nuevos marcadores en el diagnóstico de enfermedades ... · de enfermedades autoinmunes. ... -...
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Catalina Pérez K, M. D. Patóloga Clínica
Uruguay, noviembre 8 de 2016
Nuevos marcadores en el diagnóstico
de enfermedades Autoinmunes.
“Retos para el clínico y el Laboratorio”
S
A
F
•
•
•
1Cohen D. et al. 2010 BMJ, 340:c2541
• Aparición de uno o más eventos trombóticos o tromboembólicos,
que no se explican de ninguna otra manera.
• Una o varias morbilidades del embarazo
• Trombocitopenia o prolongación de alguna de las pruebas de
coagulación que no se explica de otra manera (como por ejemplo: el
TTPa).
Hª CLÍNICA PRUEBAS COMPLEMENTARIAS
SOSPECHA
CRITERIOS DIAGNÓSTICOS • Criterios de SYDNEY, revisados (2006)
1 criterio clínico + 1 criterio analítico (en 2 ocasiones separadas entre sí 12 semanas)
CRITERIOS DIAGNÓSTICOS • Criterios de SYDNEY, revisados
(2006)
No más de 5 años antes del debut de las manifestaciones clínicas
Situación Clínica Sugestiva
Tendrá el paciente aPL?
LA aCL (IgG/IgM)
ab2GPI (IgG/IgM)
Miyakis et al. J Thromb Haemost 2006
Wilson et al. Arthritis Rheum 1999
CRITERIOS DXS
aCL y Anti-b2GPI
aCL 70% 75%
Anti-b2GPI 53% 95%
“S” “E”
Amengual et al. Br J Rheumatol 1996
Atsumi et al. Arthritis Rheum 2000
Limitaciones: Falta de estandarización
• Ac. aCL tipo IgG e IgM
• Ac. Anti B2GP1 tipo IgG e IgM
• Prueba del anticoagulante lúpico (LA)
INICIALES:
CONFIRMACIÓN:
• Si test previos + repetir a las 12 semanas
• ¿Por qué? La elevación transitoria de los ac aCL tipo IgG e IgM, así
como la postividad del LA puede ocurrir entre el 6-10% de individuos sanos
e infecciones.
¿Y en el paciente anticoagulado?
• Ac. aCL tipo IgG e IgM
• Ac. Anti B2GP1 tipo IgG e IgM
• NO anticoagulante lúpico
• El riesgo de fenómenos tromboembólicos, así como la confianza en
el diagnóstico puede aumentar con los niveles de ac aPL y con el Nº
de test diferentes positivo para detectar ac aPL. Por cada 10
unidades que aumentaban la IgM o IgG del ac aCL se
aumentaba entre un 5-7% el riesgo de tromboembolismo.
CONSIDERACIONES:
• Una triple positividad (LAC, aCL, β2GP1) está relacionada con una mayor tasa de episodios trombóticos
1Pengo, V et al. Blood. 2011 vol. 118 no. 17 4714-4718.
0,5
1,7
5,5
0
1
2
3
4
5
6
Normal Singlepositivity
Triplepositivity
Tasas promedio anuales de primeros eventos; sanos, portadores de 1 aPL positivo; con triple marcador
Sanos positividad positividad
aislada triple
CONSIDERACIONES:
¿Y con los que NO cumplen criterios?
• Reevaluación clínica y de laboratorio
• Valorar gravedad clínica • Valorar potencial riesgo de eventos
recurrentes
Hallazgos clínicos
Hallazgos de laboratorio
CRITERIOS DIAGNÓSTICOS
A pesar de la asociación de EAI con anticuerpos, algunos pacientes son persistentemente negativos para anticuerpos especificos (ej AR)
Aunque la prevalencia es baja – alto impacto: son casos difíciles que
representan un problema en la práctica
Posibles explicaciones:
• Dx errado?
• aPL revirtieron a negativos?
• Diferentes autoanticuerpos?
