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Obtención de un Preparado Enzimático de Ligninasas por Fermentación en Estado
Sólido Empleando Trametes versicolor y Residuos Agroindustriales
Propuesta Tesis Doctoral
Estudiante
Doctorado en Ciencias Agrarias
YÉSICA ALEJANDRA PATIÑO MARÍN
Director
ÓSCAR JULIÁN SÁNCHEZ TORO, M.Sc., Ph.D.
Grupo de Investigación en Alimentos y Agroindustria
Co-directora
SANDRA MONTOYA BARRETO, Esp., M.Sc., Ph.D.
Grupo de Investigación en Alimentos y Agroindustria
Doctorado en Ciencias Agrarias
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Universidad de Caldas
Manizales 2015
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1. INTRODUCCIÓN
El crecimiento de las plantas es importante en los ecosistemas terrestres; pero
igualmente es importante su muerte, descomposición y reciclaje. Las plantas desprenden
constantemente hojas, ramas y otras partes que acceden así al suelo. Estos materiales
crean un área de material muerto en el suelo denominado Residuosfera (Saval, 2012). Este
nuevo hábitat es muy rico en actividad microbiana, en donde se produce una gran
variedad de procesos microbiológicos. En las zonas anaeróbicas, a partir de los materiales
solubles liberados de los residuos vegetales se produce desnitrificación proceso
metabólico donde el nitrato se convierte en nitrógeno gas bajo condiciones anóxicas, y
posiblemente proceso de intercambio genético.
La mayor parte del resto de materiales no solubles, como celulosa y algunas proteínas
son degradadas tanto aeróbica como anaeróbicamente. La lignina, un polímero insoluble y
altamente recalcitrante de compuestos cíclicos aromáticos requiere una degradación
aeróbica. El género de los hongos basidiomicetos, que actúan mejor aeróbicamente, son
los mayores productores a nivel mundial de ligninasas y fenoloxidasas, enzimas
requeridas para la degradación de lignina. La descomposición de este material biológico
también está limitada por la naturaleza física del material las plantas leñosas en buen
estado se encuentran saturadas en savia, creando un ambiente aeróbico, con un reducido
flujo de oxígeno similar al encontrado en los ambientes acuáticos. Además, altos niveles
de etileno y CO2, así como la presencia de compuestos fenólicos y terpenoides, retrasan el
crecimiento de los hongos degradadores de lignina. Por tanto el primer paso en la
descomposición de la lignina es físico, que implica la creación de un ambiente aeróbico
que comienza cuando cesa el flujo de savia a través del tejido vascular. Esto proporciona
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suficiente oxígeno a los tejidos de la planta para comenzar la degradación aeróbica de la
lignina.
Además de estos materiales se tienen los generados en la agroindustria, representados
por la biomasa lignocelulósica, los desechos del sector del agro muestran que entre el 20 y
50 % de su totalidad son materiales lignocelulósicos. Toda esta cantidad de biomasa tiene
un potencial importante como fuente de riqueza y de productos de mayor valor agregado.
Desafortunadamente son desechos que no se disponen adecuadamente generando una
importante contaminación ambiental debido a la fermentación rápida que genera
proliferaciones de insectos, calentamiento de las aguas de río y riachuelos con la
consiguiente agresión ambiental. La disposición final de desechos y su posible utilización,
es un campo de difícil manejo debido a varios factores, entre los que se pueden citar la
gran heterogeneidad del recurso, carencia de técnicas para su industrialización o
tratamiento y falta de información sobre volúmenes de biomasa generados, lo cual
muestra que es un recurso totalmente sub-explotado con un gran potencial.
El material lignocelulósico es el principal componente de la pared celular de las
plantas, esta biomasa producida por la fotosíntesis es la fuente de carbono renovable más
prometedora para solucionar los problemas actuales de energía (Cuervo et al., 2009). El
principal impedimento tecnológico para la utilización de la biomasa vegetal es en general,
la ausencia de una tecnología de bajo costo dirigida a eliminar la recalcitrancia de la
lignina contenida en el material lignocelulósico. Se han desarrollado diversos métodos
que mejoran la hidrólisis del material lignocelulósico, como los pre-tratamientos
fisicoquímicos y biológicos. La finalidad del pre-tratamiento es remover la lignina,
hidrolizar la hemicelulosa a azúcares fermentables, y reducir la cristalinidad de la celulosa
para liberar la glucosa.
