nẤm chaetomium nhẰm phÒng trỪ - thư...
TRANSCRIPT
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------
Nguyễn Thị Kim Oanh
NGHIÊN CỨU, PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ
NẤM CHAETOMIUM NHẰM PHÒNG TRỪ
NẤM GÂY BỆNH CHO CÂY CHÈ
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
HÀ NỘI- 2017
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------
Nguyễn Thị Kim Oanh
NGHIÊN CỨU, PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ
NẤM CHAETOMIUM NHẰM PHÒNG TRỪ
NẤM GÂY BỆNH CHO CÂY CHÈ
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ THANH HUYỀN
HÀ NỘI- 2017
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới TS.Trần Thị
Thanh Huyền người đã giúp đỡ tận tình và hướng dẫn trực tiếp tôi trong cả quá
trình thực hiện đề tài, giúp tôi vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy giáo trong khoa sinh học, trường
Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và cung cấp những
kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt hai năm học vừa qua và giúp tôi rất nhiều trong
việc nắm bắt kiến thức khoa học cũng như động viên tôi về mặt tinh thần.
Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và tạo
điều kiện của Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Phòng công tác chính trị
học sinh và sinh viên, Phòng sau đại học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên. Tôi
xin cảm ơn sự giúp đỡ này!
Tôi cũng gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Văn Thiệp cùng các cộng sự của
Bộ môn Công nghệ sinh học và bảo vệ thực vật của Viện miền núi phía Bắc đã
luôn tạo điều kiện về mọi mặt để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này.
Cho phép tôi giửi lời cảm ơn tới GS. Kasem Soytong đã hướng dẫn và chỉ
bảo cho tôi về mặt chuyên môn cũng như những kinh nghiệm thực tế giúp tôi hoàn
thành bài luận văn này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình thân yêu và bạn bè đã luôn ở
bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn.
Hà Nội, ngày... tháng 1 năm 2017
Học viên
Nguyễn Thị Kim Oanh
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 4
1.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM CHAETOMIUM .................................................. 4
1.1.1. Giới thiệu chung về nấm Chaetomium .................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm hình thái của nấm Chaetomium .............................................. 4
1.1.3. Đặc điểm phân bố của nấm Chaetomium ................................................ 5
1.1.4. Yếu tố dinh dưỡng, sinh trưởng và phát triển của nấm Chaetomium ..... 5
1.1.5. Hoạt tính cơ bản của nấm Chaetomium .................................................. 7
1.1.6. Đặc điểm phân loại của nấm Chaetomium .............................................. 8
1.2. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ CHẾ PHẨM SINH HỌC ......................... 13
1.2.1. Những nghiên cứu ngoài nước .............................................................. 13
1.2.2. Những nghiên cứu trong nước .............................................................. 16
1.3. ĐẠI CƢƠNG VỀ CÂY CHÈ ..................................................................... 18
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined.
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ..................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.1. Dụng cụ và thiết bị ................................ Error! Bookmark not defined.
2.1.2. Môi trường nuôi cấy. ............................. Error! Bookmark not defined.
2.2.3. Đối tượng nghiên cứu ............................ Error! Bookmark not defined.
2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................ Error! Bookmark not defined.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. Error! Bookmark not defined.
2.3.1. Phương pháp phân lập nấm ChaetomiumError! Bookmark not defined.
2.3.2. Phương pháp phân lập nấm gây bệnh ... Error! Bookmark not defined.
2.3.3. Phương pháp xác định ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh
trưởng của các chủng nấm phân lập ................ Error! Bookmark not defined.
2.3.4. Đánh giá hoạt tính phân giải cellulose của chủng ChaetomiumError! Bookmark not defined.
2.3.5. Phương pháp đánh giá tính đối kháng ... Error! Bookmark not defined.
2.3.6. Định danh nấm Chaetomium bằng phương pháp sinh học phân tửError! Bookmark not defined.
2.4. NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM NẤM CHAETOMIUMError! Bookmark not defined.
2.4.1. Nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ nấm gây bệnhError! Bookmark not defined.
2.4.2. Đánh giá hiệu lực phòng trừ nấm của chế phẩm trên chèError! Bookmark not defined.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬNError! Bookmark not defined.
3.1. PHÂN LẬP NẤM ĐỐI KHÁNG VÀ NẤM GÂY BỆNHError! Bookmark not defined.
3.1.1. Phân lập nấm đối kháng (Chaetomium) Error! Bookmark not defined.
3.1.2. Phân lập nấm gây bệnh trên cây chè .... Error! Bookmark not defined.
3.2. ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SỰ SINH
TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM ........... Error! Bookmark not defined.
3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới sự phát triển của nấmError! Bookmark not defined.
3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ........................ Error! Bookmark not defined.
3.2.3. Ảnh hưởng của ánh sáng tới sự sinh trưởng và phát triển bào tử của
nấm Chaetomium ............................................ Error! Bookmark not defined.
3.2.4. Ảnh hưởng của pH tới sự phát triển của tản nấm và sản lượng bào tử
của nấm Chaetomium. ..................................... Error! Bookmark not defined.
3.3. Đánh giá hoạt tính kháng nấm bệnh của của nấm CheatomiumError! Bookmark not defined.
3.4. Xác định hoạt tính cellulase của chủng Chae 1Error! Bookmark not defined.
3.5. ĐỊNH DANH NẤM CHAETOMIUM ......... Error! Bookmark not defined.
3.6. NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM CHAETOMIUMError! Bookmark not defined.
3.6.1. Nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ nấm gây bệnhError! Bookmark not defined.
3.6.2. Đánh giá hiệu lực phòng trừ nấm của chế phẩm trên cây chèError! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................... Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Từ/cụm từ viết đầy đủ
Bp Base pair (cặp nuclêôtit)
CMA Cormeal Agar
CMC Cacboxyl methyl cellulose
DNA Deoxyribonucleic Acid
ITS Internal transcribed spacer
PCR Polymerase chain rection
PDA Potato dextrose agar
RFLP Restriction fragment length polymorphism
rDNA Rebosonal Deoxyribonucleic Acid
OTU Operational Taxonomic Unit
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Nồng độ pha loãng dung dịch D-glucose . Error! Bookmark not defined.
Bảng 2.2. Các công thức phối trộn ............................ Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.1: Kết quả phân lập nấm từ các mẫu đất khác nhauError! Bookmark not
defined.
Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái các chủng Chae phân lậpError! Bookmark not
defined.
Bảng 3.3: Một số đặc điểm hình thái của các chủng nấm gây bệnh phân lập .. Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.4. Kết quả lây bệnh hại rễ do nấm Fusarium. spError! Bookmark not
defined.
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến đường kính tản nấm và số lượng
bào tử của Chae 1 ...................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến đường kính tản nấm và số lượng
bào tử của Chae 2 ...................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của tản nấm bệnh
Fusarium. sp .............................................................. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng của nấm Chae1 ........... Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.9. Sinh trưởng của nấm Chae 2 ở môt số ngưỡng nhiệt độ khác nhau . Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của nấm Fusarium.sp .... Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của ánh sáng nuôi cấy đến đường kính tản nấm của nấm đối
kháng và nấm gây bệnh sau 7 ngày sau khi cấy........ Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của pH đến đường kính tản nấm Chae1Error! Bookmark
not defined.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của pH đến đường kính tản nấm Chae 2Error! Bookmark
not defined.
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của pH tới sự phát triển của nấm bệnh Fusarium sp. .. Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.15. Hoạt tính đối kháng của Chae 1 và Chae 2 đối với nấm hại rễ chè sau
cấy 15 ngày ............................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.16. Kết quả tính hoạt tính cellulase của chủng Chae 1Error! Bookmark not
defined.
Bảng 3.18. Hiệu lực của chế phẩm trong nhà lưới .... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.19. Hiệu lực của chế phẩm trên nương chè .. Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc của Chaetoglobosin C do C. globosum sản sinh ra ...................... 8
Hình 1.2. Sơ đồ cấu trúc gen mã hóa RNA ở vi nấm................................................ 10
Hình 1.3. Hình ảnh cây chè bị bệnh thối rễ ............................................................... 20
Hình 2.1. Đồ thị biểu diễn độ hấp phụ của đường D-glucose ở bước sóng 500 nm
................................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.2. Quả thể nấm Chaetomium trên giấy lọc nhìn dưới kính hiển vi soi nổi sau
3 tuần bẫy nấm .......................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.3. Hình ảnh 2 chủng phân lập được chủng .... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.4: Khuẩn lạc và bào tử nấm Fusarium.sp ...... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.5. Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo cho cây chè 1 tuổiError! Bookmark not
defined.