• Persiste alta sospecha de SAF
• Ac. aCL y anti Β2GP1 tipo IgA
• Ac. Anti-protrombina, anti-fosfatidilserina, anti-fosfatidilinositol
no rutinarios por:
• No están estandarizados • Se conoce poco sobre su S y E, su significado clínico y
pronóstico
CONDIDERACIONES
Anti PS/PT
• PS/PT es un complejo de fosfolípido y proteina
Complejo Fosfatidilserina/protrombina (PS/PT)
– La unión de estos, causa cambio conformacional en la proteína, evidenciando sitios de unión de anticuerpos clínicamente relevantes
Swadzba, J. et al. 2012 Diagnostyka Sp. ZO.O
phosphatidylserine
prothrombin aPS/PT
Isotipos IgG e IgM
aPS/PT
•Los anticuerpos contra PT muestran muy pobre correlación con manifestaciones clínicas de SAF
•Anticuerpos contra PS/PTpero no aPT, se encuentran más frecuentemente en pacientes con LAC
• IgG e IgM PS/PT estuvieron asociados a trombosis en general y particularmente con trombosis venosa en pctes con LAC
Miyakis, S. et al. 2006 J Throm Haemos
Hoxha, A. et al. 2012 Lupus
Vlagea, A. et al. 2012 Clin Appl Thromb Hemost
• Correlación
Pts # LAC pos
PS/PT IgG and/or IgM
Ref
St Thomas (Khamashta) APS; SLE/APS 71 58% Shums et al, poster
Milan (Meroni) APS 77 87.6% Pregnolato et al,2013 in press
Ljubljana APS 85% Zigon et al, Abstract
Paris (Miyara) APS 81 91% Miyara et al, abstract
Hopkins (Petri) SLE 71 48% Akhter,Shums, Norman,Binder,Fang,Petri, J Rheum 2013 in press
Italy (Bizzaro) APS 49 75.5% Bizzaro et al, abstract Granada, 2012
LAC y PS/PT
Cofactor?
100% pctes con anti PS/PT por Bizzaro son LAC+ 2013
Pcte de sexo femenino de 30 años Historia previa de cefalea, alteraciones de memoria
(RM:alteración de pequeños) Livedo reticularis marcado en ambos MsIs Pre-eclampsia severa y parto @34 sem
aCL – ve/LA – ve/anti-B2GPI+ve
2005 - No SAF
2011 APS
aCL - ve /LA - ve /anti B2GPI- ve/anti-PS/PT+ve
2011 No SAF
Pruebas
SAF seronegativo
30.8%
18.6%
9.3%
0%
0
5
10
15
20
25
30
35
ACA IgG ACA IgM ACA IgA ACA IgG ACA IgM ACA IgA
% P
os
SAF Seropositivo SAF Seronegativo
Sero-Pos=107
Sero-Neg=68
Cortesía: Dr Munther Khamashta
SAF SERONEGATIVO
26%
23.3% 22.4%
0% 0% 1.4%
0
5
10
15
20
25
30
β 2GPI IgG
β 2GPI IgM
β 2GPI IgA
β 2GPI IgG
β 2GPI IgM
β 2GPI IgA
% P
os
SAF Seronegativo
Cortesía: Dr Munther Khamashta
SAF Seropositivo
Sero-Pos=107
Sero-Neg=68
SAF SERONEGATIVO
41.1%
35.5%
5.8% 5.8%
0
10
20
30
40
50
PSPT IgG PSPT IgM PSPT IgG PSPT IgM
% P
os
SAF Seropositivo SAF Seronegativo
Sero-Pos=107
Sero-Neg=68
Cortesía: Dr Munther Khamashta
SAF SERONEGATIVO
J Thromb Haemost. 2012 Dec;10(12):2512-8.
• 230 pacientes con LES
• Evaluaron LA, aCL, aB2GPI, aPT, aPS/PT, aPE (IgG e IgM)
• 23 posibles combinaciones de resultados
LA+ B2GPI+ PSPT = mejor exactitud diagnóstica para SAF, para trombosis y pérdida fetal = mejor especificidad de todas las combinaciones
Triple positividad LA+ B2GPI+ PSPT asociado fuertemente con eventos clínicos
23,2 7,32 5,67 3,11
0
50
Triple positiveLAC only PS/PT only B2GP1 only
Odds ratios for thrombosis according to aPL profile
Cual es la mejor combinación?
Cual es la mejor combinación?