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Toda la materia orgánica de origen vegetal o animal que incluyen materiales
procedentes de su transformación natural o artificial es denominada como: Biomasa
Lignocelulósica, los principales constituyentes de los vegetales son el almidón; utilizado
como reserva energética, y los que componen sus paredes celulares, constituidas por
pectinas, celulosa hemicelulosa y lignina (Montoya, 2008). La celulosa y la lignina son
los biopolímeros más abundantes de la naturaleza, su descomposición a CO2, H2O y
sustancias húmicas, constituyen probablemente el evento biodegradativo más importante
conocido en el ciclo biosférico del carbono.
Uno de los retos más grandes que tiene visualizado el sector científico de la
biotecnología es lograr conocer en totalidad y estandarizar la producción de enzimas
ligninolíticas producidas por hongos de la pudrición blanca, como una solución eficiente y
altamente versátil para la despolimerización y mineralización de las sustancias que
constituyen este material, siendo la lignina la de mayor interés para la industria y la
biología.
Los basidiomicetos comprenden más de 14.000 especies de setas comestibles, setas
venenosas, falos hediondos, pedos de lobo, políporos, hongos gelatinosos y nidos de
pájaros. En lenguaje coloquial se suelen llamar setas, hongos o incluso champiñones a
muchos de estos cuerpos fructíferos. Los hongos de la pudrición blanca u hongos
ligninolíticos pertenecen al grupo de basidiomicetos, estos hongos poseen un aparato
vegetativo formado por hifas tabicadas, y secretan varias enzimas extracelulares de esta
manera han conseguido desarrollar un sistema enzimático único y no especifico que
funciona en el ambiente extracelular (Jordaan et al., 2004). Los hongos de la pudrición
blanca han sido reconocidos y valorados por su capacidad de sintetizar un complejo
enzimático con actividad oxidativa contra una amplia variedad de sustancias orgánicas,
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entre estas sustancias se encuentran los componentes de la pared celular incluyendo la
lignina. Las enzimas oxidativas extracelulares producida por los hongos de pudrición
blanca más importantes son: manganeso peroxidasa (Mn-P), lignina peroxidasa (Li-P) y
lacasa.
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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Las actividades agropecuarias y agroindustriales son cruciales para el desarrollo
económico de países con gran disponibilidad de recursos naturales. Sin embargo estas
actividades son una de las principales responsables de la contaminación ambiental que
hoy en día aqueja al mundo. En general, la contaminación generada por el sector
agropecuario es causada por la producción de grandes volúmenes de residuos sólidos, el
uso de grandes cantidades de compuestos químicos de alta peligrosidad como pesticidas y
la contaminación y explotación de recursos y efluentes hídricos (Dávila y Vázquez, 2006).
La acumulación de residuos sólidos agrícolas y agroindustriales es un reto que deben
enfrentar tanto los gobiernos, como el sector productivo. Desafortunadamente son varios
los inconvenientes que no permiten aplicar tecnologías eficientes para la disposición final
de estos residuos sólidos lignocelulósicos, entre los que se destaca la falta de
conocimiento con respecto a la caracterización química y física de los mismos, un número
reducido de tecnologías disponibles para la reutilización de los desechos sólidos
lignocelulósicos, las pocas metodologías eficientes de reciclaje existentes, y la ausencia
de personal capacitado.
De otro lado, las industrias más contaminantes en todo el mundo son la química, la
textil, la curtición de pieles, el blanqueamiento de papel, la petroquímica y la metalúrgica
(Gil et al., 2012). En particular, en la industria textil las descargas residuales procedentes
de procesos de tintura y acabados representan el 80% del total de las aguas residuales, el
12% corresponde a las aguas usadas para el procesamiento de fibras y el 8% restante a
otros procesos (Salazar et al., 2009). Entre los contaminantes de estas aguas se encuentran
colorantes azoicos, compuestos organoestánnicos, perfluorados, clorobencenos,
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disolventes clorados, clorofenoles, y alquilfenoles, lo que hace a estos efluentes
resistentes a la biodegradación en el ambiente, siendo tóxicos y altamente contaminantes
(Gil et al., 2012). Por otra parte el proceso de blanqueo durante la fabricación de papel y
pasta genera efluentes líquidos que contienen una cantidad significativa de sustancias
orgánicas (principalmente lignina) y compuestos organoclorados. Por ello, una de las
mayores preocupaciones por parte de la opinión pública son las consecuencias
ecotoxicológicas y los impactos negativos en la salud humana a causa de los altos
contenidos de sustancias fenólicas, con anillos bencénicos y materiales organoclorados en
las aguas residuales emitidas por este tipos de industrias.
