (1:0,11) và hàm

lượng sulfate (38,75%) mà chúng tôi thu được ở cùng phân đoạn rửa giải. Kết quả

này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu fucoidan của các loài rong nâu khác trên

thế giới [40,80] và được giải thích là do sự khác nhau về phương pháp tách chiết,

phân đoạn cũng như phân tích [81].

Kết luận:

Fucoidan phân lập từ loài rong nâu Sargassum swartzii sau khi tách phân

đoạn bằng sắc ký trao đổi ion trên cột DEAE-cellulose, cho thấy tồn tại 5 dạng cấu

trúc khác nhau. Trong khi đó với các loài rong còn lại là S.denticapum,

S.polycystum và S.mcclurei chúng chỉ sở hữu 3 dạng cấu trúc fucoidan. Khác với

các loài rong chi Sargassum, fucoidan chiết từ loài rong thuộc chi Turbinaria lại tồn

tại 4 dạng cấu trúc khác nhau. Kết quả phân tích thành phần đường chỉ ra rằng

fucoidan của các loài rong thuộc các chi rong khác nhau là khác nhau, các loài rong

thuộc cùng một chi rong hay trong cùng một loài rong cũng khác nhau về thành

phần và tỉ lệ mol giữa các gốc đường đơn. Điều này cho thấy thành phần cũng như

đặc điểm cấu trúc của fucoidan vô cùng phức tạp.

Tuy nhiên, fucoidan của các loài rong trên đều có một đặc điểm chung là bên

cạnh hàm lượng sulfate cao, hai đường fucose và galactose luôn chiếm hàm lượng

lớn hơn so với các gốc đường khác, với đặc điểm này chúng được gọi là các

galactofucan sulfate hóa.

Theo các tài liệu đã công bố, fucoidan rong nâu nói chung và galactofucan

sulfate hóa nói riêng sở hữu phổ hoạt tính sinh học rất rộng và đa dạng như hoạt

tính kháng ung thư, kháng đông tụ máu, kháng vi rút,... [81,98]. Do vậy, trước khi

tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các đặc trưng cấu trúc của fucoidan rong nâu Việt

62

Nam nhằm mục đích ứng dụng chúng làm thực phẩm chắc năng và dược liệu.

Chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư người.

3.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN

3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của fucoidan

Theo các công trình đã công bố [38,39,52,62,69] fucoidan có phổ hoạt tính

sinh học rất đa dạng, đặc biệt là hoạt tính kháng ung thư, do vậy nó đã trở thành đề

tài thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới

nhằm tìm kiếm các nguồn dược liệu mới. Vì vậy trong luận án này chúng tôi tiến

hành thử nghiệm thăm dò hoạt tính gây độc tế bào ung thư người của fucoidan và

các phân đoạn fucoidan chiết tách từ một số loài rong nâu Việt Nam.

Fucoidan được chiết tách từ 06 loài rong nâu khác nhau được tiến hành thử

nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro tại Viện Nghiên cứu sinh học và Công nghệ

sinh học Hàn Quốc (Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology -

Hàn Quốc), Phòng Thử nghiệm Hoạt tính Sinh học - Viện Hóa học các Hợp chất

Thiên nhiên - VAST và Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn lâm

Khoa học Nga, Chi nhánh Viễn Đông - L.B.Nga. Hoạt tính gây độc tế bào của các

mẫu fucoidan được tiến hành thử trên 05 dòng ung thư là Hep-G2 (ung thư gan),

RD (ung thư màng tim), LU (ung thư phổi), MDA-MB-231(ung thư vú) và DLD-1

(ung thư ruột kết). Các kết quả thử nghiệm được trình bày trên bảng 3.7

Bảng 3.7. Hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan chiết từ rong nâu của Việt Nam

Dòng tế bào ung thư của người Fucoidan

Hep-G2* RD* MDA-MB-231** LU* DLD-1***

Kết luận

F-Sp + + nd nd nd Dương tính 02 dòng

F-Sm + - nd nd + Dương tính 02 dòng

F-So + + nd nd nd Dương tính 02 dòng

F-Ss + + + + - Dương tính 04 dòng

F-Sd + + nd nd - Dương tính 02 dòng

F-To + + nd nd nd Dương tính 02 dòng

63

* Thử nghiệm tại Phòng thử nghiệm sinh học - Viện Hóa học Các hợp chất thiên nhiên

** Thử nghiệm tại Viện Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc, Hàn Quốc

*** Thử nghiệm tại Viện Hóa sinh hữ cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn lâm Khoa học Nga

+: dương tính; -: âm tính; nd: chưa xác định

Kết quả bảng 3.7 cho thấy tất cả các mẫu fucoidan thử nghiệm đều có hoạt

tính gây độc tế bào trên ít nhất 02 dòng tế bào ung thư. Cả 06 mẫu fucoidan đều có

hoạt tính với tế bào ung thư gan (Hep-2), 05 mẫu có hoạt tính với tế bào ung thư

màng tim (RD), ngoại trừ fucoidan chiết tách từ loài rong S.mcclurei không có hoạt

tính với tế bào ung thư màng tim nhưng lại có hoạt tính với tế bào ung thư ruột kết

(DLD-1), 02 mẫu fucoidan F-Sd và F-Ss của loài rong S.denticarpum và S.swartzii

không có hoạt tính với dòng tế bào ung thư này. Trong số 06 mẫu fucoidan chỉ có

duy nhất fucoidan được phân lập từ loài rong S.swartzii được tiến hành thử và có

hoạt tính với 02 dòng tế bào ung thư vú (MDA-MB-231) và ung thư phổi (LU).

Từ các mẫu có hoạt tính sinh học đã được sàng lọc, chúng tôi tiến hành thí

nghiệm đánh giá giá trị hoạt tính thông qua giá trị IC50 của các mẫu đó để so sánh

khả năng kháng các dòng tế bào ung thư của các mẫu thử với các chất đã công bố.

Kết quả được thể hiện trên bảng 3.8.

Bảng 3.8. Giá trị IC50 của các mẫu fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào

Giá trị IC50 (µg/ml)

Dòng tế bào TT Fucoidan

Hep-G2 RD LU DLD-1 MDA-

MB-231

Kết luận

1 Chứng (+) 0,25 0,1 0,32 0,1 0,2

2 F-Sp 4,5 7,1 CXĐ CXĐ CXĐ Dương tính 2 dòng

3 F-Sm 2,4 20,0 CXĐ 6,5 CXĐ Dương tính 2 dòng

4 F-So 18,5 10,4 CXĐ CXĐ CXĐ Dương tính 2 dòng

5 F-Ss 3,8 16,7 15,5 CXĐ 5,4 Dương tính 4 dòng

6 F-Sd 8,1 15,4 CXĐ CXĐ CXĐ Dương tính 2 dòng

7 F-To 12,8 10,9 CXĐ CXĐ CXĐ Dương tính 2 dòng

64

Giá trị IC50 cho thấy fucoidan chiết rút từ các loài rong S.mcclurei, S.swartzii

và S.polycystum cho hoạt tính cao với dòng tế bào ung thư gan (Hep-2) tiếp theo là

S.denticaprum và Turbinaria ornata, mẫu cho hoạt tính thấp nhất là fucoidan chiết

từ loài rong S.oligocystum với IC50 là 18,5 μg/ml. Fucoidan chiết từ loài rong

S.mcclurei có hoạt tính cao với dòng tế bào ung thư kết tràng (DLD-1), trong khi

fucoidan của rong S.swartzii có hoạt tính mạnh với dòng tế bào ung thư vú (MDA-

MB-231). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các công bố trước đây về hoạt kháng

ung thư của fucoidan [5,16,22,82,98]. Như vậy, ta thấy hoạt tính kháng u của các

mẫu fucoidan là không giống nhau do mỗi fucoidan có những đặc trưng cấu trúc

khác nhau. Để tìm hiểu thêm về mối tương quan giữa các yếu tố đặc trưng cấu trúc

với hoạt tính sinh học của fucoidan, chúng tôi tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng

u với những phân đoạn fucoidan được tinh sạch vì những phân đoạn fucoidan này

có những đặc trưng cấu trúc rõ ràng hơn và đồng nhất hơn về cấu trúc phân tử, từ đó

giúp ta dễ dàng hơn trong việc đánh giá về mối quan hệ giữa cấu trúc với hoạt tính

sinh học của fucoidan.

3.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn fucoidan được phân lập từ

rong Sargassum swartzii và Sargassum mcclurei

Trong số các mẫu fucoidan được thử nghiệm ở trên, chúng tôi lựa chọn các

phân đoạn của fucoidan từ rong Sargassum mcclurei thu được bằng sắc ký trao đổi

ion để tiếp tục thử nghiệm hoạt tính với dòng tế bào ung thư kết tràng (DLD-1) và

các phân đoạn fucoidan từ Sargassum swartzii thử nghiệm với tế bào ung thư vú

(MDA-MB-231). Vì đây là hai loài rong phổ biến, có trữ lượng lớn nhất trong số 06

loài rong khảo sát được thu ở vùng biển Khánh Hòa và có tiềm năng khai thác tự

nhiên cũng như nuôi trồng ở quy mô công nghiệp [1,6-8].

05 phân đoạn fucoidan từ rong Sargassum swartzii được thử nghiệm hoạt

tính gây độc tế bào trên dòng tế bào thư vú của người (MDA-MB-231) (hình 3.7).

Kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy sự phân đoạn fucoidan bằng sắc ký trao đổi

anoin không làm mất hoạt tính kháng u, cả 05 phân đoạn của fucoidan S. Swartzii

đều thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, trong đó phân đoạn

SwF5 với hàm lượng sulfate cao nhất thể hiện hoạt tính kháng lại tế bào ung thư

65

mạnh nhất. Kết quả này chứng tỏ rằng hàm lượng sulfate đóng vai trò then chốt

trong hoạt tính kháng ung thư của loại fucoidan này. Tuy nhiên, thực tế cũng cho

thấy phân đoạn SwF3 thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư thấp

hơn phân đoạn SwF1 mặc dù phân đoạn SwF3 có hàm lượng sulfate cao hơn SwF1.

Như vậy có thể thấy rằng hoạt tính kháng ung thư của fucoidan không phải chỉ phụ

thuộc vào mật độ nhóm sulfate mà còn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố đặc trưng cấu

trúc khác như hàm lượng uronic axít, thành phần đường đơn và cả kiểu liên kết

glycoside [98].

0

20

40

60

80

100

120

Đốichứng

SwF1 SwF2 SwF3 SwF4 SwF5

Nồng độ các phân đoạn fucoidan

Sự

ức

chế

ph

át t

riển

tế

bào

, %

5 μg/ml

0,5 μg/ml

Hình 3.7. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MDA-MB-231

của các phân đoạn fucoidan từ rong Sargassum swartzii

Hiệu quả ức chế sự phát triển tế bào ung thư vú MDA-MB-231 phụ thuộc

vào nồng độ của các phân đoạn fucoidan cũng được mô tả trên hình 3.8, kết quả cho

thấy nồng độ của fucoidan ở ngưỡng 0,5 μg/ml là đủ để ức chế phần lớn các tế bào

ung thư. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MDA-MB-231 của fucoidan từ các

nguồn rong khác nhau như L. Saccharina, L. Digitata, F. serratus, F. distichus và

F. vesiculosus cũng đã được công bố [38].

66

Hình 3.8: Hiệu quả ức chế sự phát triển tế bào ung thư vú MDA-MB-231

của hai phân đoạn fucoidan SwF4 và SwF5 từ rong Sargassum swartzii

Fucoidan từ rong Sargassum mcclurei được nghiên cứu thử nghiệm gây độc

tế bào ung thư kết tràng người DLD-1 sử dụng 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-

carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, muối nội (MTS assay).

Kết quả là fucoidan không thể hiện bất kỳ độc tố tế bào đáng kể nào, sau khi xử lý

trong thời gian 24h và 48h ở nồng độ 1 đến 200 μg/ml. Các kết quả này khẳng định

thêm dữ liệu đã thu được trong các nghiên cứu trước đây. Các polysacarit sulfate

hóa từ các loài rong nâu khác nhau cũng đã được phát hiện là không độc với JB6

C141 (tế bào biểu bì chuột nhắt), vero (thận khỉ xanh lục châu Phi), MCF-10A (tế

bào biểu mô người), MCF-7 (tế bào ung thư vú người và các tế bào khác)

[16,39,52,62,82,98]. Như vậy, các kết quả chúng tôi thu được chỉ ra rằng các

polysacarit này là không gây độc tế bào đối với các tế bào ung thư kết tràng người

DLD-1 ở nồng độ từ 1-200 μg/ml.

Tiếp theo chúng tôi xác định xem khả năng các polysacarit sạch có ức chế

được sự tạo thành khuẩn lạc (phương pháp agar mềm) của các tế bào DLD-1 ung

thư kết tràng của người hay không. Đây là mô hình thí nghiệm đang được áp dụng

rất phổ biến để nghiên cứu tiềm năng của các tác nhân kháng u [98]. Tế bào ung thư

kết tràng của người DLD-1 được xử lý với fucoidan ở nồng độ 100 μg/ml trong chất

Đối chứng SwF4 (0,5 μg/ml) SwF5 (0,5 μg/ml)

67

nền agar mềm và các tế bào được ủ ở 37oC trong buồng ủ với 5% CO2 ở áp suất khí

quyển trong 3 tuần.

Hình 3.9: Hiệu quả ức chế sự phát triển tế bào ung thư kết tràng DLD-1 của các

phân đoạn fucoidan được chiết tách từ rong Sargassum mcclurei

Kết quả cho thấy ở nồng độ 100 μg/ml các polysacarit thử nghiệm có hoạt

tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư DLD-1. Các phân đoạn SmF1,

SmF2, SmF3 và SmF-DS lần lượt ức chế sự hình thành kết tràng của các tế bào ung

thư kết tràng DLD-1 với 17%, 48%, 20% và 18% (hình 3.9). Các kết quả này cũng

phù hợp với nghiên cứu về fucoidan có hoạt tính kháng tế bào ung thư ruột kết

DLD-1 được phân lập từ rong E. Bicyclis [121,127]. Hoạt tính sinh học của

polysacarit sulfate hóa từ rong nâu có liên quan đến một vài yếu tố đặc trưng cấu

trúc như mức độ sulfate hóa, thành phần các đường đơn cũng như kiểu liên kết

glycoside [38,81,94]. Hàm lượng sulfate của polysacarit là một trong những yếu tố

quan trọng nhất đối với các hoạt tính sinh học của chúng cũng đã được công bố bởi

SmF3-DS (100 μg/ml)

Đối chứng SmF1 (100 μg/ml)

SmF2 (100 μg/ml) SmF3 (100 μg/ml)

68

các tác giả [90,101]. Theo các kết quả nghiên cứu mà chúng tôi thu nhận được cho

thấy, mức độ sulfate hóa không hoàn toàn đóng vai trò quyết định lên khả năng ức

chế sự hình thành khuẩn lạc. Hiệu quả ức chế sự tạo thành khuẩn lạc trong các tế

bào ung thư DLD-1 của fucoidan phân đoạn SmF3 (35% sulfate) trước khi đề

sulfate hóa và sau khi đề sulfate hóa không có sự khác biệt đáng kể. Thêm nữa, hiệu

quả ức chế sự tạo thành khuẩn lạc (colonies) trong các tế bào ung thư kết tràng

DLD-1 bởi fucoidan phân đoạn SmF2 (25,7% sulfate) là cao hơn so với SmF3. Như

vậy, chúng tôi cho rằng hoạt tính gây độc tế bào ung thư kết tràng DLD-1 của

fucoidan từ S.mcclurei (SmF1, SmF2 và SmF3) có thể được giải thích là do ảnh

hưởng của các yếu tố đặc trưng cấu trúc khác ngoài vai trò của nhóm sulfate như

kiểu liên kết glycoside giữa các gốc đường và yếu tố mạch nhánh đóng vai trò quan

trọng hơn đối với hoạt tính này [98,121].

Kết luận: Lần đầu tiên, đã chứng minh được rằng fucoidan phân lập từ

S.mcclurei có hoạt tính gây độc đối với tế bào ung thư kết tràng DLD-1 ở người và

ung thư gan. Hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư DLD-1 không chỉ

phụ thuộc vào hàm lượng sulfate mà có thể còn phụ thuộc vào thành phần đường và

kiểu liên kết glycoside giữa các gốc đường trong phân tử fucoidan

Fucoidan từ rong S.swartzii có hoạt tính kháng 4 dòng tế bào ung thư là ung

thư gan, ung thư phổi, ung thư màng tim và ung thư vú MDA-MB-231.

Fucoidan từ các loài rong S.oligocystum, S.denticapum và Turbinaria ornata

có hoạt tính gây độc tế bào trên 02 dòng tế bào ung thư là ung thư phổi và ung thư

gan.