Hình 3.6: Hình ảnh rễ của cây chè sau khi lây bệnh hại rễ của Fusarium.sp.... Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.7. Ảnh hưởng của môi trường đến đường kính tản nấm Chae 1 ........... Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.8. Ảnh hưởng của môi trường tới đường kính tản nấm Chae 2. ........... Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.9. Ảnh hưởng của 4 loại môi trường tới sự phát triển tản nấm Fusarium. sp
phân lập ..................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới đường kính tản nấm Chae 1 .............. Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới đường kính tản nấm Chae 2. .............. Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới đường kính tản nấm bệnh Fusarium.sp
................................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH tới đường kính tản nấm Chae 1Error! Bookmark
not defined.
Hình 3.14. Ảnh hưởng của pH tới đường kính tản nấm Chae 2Error! Bookmark
not defined.
Hình 3.15. Ảnh hưởng pH tới sự phát triển tản nấm bệnh Fusarium.sp........... Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.16. Kết quả cấy đối kháng: ............................ Error! Bookmark not defined.
Hình 3. 17. Cây phát sinh chủng loại của nấm Chae 1Error! Bookmark not
defined.
Hình 3.18. Cây chè 1 tuổi xử lý nấm đối kháng sau 4 thángError! Bookmark not
defined.
MỞ ĐẦU
Như chúng ta đã biết cây chè là một trong những cây công nghiệp chủ lực của
vùng trung du miền núi phía Bắc. Theo số liệu của tổng cục thống kê diện tích chè
cả nước chiếm khoảng 130 nghìn ha thì trong đó vùng miền núi phía Bắc chiếm
khoảng gần 2/3. Cây chè đã góp phần tạo việc làm và là nguồn thu nhập chính cho
hàng triệu lao động. Tuy nhiên, việc tăng năng xuất chè thường gắn liền với việc
lạm dụng phân bón hóa học, thuốc trừ bệnh hóa học khiến bệnh hại chè cũng phức
tạp hơn đồng thời gây ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái, ảnh hưởng tới
sức khỏe con người. Hướng đi được quan tâm hiện nay là sự phát triển bền vững ở
các khu vực trồng chè như áp dụng các biện pháp phòng trừ sinh học, đặc biệt là
những chế phẩm sinh học vừa có tác dụng kháng bệnh hại lại vừa có khả năng làm
tăng độ phì nhiêu trong đất, thân thiện với môi trường.
Công nghệ vi sinh nói chung và chế phẩm sinh học nói riêng đã đóng góp
cho nền nông nghiệp thế giới những thành tựu to lớn, nó tham gia giải quyết nhiều
vấn đề như bảo vệ môi trường, nâng cao độ phì nhiêu của đất, tăng năng suất cây
trồng. Trong ngành chè, chế phẩm Kaetomium của Thái Lan là chế phẩm thương
mại được nghiên cứu sản xuất từ các chủng nấm Chaetomium phân lập tại Thái, có
khả năng phòng trừ được nhiều loại nấm bệnh trên cây chè. Nhưng nấm đối kháng
nói chung hay nấm Chae nói riêng ở những vùng sinh thái khác nhau có những đặc
điểm thích nghi riêng cho từng vùng sinh thái và chỉ phát huy hiệu quả đối kháng
của chúng ở những vùng sinh thái đặc trưng. Ở Việt Nam, một vài loài Chae cũng
đã được phân lập và sản xuất thử thành công chế phẩm sinh học có khả năng kháng
lại một số nấm bệnh trên cây trồng như: khoai tây, cam canh, hoa cúc nhật, cà
chua. Nhưng chưa có nghiên cứu nào đề cập đến việc phân lập chủng Chae từ chính
đất trồng chè dùng làm chế phẩm sinh học cho cây chè. Vì vậy, chúng tôi tiến hành
đề tài: “ Nghiên cứu, phát triển chế phẩm sinh học từ nấm Chaetomium nhằm
phòng trừ nấm gây bệnh trên cây chè”. Để xây dựng vùng sản xuất chè an toàn,
thân thiện với môi trường.
Nội dung chính của khóa luận bao gồm:
- Thu thập, phân lập chủng Chaetomium từ đất trồng chè và xác định một số
đặc điểm sinh học, sinh thái của chúng.
- Phân lập nấm gây bệnh trên vùng rễ chè và xác định một số đặc điểm sinh
học, sinh thái của nấm gây bệnh.
- Xác định ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy của nấm đối kháng và nấm gây bệnh
- Đánh giá một số hoạt tính của nấm Chaetomium phân lập được như hoạt
tính kháng nấm và hoạt tính phân giải cellulose.
- Nghiên cứu công thức tạo chế phẩm.
- Thử hoạt tính chế phẩm trên qui mô phòng thí nghiệm, nhà lưới và ở ngoài
đồng ruộng.
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM CHAETOMIUM
1.1.1. Giới thiệu chung về nấm Chaetomium
Chi Chae thuộc Giới nấm; Nghành: Ascomycota; Lớp: Sordariomycetes; Bộ:
Sordariales; Họ: Chaetomiumceae; Chi: Chaetomium. Bộ Sordariales có 120 chi và
700 loài khác nhau. Riêng chi Chae có khoảng 300 loài khác nhau [49] [38]. Các
loài Chae có đặc trưng riêng là có các lông bao, còn gọi là “sợi tóc”; cellulose là vật
chất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát sinh bào tử. Nấm Chaetomium được tìm
thấy trên nhiều loại bề mặt vật chất khác nhau ở điều kiện ấm áp và khô như: phân,
rơm, giấy, hạt, mảnh vụn thực vật, lông chim….Nhưng môi trường sống chủ yếu
vẫn là ở trong đất. Theo K. Soytong and Quimio các loài Chaetomium có thể được
phân lập bằng phương pháp bẫy nấm bằng mảnh giấy lọc đặt trên bề mặt đất ẩm
trong đĩa petri (vì nấm Chae có enzyme phân huỷ cellulose nên ta dễ dàng chọn lọc
được Chaetomium).
1.1.2. Đặc điểm hình thái của nấm Chaetomium
- Khuẩn lạc: phát triển nhanh trên môi trường thạch khoai tây, kích thước 6-
9cm sau 9-10 ngày nuôi cấy. Khuẩn lạc ban đầu có màu trắng như bông, sau chuyển
sang màu xám nhạt, rồi dần chuyển sang màu nâu đen do sự hình thành các thể quả
ascoma. Các quả thể này có dạng hình gần cầu hoặc hình quả lê, kích thước lớn, hình
thành rải rác khắp bề mặt khuẩn lạc, tạo thành đám màu nâu đen khi về già.
- Sợi nấm: Sợi nấm có vách ngăn, có màu xám hoặc nâu nhạt, mọc từ môi
trường và từ sợi khí sinh.
- Cơ quan sinh sản: Quả thể hình quả lê phình ra ở giữa, có màu tối (đen
hoặc nâu đen), có mở lỗ; có nhiều lông bao mọc xung quanh bên ngoài, kích thước
100-500 x 100 -400 µm, với các kiểu dáng và độ dày mỏng khác nhau tuỳ loài; có
loại thẳng hay uốn nếp kiểu gợn sóng, loại ngoằn ngoèo kiểu ruột già, loại chỉ
ngoằn ngoèo trên đỉnh sợi, loại xoăn lọn, loại đơn giản, loại phân nhánh.
Quả thể lúc còn non có hình cavat đến hình gậy chứa đựng từ 4-8 bào tử
màu nâu. Khi quả thể chín các nang nấm giống như cột trụ hoặc hình chùy nhú lên
từ đầu của quả thể, chứa các nang bào tử thẳng hoặc không thẳng hàng. Kích thước
của nang nấm là 68-84 x 5-7µm. Các nang bào tử có màu, thành tế bào nhẵn, có
nhiều hình dạng khác nhau (chủ yếu là hình quả chanh) với 1 lỗ mầm, kích thước
10-12 x 2.8-4 µm [30]. Bào tử bọc sinh ra từ túi bào tử hình trụ hoặc sợi nấm, kích
thước bào tử 7-8 x 5-6 µm.
1.1.3. Đặc điểm phân bố của nấm Chaetomium
Nấm Chae là một trong những nhóm nấm lớn nhất trong hệ vi sinh vật đất.
Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, và sự phân bố của chúng cũng tuân theo quy
luật như các loài vi sinh vật khác. Số lượng của nấm Chaetomium chủ yếu nằm
trong các tầng đất dưới. Đặc biệt ở tầng đất sâu 25-30 cm thì số lượng Chae có
nhiều nhất [38].
1.1.4. Yếu tố dinh dƣỡng, sinh trƣởng và phát triển của nấm Chaetomium
Nguồn carbon:
Khả năng hấp thụ nguồn carbon khác nhau của các chủng nấm Chaetomium
được ứng dụng trong việc sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh hại cây
trồng [40]. Các chủng nấm này hấp thụ tốt một số loại đường: Sacarose, glucose,
fructose, xenlubioza, D- lactoza, D-maltosa, tinh bột, rỉ đường, axit malic, L-
arabinosa để tổng hợp năng lượng. Chúng hấp thụ kém đối với rượu, N-amylic, axit
citric... [4].
Theo Bainier [14] Chaetomium sử dụng rất tốt với các loại đường fructose,
sacaroza, galactoza, riboza, xenlobioza. Riêng rượu mannit, dextri và arabinoza thì
ức chế sinh trưởng của nấm Chae .
Nhưng cũng có những nghiên cứu cho thấy rằng, trong môi trường không
cần đường thì Chaetomium vẫn phát triển tốt [51].
Nguồn nitơ (đạm):
Theo K. Soytong [37], thì các loài Chaetomium hấp thụ cả hợp chất vô cơ và
hữu cơ có chứa nitơ, nhưng ưa môi trường có chứa L-triptophan và L-glutamic.
Prolin nhanh chóng bị phân giải bởi Chaetomium globosum và nó sử dụng các sản
phẩm của quá trình phân giải đó. Các loài C. cupreum, C. globosum, C.
lucknowense thích hợp sử dụng đạm nitrat natri, nitrat amon chúng sử dụng kém
hơn. Cũng theo K. Soytong thì có những loài hấp thụ tốt muối amon đó là C
mollicellum, C. funicolum. Trên môi trường có chứa casein ức chế sinh trưởng của
nhiều loài Chaetomium.
Độ ẩm:
Độ ẩm tương đối là ảnh hưởng đến sự nảy mầm của bào tử và phát triển các
cơ quan dinh dưỡng của nấm Chaetomium. Bào tử nấm Chae có thể nảy nầm trong
một phổ độ ẩm tương đối rộng 30-100% [ 33;31;42], nhưng phù hợp nhất là 70-
100%. Bào tử nấm Chaetomium có thể nảy mầm cả khi ở các vùng đất khô hạn vì
bản thân nó tiết ra ergosterol [33].
Nhiệt độ:
Nấm Chae phát triển trong một phổ nhiệt độ rộng từ 3-520C [19] [49]. Mỗi
loài Chae lại có khoảng nhiệt độ thích nghi riêng như: C. globosum, C. cupreum là
4-420C, C. lucknowense là 3-50
0C.
Nguồn gốc xuất xứ có ảnh hưởng lớn đến khoảng nhiệt độ sinh trưởng thích
hợp của nấm Chaetomium. Nếu cùng C. globosum, nhưng khi phân lập ở Trung
Quốc trong vùng khí hậu ôn đới thì nhiệt độ thích hợp là 12 – 150C và phát triển tối
ưu cả ở Nga, nhưng cũng loài đó khi phân lập ở Thái Lan thì nhiệt độ thích hợp là
25-300C. Khi nhiệt độ lên cao quá thì nấm Chae chậm sinh trưởng, bề mặt của
chúng mấp mô, không bằng phẳng [47] [42].
Tuy nhiên nhiệt độ không ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính đối kháng của nấm
Chaetomium [17;14;50].
Ánh sáng:
Theo một số nhà nghiên cứu [48] [23] [21] ánh sáng có ảnh hưởng đến hoạt
động và quá trình sinh trưởng của nấm Chaetomium:
+ Trong điều kiện tối, quá trình sinh bào tử chậm hơn trong điều kiện chiếu sáng,
nhưng số lượng bào tử điềụ kiện chiếu sáng liên tục sẽ ít hơn so với điều kiện tối.
+ Trong điều kiện sáng xen tối thì lượng bào tử và lượng nấm sinh khối thu
được là cao nhất.
+ Trong điều kiện chiếu sáng liên tục sẽ ức chế sự tạo thành sinh khối, sự
hình thành bào tử và sự tăng trưởng phát triển của sợi nấm.
Nhưng thì ánh sáng không có ảnh hưởng rõ rệt đến một số chủng nấm
Chaetomium [23].
pH:
Là một yếu tố quan trọng liên quan đến sự sinh tồn của nấm Chaetomium.
Mặc dù các loài Chaetomium khác nhau có thể phát triển ở các mức pH khác nhau,
những loài cụ thể có độ pH tối ưu khác nhau, C. globosum và C. cupreum (pH 5-6),
nhưng C. lucknowense (pH 3-8) [42].
1.1.5. Hoạt tính cơ bản của nấm Chaetomium
Một trong những hoạt tính cơ bản và quan trọng của loài Chaetomium là khả
năng sinh enzyme ngoại bào mạnh như cellulase. Cellulase là enzyme phổ biến ở
nhiều loài Chaetomium. Đây là enzyme khá quan trọng trong quá trình sống của loài
nấm này. Chúng không chỉ giúp phân giải các xác thực vật tạo nguồn dinh dưỡng
cho sinh trưởng và phát triển của nấm mà chúng còn tạo cơ chế để xâm nhập và phá
hủy một số loại nấm gây bệnh khác bằng cách ức chế sự tổng hợp thành tế bào nấm
như ức chế hình thành thành tế bào |3 - D - glucan của nấm. Đây là một trong những
cơ chế cơ bản để ký sinh trên nấm bệnh của Chaetomium. Vì vậy, trong bài luận văn
này xác định hoạt tính cellulase của nấm Chaetomium để đánh giá được một trong
những cơ chế đối kháng của nấm Chaetomium với một số nấm gây bệnh khác.
Ngoài ra, Chaetomium còn kích thích sinh trưởng của cây bằng cách tiết
ergosterol làm tăng độ mùn trong đất, từ đó kích thích cây sinh trưởng làm tăng sức
đề kháng cho cây .
Nấm Chaetomium có khả năng sản sinh ra bào tử trong vùng đất của rễ cây
trồng, có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng mạnh hơn so với nấm bệnh, nhất là trong
điều kiện đất có nhiều mùn hơn.
Chaetomium còn có khả năng tổng hợp được các chất hoạt hóa sinh học nhóm
Mycotoxin (Chaetoglobosin Q, R, T, U) [24] và nhóm Epipolythiodioxopiperazine
(Chaetoglobosin A, B, C) [27]. Đây là nhóm chất có hoạt tính kháng nấm, có khả năng
tiêu diệt các tế bào nấm bệnh bằng cách phá hủy màng tế bào, làm cho nguyên sinh chất
bị phá vỡ ra ngoài và mất đi độc tính của nấm bệnh, kết quả là làm giảm hiệu quả của tác
nhân gây bệnh cũng như mức độ nhiễm bệnh [21].
Hình 1.1: Cấu trúc của Chaetoglobosin C do C. globosum sản sinh ra
1.1.6. Đặc điểm phân loại của nấm Chaetomium
1.1.6.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống
Nấm Chaetomium được chia thành nhiều loại khác nhau dựa trên các đặc
điểm sau:
- Hình dáng quả thể, lông bề mặt và lông bên của quả thể, chi tiết quả bào tử.
Trong thực tế Chaetomium rất đa dạng về hình dáng quả thể, đa dạng của
lông bao. Khi nghiên cứu nhận dạng và phân loại Chaetomium cần phải dựa trên các
mẫu điển hình vì rất nhiều kết quả mô tả bị sai lệch. Hầu hết các tác giả đều dựa
trên sự phân nhánh và cách cuộn xoắn của lông bao bên ngoài quả thể làm tiêu chí
chính cho phân loại dựa trên đặc điểm của nang bào tử và đặc điểm của lông mao,
trong khi đó Von Arx và cs [49] phát biểu rằng để có thể thành công hơn trong việc
nghiên cứu phân loại loài Chaetomium dựa trên đặc điểm của nang bào tử, quả bào
tử và dựa vào bề mặt thành của nang bào tử.