• Pueden servir como test confirmatorios del LAC, sin necesidad de interrumpir terapia.
• Es una factor de riesgo independiente para trombosis venosa y complicaciones obstétricas.
• Detección SAF seronegativos
• Cuando presente una sola prueba positiva a titulos muy bajos (20 – 30% pctes )
Vlagea M L. et al. 2012 Clin Appl Thromb Hemost. 2 March 2012. DOI:1177/1076029612437578
Sciascia, S. et al. 2012 Clin Haem Thromb
Conclusiones anti PS/PT
βeta2 - Glicoproteína 1
Dominio 1
β2 GPI Dominio 1
• β2 Glicoproteina I (β2 GPI) es una proteína de 326 aa con 5 dominios
• β2 GPI-D1 (64 aa) es el blanco principal de los autoanticuerpos en pctes con SAF
Mahler M, Mahler, Norman, Meroni, Khamashta. Autoantibodies to domain 1 of beta 2 glycoprotein 1: A promising
candidate biomarker for risk management in antiphospholipid syndrome. Autoimmun Rev 2013
• Exposición del epítope de β2-GP1-D1 luego de unirse a fosfolípidos vía dominio 5
β2 GPI Dominio 1
D5
R39-R43
c)
Based on data from:
Bouma et al. 1999,
Scharzenbacher et al. 1999, Hammel et al. 2002, Agar et al. 2010
Reviewed in:
DeLaat` 2011
Conformation change leads to the exposure of the domain 1 epitope(intermediate stages not shown)
De Laat B, et al. Pathogenic anti-beta2-glycoprotein I
antibodies recognize domain I of beta2-glycoprotein I only
after a conformational change. Blood. 2006 Mar
1;107(5):1916-24. Epub 2005 Nov 3.
Mahler M, et al. Autoantibodies to domain 1 of beta 2
glycoprotein 1: A promising candidate biomarker for risk
management in antiphospholipid syndrome. Autoimmun Rev
2013
Asociación de anticuerpos β2 GPI-D1 y no-β2 GPI-D1 y trombosis
β2 GPI Dominio 1
De Laat B, et al. The association between circulating antibodies against domain I of beta2-glycoprotein I
and thrombosis: an international multicenter study.
J Thromb Haemost. 2009 Nov;7(11):1767-73.
β2 Glicoproteina I Dominio 1 (β2 GPI-D1)
• Asociación con trombosis
De Laat B, et al. IgG antibodies that recognize epitope Gly40-Arg43 in domain I of beta 2-glycoprotein I cause LAC, and their presence correlates strongly with thrombosis. Blood. 2005 Feb 15;105(4):1540-5. Epub 2004 Oct 26.
D1+ Non-D1+
Asociación de anticuerpos β2 GPI-D1 y no-β2 GPI-D1 con
complicaciones obstétricas
β2 GPI Dominio 1
De Laat B, et al. The association between circulating antibodies against domain I of beta2-glycoprotein I and
thrombosis: an international multicenter study.
J Thromb Haemost. 2009 Nov;7(11):1767-73.
β2GPI Dominio 1– estudio SAF
Desempeño en pctes y controles
Albesa et al., Performance of a novel chemiluminescent test for detection of antibodies to β2GP1-Domain 1 in patients with anti-phospholipid syndrome (APS). 8th International Congress on Autoimmunity, Granada, Spain from 9-13 May, 2012.
Figure 1 Anti-β2GP1-D1 in different patient cohorts (values in
relative light units, RLU).