Từ kết quả tách phân đoạn và phân tích thành phần của các phân đoạn

fucoidan (hình 3.2 - hình 3.6 và bảng 3.2 - bảng 3.6) cho thấy fucoidan của rong nâu

Việt Nam nhìn chung có cấu trúc phức tạp với sự có mặt đồng thời của nhiều gốc

đường khác nhau trong phân tử, sự phân bố của nhóm sulfate trên các gốc đường

cũng không tuân theo quy luật. Nên rất khó để có thể phân tích cấu trúc chi tiết của

fucoidan. Vì vậy, chúng tôi chỉ lựa chọn những phân đoạn fucoidan có hoạt tính và

có thành phần đơn giản nhất đại diện cho các loài rong để tiếp tục nghiên cứu rõ

hơn về các đặc trưng cấu trúc của chúng.

69

3.5 . ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN

3.5.1. Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ IR

Các phân đoạn SdF3, SwF5, SpF3, SmF3 và ToF2 là những phân đoạn có

hoạt tính sinh học tốt, đồng thời có thành phần đường đơn giản nhất so với các phân

đoạn fucoidan còn lại được lựa chọn để tiếp tục phân tích các đặc trưng cấu trúc.

Các phân đoạn này có mức độ sulfate hóa khác nhau dao động từ 33,99 - 43,26%,

fucoidan của rong Turbinaria ornata có mức độ sulfate hóa cao nhất là 43,26%

(ToF2) và thấp nhất là của rong Sargassum polycystum 33,99% (SpF3) (bảng 3.2-

3.6). Sulfate là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định hoạt tính sinh

học của fucoidan, theo các tác giả [34, 38, 99, 121, 127] hoạt tính kháng đông tụ

máu và kháng ung thư của fucoidan phụ thuộc vào mật độ và vị trí của nhóm sulfate

trên các gốc đường. Vì vậy, việc phân tích hàm lượng và vị trí nhóm sulfate trên các

gốc đường trong phân tử fucoidan sẽ giúp ta làm sáng tỏ về mối quan hệ giữa hoạt

tính sinh học và đặc trưng cấu trúc của chúng. Phổ hồng ngoại IR là một trong

những phương pháp đơn giản nhất thường được sử dụng để xác định vị trí của nhóm

sulfate trên các gốc đường [23].

Phương pháp phổ hồng ngoại là phương pháp phân tích nhanh và thuận tiện

để nghiên cứu cấu trúc phân tử thông qua việc sắp xếp các vạch phổ dao động tương

ứng với nhóm nguyên tử nhất định trong phân tử. Trong phân tích cấu trúc của

polysacarit, phương pháp phổ IR cho biết các thông tin về vị trí nhóm sulfate, các

liên kết glycoside tồn tại trong phân tử fucoidan, từ đó cho biết về đặc trưng cấu

trúc của chúng. Theo các tài liệu tham khảo [5,12,25,48,98], các dao động hấp thụ ở

vùng số sóng 820-828 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O-S ở vị trí equatorial C2

hoặc/và C3, vùng 840-848 cm-1 đặc trưng cho liện kết C-O-S ở vị trí axial C4, vùng

1240-1272 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của S = O, vùng 1610-1625 cm-1 và

1410 cm-1 đặc trưng cho dao động đối xứng và không đối xứng của nhóm

cacboxylat. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các phân đoạn fucoidan được

trình bày trên hình 3.10 và phụ lục IV. Các dải hấp thụ chính trong phổ hồng ngoại

của các phân đoạn fucoidan được trình bày trong bảng 3.9

70

Bảng 3.9. Một số vân phổ đặc trưng trong phổ hồng ngoại của fucoidan

được chiết tách từ một số loài rong nâu Việt Nam

Mẫu Loài rong Số sóng dao động

đặc trưng (cm-1)

Vị trí nhóm sulfate

SdF3 Sargassum denticapum 847,90 Nhóm sulfate chủ yếu

ở vị trí C4

SpF3 Sargassum polycystum 835,40 Nhóm sulfate chủ yếu

ở vị trí C4

SwF5 Sargassum swartzii 803,77 Nhóm sulfate chủ yếu

ở vị trí C2 và/hoặc C3

SmF3 Sargassum mcclurei 839,22 Nhóm sulfate chủ yếu

ở vị trí C4

ToF2 Turbinaria ornata 820,00 Nhóm sulfate chủ yếu

ở vị trí C2 và/hoặc C3

Tương tự như phổ hồng ngoại của fucoidan chiết từ các loài rong nâu khác

trên thế giới, phổ hồng ngoại của các mẫu fucoidan chiết từ rong nâu Việt Nam

cũng chứa những tín hiệu hấp thụ ở vùng 1240-1272 cm-1 (vùng dao động đặc trưng

của liên kết S = O) và vùng 800-848 cm-1 (vùng dao động của liên kết C - O - S)

khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate. Trên phổ hồng ngoại của các mẫu fucoidan

SdF3 (S.denticapum), SpF3 (S.polycystum) và SmF3 (S.mcclurei) xuất hiện các tín

hiệu hấp thụ rộng ở 1240,98; 1248,28 và 1262,73 cm-1 thuộc về các dao động hóa

trị S=O của nhóm sulfate, bên cạnh đó các đỉnh hấp thụ mạnh trong vùng 835,40-

847,90 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C-O-S ở vị trí axial cho biết

nhóm sulfate chủ yếu liên kết ở vị trí C4 của vòng α-L-fucopyranose [25]. Tương tự

các mẫu fucoidan SdF3, SpF3 và SmF3, sự có mặt của nhóm sulfate trong mẫu

fucoidan ToF2 (Turbinaria ornata) và SwF5 (S.polycystym) được xác định dựa vào

các tín hiệu xuất hiện ở số sóng 1254,55 và 1256 cm-1 là vùng dao động đặc trưng

của liên kết S=O. Tuy nhiên, trong khi nhóm sulfate chủ yếu liên kết ở vị trí C4 của

vòng α-L-fucopyranose trong các mẫu fucoidan SdF3, SpF3 và SmF3 thì các tín

71

hiệu hấp thụ ở 820 và 803,77 cm-1 của dao động C-O-S trên phổ IR của các mẫu

ToF2 và SwF5 lại cho thấy nhóm sulfate chủ yếu xuất hiện ở vị trí C2 hoặc/và C3

của vòng α-L-Fucopyranose. Ngoài ra các tín hiệu hấp thụ xuất hiện ở vùng số sóng

580 và 626 cm-1 được cho là dao động biến dạng đối xứng và không đối xứng của

liên kết O=S=O của nhóm sulfate [21].

Hình 3.10. Phổ hồng ngoại của phân đoạn fucoidan SpF3

Như vậy, phổ IR cho ta biết sự có mặt của nhóm sulfate trong tất cả các mẫu

fucoidan nghiên cứu và thông tin về vị trí của chúng trong các gốc đường pyrannose

thông qua dao động của liên kết C-O-S. Tương tự như fucoidan của các loài rong

nâu khác thuộc cùng bộ Fucales sinh trưởng ở vùng biển ôn đới như Ascophyllum

nodosum, Fucus evanescens và Fucus serratus L. [23,24,34] nhóm sulfate của các

phân đoạn fucoidan chiết từ rong nâu Việt Nam SwF5 và ToF2 chủ yếu ở vị trí C2.

Ngược lại nhóm sulfate trong các phân đoạn fucoidan SdF3, SpF3 và SmF3 chiếm

ưu thế ở vị trí C4 của vòng fucopyranose, kết quả này cũng phù hợp với các công

bố về fucoidan được chiết từ các loài rong Undaria pinnatifida, Chorda filum,

Fucus vesiculosus và Sargassum thunbergii [21,36,39,101].

Kết luận: Qua kết quả phân tích phổ hồng ngoại một lần nữa khẳng định sự

có mặt của nhóm sulfate trong phân tử fucoidan, điều này cũng phù hợp với các kết

S = O

C-O-S

72

quả phân tích thành phần monosacarit ở bảng (3.2-3.6). Tuy nhiên phổ IR cũng chỉ

cho biết một phần thông tin về vị trí nhóm sulfate chiếm ưu thế tại vị trí C4 hay vị

trí C2/C3 trên gốc đường α-L-fucopyranose, để xác định chính xác vị trí của các

nhóm sulfate chúng ta cần thêm những thông tin từ phổ cộng hưởng từ hạt nhân

NMR và phổ khối (MS)

3.5.2. Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ NMR

* Phổ 13C-NMR:

Kết quả đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của các phân đoạn

fucoidan được đưa ra trên hình 3.11 và phụ lục III. Giống như nhiều fucoidan rong

biển khác trên thế giới đã được công bố [125,18-24,34-36], fucoidan rong nâu ở

Việt Nam cũng có phổ 13C-NMR rất phức tạp với nhiều vùng tín hiệu trùng lặp lên

nhau do trong phân tử của chúng được cấu tạo bởi các gốc đường fucose (C6H12O5)

và hexose (C6H12O6) khác nhau, điều này rất khó để giải thích được một cách đầy

đủ về cấu trúc của chúng. Tuy nhiên, trên phổ 13C-NMR của tất cả các phân đoạn

fucoidan đều có những đặc điểm chung đặc trưng cho cấu trúc của gốc α-L-Fucp đó

là những tín hiệu mạnh xuất hiện trong vùng trường cao 15-18 ppm đặc trưng cho

nhóm metyl (CH3-) và các tín hiệu trong vùng trường thấp 97-102 ppm đặc trưng

cho cacbon α-anomeric (C1) của gốc đường 1→3)-α-L-fucopyranose, vùng tín hiệu

67-86 ppm là vùng của cacbon C2-C5 của vòng pyranoid [23]. Bên cạnh đó, phổ

13C-NMR cũng cho thấy sự có mặt của gốc đường β-D-Galactose thông qua các tín

hiệu đặc trưng cho cacbon C6 không liên kết và cacbon C1 của gốc β-D-Galactose

tương ứng ở độ dịch chuyển hóa học trong vùng 61-62 ppm và 103-104 ppm [98].

Ngoài ra, các tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học 20,9 ppm và vùng (173-175 ppm)

trên phổ 13C-NMR của các phân đoạn SpF3 và SwF5 còn chỉ ra sự có mặt của nhóm

O-acetyl trong phân tử của hai loại fucoidan này.

Như vậy, qua phân tích phổ 13C-NMR chúng tôi thấy rằng các mẫu fucoidan

nghiên cứu có đặc trưng cấu trúc đúng như dự đoán từ kết quả phân tích thành phần

monosacarit, chúng thuộc nhóm sulfated galactofucan. Đặc trưng cấu trúc của các

phân đoạn fucoidan này sẽ được nghiên cứu thêm bằng phân tích phổ 1H-NMR.

73

* Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR:

Kết quả đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của các mẫu phân đoạn

fucoidan được trình bày trên hình 3.12 và phụ lục 3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

của các polysacarit nói chung và của fucoidan nói riêng đều hết sức phức tạp với độ

phân giải không cao do có rất nhiều pic trùng chập và chen lấn nhau. Vì vậy, rất khó

để giải thích thỏa đáng các tín hiệu trên phổ 1H-NMR. Mặc dù vậy, cũng giống như

các loại fucoidan đã được công bố trước đó, trên phổ proton 1H-NMR có những tín

hiệu cộng hưởng đặc trưng để nhận biết fucoidan, đó là các tín hiệu xuất hiện trong

vùng anomeric (5,0-5,5 ppm) của H1 và ở vùng trường cao 1,2-1,5 ppm của proton

H6 của vòng α-L-Fucopyranose [22-24].

Trên phổ 1H-NMR của fucoidan SdF3, các tín hiệu mạnh ở vùng trường cao

1,2 ppm thuộc về proton (H6) của nhóm methyl và các tín hiệu ở 5,0-5,1 ppm là

vùng tín hiệu đặc trưng của proton anomeric (H1) của vòng α-L-Fucpyranose liên

α-L-Fucp-C6

β-D-Gal-C6

α-L-Fucp C2-C5

β-D-Gal-C1

α-(1,3)-L-Fucp-C1

Hình 3.11. Phổ 13C-NMR của phân đoạn fucoidan SdF3

74

kết 1→3 [34]. Bên cạnh đó trên phổ 1H-NMR cũng xuất hiện các tín hiệu xác nhận

sự có mặt của gốc đường galactose thông qua các tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học

3,3 ppm và 5,3 ppm đặc trưng cho proton H6 và H1 của vòng β-D-Galactose. Ngoài

ra, nhóm tín hiệu ở 2,1 ppm còn cho thấy sự có mặt của nhóm O-acetyl.

Tương tự như phổ của fucoidan SdF3, trên phổ 1H-NMR của fucoidan SwF5

xuất hiện các tín hiệu mạnh ở vùng trường cao 1,2-1,3 ppm đặc trưng cho proton

nhóm (CH3-) của vòng fucose và nhóm tín hiệu ở 5,3-5,4 ppm đặc trưng cho proton

(H1) của gốc α-L-Fucpyranose liên kết 1→3, nhóm các tín hiệu nhỏ hơn ở 5,1-5,2

thuộc về proton (H1) của gốc α-L-Fucpyranose liên kết 1→4 [34]. Thành phần của

gốc đường galactose trong phân tử fucoidan được xác nhận thông qua các tín hiệu

đặc trưng ở 5,3 ppm và 3,5 ppm của proton H1 và H6 của vòng β-D-galactose.

Vùng tín hiệu nhỏ hơn ở 2,1-2,2 ppm đặc trưng cho proton CH3- của nhóm O-acetyl,

kết quả này cho thấy trong phân tử fucoidan SwF5 có tồn tại gốc acetyl [23-24]. Kết

α-L-Fucp-H6

β-D

-Gal

p-H

6

β-D-Galp-H1

α-(

1,3)

-L-F

ucp

-H1

OAc(CH3)

Hình 3.12. Phổ 1H-NMR của phân đoạn SdF3 (Sargassum denticapum)

C2-C5

75

hợp với các dữ liệu thu được từ phân tích phổ hồng ngoại (bảng 3.9), ta có thể đưa

ra nhận xét về đặc trưng cấu trúc của fucoidan SwF5 gồm chủ yếu là liên kết

(1→3)-α-L-Fucp và một phần liên kết (1→4)-α-L-Fucp, nhóm sulfate ở vị trí C2

của vòng fucose chiếm ưu thế. So với công bố trước đó của tác giả [4] thì fucoidan

của loài rong này chỉ tồn tại kiểu cấu trúc là liên kết (1→3)-α-L-Fucp, tuy nhiên

nhóm sulfate ở vị trí C4 chiếm ưu thế và một phần ở vị trí C2. Các kết quả tương tự

cũng đã được công bố về fucoidan của rong Fucus vesiculosus, sự khác biệt về đặc

trưng cấu trúc của fucoidan có thể được giải thích do ảnh hưởng của kỹ thuật chiết

tách cũng như phương pháp phân tích cấu trúc khác nhau [101,103].

Phổ 1H-NMR của fucoidan phân đoạn SpF3 (Sargassum polycystum) cũng

cho thấy những đặc điểm tương tự như phổ 1H-NMR của fucoidan từ Sargassum

swartzii với 03 vùng tín hiệu đặc trưng của fucoidan với cấu tạo mạch chính là : thứ

nhất là nhóm tín hiệu mạnh ở vùng trường cao 1,2-1,5 ppm đặc trưng cho proton

(H6) của nhóm methyl vòng fucose, thứ hai là nhóm tín hiệu ở vùng trường thấp

4,9-5,2 ppm đặc trưng cho proton (H1) của gốc (1→3)-α-L-Fucopyranose, thứ 3 là

các tín hiệu ở δ = 2,1 ppm cho thấy sự có mặt của nhóm acetyl [23-27]. Gần đây đặc

trưng cấu trúc của fucoidan từ loài rong này cũng đã được công bố bởi Bilan và

cộng sự [27] với bộ khung mạch chính được cấu tạo bởi các gốc (1→3)-α-L-Fucp,

gốc đường (1→2)-β-D-Galp chèn vào sau mỗi 03 gốc liên kết (1→3)-α-L-Fucp,

nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4 của cả gốc đường fucose và galactose.

Phổ 1H-NMR của fucoidan SmF3 (Sargassum mcclurei) cũng cho thấy

những đặc điểm chung như fucoidan từ các loài rong khác thuộc chi Sargssum đó là

dạnh cấu trúc mạch chính được tạo nên bởi gốc α-L-Fucp liên kết 1→3, nhóm

sulfate ở vị trí C4 (bảng 3.9).