Trong khuôn khổ chi Chaetomium, có trên 300 loài đã được nghiên cứu và
mô tả. Tuy nhiên trong đó có một số chủng đã được thay đổi sau khi phân loại lại
hoặc có những ý kiến về sự giống nhau của chúng từ các nghiên cứu của các tác giả
khác nhau. Hiện nay còn nhiều ý kiến trong mô tả, cấu tạo thành tế bào của quả thể,
về quả bào tử và nang bào tử.
Trong các phân loại có phân loại của K. Soytong và T.H. Quimio là có
những mô tả và hình ảnh rõ ràng nhất từ quả thể, lông bao quả thể (đặc điểm của
lông, sự phân nhánh của lông), hình dạng quả bào tử, hình dạng nang bào tử. Kết
quả phân loại hình thái một số nấm được thể hiện trong phần phụ lục.
Tuy nhiên, đến nay có một số loài đã được thay đổi sau khi phân loại lại hoặc
có những ý kiến về sự giống nhau của chúng từ các nghiên cứu của các tác giả khác
nhau. Hiện nay còn nhiều ý kiến trong mô tả, cấu tạo thành tế bào của quả thể, về
quả bào tử và nang bào tử. Nhiều tác giả khác nhau lại có những công bố khác nhau.
[31] công nhận 150 loài. Von arx and cs công nhận 92 loài. Ở Philippin T.H.Quimio
và K. Soytong phân lập được 19 loài hoàn chỉnh trong tổng số 88 isolate được phân
lập. Ở Thái Lan K. Soytong đã phân lập được 15 loài hoàn chỉnh trong tổng số 190
isolate. Theo Seth cần phải có các phân loại mới về Chaetomium để giảm các loài
đồng nghĩa. Theo Udagawa [47] thì việc kiểm kê lại tất cả các loài đã được định
danh là cần thiết. Phương pháp phân loại hiện đại có thể khắc phục những hạn chế
của phương pháp phân loại theo hình thái, xác định tên loài nhanh và chính xác hơn.
1.1.6.2. Phân loại theo phương pháp hiện đại
Phương pháp hiện đại phân loại Chaetomium dựa vào trình tự rRNA, hoặc
rDNA (trình tự mã hoá cho rRNA) vì rDNA là vật liệu dễ thu nhận, có tính bền cao
hơn RNA và xây dựng cây phân loại.
Giới thiệu về vùng rDNA
Những gen mã hoá rRNA được tìm thấy trong vùng rDNA, sản phẩm của
những gen này (rRNA) kết hợp với những phân tử protein hình thành những
ribosom có chức năng tổng hợp protein. Do nhu cầu tổng hợp protein cao, có nhiều
bản sao của gen này trong các gennom khác nhau (E.coli có 7 bản sao, người có
khoảng 200 bản sao trong tế bào đơn bội). Ở Eukaryote, có hai tiểu đơn vị gồm một
tiểu đơn vị nhỏ (small subunit – SSU tổng hợp từ gen 18S) và một tiểu đơn vị lớn
(large subunit – LSU tổng hợp từ gen 28S; 5,8S và một gen 5S, nhưng thường chỉ
có gen 28S được nhắc đến như là gen tổng hợp LSU).
Ribosom DNA chứa vùng 18S, ITS1 (internal transcribed spacer); 5,8S (một
tiểu đơn vị ribosom nhỏ hơn trở thành một phần của LSU), ITS2, 28S và vùng IGS
(intergenic spacer). Vùng phiên mã 18S kết thúc tiểu đơn vị nhỏ (SSU), trong khi
28S cộng với 5,8S và một gen 5S thêm vào từ những thành phần khác của gennom
hình thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của ribosom RNA. Những vùng ITS được phiên
mã (tổng hợp từ RNA) nhưng bị cắt trước khi rRNA hoàn thiện được hình thành,
mặc dù chúng có thể có một chức năng trong sự hình thành ribosom. Ở đầu 5’ của
18S và đầu 3’ của 28S, cũng có một vùng được biết đến là ETS (external
transcribed spacer). Toàn bộ vùng này bao gồm ETS-18S-ITS1-5,8S-ITS2-28S-ETS
dài khoảng 13000 bp ở người và lặp lại 200 lần trong mỗi genom đơn bội, và hình
thành tiền rRNA 45S. Giữa mỗi cassette của gen có một vùng gọi là IGS (intergenic
spacer). Vùng này kém bảo tồn nhất của rDNA. Vùng IGS là vùng quan trọng vì
chứa trình tự kết thúc phiên mã của những gen rRNA. Những gen rRNA ở sinh vật
có nhân điển hình (còn được gọi là ribosomal DNA hoặc RNA) được tìm thấy ở
những phần đơn vị lặp lại được sắp xếp thành cặp, nằm tại vùng chromosom. Vùng
này được biết đến như vùng tổ chức nhân (NORs). Mỗi đơn vị lặp lại chứa một
vùng phiên mã (có những gen rRNAs như 18S; 5,8S; 26S và những vùng phiên mã
bên ngoài như ETS1 và ETS2) và một vùng không phiên mã (NTS). Trong vùng
phiên mã, ITS được tìm thấy trên gen 5,8S rRNA bao gồm ITS1 và ITS2.
rDNA chứa những vùng bảo tồn (18S; 5,8S; 28S) cũng như những vùng ít
bảo tồn (ITS) và những vùng biến động hơn (IGS). Những vùng này có thể được sử
dụng để phân tích sự đa dạng về di truyền và sự phát sinh loài của sinh vật. Trình tự
của vùng này cũng được sử dụng để tìm ra và xác định sự biến thiên số lượng của
nhiều loài hoặc nhóm nấm [6].
Hình 1.2. Sơ đồ cấu trúc gen mã hóa RNA ở vi nấm
Vùng ITS1 và ITS2 được tìm thấy giữa gen của tiểu đơn vị ribosom nhỏ
(18S) và tiểu đơn vị lớn (28S) chỉ ra sự biến thiên trong cùng loài. Khuyếch đại
vùng ITS này sau đó phân tích bằng các enzyme cắt giới hạn, được sử dụng để phân
tích sự khác nhau của các loại nấm. Vùng ITS2 khám phá sau vùng ITS1, và vùng
ITS2 có tính bảo tồn cao hơn ở một vài vùng tương đồng của vùng 18S. Vùng IGS
thậm chí cho thấy sự biến động lớn hơn và IGS-RFLP (giống với ITS-RFLP) đã
được sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng di truyền trong cùng loài.
Gen rDNA 16S mã hóa một phân tử RNA hình thành tiểu đơn vị ribosom
nhỏ của vi khuẩn điển hình (thành phần protein của tế bào). Trình tự của gen này
thích hợp là một mô hình phổ biến để nghiên cứu sự tiến hóa và phân loại vi khuẩn.
Gen rDNA được tìm thấy ở hầu hết các dạng sống (ngoại trừ virut và prion). Các
thành phần của trình tự rDNA từ những vi sinh vật có quan hệ với nhau được đánh
dấu giống nhau. Điều này có nghĩa trình tự của những sinh vật thân cận đã được sắp
xếp, làm cho những khác biệt dễ dàng đánh giá. Điều đó cũng có nghĩa là chỉ một
vài nhóm primer PCR là cần thiết để khuếch đại gen rDNA từ bất cứ loài nấm nào.
Trình tự rDNA của 16S đã được xác định cho nhiều loài.
Chiều dài và trình tự của những vùng ITS của rDNA được cho rằng là vùng
tiến hóa nhanh nhất và vì vậy có thể rất biến đổi. Những universal primer được thiết
kế từ những vùng bảo tồn nằm hai đầu vùng ITS và vùng ITS có kích thước nhỏ
(600-700bp) dễ dàng được khuếch đại bởi vì số bản sao lớn, lên tới 30.000 bản sao
trên một tế bào của vùng lặp lại trên rDNA. Điều này làm cho vùng ITS trở thành
một đề tài được quan tâm cho việc nghiên cứu tiến hóa phát sinh loài [14] [13] [44]
cũng như những nghiên cứu về địa lý sinh vật.
Phƣơng pháp giải trình tự:
Phương pháp đọc chuỗi mã Sanger
Cơ sở: dựa trên sự tổng hợp sợi DNA bổ sung của sợi cần được xác định trình tự.