BIO-FLASH B2GP1-Domain 1
Norm
als
(N=2
00)
HBV (N
=32)
HCV (N
=20)
HIV
(N=1
0)
Syp
h (N=1
0)
APS (N
=144
)0
1100 6
2100 6
3100 6
RL
Us
BIO-FLASH B2GP1-Domain 1
Norm
als
(N=2
00)
HBV (N
=32)
HCV (N
=20)
HIV
(N=1
0)
Syp
h (N=1
0)
APS (N
=144
)0
1100 6
2100 6
3100 6
RL
Us
p < 0.05
Excelente discriminación entre pctes con SAF y controles
•Pctes: 144 APS, 10 HIV, 10 Sífilis, 32 HBV, 20 HCV, 200 personas aparentemente sanas
β2 GPI-D1 vs otros dominios
Anti D1 se encuentra en 55% de pctes con antiB2GP1 positivos 83% tuvieron trombosis Asociación con morbilidad obstétrica
Conclusiones anti dominio 1β2GPI
• β2GPI Dominio 1 muestra buena sensibilidad/especificidad para SAF y mayor probabilidad de trombosis
• Utilidad Clínica potencial:
- Prueba diagnóstica de alta especificidad -Prueba confirmatoria
- Prueba para estratificación de riesgo
• Hay en el momento varios estudios Internacionales
• Aún falta por esclarecer su papel como ac aislado
ENTENDIENDO EL DFS 70
Anticuerpos Anti-DFS70
S
A
R
D
HEp-2 es el sustrato ideal de screening.
Positividad de ANA (HEp-2) en población general
Positividad IFI en pacientes no SARD se atribuye a anticuerpos DFS70
Watanabe A, Kodera M, Sugiura K et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis Rheum 2004; 50: 892-900
ANA +20%
ANA -80%
Chart Title
ANA + (DFS)10%
ANA -80%
ANA -(other
pattern)10%
Chart Title
Report of the first International Consensus on standarized nomenclature of ANA Hep 2 cell patterns 2014-2015
b.) c.)
d.)
Anti-DFS70 (HEp-2)
Antígeno = “Lense epithelium derived growth factor (LEDGF)”
• Patrón característico:
• Una publicación de revisión de cinco artículos indica que los Acs - DFS70 son más
frecuentes en dolencias no SARD como el síndrome de Vogt-Harada, dermatitis
atópica, asma, cistitis intersticial, así como en individuos sanos
Prevalencia de anti-DFS70 en diversas
condiciones clínicas
Prevalencia de Acs anti-DFS70 en forma aislada o
en combinación con otros autoacs en SARD
• Una revisión de tres artículos revela que los anticuerpos - DFS70 son muy
raros en SARD, y aún más rara en forma aislada sin otros autoanticuerpos
específicos
ELISA
Inmunoblot
CLIA
SOPORTE
MICROPLATOS Anti-Ig humana -
enzima
MEMBRANA Anti-Ig humana-
enzima
NITROCELULOSA
PARTÍCULA
PARAMAGNÉTICA Anti-Ig humana –
isoluminol
SUSTRATO
Inmunoensayos específicos anti DFS-70
Test de inhibición de DFS 70 Mayor especificidad
Patrones moteado grueso y moteado fino denso
Patrón moteado grueso
Patrón puntos nucleares y moteado fino denso
Patrón Puntos Nucleares
AUTOANTICUERPOS EN MIOPATÍAS NECROTIZANTES
INDUCIDAS POR ESTATINAS (HMGCR): (3-HYDROXY-3-
METHYL-GLUTARYL-COA REDUCTASE)
Anticuerpos anti-HMGCR
M
i
o
p
a
t
í
a
s
Prevalencia en uso estatinas USA
• 50% de hombres y 36% de mujeres en edades
comprendidas entre 65-74 años, se les prescribe estos
medicamentos
• Incremento dramático en los últimos 10 años
CDC: Health, United State 2010 report
Nuevas guías
•
•
•
-
-
-
-
Miopatías por estatinas
• Aunque las estatinas son practicamente seguras, el 20% de pctes
suspenden la terapia por reacciones adversas que van desde
dolores musculares leves hasta una rabdomiolisis
• En la mayoría de los casos, la miopatía por estatinas es autolimitada
y se resuelve al suspender la terapia
• En algunos casos, las estatinas conllevan a una miopatía progresiva,
severa, mediada inmunológicamente, que no se resuelve con la
suspensión del tratamiento
Estos Pctes. Desarrollan anticuerpos anti-HMGCR, el blanco
farmacológico de las estatinas
FDA obligó cambio en etiquetado
• Asociación con miopatías necrotizantes aociadas a estatinas.