Tương tự như phổ 1H-NMR của các loại fucoidan khác thuộc chi Sargssum,

phổ 1H-NMR của fucoidan ToF2 (Turbinaria ornata) gồm nhiều cụm tín hiệu

chồng lấp lên nhau với độ phân giải rất kém nên việc có thể giải thích chi tiết các tín

hiệu trên phổ này là điều rất khó. Tuy nhiên, giống như nhiều fucoidan rong nâu

khác, phổ 1H-NMR luôn xuất hiện những tín hiệu đặc trưng giúp ta nhận biết về

fucoidan, đó là các tín ở 1,2-1,4 ppm (H6-nhóm methyl) và 5,1-5,3 ppm (H1-

76

anomeric) của gốc 1→3)-α-L-Fucp. Các tín hiệu ở 5,3 ppm và 3,5 ppm đặc trưng

cho proton H1 và H6 của gốc β-D-Galactose, ngoài ra tín hiệu ở 2,1-2,3 ppm còn

xác nhận sự có mặt của nhóm O-acetyl trong phân tử của fucoidan này. Kết hợp với

các kết quả phân tích thành phần đường (bảng 3.6) và phân tích phổ hồng ngoại

(bảng 3.9) chúng tôi đưa ra kết luận về đặc trưng cấu trúc của fucoidan phân đoạn

ToF2 như sau: đây là loại sulfated galactofucan, cấu trúc mạch chính gồm các liên

kết 1→3)-α-L-Fucp, nhóm sulfate chủ yếu chiếm vị trí C2 của gốc fucose. Kết quả

này cũng cho thấy sự phù hợp với công bố của tác giả [122] về đặc trưng cấu trúc

của fucoidan không được phân đoạn tinh chế từ rong Turbinaria ornata với cấu tạo

mạch chính là các liên kết 1→3)-α-L-Fucp, gốc 1→4)-β-D-Galp tồn tại ở mạnh

nhánh, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và một lượng nhỏ ở C4.

Kết luận:

Kết quả phân tích thành phần monosacarit và phân tích phổ (IR và NMR)

của 05 loại fucoidan chiết tách từ rong nâu Việt Nam cho thấy fucoidan từ các loài

rong khác nhau có thành phần đường đơn, mức độ sulfate hóa, vị trí nhóm sulfate

trên các gốc đường cũng như cấu trúc mạch chính khác nhau. Fucoidan từ loài rong

S.swartzii, S.denticapum và Turbinaria ornata là các galactofucan sulfate hóa và

acetyl hóa một phần với mạch chính là →3)-α-L-Fucp-(1→, ở mạch nhánh hoặc

xen kẽ trong mạch chính có thể tồn tại gốc β-D-Galp và/hoặc liên kết →4)-α-L-

Fucp-(1→. Nhóm sulfate ở vị trí C-2 vòng fucose và/hoặc glactose chiếm ưu thế.

Fucoidan từ rong S.polycystum là polysacarit dạng galactofucan sulfate hóa cao và

bị acetyl hóa một phần với khung mạch chính là →3)-α-L-Fucp-(1→, ở mạch nhánh

hoặc xen kẽ trong mạch chính có thể tồn tại gốc β-D-Galp. Nhóm sulfate chủ yếu ở

vị trí C-4 của vòng fucose và/hoặc glactose. Trong khi đó fucoidan được chiết từ

rong S.mcclurei cũng thuộc nhóm galactofucan sulfate hóa cao, mức độ sulfate hóa

là (35%) nhưng không bị acetyl hóa như fucoidan từ S.swartzii, S.polycystum và

Turbinaria ornata, nhóm sulfate chủ yếu chiếm vị trí C-4 của vòng fucose hoặc/và

galactose. Fucoidan từ S.mcclurei có cấu tạo mạch chính là →3)-α-L-Fucp-(1→ và

một phần là liên kết →4)-α-L-Fucp-(1→ cũng như gốc β-D-Galactose có thể tồn tại

xen kẽ trong mạch chính hoặc ở mạch nhánh.

77

Như vậy, fucoidan của 05 loài rong nâu Việt Nam đã phân tích ở trên đều

thuộc nhóm galactofucan sulfate hóa với các dạng cấu trúc không đồng nhất và bị

chẻ nhánh một cách ngẫu nhiên, đôi khi còn bị acetyl hóa. Trong thành phần các

đường đơn tạo nên polymer fucoidan ngoài hai thành phần chính là fucose và

galactose còn tồn tại các đường đơn khác như mannose, xylose và glucsoe với hàm

lượng nhỏ hơn. Những đặc điểm này tạo ra sự đa dạng cấu trúc cũng như hoạt tính

sinh học của fucoidan, nhưng đồng thời cũng làm cho việc phân tích chi tiết cấu

trúc của fucoidan trở nên vô cùng phức tạp. Đó chính là lý do tại sao cho đến nay

trên thế giới mới chỉ có một vài công bố về cấu trúc hoàn chỉnh của fucoidan,

nhưng không một công bố nào đưa ra được mối liên hệ có tính quy luật cho cấu trúc

fucoidan với các bộ rong.

Do vậy, chúng tôi lựa chọn phân đoạn fucoidan SmF3 của rong S.mcclurei

để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm cấu trúc. Vì đây là phân đoạn fucoidan

có hoạt tính gây độc tế bào tốt trên dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 và có thành

phần đơn giản nhất trong số các phân đoạn fucoidan còn lại.

3.6. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN SmF3 ĐƯỢC

CHIẾT TÁCH TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI

Fucoidan phân đoạn SmF3 từ rong Sargassum mcclurei được lựa chọn để

nghiên cứu cấu trúc vì đây là phân đoạn galactofucan sulfate hóa cao và có thành

phần đơn giản nhất (chỉ gồm hai gốc đường fucose và galactose). Đồng thời

Sargassum mcclurei cũng là loài rong nâu phổ biến ở nước ta, phân bố ở các tỉnh

Đà Nẵng, Khánh Hòa, Ninh Thuận và Bình Thuận trong đó trữ lượng lớn nhất ở

vùng biển Khánh Hòa [1,6-8].

Theo kết quả ở mục 3.3, phân đoạn SmF3 có thành phần chính là fucose,

galactose và sulfate (35%), tỉ lệ fucose:galactose ≈ 1:0,71, ngoài ra không chứa

thêm các thành phần đường khác (bảng 3.5). Phổ FT-IR của phân đoạn SmF3 cũng

như phổ hồng ngoại của các phân đoạn fucoidan rong nâu khác đã được mô tả ở

mục 3.5.1 giúp ta nhận biết sự có mặt của nhóm sulfate thông qua các tín hiệu ở

1262,73 cm-1 (S=O) và 839,22 cm-1 (S-C-S) (hình 3.13), ngoài ra đỉnh hấp thụ ở số

sóng 839,22 cm-1 còn cho biết vị trí nhóm thế sulfate trong phân tử fucoidan SmF3

78

ở axial (C4) chiếm ưu thế. Tuy nhiên, dữ liệu phổ hồng ngoại chỉ cho biết thông tin

nhóm sulfate ở vị trí axial (C4) hay equatorial (C2 hoặc C3) của vòng pyranose nói

chung mà không phân biệt được nó thuộc vòng fucose hay galactose. Vì vậy, để giải

quyết vấn đề này các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối sẽ tiếp

tục được nghiên cứu.

Tương tự như nhiều fucoidan rong nâu tự nhiên khác, fucoidan SmF3 có phổ

13C-NMR rất phức tạp, nên việc giải thích chính xác các tín hiệu trên phổ này là rất

khó. Một số tín hiệu chính trên phổ 13C-NMR của SmF3 cũng cho thấy là những tổ

hợp nhiều tín hiệu chồng lấp lên nhau. Điều này chỉ ra sự đa dạng trong vị trí của

các liên kết glycoside và/hoặc mô hình sulfate hóa kép trong phân tử fucoidan. Phổ

13C-NMR của fucoidan tự nhiên phân đoạn SmF3 (hình 3.14) có chứa một vài tín

hiệu mạnh trong các vùng anomeric (96,0-100,4 ppm) và vùng trường cao (15,5-

17,7 ppm) đặc trưng cho C-1 và C-6 của vòng α-L-fucopyranose. Bên cạnh đó các

tín hiệu ở 102,7 ppm, 61,7 và 67,0 ppm lần lượt đặc trưng cho cacbon C-1, C-6 tự

do và C-6 có liên kết của gốc β-D-galactose [98]. Tổ hợp phức tạp các tín hiệu ở

C-O-S

S=O

Hình 3.13: Phổ FT-IR của fucoidan- SmF3 từ rong nâu Sargassum mcclurei

79

67,8-85,0 ppm là của cacbon vòng pyranose C2-C5. Ngoài ra không phát hiện thấy

các tín hiệu chứng tỏ sự có mặt của các nhóm acetat và axít uronic trong phân tử

fucoidan SmF3.

Kết quả đo phổ 1H-NMR của phân đoạn fucoidan SmF3 (phụ lục 3) cũng

tương tự như phổ của các fucoidan đã được công bố với nhiều vùng tín hiệu trùng

lấp nhau, nên việc giải thích thỏa đáng các tín hiệu trên phổ này là điều không thể.

Tuy nhiên, một phần thông tin về đặc trưng cấu trúc của fucoidan vẫn có thể thu

nhận được từ phổ 1H-NMR thông qua các tín hiệu đặc trưng của gốc đường fucose

và galactose. Đó là các tín hiệu mạnh trong vùng trường cao 1,2-1,4 ppm của proton

H6 (nhóm methyl) và vùng 5,2-5,3 ppm thuộc về proton H1(α-anomeric) của gốc

1→3)-α-L-Fucp, tín hiệu nhỏ hơn ở 5,0 ppm là H1 của gốc 1→4)-α-L-Fucp. Bên

cạnh đó, các tín hiệu đặc trưng cho proton H6 và H1 của gốc β-D-galactose được

xác nhận thông qua các tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học 3,7 ppm và 5,4 ppm.

Hình 3.14: Phổ 13C-NMR của fucoidan- SmF3 từ rong nâu Sargassum mcclurei

α-L-Fucp-C6

β-D-Gal-C6

α-(1,3)-L-Fucp β-D-Gal-C1

C2-C5

80

* Khử sulfate

Phương pháp khử sulfate được thực hiện nhằm mục đích làm đơn giản hóa

cấu trúc của fucoidan phân đoạn SmF3. Phổ 13C-NMR của fucoidan đề sulfate hóa

SmF3-DS (phụ lục 3) chứa một nhóm lớn các tín hiệu trong vùng anomeric (96-104

ppm). Kết quả này cho thấy fucoidan SmF3 có thể chứa một vài dạng liên kết khác

nhau của các gốc đường fucose và galactose. Tín hiệu của pic ở 61,7 ppm đặc trưng

cho cacbon C-6 không liên kết của gốc β-D-Galactose đã tăng lên một cách đáng kể

sau khi thực hiện khử nhóm sulfate, điều này chỉ ra rằng nhóm sulfated có mặt ở

C-6 của một số gốc galactose.

Do fucoidan là một dạng polysacarit sulfate hóa dị thể và bị phân nhánh, nên

phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chúng thường rất phức tạp với nhiều cụm tín hiệu

có độ phân giải kém, dẫn đến việc phân tích kiểu liên kết giữa các gốc đường gặp

nhiều khó khăn. Methyl hóa là một trong những phương pháp phân tích rất hiệu quả

để xác định vị trí liên kết giữa các gốc đường trong phân tử fucoidan [27].

* Phân tích liên kết bằng phương pháp methyl hóa

Phương pháp methyl hóa để phân tích liên kết glycoside đã được sử dụng

rộng rãi trong phân tích liên kết các polysacarit fucoidan [12,35,80,96]. Trong phân

tích cấu trúc của các polysacarit, phương pháp methyl hóa không chỉ cho chúng ta

biết về vị trí các liên kết giữa các monomer mà còn cho biết những thông tin dự

đoán vị trí các liên kết của nhóm thế sulfate trong phân tử của polysacarit [12].

Thành phần chính của fucoidan phân đoạn SmF3 là đường fucose và galactose

(bảng 3.5) cùng với kết quả phân tích phổ hồng ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt

nhân (1H-NMR và 13C-NMR) cho thấy fucoidan phân đoạn này có thể tồn tại các

kiểu liên kết (1,3)-α-L-Fucose và (1,6)-β-D-Galactose và/hoặc (1,2)-β-D-Galactose.

Vì vậy, mục đích của phân tích liên kết glycoside sẽ giúp ta kiểm tra lại các thông

tin dự đoán trên.

Fucoidan sau khi đã khử nhóm sulfate (SmF3-DS) được methyl hóa bằng

methyl iodua với sự có mặt của NaOH trong DMSO [27]. Polysacarit methyl hóa

được thủy phân, khử mở vòng và acetyl hóa, các dẫn xuất aditol acetacte được phân

tích bằng GC-MS [24]. Dựa trên cơ sở xác định dạng và số lượng dẫn xuất methyl

81

ete của các gốc đường sau khi methyl hóa các nhóm hydroxy, chúng tôi thu được

kết quả như trong bảng 3.10.

Kết quả bảng 3.10 cho thấy fucoidan SmF3 chứa chủ yếu các gốc fucose liên

kết 3 (46%), một lượng ít hơn các gốc galactose liên kết 4 (18%), fucose liên kết 4

(12%) và galactose liên kết 6 (2%). Fucoidan SmF3 chứa fucose và galactose ở đầu

cuối không khử và nó chỉ chứa gốc galactose liên kết (1→6) bị khử ở cuối mạch.

Việc phát hiện các gốc 3,4- và 2,4-di-O-methyl-galactitol cho thấy nhóm

sulfate ở vị trí C2/C3 và/hoặc C4 của galactose và/hoặc gốc galactose tồn tại ở

mạch nhánh của fucoidan SmF3.

Bảng 3.10. Phân tích methyl hóa của phân đoạn fucoidan đề sulfate hóa SmDsF3.

Thành phần các gốc đường (methylated

fucitol hoặc galactitol acetate)

mol

%

Dạng liên kết

2,3,4-tri-O-methyl-fucitol 5 Fuc1→

2,3-di-O-methyl-fucitol 12 →4Fuc1→

2,4-di-O-methyl-fucitol 46 →3Fuc1→

2,3,4,6-tetra-O-methyl-galactitol 8 Gal1→

2,3,6-tri-O-methyl-galactitol 18 →4Gal1→

2,3,4-tri-O-methyl-galactitol 2 →6Gal1→

3,4-di-O-methyl-galactitol 1 →2,6Gal1→

2,4-di-O-methyl-galactitol 2 →3,6Gal1→

1,2,3,4-tetra-O-methyl-galactitol 6 →6Gal

Như vậy, bằng các phương pháp phân tích hóa học và các phương pháp phân

tích phổ IR, NMR chúng tôi đã xác định được thành phần monosacarit, kiểu liên kết

glycoside giữa các gốc đường và vị trí nhóm sulfate trong phân tử fucoidan SmF3.

Từ đó đưa ra dự đoán về đặc trưng cấu trúc của fucoidan SmF3 như sau: mạch

chính được tạo nên chủ yếu bởi gốc α-L-fucose-(1→3), ngoài ra trong thành phần

82

mạch chính hoặc mạch nhánh còn chứa các gốc α-L-fucose-(1→4); galactose-

(1→4) và galactose-(1→6). Nhóm sulfate ở vị trí C2 và/hoặc C4 trên gốc đường

fucose và galactose.

Để khẳng định lại cấu trúc dự đoán trên và xác định trật tự liên kết giữa các

gốc đường trong phân tử fucoidan SmF3 chúng tôi tiến hành phân tích khối phổ

nhiều lần (MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS) của các oligofucoidan SmF3.

* Phổ khối của oligosacarit được điều chế bằng phương pháp tự thủy

phân fucoidan SmF3

Để nghiên cứu chi tiết đặc trưng cấu trúc của fucoidan SmF3, chúng tôi tiến

hành phân tích khối phổ nhiều lần của fucoidan-oligosacarit thu được bằng phương

pháp tự thủy phân fucoidan SmF3 tự nhiên (autohydrolysis) [18] (mục 2.2.7). Hiệu

suất của phân đoạn oligosacarit SmF3-AH đạt được là 85% so với SmF3. Kết quả

phân tích thành phần monosacarit của phân đoạn này cho thấy hàm lượng (% mol)

fucose chiếm 68,5%, hàm lượng galactose chiếm 31,5%, như vậy hàm lượng tương

đối của galactose trong thành phần đường đơn của oligosacarit SmF3 (Fuc:Gal =

2:1) đã tăng lên so với polysacarit fucoidan SmF3 (Fuc:Gal = 3:2). Galactose chiếm

hàm lượng cao trong hỗn hợp tự thủy được cho là vai trò cấu trúc của gốc đường

này trong fucoidan SmF3 có thể khác so với galactose trong fucoidan được chiết từ

các loài rong thuộc bộ Laminariales, galactose trong fucoidan của các loài rong bộ

Laminariales có thể tạo nên các đoạn mạch kéo dài [17,27,129]. Hơn nữa, hàm

lượng galactose trong các phân đoạn trọng lượng phân tử thấp (low molecular

weight-LMW) thu được từ các sản phẩm thủy phân của galactofucan từ Laminaria

gurjanovae [114] và Costaria costata [17] không vượt quá 10% mol. Trong khi đó

thành phần galactose trong phân đoạn trọng lượng phân tử cao thu được sau thủy

phân (phần bền với quá trình tự thủy phân) của fucoidan từ các loài rong

Laminariales thường chiếm hàm lượng lớn. Ngược lại, kết quả phân tích thành phần

đường đơn của phân đoạn trọng lượng phân tử cao thu được sau quá trình tự thủy

phân fucoidan SmF3 cho thấy hàm lượng galactose giảm (14,7%) và hàm lượng

fucose tăng lên (85,3%). Kết quả này cho thấy fucoidan SmF3 không chứa các đoạn

mạch dài được tạo nên chỉ bởi các gốc galactose, để chứng minh thêm cho dự đoán

83

này chúng tôi tiến hành phân tích khối phổ hai lần với chế độ ion âm (negative-ion

tandem MS) của các đoạn mạch ngắn nhằm xác định trật tự của các liên kết đường

trong phân tử fucoidan. Phổ khối của oligofucoidan SmF3-AH được đo theo hai

phương pháp là MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS. Kết quả phân tích phổ khối

MALDI-TOF/MS của oligofucoidan SmF3-AH được trình bày trên hình 3.15, phổ

khối ESI-MS (phụ lục 5).