Trong phản ứng tổng hợp sợi bổ sung, dideoxynucleotide được bổ sung vào thành phần
phản ứng. Dideoxynucleotide (ddNTP) là các deoxynucleotide đã được khử nhóm OH ở
đầu 3’, khi deoxynucleotide gia nhập vào chuỗi, sự kéo dài chuỗi sẽ ngưng lại.
Phương pháp sử dụng máy sequencer:
Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động dựa trên cơ sở phương
pháp dideoxy. Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và
giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật. Cả hai loại prime xuôi và ngược đều được sử dụng
để đọc cả hai mạch đơn DNA [1]
Giải trình tự theo phương pháp tự động không phải dùng chất phóng xạ mà
sử dụng các chất huỳnh quang để đánh dấu DNA, máy sequencer có thể phát hiện
cùng một lúc hiện tượng huỳnh quang ở bốn độ dài sóng khác nhau.
Đọc trình tự sản phẩm PCR
Có hai phương pháp đọc trình tự sản phẩm PCR:
- Một là tạo ra các dòng phụ (subclone) của sản phẩm PCR sau đó đọc trình
tự các subclone này.
- Hai là đọc trình tự sản phẩm PCR một cách trực tiếp, đây là cải tiến quan
trọng trong phân tích gennom do nhanh chóng có được trình tự của đối tượng
nghiên cứu mà không cần phải xây dựng một kho lưu trữ clone.
Phƣơng pháp xây dựng cây phả hệ:
* Phương pháp Neighbors-joining:
Đây là phương pháp xây dựng cây phả hệ trong gói phần mềm Phylip 3.61.
Phương pháp này có thể làm giảm tối thiểu tổng chiều dài của cây, phương
pháp bắt đầu từ một cây có hình sao, không có nhóm OTUs (Operational
Taxonomic Unit – đơn vị tiến hoá – cá thể) và chỉ có một nhánh (node) Y.
Tách những cặp OTUs giống nhau nhất ra khỏi node Y và các nhánh khác
bằng cách thêm một node X và nhánh trung gian nối X và Y lại. Như vậy node Y
chỉ còn là node chung cho những OTUs còn lại.
* Phương pháp Maximum Parsimony:
Đây là phương pháp nằm trong gói phần mềm Phylip 3.61, được phát triển
đầu tiên cho các trình tự protein.
Nguyên tắc của phương pháp: xác định kiểu hình nhánh của cây sao cho sự
thay đổi về mặt tiến hoá (sự thay thế nucleotide hay protein) là nhỏ nhất để giải
thích những khác biệt được quan sát giữa các OTUs.
Cây sử dụng những tập ký tự rời rạc và có con đường dẫn tới những tập ký tự
đó ngắn nhất là cây tốt nhất.
Phương pháp này không cho ta chiều dài nhánh mà chỉ cho cách sắp xếp và
thứ tự nhánh.
* Phương pháp Bootstrap:
Dùng để đo lường độ tin cậy của một node nào đó trong cây phả hệ. Nhưng
không phải thước đo sự tốt xấu cho cây phả hệ.
Chương trình sử dụng:
- Clustal X: Boostrap N-J Tree.
- Phylip 3.61: sepboot (tạo dữ liệu Bootstrap từ đầu vào (input) là tập tin sắp
gióng cột đa trình tự có định dạng là phylip [.phy], consense (tạo cây bảo tồn trong
100 cây được tạo ra từ dữ liệu Bootstrap).
Quy luật như sau:
- 70-100% là tốt
- 30-70% khó kết luận
- 0-30% là xấu
1.2. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ CHẾ PHẨM SINH HỌC
1.2.1. Những nghiên cứu ngoài nƣớc
Hiện nay trên thế giới, chế phẩm sinh học phòng trừ sâu hại được thương
mại hóa nhiều hơn so với chế phẩm phòng trừ nấm sinh học. Chế phẩm sinh học
được sản suất nhiều nhất là chế phẩm Bt. Smith [35] đã sản xuất công nghiệp chế
phẩm này ở Mỹ với môi trường chứa 6-10% chất dinh dưỡng
Chế phẩm sinh học được sử dụng để phòng trừ một số loại nấm bệnh hại lan
truyền qua đất, qua hạt, qua không khí ... Trong quá trình sản xuất người ta quan
tâm đến khối lượng bào tử và các độc tố nấm đóng vai trò chính trong hoạt tính diệt
nấm. Trong thực tế sản xuất hiện nay đã có một vài chế phẩm phòng trừ nấm hại đã
được thương mại hóa, chế phẩm được dùng rộng rãi nhất là Trichoderma. Khi sản
xuất chế phẩm sinh học cần phải lựa chọn môi trường thích hợp cung cấp nguồn
carbon hữu cơ để tổng hợp năng lượng, nguồn nitơ để tổng hợp protein, vitamin
cùng một số loại muối khoáng và dinh dưỡng; mục đích để tạo ra lượng lớn bào tử
nấm đối kháng. Ở Israel, người ta dùng cám lúa mì hoặc than bùn để làm chất phụ
gia cho việc sản xuất chế phẩm, còn ở Pháp người ta dùng hạt yến mạch và agar. Ở
Ấn độ người ta lại dùng các loại phế liệu nông sản như vỏ quả cây cà phê. Ở Đài
Loan dùng vỏ trấu làm môi trường sản xuất chế phẩm trừ nấm sinh học. Một trong
những nước nghiên cứu nhiều về phương pháp sản xuất chế phẩm sinh học phòng
trừ nấm bệnh là Liên Xô cũ. Các tác giả đã dùng các nguồn nguyên liệu khác nhau
làm chế phẩm sinh học Trichoderma. Có thể dùng 4 loại môi trường khác nhau:
(1) Trichodermin 1 được sản xuất trên môi trường dinh dưỡng giàu chất đạm
và tinh bột như hạt mì, đại mạch, ngô và agar.
(2) Trichodermin 2 được sản xuất trên môi trường rơm, cỏ được nghiền nhỏ.
(3) Trichodermin 3 được nhân trên than bùn đã được sấy khô và khử độc.
(4) Trichodermin 4 được sản xuất theo phương pháp lên men chìm [34].
Các loài Chaetomium được phân lập từ đất sử dụng như tác nhân kiểm soát
sinh học tiềm năng được khai thác ở Thái Lan từ năm 1989. Theo kết quả nghiên
cứu thì các loài Chae có khả năng phòng trừ bệnh nấm hại cây trồng, biệt là các
bệnh nấm lan truyền trong đất như Pyricularia oryzae, Curvularia lunata,
Rhizoctonia oryzae, Phytophthora palmivora, Phytophthra parasitica [38;43]
Venturia inequalis [20][23], Fusarium oxysporum f.sp Lycopersici, Sclerotium
rolfsii [42] Phythium ultimum [21] Bostrytis cineria [25]. Những bào tử sống của
loài Chae làm giảm bệnh héo rũ cây cà chua do nấm Fusarium oxysporum, Fus.
lycopersici trong những thí nghiệm trong nhà kính hay trên đồng ruộng [40] [44] và
cũng ngăn chặn bệnh thối cuống lá ngô do Sclerotium rolfsii [41]. Theo [35]dùng
môi trường có 1% rỉ đường, 2-3% nấm men có thể sản xuất chế phẩm sinh học
phòng trừ một số loại nấm bệnh từ một số chủng Chaetomium. Nghiên cứu sự tạo
bào tử của các chủng nấm khác nhau bằng phương pháp nuôi cấy chìm [22]. Theo
ông, cũng giống như quan điểm của K. Soytong hoạt tính diệt nấm hay chất lượng
của chế phẩm phụ thuộc vào môi trường và đặc biệt là chủng giống. Nếu tìm được
các chủng có hoạt tính đối kháng cao, sẽ có chế phẩm tốt hơn.