www.fda.gov/safety/medwatch/safetyinformation/ucm327852.htm
Características de la miopatía autoinmune
necrotizante
• “Necrotizing autoimmune myopathy” (NAM)
• Características:
- Necrosis de la fibra muscular sin inflamación
- Altos niveles de CK
- Negativos para anti-SRP, anti-Jo-1, anti-PM/Scl
- Responden bien a la terapia inmunosupresora
• Los sxs de intolerancia pueden ocurrir en cualquier
momento luego del inicio de estatinas
- Promedio 6.3 meses, con un rango entre 1 semana a 4 años
Mohassel, P. et al. Statin-associated autoimmune myopathy and anti-HMGCR autoantibodies. Muscle and Nerve 2013
La importancia de reconocerla
tempranamente
• El tiempo entre la suspensión de la estatina y la resolución de los sxs
varía considerablemente, con un promedio de 2.3 meses (1 sem – 14
meses)
• En lugar de esperar a que los síntomas desaparezcan para determinar
si se trata de la forma autolimitada, la determinación de anti-HMGCR
ayuda a detectar pctes que probablemente progresarán a una miopatía
autoinmune asociada a estatinas
• Recordar que este proceso puede culminar en rabdomiolisis: falla renal
Mohassel, P. et al. Statin-associated autoimmune myopathy and anti-HMGCR autoantibodies. Muscle and Nerve 2013
74%
19%
7% IMNM (20/26)
PM (5/26)
DM (2/26)
•
63
La Mayoría de pctes positivos tuvieron dx IMNM.
Ghirardello A, et al. International multi-center study on anti-HMGCR antibodies, a novel autoantibody in statin associated necrotizing myopathies. 9th International Congress on Autoimmunity 26-30th March 2014, Nice, France.
•
Musset M, et al. Analysis of autoantibodies to 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A reductase (HMGCR) using different technologies. J Immunol Res, in press Drouot L, et al. Exploring necrotizing autoimmune myopathies with a novel immunoassay for anti-3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase autoantibodies. Arthritis Res Ther 2014, 16:R39.
64
ELISA
•
•
•
•
CALPROTECTINA
E
n
f
G
a
s
t
r
o
i
n
t
e
t
i
n
a
l
•1- 1.5 millones de personas en USA
• Alta morbilidad y utilización de los servicios de salud.
• Sólo intestino grueso
• Continuo
• Inflamación de la mucosa
• Manifestaciones extraintestinale (piel, ojos,
articulaciones) y malignidad colorectal
• Todo el tracto GI (ileo terminal)
• Discontinuo
• Inflamación transmural
• Manifestaciones extraintestinale (piel, ojos,
articulaciones) y malignidad colorectal
Colitis ulcerativa Enfermedad de
Crohn
IC
UC-like CD
Enfermedad Inflamatoria intestinal - EII
Casos EII aumentando a nivel mundial
10,000
20,000
30,000
40,000
50,000
60,000
70,000
80,000
UC CD
2,831 3,518
4,098 4,856
5,715 6,609
7,702 8,862
9,980
11,337
12,645
13,997
15,440
16,891 18,036
19,651
21,061
0
5,000
10,000
15,000
20,000
25,000
85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01
11,602 13,613
16,037 18,072
20,813 23,200
26,603
29,661 33,114
36,979
41,243
46,215
51,4
77
57,078
60,631
66,714
72,672
0 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01
Data Courtesy of Drs H. Ogata and Xia Bing
Jiang L, Xia B, Li J, et al. Inflamm Bowel Dis, 2006;12:212-7
China -Wuhan City desde 1990
CD
UC
Japón (1985-2001)
Europa (1955-1990) • Incremento verdadero en incidencia ? • Mejor diagnóstico y detección?
Presentación clínica del SII y EII
69
SII • flatulencia • Moco en las
heces • defecación
desordenada
EII • disentería
• Pérdida de peso • Ulceras
• Perforación de colon
Superposición
• Diarrea • Dolor abdominal y
calambres • Estreñimiento
Trastorno funcional del intestino que afecta a un 15-20% de la población con dolor o malestar abdominal junto con otros síntomas clínicos
Inflamación crónica de la totalidad o parte del tracto digestivo que afecta a 0,5 a 1% de la población
Longstreth, G. et al. Functional Bowel Disorders. J Gastroenterol. 2006;130:1480 –1491.