Hình 3.15. Phổ khối MALDI-TOF chế độ ion âm của fucooligosacarit SmF3

từ rong Sargassum mcclurei nhận được bằng tự thủy phân

Dựa vào các tài liệu đã công bố về nghiên cứu cấu trúc của oligosacarit

fucoidan [17-20,124] và cơ chế phân mảnh theo quy tắc được đề xuất bởi Domon và

Costello [47] chúng tôi đã tính toán xác định được đặc trưng cấu trúc của các mảnh

ion monosacarit và oligosacarit chính trên phổ MALDI-TOF/MS và ESI/MS như

trình bày trong bảng 3.11. Kết quả đo khối phổ của hai phương pháp cho thấy thành

phần các mảnh chính của hỗn hợp là monosulfated fucose ở m/z: 243,0. Theo kết

quả phân tích hàm lượng sulfate trong bảng 3.5, fucoidan SmF3 có mức độ sulfate

hóa cao (35%), nhưng cả hai phương pháp đều không phát hiện thấy gốc disulfated

fucose trong hỗn hợp oligosacarit, trong khi đó fucan sulfate hóa cao từ rong

84

Laminaria cichorioides cho kết quả ngược lại [19]. Tuy nhiên, các kết quả thu được

trên cả hai phổ ESI/MS và MALDI/MS đều có chứa một tập hợp các ion mảnh với

tín hiệu mạnh như (m/z: 224,98; 387,09; 533,14; 695,15 và các mảnh ion khác) và

lượng lớn các monosulfated fucooligosacarit (m/z: 389,10; 535,15; 681,16 và

827,13). Sự phân mảnh quá nhỏ, cùng với việc tách nhóm sulfate cũng được phát

hiện trong khi thu nhận oligosacarit từ 2,4-disulfated 3-linked α-L-fucan của rong

S. cichorioides [19]. Kết quả phân tích methyl hóa (bảng 3.10) đã xác nhận được sự

có mặt của gốc 3-linked α-L-Fucp trong thành phần cấu tạo của fucoidan SmF3.

Các kết quả phân tích phổ khối đã chỉ ra sự khác nhau của oligosacarit có chứa

fucan (thu được bằng tự thủy phân trong cùng điều kiện) với mạch chính được tạo

nên bởi các các gốc Fucopyranose liên kết tuần tự α-(1→3)-/α-(1→4)- và ít bị

sulfate hóa. Đó là dạng liên kết α-(1→4)- thường bị thủy phân chậm hơn liên kết α-

(1→3)- [18]. Trên phổ MALDI-TOF/MS (hình 3.15) và ESI-MS (phụ lục 5) cho

thấy các thành phần của hỗn hợp tự thủy phân được tạo ra trong các nguồn ion hóa

ESI và MALDI khác nhau không đáng kể. Các mảnh ion được sulfate hóa nhiều lần

(lên tới 3 nhóm sulfate trên phân tử) còn lại trong phổ ESI-MS dễ dàng hơn trong

MALDI/MS, trong phổ MALDI thường chỉ có thể phát hiện thấy các mảnh ion

sulfate hóa bậc 2. Ngược lại, sulfated fucan của rong nâu Fucus evanescens dễ dàng

sinh ra các oligosacarit sulfate hóa mạnh (tới 5 nhóm sulfate trên phân tử) khi đo

bằng phương pháp MALDI-TOF/MS [18]. Vì vậy, sự khử sulfate quá mức có khả

năng là do ảnh hưởng của đặc trưng cấu trúc của các hợp phần hơn là yếu tố tác

động do phương pháp ion hóa của phổ khối tạo ra. Tuy nhiên, như đã biết phương

pháp MALDI-TOF/MS thường được sử dụng có hiệu quả tốt hơn khi phân tích các

hỗn hợp phức tạp [60]. Như vậy, có khả năng là do fucoidan SmF3 chứa cả hai gốc

galactose và fucose sulfate hóa cao, được sắp xếp gần các nhóm sulfate về không

gian, điều này dẫn đến đẩy mạnh sự phân mảnh/đề sulfate hóa quá mức trong quá

trình tự thủy phân và/hoặc trong nguồn ion của phổ khối. Để làm sáng tỏ thêm về

nhận định này chúng tôi tiếp tục tiến hành phân tích khối phổ nhiều lần của các

mảnh ion chính và các mảnh oligosacarit đặc trưng được tạo ra trong cả hai phương

pháp phổ MALDI-TOF/MS và ESI-MS.

85

Bảng 3.11. Các đặc trưng cấu trúc của một số oligosacarit nhận được từ fucoidan

SmF3 của rong S. mcclurei bằng tự thủy phân

m/z

MALDI

[M* - Na]-

ESI

[M - nNa]n−

Thành phần/đặc trưng cấu trúc của monosacarit

và oligosacarit

243,00 243,016 Fuc(4 SO3−), Fuc(2 SO3

−), Fuc(3 SO3−)

- 259,012 Gal(4(6) SO3−), Gal(2 SO3

−)

389,10 389,077 [Fuc2(SO3)]−

405,10 405,070 Gal(2 SO3−)-(1,3)-Fuc

491,04 234,0102- Fuc(2 SO3−)-(1,3)-Fuc(2 SO3

−)

Fuc-(1,3)-Fuc(2,4 SO3−)

Fuc(2 SO3−)-(1,4)-Fuc(2 SO3

−) **

- 182,3233- Fuc(2 SO3−)-(1,4)-Fuc (2,3 SO3

−)

Fuc(2,4 SO3−)-(1,3)-Fuc **

- 187,6542- Gal(4/6,3 SO3−)-(1,3/4)-Fuc(2/3SO3

−)

Fuc(2,4 SO3−)-(1,4)-Gal(2 SO3

−)

507,03 242,008 Gal(2 SO3−)-(1,3)-Fuc(2 SO3

−)

Gal(2 SO3−)-(1,3)-Fuc(2 SO3

−) **

535,15 535,136 [Fuc3(SO3)]−

- 231,007 [Fuc3(SO3)]3−

551,15 - Gal(2SO3−)-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc

- 236.341 [Fuc2Gal(SO3)3]3−

653,05 315,0402- [Fuc2Gal(SO3Na)2 − Na]−

681,16 - [Fuc4(SO3)]−

697,15 - [Fuc3Gal(SO3)]−

783,04 380,0742- [Fuc4(SO3Na)2 − Na]−

799,03 388,0702- [Fuc3Gal(SO3Na)2 − Na]−

- 285,0283- Gal(2 SO3−)-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc(SO3

−)-(1,3)-Fuc(SO3−)

Gal(4/6,2 SO3−)-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc(2 SO3

−)

Fuc-(1,4)-Gal(3 SO3−)-(1,3)-Fuc(2 SO3

−)-(1,3)-Fuc(2SO3−)

827,13 - [Fuc5(SO3)]−

843,12 - [Fuc4Gal(SO3)]−

859,10 - [Fuc3Gal2(SO3)]−

944,97 460,0942- [Fuc4Gal(SO3Na)2 - Na]−

86

960,95 - [Fuc(2SO3Na)-(1,4)-Gal-(1,3)-Fuc(2SO3Na)-(1,4)-Gal-(1,3)-Fuc - Na]-

[Fuc(2SO3Na)-(1,4)-Gal(2SO3Na)-(1,3)-Fuc-(1,4)-Gal-(1,3)-Fuc - Na]-

[Gal(2SO3Na)-(1,3)-Fuc(2SO3Na)-(1,4)-Gal-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc - Na]-

[Gal(4SO3Na)-(1,3)-Fuc-(1,4)-Gal-(1,3)-Fuc(4SO3Na)-(1,3)-Fuc - Na]-

- 339,0513- [Fuc3Gal2(SO3)3]3−

989,05 - [Fuc5Gal(SO3)−

1005,04 - [Fuc4Gal2(SO3)]−

1062,79 338,551 [Fuc3Gal2(SO3Na)3 - Na]-

1090,87 - [Fuc5Gal(SO3Na)2 − Na]−

1106,87 541,065 [Fuc4Gal2(SO3Na)2 − Na]−

*M: muối natri sulfate oligosacarit ** Các ion mảnh đặc trưng cho kiểu liên kết có cường độ thấp

Bằng phương pháp khối phổ nhiều lần đo với chế độ ion âm sử dụng cả hai

phương pháp ESI-MS/MS và MALDI-MS/MS, các đặc trưng cấu trúc của một số

mảnh ion chính sẽ được làm sáng tỏ. Theo các tài liệu đã công bố về nghiên cứu cấu

trúc của các oligosacarit từ carrageenan, glucosaminoglucans và fucoidan

[12,61,60], cho thấy phổ ion sản phẩm của [M-Na]- thuộc về số lượng lớn các mảnh

dạng B- và C- được sinh ra do phân cắt liên kết glycoside về phía đầu mạch không

khử (danh pháp và cơ chế phân mảnh theo đề xuất bởi Domon và Costello [47]),

trong khi đó mảnh dạng Y- được sinh ra do sự phân cắt liên kết glycoside về phía

đầu mạch khử và chủ yếu xảy ra ở các gốc sulfate hóa [138]. Kiểu phân mảnh xảy

ra ở liên kết glycoside phù hợp với sự chuyển hydrogen thông qua trung gian sulfate

để tạo thành ion dạng B1- như đã được đề xuất trước đó bởi Saad và cộng sự [112].

Cơ chế phân mảnh này đã chứng minh cho nhận định rằng nếu gốc sulfate của

oligosacarit gần hơn về không gian với liên kết glycoside, thì dễ xảy ra sự phân

mảnh ở liên kết glycoside và tạo ra mảnh B1- . Các phương pháp hóa học tính toán

và khối phổ ESI-MS/MS trên các gốc fucose sulfate hóa ở vị trí C2 và C4 gần đây

đã phát hiện ra là các ion mảnh 0,2X/0,2A chỉ được sinh ra khi nhóm hydroxyl ở vị trí

C3 không bị thế [124]. Như vậy, khi các oligosacarit bị thế hoặc/và có liên kết ở vị

trí C3 bị phân mảnh trong phổ CID ESI/MS/MS hoặc MALDI-TOF/MS/MS không

thể xuất hiện sự phân mảnh phá vỡ vòng đường.

87

Trên phổ ion-âm ESI-MS/MS của mảnh monosulfated galactose [GalSO3]- ở

m/z 259,02 (phụ lục 5) xuất hiện hai tín hiệu chính có cường độ mạnh tương đương

nhau ở số khối m/z 138,98 (0,2X) và m/z 198,99 (0,2A). Theo công bố của Tissot và

cộng sự [124] mảnh m/z 138,98 (0,2X) đặc trưng cho vị trí nhóm sulfate ở C-2,

mảnh m/z 198,99 (0,2A) đặc trưng cho vị trí nhóm sulfate ở C-4. Tín hiệu phụ đi

kèm có cường độ nhỏ hơn ở m/z 180,98 (0,2A-H2O) được cho là mảnh con của mảnh

(0,2A) khi mất đi một phân tử nước. Như vậy, với sự xuất hiện đồng thời của hai tín

hiệu ở m/z 138,98 và m/z 198,99 có thể thấy các gốc Galactose được sulfate hóa ở

cả C-2 và C-4 [86]. Kết quả đo phổ 13C-NMR của fucoidan khử sulfate SmF3-DS

(phụ lục 3) cho thấy tín hiệu nhóm methyl C-6 không liên kết của vòng Galactose

tăng lên đáng kể so với fucoidan SmF3 trước khi được khử sulfate, điều này cho

thấy nhóm sulfate có thể tồn tại ở vị trí C-6 của gốc đường này. Như vậy, mảnh ở

m/z 259,02 tương ứng với hai dạng cấu tạo là Gal(4/6SO3-) và Gal(2SO3

-)

Hình 3.16. Phổ khối MALDI-MS/MS của mảnh [FucSO3]- ở số khối 225,0 (A) và

phổ khối ESI-MS/MS của mảnh [FucSO3]- ở số khối 243,02 (B)

Kết quả đo phổ ESI-MS/MS và MALDI-TOF/MS/MS ở chế độ ion âm của

mảnh fucose monosulfate [FucSO3]- ở m/z 243,0 được thể hiện trên hình 3.16 A,B.

88

Tương tự như các kết quả đã được công bố với fucoidan từ rong S.cichorioides, các

tín hiệu ở m/z 182,9 và m/z 138,9 cho thấy các gốc α-L-Fucp sulfate hóa ở C-4 và

C-2 [124]. Trên phổ ESI-MS/MS các tín hiệu ở m/z 182,9 và m/z 138,9 có cường

độ tương đương nhau, tuy nhiên trên phổ MALDI-TOF/MS/MS tín hiệu ở m/z

182,9 cao hơn so với tín hiệu ở m/z 138,9 (hình 3.16 A) kết quả này có thể đã xảy ra

sự mất gốc fucose sulfate hóa ở C-2 khi sử dụng nguồn ion MALDI [19]. Tín hiệu

nhỏ ở m/z 168,9 được phát hiện trong cả hai kỹ thuật MALDI-MS/MS và

ESI-MS/MS là tín hiệu mảnh đặc trưng của gốc fucose sulfate hóa ở vị trí C-3, vì

một mảnh ion tương tự (có tín hiệu thấp) cũng được phát hiện trong phổ khối

ESI-MS/MS của chất chuẩn α-L-Fucp sulfate hóa ở vị trí C-3 [124]. Bên cạnh đó,

tín hiệu của mảnh ion ở m/z 225,0 được sinh ra do gốc fucose monosulfate

[FucSO3]- mất đi một phân tử nước cũng rất thấp. So với các kết quả phân tích phổ

khối MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS của fucose monosulfate của fucoidan từ

rong Fucus evanescens thì tín hiệu mảnh ion ở m/z 168,9 không được phát hiện,

nhưng tín hiệu của mảnh ion ở m/z 225,0 lại tăng lên [18]. Như vậy, sự phân mảnh

cùng với đề sulfate hóa của các oligosacarit trong nguồn ion hóa của phổ khối có

thể được giải thích bởi khuynh hướng phân ly gần với vị trí nhóm sulfate của gốc

fucose sulfate hóa ở vị trí C3, cơ chế này dường như được trợ giúp bởi sự phân tách

của phần lớn các gốc galactose liên kết 4, cho dù các ion mảnh được trộn lẫn vào

nhau. Như vậy, phổ MS/MS của mảnh ở m/z 243,0 cho thấy nó là hỗn hợp của hai

monosulfate fucose gồm Fuc(4 SO3-) và Fuc(2 SO3

-) (hình 3.16A)

Trên phổ MALDI-TOF/MS/MS (hình 3.17A) và ESI/MS/MS của mảnh

[Fuc2(SO3Na)2-Na]- ở m/z 491,0 đều cho thấy thành phần của hầu hết các mảnh ion

chính tương tự với phổ MS/MS của mảnh ion mẹ cùng loại [Fuc2(SO3Na)2-Na]-

được tạo ra từ fucoidan có thành phần là 1,3-α-L-Fucose của rong L.cichorioides

[19]. Như vậy, mảnh disacarit [Fuc2(SO3Na)2-Na]- ở m/z 491,0 có thể được sinh ra

chủ yếu từ gốc (1→3)-α-L-Fucp, theo kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa

gốc (1→3)-α-L-Fucp trong phân tử fucoidan SmF3 chiếm 46% (bảng 3.10). Mảnh

ion ở m/z 326,9 tương ứng với gốc disulfate α-L-Fucp ở phía đầu mạch không khử

không được phát hiện thấy có thể do nhóm sulfate ở vị trí C-4 của gốc này đã bị

89

phân tách và/hoặc C-4 là điểm chẻ nhánh của mạch chính 1→3)-α-L-Fucp, kết quả

phân tích methyl hóa cũng cho thấy gốc 1→4)-α-L-Fucp chiếm 12% (bảng 3.10).