Como respuesta a la problemática generada por los grandes volúmenes de producción y
acumulación de residuos contaminantes, las universidades y los centros de investigación
han orientado sus esfuerzos investigativos hacia el desarrollo de sistemas de
descontaminación que utilicen la actividad biológica de organismos como bacterias,
hongos, y algas, a fin de degradar y remover potencialmente compuestos contaminantes
de alta peligrosidad para la salud humana y el ambiente (biorremediación). Dentro de
estos organismos se encuentra los hongos de pudrición blanca reconocidos por su
capacidad de humificación de la lignina durante la degradación de los compuestos
lignocelulósicos. Específicamente las ligninasas producidas por estos hongos, en conjunto
con otras óxido-reductasas que actúan sinérgicamente con ellas, se han investigado en los
últimos años por su capacidad para deslignificar y mineralizar parcialmente la lignina, así
como muy diversos compuestos fenólicos y aromáticos. Las enzimas ligninolíticas han
sido empleadas en la biorremediación de aguas y suelos contaminados, puesto que han
demostrado ser competentes en la degradación de compuestos orgánicos persistentes,
tóxicos y degenerativos para el medio ambiente.
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Los procesos de obtención de ligninasas a gran escala se ven obstaculizados por la
ausencia de información sistemática y suficiente sobre el cultivo de los hongos que las
producen. Los sistemas de fermentación que se han diseñado para tal fin presentan
restricciones en cuanto al control de parámetros críticos como la composición del medio
de cultivo, el tamaño del inóculo, la velocidad de consumo de glucosa y otros
componentes del medio, el suministro de oxígeno, y la determinación de los rangos
óptimos de pH, temperatura y agitación, entre otros aspectos (Soon-Seop y Katsuya,
2002; Baborová et al., 2006). Adicionalmente, se evidencian limitaciones en
infraestructura tecnológica, metodologías y diseños para definir los esquemas de
separación y purificación de las enzimas ligninolíticas. Los avances biotecnológicos en la
producción comercial de enzimas han logrado la obtención de concentrados enzimáticos
de alta pureza, en particular en la obtención de hidrolasas; sin embargo no es éste el caso
de óxido-reductasas como las ligninasas.
Pese a que existen investigaciones a nivel mundial centradas en la producción de
ligninasas de hongos de pudrición blanca, falta dar respuestas a muchos interrogantes
sobre su obtención. En particular se necesita estudiar otras especies de hongos potenciales
en la síntesis y producción de ligninasas, ya que la mayoría de las investigaciones han
empleado el hongo Phanerochaete chrysosporium; de hecho, es limitada la búsqueda de
otros posibles hongos que sean eficientes en la producción de enzimas ligninolíticas como
lo son diferentes especies de macromicetos.
Una de las especies propuestas y más promisorias para la obtención de ligninasas por
macromicetos es el hongo Trametes versicolor. Esta especie tiene la ventaja de sintetizar
las tres ligninasas más utilizadas en procesos de biorremediación (manganeso peroxidasa,
lignina peroxidasa y lacasa). Sin embargo es necesario profundizar en el estudio de este
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hongo como productor de tales ligninasas, así como en la evaluación de las actividades
enzimáticas correspondientes. De otro lado, se encuentra poca información sobre los
parámetros de cultivo de la fermentación en estado sólido a partir de residuos
agroindustriales utilizando este hongo (Montoya et al., 2013). También se requiere
elucidar y definir las metodologías, parámetros de diseño y condiciones de operación para
la separación, concentración y purificación de enzimas ligninolíticas sintetizadas por T.
versicolor mediante fermentación en estado sólido. Al día de hoy se reporta muy poca
información sobre las operaciones unitarias para llevar a cabo procesos de recuperación
eficiente de ligninasas con reducidos impactos ambientales; no se han analizado con
mayor detalle los sistemas de recuperación más utilizados como la extracción líquido-
líquido, lixiviación, y concentración por evaporación. Los pocos estudios disponibles para
obtener ligninasas purificadas involucran la tecnología de membranas, intercambio iónico
y cromatografía (Nishizawa et al., 1995; Baborová et al., 2006; Mishra et al., 2011).
Adicionalmente se debe considerar que la gran mayoría de trabajos sobre esta temática se
han realizado a nivel de laboratorio (Quintero et al., 2006; Forootanfar et al., 2011;
Gassara-Chatti et al., 2013), no encontrándose reportes en la literatura disponible que
traten la separación y purificación de enzimas ligninolíticas a nivel piloto.