Ketomium là tên thương mại của thuốc trừ nấm sinh học phổ rộng (Int. cl. 5
AO 1 N 25/12, chứng nhận sáng chế Thái Lan số. 6266, 20 năm, ngày phát hành
22/1/1994: ngày kết thúc 21/1/2014) là chế phẩm sinh học sản xuất từ 22 chủng
Chaetomium globosum và Chaetomium. Ketomium đã được đăng ký bởi Bộ Nông
nghiệp Thái Lan (số 458/2539, 2/9/1996) sử dụng như thuốc trừ nấm sinh học kiểm
soát bệnh hại cây trồng, như phân bón sinh học phân hủy chất hữu cơ, cảm ứng hệ
miễn dịch thực vật và như chất kích thích tăng trưởng [45]. Cơ chế kiểm soát bệnh
cây đòi hỏi các chủng cụ thể của C. globosum và C. cupreum có khả năng sản xuất
chất kháng sinh; sản xuất ergosterol kích thích tăng trưởng cây trồng do khả năng cải
thiện lớp mùn trong đất, tăng độ phì của đất; ví dụ như C. globosum sản xuất
Chaetoblobosin C, ngăn chặn sự phát triển của tác nhân gây bệnh như Phytophthora
parasitica, P. palmivora , P. cactorum, Pyricularia oryzae, Fusarium oxysporum,
Colletotrichum gloeosporioide, C. dematium, Sclerotium rolfsii và Rhizoctonia solani
[39] [44] [45],Công ty NOVA SCIENCE sản xuất chế phẩm này bằng quá trình lên
men như sau : Nấm được nuôi cấy ở ống thạch nghiêng sau đó nhân giống cấp 1
trong bình tam giác rồi chuyển sang nhân giống cấp 2 trong tăng con của hệ thống lên
men. Môi trường canh thăng cho nhân giống và môi trường cho sản xuất như sau:
Nguồn Nitơ NaNO3, nguồn carbon: Rỉ đường và một số muối khoáng KH2PO4,
KH2PO4, MgSO4.7 H2O, KCl, vitamin và Yeast extract. Khi bào tử được hình
thành, ly tâm trộn với chất phụ gia (chất mang: talc và alginate và một vài phụ gia
khác), sấy khô, sau đó đóng gói. Theo K. Soytong, chế phẩm Ketomium trừ nấm
sinh học có hoạt tính diệt nấm, lượng bào tử phải đạt 3,2 x 107 bào tử/g.
Sử dụng chế phẩm Ketomium trong kiểm soát bệnh cây để thay thế các thuốc
trừ sâu và thuốc diệt nấm hóa học, đặc biệt là các bệnh do tác nhân gây bệnh trong
đất gây ra kết hợp với các biện pháp kiểm soát khác như vệ sinh môi trường, cải
thiện hệ thống thoát nước, cắt tỉa loại bỏ các bộ phận bị bệnh của cây, bón vôi và
phân hữu cơ (nhưng không sử dụng đồng thời hay pha trộn với thuốc trừ sâu hóa
học) và sử dụng trước khi có những thiệt hại về kinh tế có thể giúp ngăn ngừa các
thiệt hại do nấm bệnh [43].
1.2.2. Những nghiên cứu trong nƣớc
Cho đến nay, tác nhân sinh học trừ bệnh hại được nghiên cứu nhiều hơn cả
vẫn là nhóm nấm đối kháng Trichoderma. Việc nghiên cứu nấm đối kháng
Trichoderma bắt đầu từ năm 1988 tại Viện Bảo vệ thực vật. Kết quả của một số thí
nghiệm trong phòng và thí nghiệm trong chậu cho thấy có thể sản xuất chế phẩm
nấm đối kháng Trichoderma để sử dụng trong phòng trừ nấm Corticium sakii gây
bệnh khô vằn hại lúa và nấm S. rofsii gây nên bệnh héo lạc [3].
Tác giả [12] đã điều tra thu thập được 10 nguồn nấm đối kháng Trichoderma
và cũng chính tác giả đã đề xuất quy trình sản xuất, sử dụng chế phẩm nấm đối
kháng Trichoderma trong phòng trừ một số loài nấm bệnh hại cây trồng ở quy mô
thủ công, sử dụng các loại phế liệu như bã mía, cám gạo bã đậu phụ... Chế phẩm
sản xuất được vừa là chế phẩm sinh học trừ nấm, vừa là nguồn phân bón sinh học.
Thời gian bảo quản tối đa không được quá 9 tháng. Về sau, chế phẩm này cũng đã
được chính tác giả và cộng sự cải tiến quy trình sản xuất cho chất lượng và khả
năng phòng chống cao hơn [13]. Chế phẩm này đã được ứng dụng vào thực tiễn sản
xuất, có khả năng phòng trừ một số bệnh như khô vằn hại ngô (giảm được 51,3 -
59,8% bệnh), những nơi sử dụng chế phẩm đã giảm được lượng thuốc bảo vệ thực
vật hóa học, đã giảm được vốn đầu vào của sản xuất góp phần bảo vệ môi trường
sức khỏe và kinh tế của người sản xuất [4].
Các chủng nấm Trichoderma spp. được phân lập từ các vườn trồng cam quýt
tại đồng bằng sông Cửu Long có khả năng khống chế sự phát triển của nấm
Fusarium solani gây bệnh thối rễ cam quýt. Các chủng Trichoderma spp. có khả
năng tiết chitinase (chitinolytic enzym) cao đều đối kháng tốt với nấm bệnh
Fusarium solani gây bệnh thối rễ trên cam quýt [2] .
Khi nghiên cứu đối kháng nấm Trichoderma đã phát hiện những điểm kí
sinh hoặc sự quấn của sợi nấm đối kháng lên sợi nấm bệnh. Đôi khi còn thấy hiện
tượng sợi nấm bị quăn lại, chết từng đoạn mà không cần có sự ký sinh trực tiếp.
Điều này chứng tỏ nấm Trichoderma có thể tạo ra độc tố có hại cho nấm bệnh. Bên
cạnh sự tác động qua lại trong quần thể nấm đối kháng và nấm bệnh, nấm
Trichoderma còn có tác động trực tiếp lên sự phát triển của cây trồng, do nấm này
sản sinh ra các men phân hủy glucose, cellulose trong hoạt động sống của mình.
Nhờ các men này các chất hữu cơ có trong đất được phân hủy nhanh hơn, làm tăng
chất dinh dưỡng dưới dạng dễ hấp thu cho cây trồng, tạo điều kiện cho cây sinh
trưởng và phát triển tốt [8].
Trichoderma có thể phát triển và hình thành bào tử trên môi trường có nhiều
cellulose như: lõi ngô, thóc... Đặc biệt trên môi trường bã đậu phụ nấm phát triển tốt
nhất với lượng bào tử sản sinh là 7,5 x 109 bào tử/g. Tuy nhiên việc bảo quản chế
phẩm này rất khó khăn do ẩm độ cao. Trên môi trường thóc tuy lượng bào tử sản
sinh ít hơn, mật độ khoảng 3,2 x 109 bào tử/ g nhưng việc bảo quản dễ dàng hơn.
Trong thời gian nhân nuôi, nấm Trichoderma cần có điều kiện thoáng khí sau khi vô
trùng để làm cho môi trường xốp bằng cách lắc để chúng không kết lại thành mảng.
Nếu bị kết mảng bào tử hình thành rất ít thậm chí sợi nấm không lan vào được [13].
Tác giả Phạm Thị Thùy [11] ở Viện Bảo vệ thực vật đã nghiên cứu và triển
khai thành công chế phẩm trừ côn trùng trên cây dừa, hiệu quả phòng trừ lên đến
90-95%. Gần đây đã đưa ra một chế phẩm vi nấm Metarhizium để phòng trừ mối,
hiệu quả cao tới 90-95%.
Ở Việt Nam, nấm đối kháng Chaetomium lần đầu tiên được nghiên cứu ở Viện
Di truyền nông nghiệp vào năm 1999 sau khi chuyên gia nấm đối kháng Kasem
Soytong sang thăm và làm việc với phòng bệnh học phân tử thực vật Viện Di truyền
nông nghiệp. Chế phẩm Ketomium cũng đã được thử nghiệm và đăng ký thành công
tại Việt Nam trên một số bệnh cây trồng: bệnh đạo ôn trên lúa do Pyricularia oryzae
gây ra, bệnh thối rễ cây cà chua nấm Fusarium oxysprum gây ra , bệnh thối rễ và vàng
lá cây hoa cúc do nấm Rhizoctonia solani gây ra….Các nghiên cứu đã phân lập và định
danh được 4 loài Chaetomium, nghiên cứu được khả năng đối kháng của hai loài
Chaetomium globosum và Chaetomium cupreum Việt Nam trong phòng thí nghiệm, đã
chứng tỏ rằng chúng có khả năng đối kháng cao với với các loài nấm bệnh như:
Curvularia lunata, Fusarium olucopersici, Sclerotium rolfsii, Pyricularia oryzae, P.
palmyvora, P. Parasitica, Colletotrichum gloeosporioides.