Tín hiệu có cường độ cao ở m/z 371,1 tương ứng với mảnh [M-NaHSO4]- được sinh

ra khi mảnh ion mẹ mất đi một gốc sulfate [124], kết hợp với các tín hiệu có cường

độ cao của ion Y1 tại m/z 243,0 được cho là nhóm sulfate ở vị trí C-2 của gốc

fucose ở đầu khử. Tính hiệu mạnh của ion B1 ở m/z 225,0 cùng với tín hiệu nhỏ hơn

của mảnh 0,2X0 tại m/z 138,9 cho thấy nhóm sulfate ở vị trí C-2 của gốc fucose ở

đầu mạch không khử (hình 3.17A) [18,19,42]. Phổ MS/MS cũng chứa các tín hiệu

nhỏ, gồm 0,2Xo ở m/z 138,9, 0,2A2 ở m/z 329,0 và 0,2X1 ở m/z 386,9. Các tín hiệu này

xuất hiện với cường độ cao trong phổ MS/MS của ion cùng loại disulfated

fucobiose [Fuc2(SO3Na)2-Na]- của fucoidan từ rong F.evanescen, đây là loại

fucoidan được tạo nên chủ yếu bởi các gốc α-L-Fucp liên kết 4 [18]. Tuy nhiên,

mảnh ion 0,2Xo chỉ được phát hiện trong phổ ESI-MS/MS. Sự có mặt của mảnh ion

Y’1 ở m/z 345 được cho là gốc fucose ở phía đầu mạch khử được sulfate hóa ở cả

hai vị trí C-2 và C-4, tín hiệu này không xuất hiện trong phổ MS/MS của mảnh ion

cùng loại của fucoidan từ rong F.evanescen [18], nhưng lại xuất hiện với cường độ

cao trong phổ MS/MS của fucan liên kết 3 được sulfate hóa mạnh từ L.cichorioides

[19]. Một điểm quan trọng cần lưu ý đó là trên phổ ESI-MS/MS xuất hiện một số

tín hiệu có cường độ mạnh đặc trưng cho sự phá vỡ vòng đường như mảnh 0,2Xo ở

m/z 138,9 và 0,2A1 ở m/z 182,9, tuy nhiên các mảnh ion này có cường độ thấp hoặc

không được phát hiện trên phổ MALDI-TOF/MS/MS (hình 3.17A), như vậy có khả

năng là do trong nguồn ion hóa CID ESI-MS/MS sự phân mảnh lần hai xảy ra mạnh

hơn hoặc theo một cơ chế phân mảnh khác chưa được biết đến. Thêm nữa, các

mảnh ion dạng 0,3X/0,3A cũng không được phát hiện trong phổ của cả hai phương

pháp MALDI và ESI, mặc dù các mảnh này đều được phát hiện trên phổ của

disacarit tương tự từ rong L.cichorioides [19]. Như vậy, mảnh [Fuc2(SO3Na)2-Na]-

ở m/z 491,0 sẽ là hỗn hợp của hai disacarit như được trình bày trong bảng 3.11 và

hình 3.17A.

90

Hình 3.17. Phổ Negative-ion MALDI-TOF/MS/MS của mảnh [Fuc2(SO3Na)2 - Na]-

tại m/z 491,00 (A) và CID ESI-MS/MS của mảnh [Fuc2(SO3)3]3− tại m/z 182,33 (B)

Phổ ESI/MS/MS của ion [Fuc2(SO3)2]3- ở m/z 182,33 (hình 3.17B) cho thấy

tín hiệu có cường độ cao của ion Y- ở m/z 160,98 tương ứng với gốc fucose ở phía

đầu mạch khử được sulfate hóa hai lần. Tín hiệu mạnh của ion B1 ở m/z 225.01

được gán cho gốc fucose ở phía đầu mạch không khử được sulfate hóa ở C-2 [124]

và một tín hiệu của ion dạng B được sulfate hóa kép có cường độ thấp. Trên phổ

ESI-MS/MS còn chứa tín hiệu ở m/z 181,99 được xác định là ion 2,4A2, ion này có

khả năng được sinh ra từ sự phân mảnh của gốc fucose ở phía đầu mạch khử được

sulfate hóa kép ở vị trí C-3 và C-2, trong khi đó không phát hiện thấy tín hiệu của

mảnh ion 0,2X1, đồng thời tín hiệu của mảnh ion này cũng rất nhỏ trong phổ

MALDI-TOF/MS/MS (hình 3.17A). Theo công bố của tác giả [18] đã chỉ ra rằng sự

sulfate hóa ở vị trí C-2 của gốc fucose ở đầu mạch không khử đã triệt tiêu tín hiệu

91

của ion này. Như vậy, mảnh [Fuc2(SO3)3]3- m/z 182,33 có đặc trưng cấu trúc là

Fuc(2SO3-)-(1,4)-Fuc(2,3 SO3

-) (hình 3.17B).

Tiếp theo các ion mảnh với số khối m/z 405,10 và 507,03 sẽ được nghiên

cứu đặc trưng cấu trúc, đây lần lượt là các mảnh disacarit có chứa cả fucose và

galactose [FucGal(SO3-)]- và [FucGal(SO3

-)2]2- (bảng 3.11). Kết quả phân tích phổ

khối nhiều lần MALDI-TOF/MS/MS của các mảnh ion này cho thấy vị trí liên kết

thích hợp nhất của các gốc galactose là điểm cuối của đầu mạch không khử. Kết quả

phân tích liên kết bằng methyl hóa cũng cho thấy có 8% các gốc Gal là ở phía đầu

mạch không khử (bảng 3.10). Các kết quả phân tích phổ khối và phổ cộng hưởng từ

hạt nhân 13C-NMR của fucoidan từ rong Costaria costata [17] và Saccharina

latissima [26] cũng cho những kết quả tương tự, đó là các gốc galactose ở vị trí cuối

cùng trên các đoạn mạch có cấu tạo là các gốc α-L-Fucp liên kết 3. Để làm sáng tỏ

thêm nhận định trên, chúng tôi tiến hành phân tích phổ khối nhiều lần ESI-MS/MS

của mảnh ion [GalFuc(SO3-)3]

3- ở số khối m/z 187,65 (Hình 3.18)

Hình 3.18. Phổ khối nhiều lần ESI-MS/MS của mảnh ion [GalFuc(SO3-)3]

3-

tại số khối m/z 187,65

Trên phổ ESI-MS/MS của mảnh [GalFuc(SO3)3]3- m/z 187,65 cho thấy tín

hiệu mạnh nhất là mảnh ở m/z 159,97 của ion B′1 (phông in nghiêng để ký hiệu là

92

ion hỗn hợp và dấu “′” để ký hiệu ion được sulfate hóa kép) tương ứng với gốc

galactose sulfate hóa kép ở phía đầu mạch không khử chiếm đa số (hình 3.18). Bên

cạnh đó, tín hiệu khá cao của mảnh ion 0,2A1 ở m/z 182,99 và 0,2X1 ở m/z 138,97 chỉ

ra sự có mặt của gốc fucose không khử, được sulfate hóa ở vị trí C-2 và C-4 [124].

Tuy nhiên, tín hiệu của cả hai ion kiểu ion B- xuất hiện ở m/z 225,01 và m/z 151,98

là thấp. Do vậy, tín hiệu tương tự ở m/z 199 (0,2A1) cần phải được phát hiện, đã

không được tìm thấy. Kết quả này có thể được giải thích do gốc galactose ở đầu

mạch không khử được sulfate hóa ở vị trí C-3, kết hợp với tín hiệu ở của mảnh ion

0,3A1 ở m/z 168,98 cho thấy nhóm sulfate còn có thể ở C-4/C-6. Đồng thời mảnh

m/z ở 168,98 còn chỉ ra khả năng nhóm sulfate ở vị trí C-3 của gốc fucose phía đầu

mạch khử [124]. Như vậy, mảnh [GalFuc(SO3)3]3- m/z 187,65 là hỗn hợp của hai

disacarit như được trình bay trong bảng 3.11.

Kết quả phân tích phổ ESI-MS/MS của ion triply sulfated tetrasacarit

[Fuc3Gal(SO3)3]3- ở m/z 285,03 (Hình 3.19) cho thấy khả năng mảnh này tồn tại ít

nhất 3 biến thể cấu trúc (bảng 3.11).

Hình 3.19. Phổ khối ESI-MS/MS của mảnh ion [Fuc3Gal(SO3)]3- tại m/z 285,03

93

Lần đầu tiên, bằng phương pháp phân tích phổ khối nhiều lần MS/MS của

fucooligosacarit sulfate hóa đã xác định được cấu trúc của fucoidan có mạch nhánh:

do không phát hiện thấy các ion của gốc fucose lần lượt được tách ra (dựa vào các

ion chuẩn đoán dạng B-) [19], ví dụ như mảnh ở m/z 298,042- tương ứng với

trisacarit fucotriose bị mất một phân tử nước được phân tách và/hoặc mảnh ở

m/z 225,012- tương ứng với disacarit fucobiose sulfate hóa kép được sinh ra do mất

một gốc fucose. Tín hiệu của mảnh ion Y1- ở m/z 259,01 [Gal(SO3

-)] cho phép đề

xuất biến thể cấu trúc với gốc sulfated galactose ở phía đầu khử (Fuc-Fuc-Fuc-Gal).

Tuy nhiên, như đã đề cập ở trên chúng tôi không phát hiện thấy các tín hiệu cho

thấy sự tồn tại của mảnh fucotriose, do đó biến thể cấu trúc Fuc-Fuc-Fuc-Gal không

tồn tại. Biến thể cấu trúc Fuc-Fuc-Gal-Fuc cũng không tồn tại, vì không phát hiện

thấy tín hiệu của ion dạng Y2′′ ở m/z 187,66 tương ứng với mảnh (Gal-Fuc). Thật lạ

là không phát hiện thấy bất cứ dấu hiệu nào của sự phân mảnh vỡ vòng galactose

nằm ở phía trong mạch, hơn nữa kết quả phân tích methyl hóa cũng không phát hiện

thấy các gốc galactose liên kết 4-, 3- (bảng 3.10). Như vậy, sự phân mảnh vỡ vòng

không xảy ra có thể được giải thích do nhóm sulfate chiếm vị trí C-3 của các gốc

galactose, theo Tissot và cộng sự thì nhóm sulfate ở vị trí C-3 bền vững hơn các

trạng thái khác [124].

Trên phổ MALDI-TOF/MS (hình 3.15) ta thấy tín hiệu ở m/z 960,95 tương

ứng với một oligosacarit hỗn hợp có thành phần chứa cả hai gốc galactose và fucose

[Fuc3Gal2(SO3Na)2-Na]- , đây là mảnh ion đáng được lưu ý nhất. Đặc trưng cấu trúc

của mảnh oligosacarit này sẽ được phân tích bằng khối phổ nhiều lần MALDI-

TOF/MS. Kết quả đo phổ MALDI-TOF/MS/MS của mảnh m/z 960,95 (hình 3.20)

cho thấy ion [Fuc3Gal2(SO3Na)2 - Na]- có thể được sinh ra từ mảnh ion mẹ

[Fuc3Gal2(SO3)3]3- bị mất gốc sulfate, mảnh ion này đã được phát hiện bằng phổ

khối ESI-MS ở m/z 339,05. Tuy nhiên trong phổ khối nhiều lần ESI-MS/MS do

cường độ của ion mẹ thấp nên không nhận được nhiều thông tin từ phổ này. Thay

vào đó phổ khối nhiều lần MALDI-TOF/MS của ion này tương đối đơn giản. Các

dữ liệu trên phổ MALDI-TOF/MS/MS có khả năng đưa ra dự đoán ít nhất bốn biến

thể cấu trúc của ion này (bảng 3.11). Các biến thể của một số ion sulfate hóa kép,

94

được sinh ra do sự phân tách các liên kết glycoside và phá vỡ vòng đường, được ký

hiệu bằng dấu móc lửng (“′”) nhằm hạn chế tối đa nhiều ký hiệu rườm rà trên phổ,

như chúng ta đã biết liên kết glycoside thường dễ bị phân tách ở vị trí gần với gốc

sulfate [138]. Tập hợp đầy đủ các ion dạng Y- và B- được phát hiện trên phổ khối

nhiều lần MALDI-TOF/MS của ion [Fuc3Gal2(SO3Na)2-Na]- cho phép đề xuất sự

tồn tại của các biến thể cấu trúc duy nhất của ion này:

Fuc-(1→4)-Gal-(1-3)-Fuc-(1-4)-Gal-(1→3)-Fuc

Và Gal-(1→3)-Fuc-(1-4)-Gal-(1-3)-Fuc-(1→3)-Fuc

Các biến thể cấu trúc này được sulfate hóa một cách ngẫu nhiên (do sự mất

gốc sulfate xảy ra ngẫu nhiên) ở vị trí C-2 và C-4 của cả hai gốc galactose và fucose.

Kiểu liên kết của gốc Gal chủ yếu được xác định nhờ các kết quả phân tích methyl

hóa bởi các mảnh sinh ra từ sự phá vỡ vòng các gốc Gal bị trùng lấp với các ion

mảnh sinh ra do phân tách các liên kết glycoside (hình 3.20).

Hình 3.20. Phổ khối Negative-ion tandem MALDI-TOF/MS của ion mảnh

[Fuc3Gal2(SO3Na)2 - Na]- tại m/z 960,95.

95

Như vậy, bằng các phương pháp phân tích khối phổ nhiều lần của các mảnh

oligosacarit trọng lượng phân tử thấp (LMW) được điều chế bằng phương pháp tự

thủy phân, đã xác định được các đặc trưng cấu trúc của fucoidan SmF3. Các kết quả

phân tích đã chỉ ra sự có mặt của các oligosacarit hỗn hợp có thành phần chứa cả

gốc galactose và fucose, nhưng khác với các fucoidan từ bộ Laminariales [17,19],

hỗn hợp tự thủy phân của các fucoidan từ bộ rong này chỉ chứa lượng nhỏ các thành

phần hỗn hợp, bao gồm chỉ có galactose ở cuối mạch. Các mảnh được cấu tạo chỉ

gồm các gốc α-L-Fucp với mức độ polyme hóa lên đến 5 đơn vị gốc đường và có

tới 3 nhóm sulfate trên phân tử cũng đã được phát hiện, kết hợp với các kết quả

phân tích liên kết bằng methyl hóa (bảng 3.10) đã xác định được liên kết chủ yếu

trong các mảnh đó là liên kết 3 và ở mức độ ít hơn là liên kết 4. Phân tích khối phổ

(MS) đã chứng minh được vị trí của gốc sulfate trên cả gốc α-L-Fucp và β-D-Galp ở

C-2 và/hoặc C-4, kết quả phân tích phổ 13C-NMR của fucoidan sulfate hóa và đề

sulfate hóa còn cho thấy nhóm sulfate ở vị trí C-6 của gốc β-D-Galp và có thể ở cả

C-3 của gốc β-D-Galp ở cuối mạch và gốc α-L-Fucp liên kết 4, như các mảnh sau

đã được tìm thấy và được phân tích:

Fuc (2SO3-)-(1→3)-Fuc(2SO3

-), Fuc-(1→3)-Fuc(2,4SO3-),

Fuc(2SO3-)-(1→4)-Fuc(2,3SO3

-), Fuc(2,4SO3-)-(1→3)-Fuc;

Gal(4/6, 3SO3-)-(1→3/4)- Fuc(2/3SO3

-) và Fuc(2,4SO3-)-(1→4)-Gal(2SO3

-).

Dựa trên kết quả phân tích methyl hóa đã xác định được kiểu liên kết chủ

yếu của gốc β-D-Galp là liên kết (1→4), trong trường hợp này sulfate chiếm vị trí

C-3, tương ứng với mảnh sau đây đã được phát hiện:

Fuc-(1→4)-Gal(3SO3-)-(1→3)-Fuc(2SO3

-)-(1→3)-Fuc(2SO3-).

Không phát hiện thấy tín hiệu của mảnh sinh ra từ sự phân mảnh phá vỡ

vòng đường của các gốc galactose liên kết 4, nguyên nhân có thể do nhóm sulfate ở

vị trí C-3 là vị trí bền vững ít xảy ra khả năng phá vỡ vòng [124]. Phân tích kỹ hơn

các oligosacarit hỗn hợp với bậc polymer hóa cao hơn cho thấy fucoidan SmF3

chứa các đoạn mạch được cấu tạo bởi các gốc α-L-Fucp và β-D-Galp liên kết luân

phiên, như các cấu trúc sau đây đã được tìm thấy:

96

Fuc(2SO3-)-(1→4)-Gal-(1→3)- Fuc(2SO3

-)-(1→4)-Gal-(1→3)- Fuc

Gal(2SO3-)-(1→3)-Fuc(2SO3

-)-(1→4)-Gal-(1→3)- Fuc-(1→3)- Fuc

Không phát hiện thấy các đoạn mạch được tạo bởi các gốc galactose liên kết

với nhau, khác với fucoidan từ bộ Laminariales, fucoidan từ bộ rong này có chứa

các mạch galactan [17,19,129].