La fermentación en estado sólido (FES) es un proceso que ha brindado importantes
progresos en el desarrollo de bioprocesos y en la producción de metabolitos secundarios a
partir de microorganismos de interés industrial. Este tipo de fermentación se caracteriza
por utilizar como soporte materiales sólidos húmedos. En los últimos años se ha
presentado un creciente interés por la FES utilizando residuos agroindustriales debido a
sus ventajas en comparación con la fermentación sumergida; entre estas ventajas se
destaca la pureza de los productos, mayor porcentajes de extracción, versatilidad de
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sustratos, baja actividad de agua, obtención de primordios y cuerpos fructíferos (Robinson
et al., 2001). Sin embargo el éxito de los procesos llevados a cabo por fermentación en
estado sólido está en función del control de parámetros de cultivo necesarios para
asegurar el cultivo aséptico del organismo. Al respecto la aireación y la transferencia de
calor son las variables de más difícil manejo dentro del sistema, lo cual tiene como
consecuencia problemas en la colonización del sustrato por los hongos. Por otra parte
existe un número reducido de diseños de biorreactores para fermentación en estado sólido
de hongos macromicetos. Entre ellos, la Universidad de Caldas patentó un biorreactor de
lecho fijo con convección natural y tiro forzado para la obtención de sustancias bioactivas
por fermentación en estado sólido empleando hongos macromicetos (Montoya et al.,
2012). Específicamente el uso de este biorreactor para el cultivo de Trametes versicolor
aumentó en un 72% su velocidad de crecimiento utilizando residuos agroindustriales
como sustrato alcanzando velocidades de colonización de hasta 2,0 kg de sustrato
colonizado/día en comparación con el cultivo de este mismo hongo en bolsas de plástico
de tres kilogramos de capacidad. Sin embargo, los estudios que se desarrollaron en este
biorreactor fueron preliminares y en el caso de la obtención de ligninasas, se requiere
definir las condiciones de cultivo más adecuadas para obtener títulos enzimáticos a nivel
piloto competitivos para una escala industrial.
Considerando la información publicada sobre la obtención de ligninasas a partir de
hongos macromicetos de pudrición blanca, la presente tesis doctoral pretende dar
respuesta a los siguientes interrogantes:
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1. ¿Cuál es el nivel de aireación adecuado para la producción de ligninasas por
fermentación en estado sólido a nivel piloto en un biorreactor de lecho fijo y tiro
forzado empleando Trametes versicolor y residuos agroindustriales?
2. ¿Cuál es la relación de solvente-sólido y la concentración de cosolvente adecuadas para
llevar a cabo el proceso de lixiviación del sólido colonizado obtenido por fermentación
en estado sólido utilizando T. versicolor a partir de residuos agroindustriales a fin de
obtener un concentrado ligninolítico?
3. ¿Cuál es la temperatura adecuada para concentrar un preparado enzimático de
ligninasas por medio de una evaporación por lotes?
Por lo tanto las hipótesis formuladas para la presente tesis doctoral son las siguientes:
El proceso de obtención de enzimas ligninolíticas empleando Trametes versicolor en un
biorreactor piloto de lecho fijo con convección natural y tiro forzado aumenta la
actividad específica de estas enzimas y reduce el tiempo de colonización de un sustrato
sólido basado en residuos agroindustriales.
Es posible obtener mayor actividad enzimática específica ligninolítica en el concentrado
líquido que se obtiene del proceso de lixiviación del sustrato fermentado y de la
evaporación del lixiviado resultante en comparación con la actividad obtenida en el
sustrato fermentado.
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La formulación de la presente propuesta de tesis doctoral se apoya en la revisión
bibliográfica la cual se adjunta en el documento Anexo I.
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2. JUSTIFICACIÓN
La actividad oxidativa de las ligninasas ha permitido su uso en el tratamiento de aguas
residuales provenientes de la industria textil y papelera, los cuales tienen altas
concentraciones de sustancias fenólicas y compuestos organoclorados de naturaleza
recalcitrante y altamente contaminantes. De igual manera, estas enzimas poseen la
capacidad de metabolizar materiales xenobióticos de las aguas residuales agroindustriales
como pesticidas (Moreno et al., 2004; Quintero, 2011). Además de estas funciones
descontaminantes, las ligninasas presentan otros usos industriales estudiados y probados
eficientemente. Uno de ellos es la remoción de la lignina de los materiales
lignocelulósicos para la producción de biocombustibles a partir del incremento del área
superficial y la disminución de la cristalinidad de la celulosa (Cuervo et al., 2009). De
otro lado en los últimos años se han venido desarrollando nuevas técnicas para el
tratamiento de ensilaje por medio de la adición de aditivos para mejorar su calidad. Se ha
propuesto emplear las ligninasas como aditivos suministrados al ensilaje. La función
específica de las ligninasas en el ensilaje para alimentación de rumiantes es la
degradación de la lignina contenida en los materiales lignocelulósicos y residuos
agroindustriales, mejorando la digestibilidad de los residuos con alto contenido en lignina
y aumentando el contenido proteico y energético del alimento (Albarracín et al., 2011).