Năm 2002-2003 Viện Di truyền nông nghiệp đã sản xuất thử thành công chế
phẩm trừ nấm sinh học từ các chủng Chae được tìm thấy ở Việt Nam, với tên gọi
Chae VDT và đã tiến hành thử hiệu lực chế phẩm trừ nấm sinh học này lên một số
loài cây trồng như: Cam Canh, Thông, hoa Hồng, hoa Cúc và Cà Chua [4]. Ngoài
ra ở viện khoa học kỹ thuật nông lâm nghiệp miền núi phía Bắc, Nguyễn Văn Thiệp
và cộng sự [8] đã có những nghiên cứu bước đầu về khả năng ức chế của nấm
Chaetomium với một số loại nấm gây bệnh chính trên chè, cà phê, cao su. Tuy
nhiên, những nghiên cứu này vẫn hạn chế về số loài nấm đối kháng Chaetomium, và
các nghiên cứu chỉ mới là những nghiên cứu bước đầu.
1.3. ĐẠI CƢƠNG VỀ CÂY CHÈ
Chè (Camellia sinensis) là cây công nghiệp lâu năm có nguồn gốc ở vùng
nhiệt đới nóng ẩm. Ở Việt Nam chè được trồng trên 35 tỉnh thành. Chúng đem lại
nguồn thu nhập đáng kể cho người dân và giải quyết công an việc làm cho hàng
triệu lao động.
Quá trình phát triển của của cây chè được chia làm 3 giai đoạn chính: Giai
đoạn kiến thiết cơ bản (3 năm đầu) và giai đoạn thứ 2 là giai đoạn kinh doanh từ
năm thứ 4 trở đi, giai đoạn này cho nhiều sản phẩm lá non và búp, và giai đoạn 3 là
giai đoạn già cỗi khi cây chè từ 20-30 tuổi trở đi.
Bệnh do nấm thường phá hại trên tất cả các bộ phận của cây chè, bệnh làm
rụng lá, ức chế sự sinh trưởng phát triển của cây, làm cây suy yếu dần và dẫn đến
chết.Theo Chandra Mouli [18] có 91 loài nấm gây bệnh trên chè. Trong đó bệnh hại
rễ chè thường xuất hiện ở những vùng chè được trồng trên đất rừng mới được khai
hoang hoặc trên những nương chè hơn chục năm tuổi. Loại bệnh này thường phá
hủy hệ thống rễ của cây chè nhiều khi dẫn đến cả vùng chè bị chết. Một số nơi phải
phá hủy toàn bộ diện tích chè vì không thể hạn chế được bệnh. Bệnh trên chè cũng
có thể do sự cộng hưởng của nhiều tác nhân. Tùy thuộc vào từng loại nấm phá hại
trên từng bộ phận khác nhau của cây mà ta có các biện pháp phòng trừ khác nhau.
Dưới đây là một số bệnh do nấm gây hại trên chè.
* Bệnh phồng lá chè (Do loài nấm Exobasidium spp)
Vết bệnh đầu tiên là chấm nhỏ hình giọt dầu, màu vàng nhạt, sau đó vết bệnh
lớn lên màu nhạt dần. Sau khi nấm xâm nhập vào lá khoảng 10-15 ngày sau lá
phồng lên và mặt trên lá lõm xuống, phía trên mặt có hạt phấn màu trắng. Sau một
thời gian khoảng 5-7 ngày vết phồng vỡ ra giải phóng một lớp phấn trắng hoặc
hồng hạt, chính là các bào tử của nấm. Sau khi các vết phồng vỡ vết bệnh chuyển
thành màu nâu, lá chè bị co rúm. Bệnh làm giảm năng suất, chất lượng và làm chậm
quá trình tái sinh trưởng các lứa chè sau.
* Bệnh thối búp chè (do nấm Colletotrichum camellia) thường thấy ở các
nước trồng chè vùng châu Á.
Triệu chứng và tác hại:
Bệnh được phát hiện ở Phú Hộ từ năm 1961-1962 trên những nương chè
tăng sản và lấy hom giống. Bệnh thường biểu hiện ở lá non, cuống lá và cành non.
Vết bệnh lúc đầu bằng đầu kim có màu đen, sau đó lan dần hết cả búp và cành chè.
Sau 8-10 ngày vết bệnh có thể dài tới 15-20 mm. Khi thời tiết nóng ẩm lá rễ bị rụng.
Từ tháng 7 đến tháng 9 thường có mưa kéo dài, bệnh dễ gây hại nặng.
Điều kiện phát sinh phát triển của bệnh
Nhiệt độ 270C và độ ẩm >90% là điều kiện thuận lợi cho bệnh phát sinh. Bào
tử nấm lan truyền từ mưa gió. Chè để cành và vườn ươm bón nhiều phân đạm trên
nền thâm canh cao bệnh thường phát triển nặng.
* Bệnh hại rễ chè (do nấm Fusarium hoặc Phytopthora gây nên)
Triệu chứng và tác hại:
Bệnh được phát hiện ở Phú Hộ trên những nương chè mới trồng và một số
nương chè trên 10 năm tuổi. Bệnh gây thối rễ chè từ đó làm cho lá trên cây vàng dần
rồi rụng xuống và cây chết khô dần từng phần nếu không được trừ bệnh sẽ gây chết cả
cây. Bên cạnh đó trên nương chè còn xuất hiện bệnh chết loang do thối rễ,bênh xuât
phát ban đầu từ những điểm nhỏ làm cho cây chè thối rễ , khô canh rôi chêt, bệnh lan
rộng dân qua năm thang gây chêt cây mât khoang goi la chêt loang. Nhưng nương che
cao tuôi, tôc đô chêt nhanh hơn, nhiêu nương che đa phai pha đi trông lai . Một trong
những loài nấm gây ra bênh chêt loang là Fusarium oxysporum [5].
Bệnh thường xuất hiện nhiều vào mùa mưa khi nhiệt độ nóng, ẩm và mưa
nhiều hoặc khi sức đề kháng của cây giảm nhất là trong thời gian chè ngủ.
Hình 1.3. Hình ảnh cây chè bị bệnh thối rễ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:
1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1999), Di Truyền Phân Tử, NXB Nông
Nghiệp.
2. Dương Minh, Lê Lâm Cường, Vandermissen E. et al (2003b), “Khả năng đối
kháng của các chủng nấm Trichoderma spp. nội địa đối với bệnh thối rễ
cam quít do nấm Fusarium solani tại đồng bằng sông Cửu Long”, Tạp
chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, trang 1-9.
3. Lê Minh Thi, Lê Bích Thủy, Dương Thị Hồng (1989), Thông báo kết quả
bước đầu khảo nghiệm tính đối kháng của nấm Trichoderma viridep,
Thông tin BVTV, số 2, tr 39-42.
4. Lê Thị Ánh Hồng, Nguyễn Thanh Hà, Nguyễn Thế Quyết và Nguyễn Thị
Hằng Phương (2005), Nghiên cứu ứng dụng nấm Chaetomium trong
sản xuất các chế phẩm vi sinh bảo vệ thực vật phòng chống các bệnh
nấm hại; Viện Di truyền nông nghiệp, Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn.
5. Nguyễn Hữu La và cộng sự (2012-2016), Nghiên cứu sản xuất chế phẩm
Chaetomium trừ nấm gây bệnh trên chè, cà phê, cao su, Viện khoa học
kỹ thuật nông lâm nghiệp miền núi phía Bắc, Bộ nông nghiệp và phát
triển nông thôn.
6. Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005), Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát sự đa dạng di
truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác
nhau, Luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông
Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam.
7. Nguyễn Văn Hùng (1998), Sâu, bệnh, cỏ dại hại chè, NXB NN, Hà Nội.
8. Nguyễn Văn Thiệp và cộng sự, Nghiên cứu khả năng ức chế của nấm
Chaetomium đối với một số loại nấm chính gây bệnh cho cây chè, Hội
thảo quốc gia về khoa học cây trồng lần thứ 2.
9. Nguyễn Văn Tuất, Lê Văn Thuyết (2001), Sản xuất chế biến và sử dụng
thuốc bảo vệ thực vật thảo mộc và sinh học, NXB. Nông nghiệp.
10. Phương pháp nghiên cứu BVTV theo QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT(2001),
Tiêu chuẩn bảo vệ thực vật, phân bón, Tuyển tập phân bón tiêu chuẩn
nông nghiệp Việt Nam.