Từ các kết quả phân tích chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng các oligosacarit thu

được bằng tự thủy phân, được tạo ra từ các mạch nhánh và phần mạch chính linh

động nhất của fucoidan tự nhiên trong điều kiện tự thủy phân được lựa chọn. Phần

trọng lượng phân tử cao còn lại sau quá trình tự thủy phân (phần không bị thủy

phân) có thể chứa các mảnh của mạch chính, bao gồm các gốc galactose liên kết 6 ở

cuối đầu mạch khử, do vậy nó đã không được tìm thấy trong phân đoạn khối lượng

phân tử thấp SmF3-AH. Vì thế, chúng tôi cho rằng các liên kết 1,6 là liên kết bền

trong điều kiện tự thủy phân.

Do sự khử sulfate diễn ra một cách ngẫu nhiên trong quá trình tự thủy phân

và/hoặc trong nguồn ion của khối phổ, nên một số gốc đường được phát hiện không

có gốc sulfate. Tuy nhiên, phân đoạn fucoidan SmF3 là một polysacarit sulfate hóa

cao (35%). Như vậy, có thể hầu hết các nhóm -OH tự do trên polysacarit tự nhiên

được sulfate hóa (ngoại trừ các vị trí bị hạn chế không gian) bởi vì trên phổ cộng

hưởng từ hạt nhân 13C-NMR không phát hiện được bất kỳ nhóm acetyl nào.

Kết luận: Bằng các phương pháp phân tích hóa học kết hợp với các phương

pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối, cấu trúc của fucoidan SmF3 có thể

được mô tả như sau: mạch chính của polysacarit là →3)-Fuc(2,4SO3-)-(1→3)-

Fuc(2,4SO3-)-(1→, gốc α-L-Fucp(3SO3

-) liên kết 4 rải rác có thể được chèn vào

trong mạch chính và gốc galactose liên kết 6 ở cuối đầu mạch khử. Các vị trí mạch

nhánh thích hợp là các gốc galactose liên kết 1,2,6- hoặc 1,3,6- (kết quả phân tích

methyl hóa, bảng 3.10) và/hoặc các gốc fucose liên kết 1,3,4- (kết quả phân tích phổ

khối, hình 3.19), các gốc này có khả năng tạo liên kết glycoside với các gốc

galactose ở cuối mạch hoặc là với các mạch được tạo thành bởi các gốc α-L-Fucp

sulfate hóa và β-D-Galp sulfate hóa liên kết luân phiên nhau. Cả hai gốc α-L-Fucp

và β-D-Galp được sulfate hóa ở vị trí C-2 và/hoặc C-4 (đôi khi là C-6 của gốc

97

β-D-Galp) và có thể ở vị trí C-3 của các gốc: β-D-Galp ở cuối mạch, β-D-Galp liên

kết 4 và α-L-Fucp liên kết 4.

Lần đầu tiên đã phát hiện ra sự có mặt đồng thời của các gốc →3)-α-L-Fucp

và gốc →4)-β-D-Galp liên kết luân phiên nhau trong galactofucan từ chi rong

Sargassum.

3.7. ĐÁNH GIÁ MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC VÀ

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN

Theo các công trình [14,16,39,52,69,98,121] thì hoạt tính kháng ung thư của

fucoidan phụ thuộc vào các đặc điểm cấu trúc như mức độ sulfate hóa, thành phần

đường và kiểu liên kết giữa các gốc đường. Các tác giả [90,93] đã công bố rằng

hàm lượng sulfate là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của

fucoidan. Fucoidan có trọng lượng phân tử thấp (< 2000 Da) với thành phần chính

là fucose và một lượng lớn sulfate có hoạt tính kháng u mạnh hơn fucoidan dị thể

trọng lượng phân tử cao và hàm lượng sulfate thấp. Các phân đoạn fucoidan (Sh2 và

Sh3) từ rong Sargassum hornery có cấu tạo mạch thẳng với các gốc (1→3); (1→4)-

và (1→4)-α-L-Fucp sắp xếp xen kẽ nhau đã được công bố là có hoạt kháng khối u

ác tính mạnh hơn phân đoạn Sh1 được cấu tạo bởi các gốc (1→3)- α-L-Fucp [99].

Theo các tác giả [36,91,142] fucoidan thuộc bộ Chordariales và Laminariales được

tạo nên bởi các gốc (1→3)-α-L- Fucp, nhóm sulfate ở vị trí C-2 và/hoặc C-4 (cấu

trúc dạng I). Mạch chính của fucoidan từ bộ Fucales được tạo nên bởi các gốc

(1→3)- và (1→4)-α-L-Fucp, nhóm sulfate ở vị trí C2 và/hoặc C4 (cấu trúc dạng II)

[25,24,35]. Fucoidan từ các loài rong thuộc họ Alariaceae và Sargassaceae là các

polysacarit dị thể sulfate hóa được tạo thành bởi các gốc (1→3)- hoặc (1→4)-linked

α -L-Fucp và β-D-galactopyranose (β-D-Galp) (cấu trúc dạng III) [48,98,99]. Theo

tác giả [99] fucoidan thuộc nhóm cấu trúc dạng I có khả năng ngăn chặn sự tăng

sinh khối và sự hình thành khuẩn lạc của các tế bào ung thư ruột kết, các fucoidan

thuộc nhóm cấu trúc dạng II ức chế đáng kể sự phát triển của các tế bào khối u ác

tính và cuối cùng fucoidan thuộc nhóm cấu trúc dạng III là tác nhân hóa trị lý tưởng

cho ung thư vú. Mặc dù các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của fucoidan đã bắt

98

đầu từ hàng thập kỷ trước, tuy nhiên mối quan hệ tương tác giữa hoạt tính sinh học

với cấu trúc và cơ chế phân tử của fucoidan tác động lên các tế bào ung thư vẫn

chưa được giải thích một cách rõ ràng.

Đặc điểm cấu trúc chung của phần lớn fucoidan rong nâu Việt Nam thuộc

nhóm cấu trúc dạng III là các galactofucan sulfate hóa, với thành phần chính là

fucose và galactose, cùng với một lượng nhỏ các đường đơn khác là mannose,

rhamnose, xylose và glucose. Do sự khác nhau về thành phần monosacarit, kiểu sắp

xếp giữa các gốc đường ở mạch chính cũng như mạch nhánh đã tạo nên sự da dạng

cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan.

Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư của 06 mẫu fucoidan

rong nâu Việt Nam chỉ ra rằng tất cả các mẫu đều có hoạt tính kháng ít nhất 02 dòng

tế bào ung thư với các mức độ khác nhau. Tất cả 06 mẫu fucoidan đều có hoạt tính

gây độc trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2, trong đó fucoidan từ rong S.mcclurei

với hàm lượng sulfate cao nhất (33,15%) có hoạt tính mạnh nhất. Tuy nhiên mẫu

fucoidan S.swartzii với hàm lượng sulfate thấp nhất (20,04 %) có hoạt tính mạnh

hơn fucoidan từ rong S.polycystum, S.denticapum và Turbinaria ornata. Với dòng

tế bào ung thư màng tim RD, fucoidan từ rong S.mcclurei có hàm lượng sulfate cao

nhất cho kết quả âm tính, trong khi cả 05 mẫu fucoidan còn lại đều có kết quả

dương tính với dòng tế bào ung thư này. Từ những kết quả này cho thấy hoạt tính

kháng ung thư của các galactofucan sulfate hóa từ rong nâu Việt Nam không chỉ

phụ thuộc vào nhóm sulfate, mà còn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác như thành

phần đường, kiểu liên kết glycoside giữa các gốc đường, kiểu liên kết mạch nhánh

và thậm chí là cả nhóm uronic axít [69]. Hoạt tính kháng ung thư ruột kết DLD-1

của các phân đoạn fucoidan từ rong Sargassum mcclurei và kháng tế bào ung thư vú

MDA-MB-231 của các phân đoạn fucoidan từ rong S.swartzii có thể được giải thích

là do cấu trúc mạch chính được tạo nên bởi các gốc α-L-Fucp liên kết 1,3 và β-D-

Gal liên kết 1,4. Các kết quả tương tự cũng đã được công bố cho fucoidan từ các

nguồn rong khác [98,99,121].

99

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Qua thời gian nghiên cứu chúng tôi đã thu được các kết quả như sau:

1. Fucoidan từ 08 loài rong nâu phổ biến nhất ở vịnh Nha Trang, tỉnh Khánh

Hòa bao gồm: S.oligocystum, S.denticapum, S.swartzii, S.polycystum, S.mcclurei,

Padina australis và Turbiaria ornata đã được phân lập.

2. Phân tích thành phần hóa học bao gồm thành phần đường, hàm lượng uronic

axít và hàm lượng sulfate của 08 mẫu fucoidan. Kết quả cho thấy fucoidan của rong

nâu Việt Nam thuộc nhóm sulfate galactofucan, trong khi đó fucoidan từ các loài

rong nâu của vùng ôn đới là các sulfate fucan.

3. 05 loại fucoidan thô đã được phân đoạn tinh chế và phân tích thành phần hóa

học của tất cả các phân đoạn thu được.

4. 06 mẫu fucoidan thô và 09 phân đoạn của chúng đã được khảo sát hoạt tính

gây độc tế bào trên 05 dòng tế bào ung thư gan, ung thư màng tim, ung thư phổi,

ung thư ruột kết và ung thư vú để tìm ra các phân đoạn có hoạt tính tốt dùng cho

mục đích phân tích cấu trúc.

5. Phân tích các đặc trưng cấu trúc của 05 phân đoạn fucoidan có hoạt tính gây

độc tế bào tốt từ 05 loài rong S.denticapum, S.polycystum, S.swartzii, S.mcclurei và

Turbinaria ornata. Kết quả chỉ ra rằng:

- Cấu trúc mạch chính của 05 phân đoạn fucoidan được tạo thành chủ yếu bởi

các gốc 1→3)- α-L-Fucopyranose.

- Nhóm sulfate gắn chủ yếu ở vị trí C-4 và một phần ở vị trí C-2 trên các gốc

đường pyranose.

Việc phân tích các đặc trưng cấu trúc của các phân đoạn fucoidan có hoạt tính

tốt cho phép chúng tôi đưa ra một số nhận định ban đầu về các yếu tố cấu trúc có

ảnh hưởng đến hoạt tính kháng u của fucoidan từ một số loài rong thuộc chi

Sargassum Việt Nam.

6. Bằng phương pháp tự thủy phân (autohydrolysis) sử dụng chính các nhóm

(-SO3H) của phân tử fucoidan làm nguồn axít để chuyển hóa polysacarit fucoidan

100

về dạng oligosacarit-fucoidan phù hợp cho phân tích khối phổ. Đây là một nét mới

của luận án.

7. Lần đầu tiên tại Việt Nam đã kết hợp 2 kỹ thuật phân tích khối phổ nhiều lần

MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS trong phân tích cấu trúc của polysacarit. Sự

kết hợp này giúp chúng ta thu nhận được nhiều hơn các thông tin về thành phần và

đặc trưng cấu trúc của các mảnh ion carbohydrate trong khối phổ, nhờ vậy đã cho

phép giải thích được một cách tường minh hơn cấu trúc phức tạp của fucoidan có

nguồn gốc từ rong Việt Nam. Đây là tính mới của luận án so với các nghiên cứu

cùng lĩnh vực này ở trong nước.

8. Lần đầu tiên cấu trúc của phân đoạn fucoidan SmF3 có hoạt tính gây độc tế

bào ung thư từ Sargassum mcclurei đã được thiết lập. Mạch chính của fucoidan

SmF3 gồm: →3)-Fucp(4,2SO3-)-(1→3)-Fucp(4,2SO3

-)-(1→ họa tiết xen vào các

gốc (1→4)-Fucp(3SO3-) và (→6)-Galp ở cuối đầu khử. Mạch nhánh tồn tại các

đoạn mạch sau:

Fuc(2SO3-)-(1→4)-Gal-(1→3)-Fuc(2SO3

-)-(1→4)-Gal-(1→3)- Fuc

và Gal(2SO3-)-(1→3)-Fuc(2SO3

-)-(1→4)-Gal-(1→3)- Fuc-(1→3)- Fuc

Với sự có mặt đồng thời của các gốc →3)-α-L-Fucp và gốc →4)-β-D-Galp

liên kết luân phiên trong mạch galactofucan từ rong Sargassum, chứng tỏ fucoidan

từ rong Sargassum mcclurei có cấu trúc mới so với các fucoidan đã nghiên cứu từ

chi Sargassum.

KIẾN NGHỊ

- Tiếp tục nghiên cứu phân tích cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của

fucoidan từ các loài rong nâu khác của Việt Nam nhằm tìm kiếm các hợp chất mới

có hoạt tính kháng ung thư và các hoạt tính sinh học khác từ đó làm cơ sở cho việc

khai thác và sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên rong nâu của Việt Nam.

- Nghiên cứu chuyển hóa fucoidan bằng con đường xúc tác sinh học (chuyển

hóa bằng enzyme) để tạo ra các sản phẩm oligo-fucoidan mới có hoạt tính sinh học

đặc hiệu hơn và mạnh hơn sử dụng cho mục đích làm thuốc hoặc thực phẩm chức

năng.

101

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Pham Duc Thinh, Roza V. Menshova, Svetlana P. Ermakova, Stanislav D. Anastyuk, Bui Minh Ly and Tatiana N. Zvyagintseva. Structural Characteristics and Anticancer Activity of Fucoidan from the Brown Alga Sargassum mcclurei. doi:10.3390/md11051456, Mar. Drugs 2013, 11, 1456-1476.

2. Phạm Đức Thịnh, Trần Thị Thanh Vân, Bùi Văn Nguyên, Lê Lan Anh và Bùi Minh Lý. Thành phần và đặc điểm cấu trúc của các polysaccharide tan trong nước từ một số loài rong nâu Việt Nam. Tạp chí Hóa học, 2013, 51 (6ABC), 838-842.

3. Pham Duc Thinh, Bui Minh Ly, Tran Thi Thanh Van, Le Lan Anh, Svetlana P. Ermakova, Tatyana N. Zvyagintseva. Fucoidans from brown seaweeds collected from Nhatrang Bay: Isolation, structural characteristics, and anticancer activity. Journal of Chemistry, 2013, Vol. 51(5), 539-545.

4. Pham Duc Thinh, Tran Thi Thanh Van and Bui Minh Lý. Studies fucoidan from brown seaweeds in Vietnam. Proceedings of VAST-IRD symposium on marine science. Haiphong-Vietnam, November 28th - 29th, 2013. 386-395 (ISBN: 978-604-913-162-2).

5. Pham Duc Thinh, Bui Minh Ly, Nguyen Duy Nhut, Cao Thi Thuy Hang, Tran Thi Thanh Van, Le lan Anh, S.P. Ermakova and T, N. Zvyagintseva, Composition, structural characteristics and bioactivities of fucoidan from some Vietnamese seaweeeds, Conference proceeding, the 2nd Analytical Vietnam Conference 2011, HCM city, April 7-8,2011, p.238-242.

6. Bùi Minh Lý, Nguyễn Duy Nhứt, Trần Thị Thanh Vân, Nguyễn Ngọc Linh, Hoàng Ngọc Minh, Phạm Đức Thịnh, Võ Mai Như Hiếu, Ngô Quốc Bưu, Nguyễn Đình Thuất, Cao Thị Thúy Hằng, Đặng Xuân Cường, Nghiên cứu fucoidan và công nghệ sản xuất chúng từ rong nâu Việt Nam, Tuyển tập Hội nghị Khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội 2010, 64-73 (ISBN: 978-604-913-012-0).

102

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Bùi Minh Lý. Đánh giá hiện trạng và Nghiên cứu giải pháp bảo vệ nguồn lợi rong Mơ (Sargassum) tại Khánh Hòa. Đề tài cấp tỉnh Khánh Hòa, 2010.

2. Bùi Minh Lý. Nghiên cứu công nghệ và thiết bị sản xuất fucoidan quy mô pilot từ một số loài rong nâu Việt Nam. Đề tài Nghiên cứu KH&CN cấp Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2006.

3. Ngô Quốc Bưu, Nguyễn Hữu Dinh, Huỳnh Quang Năng, Bùi Minh Lý và cs. Báo cáo nghiệm thu đề tài Điều tra cơ bản: “Hiện trạng và nguồn lợi rong biển kinh tế ven biển phía Nam Việt Nam”. 1999, pg 1-41. Nghiệm thu tại Hội đồng cấp Trung tâm KHTN và CNQG. Hà Nội 5-1999.

4. Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Thành Thị Thu Thủy, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sung. Nghiên cứu fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào tách từ rong nâu Sargasum swartzii bằng phương pháp phổ khối nhiều lần. Tạp chí Hóa học, 2009, T. 47 (3), Tr. 300 - 307.