1
10
100
10 000
0.1
1000
Crohn´s disease N = 31
IBS N = 159
Miscellaneous N = 30
Faecal calprotectin mg/L
Gut 2000;47:506-513
Calprotectina fecal
Calprotectin as marker of disease activity in UC assessed according to histology
180
0
20 40 60
80 100 120 140
160
Normal colonoscopy N = 125
U. C. No/low activity N = 36
U.C. Active disease N = 28
p = 0.02
p < 0.0001
Digestion 1997;58:176-80
Faecal calprot. mg/l
Crohns and SII UC Active vs inactive disease
•Diferencia EII de SII •Diferencia enfermedad activa vs inactiva
Introducción al test de Calprotectina Fecal
71
La Calprotectina fecal es un heterocomplejo secretado por los neutrófilos y el epitelio inflamado, como parte de la respuesta inmune innata inicial. Es resistente a la degradación intestinal, constituyéndose en un marcador específico no invasivo para la inflamación intestinal • Utilidad Diagnóstica
• Apoya el diagnóstico diferencial entre la enfermedad gastrointestinal orgánica y funcional • Puede ayudar a estratificar los pacientes en necesidad de endoscopia • Evita procedimientos invasivos innecesarios en pacientes pediátricos
Carroccio, A. et al. Diagnostic accuracy of fecal calprotectin assay in distinguishing organic causes of chronic diarrhea from irritable bowel syndrome: a prospective study in adults and children. Clin Chem 2003;49:861-7. Bunn, S. et al. Fecal calprotectin: validation as a noninvasive measure of bowel inflammation in childhood inflammatory bowel disease. J Pediatric Gastroenterology Nutrition 2001;33:14-22.
Utilidad diagnóstica (van Rheenen et al, BMJ 2010)
Estratificando pacientes en la practica diaria de Gastroenterología Práctica
73
Los resultados sugieren que el uso de la calprotectina fecal para detectar pacientes con diarrea crónica podría excluir a todos los que no tienen EII y todos los que no presentan inflamación del colon, evitando así la necesidad de una colonoscopia
Banerjee, A. et al. Faecal calprotectin for differentiating between irritable bowel syndrome and inflammatory bowel disease: a useful screen in daily gastroenterology practice. Frontline Gastroenterol. doi:10.1136/flgastro-2013-100429.
Exclusión segura de EII en niños
74 Van de Vijver, E. et al. Safely ruling out inflammatory bowel disease in children and teenagers without referral for endoscopy. Arch Dis Child 2012;97:1014-1018.
• Una estrategia diagnóstica utilizando score clínicos para los pacientes con sospecha de EII (en la práctica pediátrica) en combinación con la calprotectina fecal positiva aumenta la especificidad para detectar la EII • Niveles de calprotectina normales descartan la inflamación intestinal y evitan la realización de la endoscopia
Calprotectina como indicador de respuesta al tratamiento
Aadland et al, J Gastroenterol Hepatol 2002 Hamalainen et al, World J Gastro, 2011
Calprotectina Utilidad en monitoreo (DeVos et al, JCC 2012)
• Terapia Infliximab - 10 sems tto: calprotectina disminuyó <50
mg/kg o por lo menos 80% de valores basales en 58% pctes (hubo remisión endoscópica)
De Vos, M. et al. Fast and sharp decrease in calprotectin predicts remission by infliximab in anti-TNF naive patients with ulcerative colitis. J Crohns
Colitis. 2012;6:557–562.
Remission at week 10
No Remission at week 10
Mucosal healing key clinical parameter
March 2013
• Calprotectina podría ser un marcador importante de resolución
• Wright et al. (2014) • “Faecal calprotectin is superior to
faecal lactoferrin and s100A12 as a surrogate marker for post operative crohn’s disease endoscopic recurrence”.
Calprotectina– Incorporación en el diagnóstico
• La calprotectina fecal es un marcador óptimo para la evaluación de recurrencia post operatoria, con alta sensibilidad y VPN
Actualmente: ELISA
Metodologías
Características desempeño: Diferentes alternativas en el medio: todas por ELISA “s” y “e” Rango analítico: 0 – 3000 mg/kg
Próximamente CLIA