11. Phạm Thị Thùy (2006), Đề tài nghiên cứu công nghệ sản xuất nấm lục
cương Ma theo công nghệ Cuba để phòng trừ bọ hung hại mía và mối
đất, Đề tài cấp ngành.
12. Trần Thị Thuần (1997) “Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma”, Tạp chí
BVTV số 4, trang 33.
13. Trần Thị Thuần, Nguyễn Thị Ly, Phạm Ngọc Dung (2004), “Nghiên cứu và
sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ nhóm nấm tồn tại
trong đất gây hại cây trồng”, Tạp chí bảo vệ thực vật.
Tiếng Anh
14. Bainier G. (1910), “Monographie des Chaetomidium et des Chaetomium”,
Bull. Soc. Mycol. Fr, 25, pp. 191–237.
15. Baldwin, B.G.(1993), “Molecular phylogenetics of Calycadenia
(Compositae) based on ITS sequences of nuclear ribosomal DNA:
Chromosomal and morphological evolution reexamined”. Am. J. Bot.
80, 222–238.
16. Baldwin, B.G., Sanderson, M.J., Porter, J.M., Wojciechowski, M.F.,
Campbell, C.S., Donoghue, M.J. (1995), “The ITS region of nuclear
ribosomal DNA: A valuable source of evidence on angiosperm
phylogeny”. Ann. Missouri Bot. Gard, 82, 247–277
17. Bordeau, M.A. and J.H Andrew. (1987), Factors influencing antagonism of
Chaetomium golobosum to venturia inaequalis, A case study in failed
biocontrol. Phytopathology 77: pp. 1470-01475
18. Chandramouli, M.R. and Baby, U.I. (2002), Control of thorny stem blight
disease of tea with fungycides and biocotrol agents, Proceedings of
plantation crops symposium (PLACROSYM XV), pp. 531-534.
19. Chives, A. H. (1915), A monograph of the genera Chae and Ascotricha.
Mem. Torrey Bot. Club, 14: pp. 155-240.
20. Cullen and cs. (1984), “Chae golobosum antogonizis the apple sab pathoge,
venturia and under field conditions”, Canadian Journal of Botany 62:
1814-1818.
21. Di-pietro, A., R.Kung, M, Gutrella and F.J. Schwinn. (1991), “Parameters
influencing eficacy of Chae globosum in control Pythium ultimum
damping off of sugar - beet”, J. Plant Diseases and prtection 98, pp.
565-573.
22. Dulmage, H. T. (1970), “Insecticidal activity of HD-1, a new isolate of Bacillus
thuringiensis var. Alesti”, J. Invertebr. Pathol, (15), pp. 232-239.
23. Heye, C.C and J.H. Andrew. (1983), Antagonism of Athelia bombacina and
Chae globosum to the Scab Pathogen, Venturia naequalis. Phytopath,
73: pp. 650-654.
24. Jiao W.X., Feng Y.J., Blunt J.W., Cole A.L.J., Munro M.H.G.(2004),
“Chaetoglobosins Q, R, and T, three further new metabolites
from Chae globosum”, J. Nat. Prod. 67:1722–1725. doi:
10.1021/np030460g, [PubMed] [Cross Ref].
25. Kohl, J.W., Molhoek, H.L., van der Plas, C.H. and Fokkema, H.J. (1995),
Effect of Ulocladium atrum and other antagonists on sporulation of
Botrytis cinerea on dead lily leaves exposed to field condition,
Phytopathology 85: 393-400.
26. Kurtman, C. P and Robnett, C.J. (1997), “Identifiction of cliniccally
important ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in the
5’ end of the large - subunit (26S) ribosomal DNA gene”, J. Clin,
Microbial. 35:1216-1223.
27. Li G. Y., Li B. G., Yang T., Yan J. F., Liu G. Y. & Zhang G. L.(2006),
“Chaetocochins A-C, epipolythiodioxopiperazines from Chae
cochliodes”. J. Nat. Prod. 69, 1374–1376.
28. Mandel M, Andreotti R, Roche C. (1976), “Measurement of saccharifying
cellulase”, Biotechnol Bioeng Symp , 6: 21-23.
29. Natalija Andresen (2007), Enzymatic Hydrolysis of Cellulose, Ph.D. Thesis
30. Rai JN and Mukerji, K, G. (1964), “A Chaetomium, a new genus of
ascomycetes”. Canadian Journal of Botany 42, pp. 693 - 697.
31. Seth, H.k (1970). “A monograph of the genus Chaetomium”. Nova
Hedwigia.
32. Sekita, K., Yoshihara, S., Natori, K., Kuwano., H., (1976), “Structure of
Chaetoglobosin C, D, E, and F cytotoixic indol - 3- yl [13]
cytochalasans from Chae globosum”, Tetrahedron lett, 1351-1354.
33. Sekita, K.,S. Yoshihira, S. Natari, S. Udagawa, T. Muroi, H. Sugiyama, H.
Kurata and M. Umeda (1981), “Micotoxin production by Chae spp.
And related fungi”. Can.J.Bot.27.
34. Shafa Khan, N.B. Bagwan, Mohammed Asef Iqbal, R.R. Tamboli. (2011),
“Mass multiplication and shelf life of kiquid fermented final product of
Trichoderma viride in different formulations”. Advances in
bioresearch, pp: 178 - 182.
35. Singh, R. S., Singh, H. V., Puneet S. and Jaspal K. (2001), “A comparison of
different substrates for the mass production of Trichoderma”, Annal.
Pl. Prot. Sci., 9(2) : 248- 253
36. Smith, R.A. (1982), “Effect of strain and medium variation on mosquito
toxin production by Bacillus thuringensis var israelensis”, Can. J.
Microbiol, 28; 1089-1092.
37. Soytong, K. (1988), Species of Chae in the Philippines and screening for
their biocontrol properties against seedborne fungi for rice,
Ph.D.thesis. UPLB, Los Banos, Philippines.
38. Soytong, K and Quimio, T.H. (1989), “A taxonomic study on the philippine
species of Chaetomium”, The philippine Agriculturist.
39. Soytong, K. and Quimio, T.H.(1989), “Antagonism of Chae globosum to the
rice blast pathogen, Pyricularia oryzae”, Kasetsart Journal (Natural
Science) 23: 198-203.
40. Soytong, K. (1990), A taxonomic study of Chae spp. In Thailand. Abstract,
4th International Mycological Congress, Regensburg, Germany, August
28-September 3.
41. Soytong, K. (1991), Species of Chae in Thailand and screening for their
biocontrol properties against plant pathogens, Abstract, The 12th
international plant protection congress, Rio de Janeiro, Brazil
42. Soytong, K. (1991a), Species of Chae in Thailand soils,Thai
Phytopathology, 11, pp. 86-94. Soytong, K. (1992a), “Antagonism of
Chae cupreum to Piricularia oryzae”, Journal of Plant Protecition in the
Tropics, (9): pp. 17-24.
43. Soytong, K. (1992b), “Biological control of tomato wilt caused by Fusarium
oxysporum, f sp. lycopersici using Chae cupreum”, Kasetsart Journal
(Natural Science) 26: 310- 313.
44. Soytong, K and Kobboon. (1997), Chae as a new broad spectrum
mycofungicide, Proceedings of the 1sI Internatonal Symposium on
Biopesticides: 124- 132.
45. Suh, Y., Thien, L.B., Reeve, H.E., Zimmer, E.A. (1993), “Molecular evolution
and phylogenetic implications of internal transcribed spacer sequences of
ribosomal DNA in Winteraceae”, Am. J. Bot, 80, 1042–1055.
46. Udagawa, S. (1973), There new Species from Thailand soil, Rep, Tottori
Mycol, Inst, 10: pp. 429-435.
47. Umeda. (1981), “Micotoxin production by Chae spp and related fungi”,
Can. J. Bot. 27: pp. 766-772.
48. Von Arx, J. A., J. Guarro and M. J. Figuers. (1986), The Ascomycetes
Genus Chaetomium. Nova Hedwigia 84: pp. 1-162.
49. Von Arx, J.A., M. Dreyfuss and E. Muller. (1984), A revolution of Chae and
the Chaetomia-ceae. Persoonia, 12: pp. 169-179.
50. V.P.Prokhorov and M.A.Linnik .(2009), Morphological, Cultural and
Biodestructive Peculiarites of Chae Species, Moscow state University,
Moscow, pp. 119-991.