5. Nguyễn Duy Nhứt. Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của polysaccharide từ một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hòa. Luận án tiến sỹ Hóa học, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2008. Hà Nội.

6. Nguyễn Hữu Đại và Phạm Hữu Trí. Một số loài rong biển mới bổ sung cho khu hệ rong biển Việt Nam - Phần I. Tuyển tập Nghiên cứu biển, 2002, 12, 149-158 .

7. Nguyễn Hữu Đại và Phạm Hữu Trí. Một số loài rong biển mới bổ sung cho Việt Nam - Phần II. Tuyển tập Nghiên cứu biển, 2003, 13, 95-114 .

8. Nguyễn Hữu Đại. Rong Mơ (Sargassaceae) Việt Nam. Nguồn lợi và sử dụng. NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh, 1997, 198 trang.

9. Nguyễn Hữu Dinh và Huỳnh Quang Năng. Năm loài mới thuộc chi rong Mơ - Sargassum ở ven biển Việt Nam. Tạp chí Sinh học, 2001, 23 (1): 1-10.

10. Nguyễn Hữu Dinh, Huỳnh Quang Năng, Trần Ngọc Bút, Nguyễn Văn Tiến. Rong biển miền Bắc Việt Nam. Nhà XB KHKT, 1993, Hà Nội.

11. Trần Thị Thanh Vân, Võ Mai Như Hiếu và Bui Minh Lý. Phân tích đặc điểm cấu trúc của fucoidan chiết từ loài rong nâu Turbinaria ornata. Tạp chí Hóa học, 2009, T.47 (4A), 483-487.

12. Trần Thị Thanh Vân. Nghiên cứu cấu trúc polysaccharide dạng agar chiết từ một số loài rong biển Việt Nam. Luận án tiến sỹ Hóa học, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2007. Hà Nội.

103

TIẾNG ANH

13. Adhikaria, U.; Mateub, C.G.; Chattopadhyaya, K.C.; Pujolb, A.; Damonteb, E.B.; Ray, B. Structure and antiviral activity of sulfated fucans from Stoechospermum marginatum. Phytochemistry. 2006, 67, 2474-2482.

14. Aisa, Y.; Miyakawa, Y.; Nakazato, T.; Shibata, H.; Saito, K.; Ikeda, Y.; Kizaki, M. Fucoidan induces apoptosis of human HS-Sultan cells accompanied by activation of caspase-3 and down-regulation of ERK pathways. Am. J. Hematol. 2004, 78, 7-14.

15. Ajisaka, T, H. Q. Nang & N. H. Dinh. Sargassum denticarpum Ajisaka sp. nov. and S. longifructum Tseng et Lu: Two zygocarpic species of Sargassum from Việt Nam. Jap. J. Phycology. 1994, 42, 393-400.

16. Alekseyenko T.V.; Zhanayeva, S.Y.; Venediktova A.A.; Zvyagintseva, T.N.; Kuznetsova, T.A.; Besednova, N.N.; Korolenko, T.A. Antitumor and antimetastatic activity of fucoidan, a sulfated polysaccharide isolated from the Okhotsk sea Fucus evanescens brown alga. Bull. Exp. Biol. Med. 2007, 143, 730-732.

17. Anastyuk, S. D., Imbs, T.M., Shevchenko, N.M., Dmitrenok, P.S., Zvyagintseva, T.N. ESIMS analysis of fucoidan preparations from Costaria costata. Chem. Nat. Comp. 2009, 45, 79-86.

18. Anastyuk, S. D., Shevchenko, N. M., Nazarenko, E. L., Dmitrenok, P. S., and Zvyagintseva, T. N. Structural analysis of a fucoidan from the brown alga Fucus evanescens by MALDI-TOF and tandem ESI mass spectrometry. Carbohydrate Research. 2009, 344(6), 779-787.

19. Anastyuk, S.D.; Shevchenko, N.M.; Nazarenko, E.L.; Imbs, T.I.; Gorbach, V.I.; Dmitrenok, P.S.; Zvyagintseva, T.N. Structural analysis of a highly sulfated fucan from the brown alga Laminaria cichorioides by tandem MALDI and ESI mass spectrometry. Carbohydr. Res. 2010, 345, 2206-2212.

20. Anastyuk, S.D., Imbs, T.I., Dmitrenok, P.S., and Zvyagintseva, T.N. Rapid Mass Spectrometric Analysis of a Novel Fucoidan, Extracted from the Brown Alga Coccophora langsdorfii. The ScientificWorld Journal. 2014, ID 972450, 9 pages.

21. Andriy Synytsya, Woo-Jung Kim, Sung-Min Kim, Radek Pohl, Alla Synytsya, František Kvasnicˇka Jana Copíková, Yong Il Park. Structure and antitumour activity of fucoidan isolated from sporophyll of Korean brown seaweed Undaria pinnatifida. Carbohydrate Polymers. 2010, 81, 41-48.

22. Berteau O. and Mulloy B. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide. Glycobiology. 2003, 13 (6), 29R-40R.

104

23. Bilan, M.I, Grachev A.A., Ustuzhanina N.E. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C. Ag. Carbohydrate Research. 2002, 337, 719-730.

24. Bilan, M.I.; Grachev, A.A.; Shashkov, A.S.; Nifantiev, N.E.; Usov, A.I. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus serratus L. Carbohydr. Res. 2006, 341, 238-245.

25. Bilan, M.I.; Grachev, A.A.; Ustuzhanina, N.E.; Shashkov, A.S.; Nifantiev, N.E.; Usov, A.I. A. Highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L. Carbohydr. Res. 2004, 339, 511-517.

26. Bilan M.I.; Grachev A.A.; Shashkov A.S.; Kelly M.; Sanderson C.J.; Nifantiev N.E.; Usov A.I. Further studies on the composition and structure of a fucoidan preparation from the brown alga Saccharina latissima. Carbohydr Res. 2010, 345, 2038-2047.

27. Bilan. M.I., Grachev. A.A., Shashkov. A.S, Thuy. T.T.T, Van. T.T.T, Ly. B.M, Nifantiev. N.E, Usov. A.I. Preliminary investigation of a highly sulfated galactofucan fraction isolated from the brown alga Sargassum polycystum. Carbohydrate Research, 2013, 377, 48-57.

28. Bitter, T.; Muir, H.M. A modified uronic acid carbazole reaction. Anal. Biochem. 1962, 4, 330–334.

29. Black, W.A.P.; Dewar, E.T.; Woodward, F.N. Manufacture of algal chemicals. IV.-Laboratory-scale isolation of fucoidin from brown marine algae. J. Sci. Food Agric. 1952, 3, 122-129.

30. Carpenter, K.E.; Niem, V.H. FAO species identification guide for fishery purposes. In the living marine resources of the Western Central Pacific. Vol. 1. Seaweeds, corals, bivalves and gastropods, Rome, FAO. 1998, 1-686.

31. Chandía, N.P.; Matsuhiro, B. Characterization of a fucoidan from Lessonia vadosa (Phaeophyta) and its anticoagulant and elicitor properties. Int. J. Biol. Macromol. 2008, 42, 235-240.

32. Chen, P.; Baker, A.G.; Novotny, M.V. The use of osazones as matrices for the matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. Anal. Biochem. 1997, 244, 144-151.

33. Cheng, Z.L.; Wang, S. Study on anticoagulant activities in vitro of fucoidan and fucoidan/collagen blends. J. Funct. Polym. 2003, 16, 557-560.

34. Chevolot, L.; Foucault, A.; Chauber, F. Further data on the structure of brown seaweed fucans: relationships with anticoagulant activitity. Carbohydr. Res. 1999, 319, 154-165.

35. Chevolot, L.; Mulloy, B.; Racqueline, J. A disaccharide repeat unit is the structure structure in fucoidans from two species of brown algae. Carbohydr. Res. 2001, 330, 529-535.

36. Chizhov, A.O.; Dell, A; Morris, H.R. A study of fucoidan from the brown seaweed Chorda filum. Carbohydr. Res. 1999, 320, 108-119.

105

37. Choi, E.M.; Kim, A.J.; Kim, Y.; Hwang, J.K. Immunomodulating activity of arabinogalactan and fucoidan in vitro. J. Med. Food. 2005, 8, 446-453.

38. Cumashi, A.; Ushakova, N.A.; Preobrazhenskaya, M.E.; D'Incecco, A.; Piccoli, A.; Totani, L.; Tinari, N.; Morozevich, G.E.; Berman, A.E.; Bilan, M.I.; Usov, A.I.; Nadezhda E.; Grachev, A.A.; Sanderson, C.J.; Kelly, M.; Rabinovich, G.A.; Iacobelli, S. A comparative study of the anti-inflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds. Glycobiology 2007, 17, 541-552.

39. Cun Zhuang, Hiroko Itoh, Takashi Mizuno, and Hitoshi Ito. Antitumor Active Fucoidan from the Brown Seaweed, Umitoranoo (Sargassum thunbergii). Biosci, Biotech, Biochem. 1995, 59 (4), 563-567.

40. Daniel, R., Berteau, O., Chevolot, L., Varenne, A., Gareil, P. and Goasdoue, N. Regioselective desulfateion of sulfated L-fucopyranoside by a new sulfoesterase from the marine mollusk Pecten maximus: Application to the structural study of algal fucoidan (Ascophyllum nodosum). European Journal of Biochemistry. 2001, 268, 5617-5626.

41. Daniel, R.; Berteau, O.; Jozefonvicz, J.; Goasdoue, N. Degradation of algal (Ascophyllum nodosum) fucoidan by an enzymatic activity contained in digestive glands of the marine mollusk Pecten maximus. Carbohydr. Res. 1999, 322, 291-297.

42. Daniel, R.; Chevolot L.; Carrascal M.; Tissot, B.; Mourão, P.A.S.; Abian, J. Electrosprayionization mass spectrometry of oligosaccharides derived from fucoidan of Ascophyllum nodosum. Carbohydr. Res. 2007, 342, 826-834.

43. Dillon T., Kristensen, K. and O'hEcoha, C. The seed mucilage of Ascophyllum nodosum. Proceedings of the Royal Irish Academy, Section B: Biological, Geological, and Chemical Science. 1953, 55, 189-194.

44. Doares S.H., Albersheim P., Darvill A.G. An imporoved method for the preparation of standards for glycosyl-linkage analysis of complex carbohydrates. Carbohydr Res. 1991, 210, 311-317.

45. Dodgson, K. S.; Price, R. G. A Note on the Determination of the Ester Sulfate Content of Sulfated Polysaccharides. Biochem. J. 1962, 84, 106 - 110.

46. Doh-ura, K.; Kuge, T.; Uomoto, M.; Nishizawa, K.; Kawasaki, Y.; Iha, M. Prophylactic effect of dietary seaweed fucoidan against enteral prion infection. Antimicrob. Agents Chemother. 2007, 51, 2274-2277.

47. Domon, B.; Costello, C.E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconj. J. 1988, 5, 397-409.

48. Duarate, M.; Cardoso, M.; Noseda, M. Structural studies on fucoidans from the brown seaweed Sargassum stenophyllum. Carbohydr. Res. 2001, 333, 281-293.

106

49. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., and Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 1956, 28, 350-6.

50. Eluvakkal. T, Sivakumar. S.R and Arunkumar. K. Fucoidan in Some Indian Brown Seaweeds Found along the Coast Gulf of Mannar. Inter Journal of Botany. 2010, 6 (2), 176-181.

51. Fu, X.Y.; Xue, C.H.; Ning, Y.; Li, Z.J.; Xu, J.C. Acute antihypertensive effects of fucoidan oligosaccharides prepared from Laminaria japonica on renovascular hypertensive rat. J. Ocean Univ. Qingdao 2004, 34, 560-564.

52. Haneji, K.; Matsuda, T.; Tomita, M.; Kawakami, H.; Ohshiro, K.; Uchihara, J.; Masuda, M.; Takasu, N.; Tanaka, Y.; Ohta, T.; Mori, N. Fucoidan extracted from Cladosiphon okamuranus Tokida induces apoptosis of human T-Cell leukemia virus type 1-infected T-Cell lines and primary adult T-Cell leukemia cells. Nutrit. Cancer 2005, 52, 189-201.

53. Harvey, D. J. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates and glycoconjugates. International Journal of Mass Spectrometry. 2003, 226, 1–35.

54. Hayashi, K.; Nakano, T.; Hashimoto, M.; Kanekiyo, K.; Hayashi, T. Defensive effects of a fucoidan from brown alga Undaria pinnatifida against herpes simplex virus infection. Int. Immunopharmacol. 2008, 8, 109-116.

55. Hemmingson, J.A.; Falshaw, R.; Furneaux, R.H.; Thompson, K. Structure and antiviral activity of the galactofucan sulfates extracted from Undaria pinnatifida (Phaeophyta). J. Appl. Phycol. 2006, 18, 185-193.

56. Hiroe Mori and Kazutosi Nisizawa. Sugar Constituents of Sulfated Polysaccharides from the Fronds of Sargassum ringgoldianum. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries. 1982, 48 (7), 981-986.

57. http://www.drbvitamins.com/products/best_fucoidan_300mg_60vc#sthash.5dzDDAG9.dpbs.

58. Huynh Q. N and Nguyen H. D. The seaweed resources of Vietnam, A.T Critchley, M. Ohno. Seaweed resources of the World. 1998, 62-69, Japan.

59. Itsuko, K. Antiulcer agent and adhesion inhibitor for Helicobacter pylori. Eur. Pat. EP0645143. 1995.

60. Josep Zaia. Mass spectrometry of oligosaccharides. Mass Spectrom. Rev. 2004, 23, 161-227.

61. Josep Zaia. Principles of Mass spectroscopy of Glycosaminoglycan. Journal of Biomacromolecular Mass Spectrometry. 2004, 1 (1), 3-36.

62. Kawamoto, H.; Miki, Y.; Kimura, T.; Tanaka, K.; Nakagawa, T.; Kawamukai, M.; Matsuda, H. Effects of fucoidan from Mozuku on human stomach cell lines. Food Sci. Technol. Res. 2006, 12, 218-222.

107

63. Kawano, N.; Egashira, Y.; Sanada, H. Effect of dietary fiber in edible seaweeds on the development of D-galactosamine-induced hepatopathy in rats. J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo). 2007, 53, 446-450.

64. Kawano, N.; Egashira, Y.; Sanada, H. Effect of various kinds of Edible seawees in diets on the development of D-galactosamine-induced hepatopathy in rats. J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo). 2007, 53, 315-323.

65. Kima, M.H.; Joo, H.G. Immunostimulatory effects of fucoidan on bone marrow-derived dendritic cells. Immunol. Lett. 2008, 115, 138-143.

66. Koo, J.K. Studies on the isolation, purification and characterization of fucoidans from brown algae. Korea University (Korea). Ph.D thesis. 1994, 123 pages.

67. Kylin, H. Zur biochemie der Meersalgen. Z. Physiol. Chem. 1913, 83, 171 -197.

68. Lee, J.B.; Hayashi, K.; Hashimoto, M.; Nakano, T.; Hayashi, T. Novel antiviral fucoidan from sporophyll of Undaria pinnatifida (Mekabu). Chem. Pharm. Bull. 2004, 52, 1091-1094.

69. Li, B., Lu, F., Wei, X., and Zhao, R.. Fucoidan: Structure and Bioactivity, Molecules. 2008, 13, 1671-1695.

70. Li, B.; Rui, X.Z.; Xin, J.W. Anticoagulant activity of fucoidan from Hizikia fusiforme. Agro Food Ind. Hi-tech. 2008, 19, 22-24.

71. Li, B.; Xin, J.W.; Sun, J.L.; Xu, S.Y. Structural investigation of a fucoidan containing a fucose-free core from the brown seaweed Hizikia fusiforme. Carbohydr. Res. 2006, 341, 1135-1146.

72. Li, B.; Xu, S.Y. Structural investigation of oligosaccharides in partial acid hydrolyzed products of fucoidan isolated from Hizikia fusiforme. Nat. Prod. Res. Dev. 2007, 19, 550-553.

73. Li, D.Y.; Xu, Z.; Huang, L.M.; Wang, H.B.; Zhang, S.H. Effect of fucoidan of L. japonica on rats with hyperlipidaemia. Food Sci. 2001, 22, 92-95.

74. Li, D.Y.; Xu, Z.; Zhang, S.H. Prevention and cure of fucoidan of L. japonica on mice with hypercholesterolemia. Food Sci. 1999, 20, 45-46.

75. Li, F.; Tian, T.C.; Shi, Y.C. Study on antivirus effect of fucoidan in vitro. J. N. Bethune Univ. Med. Sci. 1995, 21, 255-257.

76. Li, L.H.; Xue, C.H; Xue, Y.; Li, Z.J.; Fu, X.Y.; The effects of fucoidans from Laminaria japonica on AAPH mediated oxidation of human low-density lipoprotein. Acta Oceanol Sin. 2006, 25, 124-130.

77. Li, Z.J.; Xue, C.H.; Lin, H. The hypolipidemic effects and antioxidative activity of sulfated fucan on the experimental hyperlipidemia in rats. Acta Nutrim. Sin. 1999, 21, 280-283.

108

78. Likhitwitayawuid, K., Angerhofer, C., Cordell, G.A., Pezzuto, J.M. Cytotoxic and antimalarial bisbenzylisoquinoline alkaloids from Stephania erecta. Journal of Natural Products. 1993, 56, 30-38.

79. Mandal, P.; Mateu, C.G.; Chattopadhyay, K.; Pujol, C.A.; Damonte, E.B.; Ray, B. Structural features and antiviral activity of sulfated fucans from the brown seaweed Cystoseira indica. Antivir. Chem. Chemother. 2007, 18, 153-162.

80. Marais, M.F. and Joseleau, J.P. A fucoidan fraction from Ascophyllum nodosum. Carbohydrate Research. 2001, 336, 155-159.

81. Marcel Tutor Ale, Jørn D. Mikkelsen and Anne S. Meyer. Important Determinants for Fucoidan Bioactivity: A Critical Review of Structure-Function Relations and Extraction Methods for Fucose-Containing Sulfated Polysaccharides from Brown Seaweeds. Mar. Drugs. 2011, 9, 2106-2130.

82. Maruyamaa, H.; Tamauchib, H.; Iizuka, M.; Nakano, T. The role of NK cells in antitumor activity of dietary fucoidan from Undaria pinnatifida Sporophylls (Mekabu). Planta Med. 2006, 72, 1415-1417.

83. Merrill JE, Waaland JR. The seaweed resources of the United State of America. In: Seaweed resources of the world. JICA, 1998, pp. 303-323.

84. Mian, A.J and Percival, E. Carbohydrates of the brown seaweeds Himanthalia lorea, Bifurcaria bifurcate and Padina pavonia. Carbohydrate Research, 1973, 26, 133-146.

85. Micheline, R.S.; Cybelle, M.; Celina, G.D.; Fernando, F.S.; Hugo, O.R.; Edda, L. Antioxidant activities of sulfated polysaccharides from brown and red seaweeds. J. Appl. Phycol. 2007, 19, 153-160.

86. Minamisawa, T.; Hirabayashi, J. Fragmentations of isomeric sulfated monosaccharides using electrospray ion trap mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005, 19, 1788–1796.

87. Mourão, P.A.S. Use of sulfated fucans as anticoagulant and antithrombotic agents: future perspectives. Curr. Pharmaceut. Des. 2004, 10, 967-981.

88. Mulloy B., Moura˜o P.A.S., Gray E. Structure: function studies of anticoagulant sulfated polysaccharides using NMR. Journal of Biotechnology. 2000, 77, 123-135.

89. Nagaoka, M., Shibata, H., Kimura-Takagi, I., Hashimoto, S., Kimura, K., Makino, T., Aiyama, R., Ueyama, S., and Yokokura, T. Structural study of fucoidan from Cladosiphon okamuranus Tokida. Glycoconj. J. 1999, 16 (1), 19-26.

90. Nishino, T., Aizu, Y., & Nagumo, T. The influence of sulfate content and molecular weight of a fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome on its antithrombin activity. Thrombosis Research, 1991, 64(6), 723-731.

109

91. Nishino, T., Nagumo, T., Kiyohara, H. and Yamada, H. Structural characterization of a new anticoagulant fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome. Carbohydrate Research. 1991, 211 (1), 77-90.

92. Nishino, T., Nishioka, C., Ura, H. and Nagumo, T. Isolation and partial characterization of a novel amino sugar-containing fucan sulfate from commercial Fucus vesiculosus fucoidan. Carbohydrate Research, 1994, 255, 213-224.

93. Nishino, T.; Nagumo, T. Anticoagulant and antithrombin activities of oversulfated fucans. Carbohydr. Res. 1992, 229, 355-362.

94. Nishino, T.; Nagumo, T. Sugar constituents and blood-anticoagulant activities of fucose-containing sulfated polysaccharides in nine brown seaweed species. Nippon Nogeikagaku Kaishi, 1987, 61, 361-363.

95. Nishino, T.; Yokoyama, G.; Dobahi, K. Isolation, purification and characterization of fucose-containing sulfated polysaccharides from the brown seaweed Ecklonia kurome and their blood-anticoagulant activities. Carbohydr. Res. 1989, 186, 119-129.

96. Nora M.A.Ponce et al. Fucoidan from the brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity and structure studies. Carbonhydrate Research. 2003, 338, 153-165.

97. Ohno M., A. T. Critchley. Seaweed cultivation and marine ranching, Bull. Mar. Sci. Fish, 1997.

98. Olesya S. Vishchuk, Svetlana P. Ermakova, Tatyana N. Zvyagintseva. Sulfated polysaccharides from brown seaweeds Saccharina japonica and Undaria pinnatifida: isolation, structural characteristics, and antitumor activity. Carbohydrate Research. 2011, 346, 2769-2776.

99. Olesya S. Vishchuk, Svetlana P. Ermakova, Tatyana N. Zvyagintseva. The fucoidans from brown algae of Far-Eastern seas: Anti-tumor activity and structure-function relationship. Food Chemistry, 2013, 141, 1211-1217.

100. Park, Y.H., Jang D.S. and Kim S.B. Utilization of marine products (2nd edition); Chapter 4, Seaweed composition, Hyoungsul press, 1997a, 283-336.

101. Patankar, M.S., Oehninger, S., Barnett, T., Williams, R.L. and Clark, G.F. A revised structure for fucoidan may explain some of its biological activities. The Journal of Biological Chemistry. 1993, 268, 21770-21776.

102. Percival, E. and McDowell, R.H. Chemistry and enzymology of marine algal polysaccharides. Academic Press, London and NEW YORK, 1967, 6-28 & 73-96 &157-174.

103. Percival, E.G.V. and Ross, A.G. Fucoidin. Part I. The isolation and purification of fucoidin from brown seaweeds. Journal of the Chemical Society, 1950, 717-720.

110

104. Pereira, M. S., Melo, F. R. and Mourão, P. A. S. Is there a correlation between structure and anticoagulant action of sulfated galactans and sulfated fucans? Glycobiology. 2002, 12(10), 573-580.

105. Pereira, M.S., Mulloy, B. and Mourao, P.A.S. Structure and anticoagulant activity of sulfated fucans: Comparison between the regular, repetitive, and linear fucans from echinoderms with the more heterogeneous and branched polymers from brown algae. The Journal of Biological Chemistry, 1999, 274 (12), 7656-7667.

106. Pereira, M.S.; Vilela-Silva A.E.S.; Valente, A.; Mourão, P.A.S. A 2-sulfated, 3-linked α-L-galactan is an anticoagulant polysaccharide. Carbohydr. Res. 2002, 337, 2231-2238.

107. Ponce, N.M.A.; Pujol, C.A.; Damonte, E.B. Fucoidans from the brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity and structural studies. Carbohydr. Res. 2003, 338, 153-165.

108. Qiu, X.D.; Amarasekara, A.; Doctor, V. Effect of oversulfateion on the chemical and biological properties of fucoidan. Carbohydrate Polymers. 2006, 63, 224-228.

109. Riki Shiroma, Teruko Konishi, Shuntoku Uechi and Masakuni Tako. Structural Study of Fucoidan from the Brown Seaweed Hizikia fusiformis. Food Sci. Technol. Res., 2008, 14 (2), 176 - 182.

110. Rocha, H.A.O.; Moraes, F.A.; Trindade, E.S.; Franco, C.R.C.; Torquato R.J.S.; Veiga, S.S.; Valente, A.P.; Mourão, P.A.S.; Leite, E.L.; Nader, H.B.; Dietrich, C.P. Structural and hemostatic activities of a sulfated galactofucan from the brown alga Spatoglossum schroederi. J. Biol. Chem. 2005, 280, 1278-41288.

111. Rupérez, P., Ahrazem, O. and Leal, J. A. Potential antioxidant capacity of sulfated polysaccharides from edible brown seaweed Fucus vesiculosus. Journal Agricultural Food Chemistry. 2002, 50, 840-845.

112. Saad, O.M.; Leary, J.A. Delineating mechanisms of dissociation for isomeric heparin disaccharides using isotope labeling and ion trap tandem mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2004, 15, 1274-1286.

113. Saito, A.; Yoneda, M.; Yokohama, S.; Okada, M.; Haneda, M.; Nakamura, K. Fucoidan prevents concanavalin A-induced liver injury through induction of endogenous IL-10 in mice. Hepatol. Res. 2006, 35(3), 190-198.

114. Shevchenko, N.M, Anastyuk, S.D, Gerasimenko, N.I, Dmitrenok, P.S, Isakov, V.V, Zvyagintseva, T.N. Polysaccharide and lipid composition of the brown seaweed Laminaria gurjanovae. Russ. J. Bioorgan. Chem. 2007, 33, 88-98.

115. Shi, Z.Y.; Guo, Y.Z.; Wang, Z. Pharmacological activity of fucoidan from Laminaria japonic. Journal of Shanghai Fish University. 2000, 9, 268-271.

111

116. Shibata, H.; Kimura-Takagi, I.; Nagaoka, M.; Hashimoto, S.; Aiyama, R.; Iha, M.; Ueyama, S.; Yokokura, T. Properties of fucoidan from Cladosiphon okamuranus tokida in gastric mucosal protection. BioFactors. 2000, 11, 235-245.

117. Shimizu, J.; Wada-Funada, U.; Mano, H.; Matahira, Y.; Kawaguchi, M.; Wada, M. Proportion of murine cytotoxic T cells is increased by high molecular-weight fucoidan extracted from Okinawa mozuku (Cladosiphon okamuranus). J. Health Sci. 2005, 51, 394-397.

118. Silva, T.M.A.; Alves, L.G.; Queiroz, K.C.S.; Santos, M.G.L.; Marques, C.T.; Chavante, S.F.; Rocha, H.A.O.; Leite, E.L. Partial characterization and anticoagulant activity of a heterofucan from the brown seaweed Padina gymnospora. Braz. J. Med. Biol. Res. 2005, 38, 523-533.

119. Song, J.Q.; Xu, Y.T.; Zhang, H.K. Immunomodulation action of sulfate polysaccharide of Laminaria japonica on peritoneal macrophages of mice. Chin. J. Immunol. 2000, 16, 70-70.

120. Stewart, C. M., Higgins, H. G. and Austin, S. Seasonal variation in alginic acid, mannitol, laminarin and fucoidan in the brown alga, Ecklonia radiata. Nature. 1961, 192, 1208.

121. Svetlana Ermakova, Roza Men'shova, Olesya Vishchuk, Sang-Min Kim, Byung-Hun Um, Vladimir Isakov, Tatyana Zvyagintseva. Water-soluble polysaccharides from the brown alga Eisenia bicyclis: Structural characteristics and antitumor activity. Algal Research. 2013, 2, 51-58.

122. Thuy Thi Thanh Thu, Van Thi Thanh Tran, Yoshiaki Yuguchi, Ly Minh Bui and Tai Tien Nguyen. Structure of fucoidan from brown seaweed Turbinaria ornata as Studied by Electrospray ionization Mass spectrometry (MSIMS) and Small Angle X-ray Scattering (SAXS) Techniques. Mar.Drugs. 2013, 11, 2431-2443.

123. Tissot, B.; Daniel, R. Biological properties of sulfated fucans: the potent inhibiting activity of algal fucoidan against the human complement system. Glycobiology 2003, 13, 29G-30G.

124. Tissot, B.; Salpin, J.; Martinez, M.; Gaigeot M.; Daniel R. Differentiation of the fucoidan sulfated L-fucose isomers constituents by CE-ESIMS and molecular modeling. Carbohydr. Res. 2006, 341, 598-609.

125. Usov A. I. Structural diversity of brown algal fucoidans. The 1st Symposium on Marine Enzymes and Polysaccharides, Abstract book, 2012. Nhatrang.

126. Usov, A.I., Smirnova, G.P. and Klochkova, N.G. Polysaccharide of algae: 55. Polysaccharide composition of several brown algae from Kamchatka. Russian Journal of Bioorganic chemistry, 2001, 27(6), 395-399.

127. Usui, T. Isolation of highly purified fucoidan from Eisenia bicyclics and its anticoagulant and antitumor activities. Agric. Biol. Chem. 1980, 44, 1965-1966.

112

128. Virginia García-Ríos, Elvira Ríos-Lea, Daniel Robledo and Yolanda Freile-Pelegrin. Polysaccharides composition from tropical brown seaweeds. Phycological Research. 2012, 60, 305-315.

129. Wang, J.; Zhang, Q.; Zhang, Z.; Zhang, H.; Niu, X. Structural studies on a novel fucogalactan sulfate extracted from the brown seaweed Laminaria japonica. Int. J. Biol. Macromol. 2010, 47, 126-131.

130. Wang, S.Z.; Bi, A.F. Clinic observation of fucoidan on patients with hyperlipidaemia. Med. J. Qilu. 1994, 173-174.

131. Wang, W.T.; Zhou, J.H.; Xing, S.T.; Guan, H.S. Immunomodulating action of marine algae sulfated polysaccharides on normal and immunosuppressed mice. Chin. J. Pharm Toxicol. 1994, 8, 199-202.

132. Wijesinghea W.A.J.P., Jeon Y. J. Biological activities and potential industrial applications of fucose rich sulfated polysaccharides and fucoidans isolated from brown seaweeds: A review. Carbohydrate Polymers. 2012, 88, 13–20.

133. Wu, X.W.; Yang, M.L.; Huang, X.L.; Yan, J.; Luo, Q. Effect of fucoidan on splenic lymphocyte apoptosis induced by radiation. Chin. J. Radiol. Med. Prot. 2003, 23, 430-432.

134. Wu, X.W.; Yang, M.L.; Huang, X.L.; Yan, J.; Luo, Q. Effect of Laminaria japonica polysaccharides on radioprotection and splenic lymphocyte apoptosis. Med. J. Wuhan Univ. 2004, 25, 239-241.

135. Yang, J.W.; Se, Y.Y.; Soo, J.O.; Sang, K.K.; Keon, W.K. Bifunctional effects of fucoidan on the expression of inducible nitric oxide synthase. Biochem. Biophys. Res. 2006, 346, 345-350.

136. Yang, X.L.; Sun, J.Y.; Xu, H.N. An experimental study on immunoregulatory effect of fucoidan. Chin. J. Marine Drugs 1995, 9-13.

137. Yoon, S.J.; Pyun, Y.R.; Hwang, J.K.; Mourão, P.A.S. A sulfated fucan from the brown alga Laminaria cichorioides has mainly heparin cofactor II-dependent anticoagulant activity. Carbohydr. Res. 2007, 342, 2326-2330.

138. Yu, G.; Zhao, X.; Yang, B.; Ren, S.; Guan, H.; Zhang, Y.; Lawson, A.M.; Chai, W. Sequence determination of sulfated carrageenan-derived oligosaccharides by high-sensitivity negative-ion electrospray tandem mass spectrometry. Anal. Chem. 2006, 78, 8499-8505.

139. Zhang, Q.B.; Yu, P.Z.; Zhou, G.F.; Li, Z.E.; Xu, Z.H. Studies on antioxidant activities of fucoidan from Laminaria japonica. Chin. Trad. Herbal Drugs 2003, 34, 824-826.

140. Zhao X.; Xue C.H.; Cai, Y.P.; Wang, D.F.; Fang, Y. The study of antioxidant activities of fucoidan from Laminaria japonica. High Tech. Lett. 2005, 11, 91-94.

113

141. Zhenqing Zhang and Robert J. Linhardt. Sequence Analysis of Native Oligosaccharides Using Negative ESI Tandem MS. Current Analytical Chemistry. 2009, 5, 225-237.

142. Zvyagintseva Tatiana. N, Nataliya M. Shevchenko, Alexander O. Chizhov, Tatiana N. Krupnova, Elena V. Sundukova, Vladimir V. Isakov. Water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds. Distribution, structure, and their dependence on the developmental conditions. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 2003, 294, 1-13.

143. Zvyagintseva, T.N.; Shevchenko, N.M.; Popivnich, I.B. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds. Carbohydr. Res. 1999, 322, 32-39.

i

PHỤ LỤC 1

Bản đồ phân bố tại vùng biển phía nam của 6 loài rong nâu

được chọn cho mục đích tách chiết fucoidan

Phuù Quoác

HAÛI PHOØNG

VINH

ÑAØ NAÜNG

BÌNH ÑÒNH

20o

15o

10o

105o

110o

Ñaûo

Haûi Nam

Coân Ñaûo

HAI PHONG

QUAÛNG NINH

20o

15o

10o

105o

110o

PHUÙ YEÂN

Chú thích: S. mcclurei S. polycystum S. oligocystum S. swartzii S. denticarpum Turbinaria ornata