Considerando la problemática ambiental que encara el mundo, se requiere la búsqueda
de soluciones alternativas que brinden resultados eficientes y de bajo costo en términos de
biorremediación y tratamiento de aguas residuales. La presente propuesta de tesis doctoral
está orientada a definir las condiciones más adecuadas para la obtención de enzimas
ligninolíticas empleando el hongo Trametes versicolor por fermentación en estado sólido
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a partir de residuos agroindustriales. Adicionalmente se propone el diseño de una
metodología de separación y purificación de ligninasas para la obtención de un
concentrado rico en estas enzimas de manera tal que se facilite su comercialización en los
diferentes campos de aplicación.
El desarrollo de esta propuesta de tesis contribuirá a obtener conocimiento aplicado
sobre los hongos de pudrición blanca y sus efectos en la disminución del deterioro
ambiental, la valorización de la biomasa lignocelulósica, la trasformación del concepto de
residuos problema en materia prima con valor agregado, y la disminución de agentes
contaminantes en los diferentes ecosistemas. De este modo se puede aportar a la
estructuración de paquetes tecnológicos que permitan el desarrollo del sector
agroindustrial y la explotación adecuada y responsable de los recursos hídricos, entre
otros aspectos. Los resultados obtenidos de este trabajo de investigación por un lado
permitirán ampliar el conocimiento de las aplicaciones biotecnológicas de las ligninasas, y
por otro comprobar las ventajas del sistema de fermentación patentado por el grupo de
investigación en Alimentos y Agroindustrias de la Universidad de Caldas. Una de las
ventajas más significativas de este sistema consiste en la aceleración de la velocidad de
colonización del sustrato por parte de T. versicolor.
A través de la ejecución de este proyecto académico se formará un investigador a
nivel de doctorado, lo cual aportará al fortalecimiento y consolidación científica del grupo
de investigación en Alimentos y Agroindustrias de la Universidad de Caldas, y por ende
de la comunidad científica colombiana. Adicionalmente se generará conocimiento
aplicado para el desarrollo de paquetes tecnológicos y para la divulgación científica
mediante publicaciones y participación en eventos especializados. De otro lado el avance
investigativo en técnicas de separación y purificación de ligninasas permitirá impulsar una
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nueva línea investigativa sobre el desarrollo de operaciones unitarias de recuperación de
bioproductos en la Planta de Bioprocesos y Agroindustria de la Universidad de Caldas.
Finalmente, la ejecución de esta propuesta de tesis permitirá establecer y afianzar
relaciones interinstitucionales para realizar actividades de investigación conjuntas con
otras universidades del país como la Universidad de Antioquia, y del exterior como la
Universidad de Buenos Aires.
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3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Obtener un preparado enzimático de ligninasas por fermentación en estado sólido
empleando Trametes versicolor y residuos agroindustriales.
3.2 Objetivos específicos
Definir las condiciones de operación de un proceso de fermentación en estado sólido
empleando Trametes versicolor para obtener un preparado enzimático de ligninasas en
un biorreactor piloto de lecho fijo con convección natural y tiro forzado.
Establecer las condiciones de operación de las etapas de lixiviación y concentración a
nivel piloto para la obtención de un preparado enzimático de ligninasas producidas por
fermentación en estado sólido empleando T. versicolor y residuos agroindustriales.
Definir el esquema de separación y concentración de un preparado rico en ligninasas
obtenido a partir de T. versicolor y residuos agroindustriales.
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4. MATERIALES Y MÉTODOS
La presente investigación se desarrollará en dos etapas: la primera etapa estará
centrada en el cultivo del hongo Trametes versicolor por fermentación en estado sólido en
un biorreactor de lecho fijo con convección natural y tiro forzado para la obtención de
enzimas ligninolíticas utilizando residuos agroindustriales. La segunda etapa estará
orientada a la obtención de una solución concentrada de ligninasas a nivel piloto. Para
este proyecto, la experimentación de la tesis doctoral propuesta se llevará a cabo en la
Planta de Bioprocesos y Agroindustria de la Universidad de Caldas ubicada en el parque
industrial Juanchito en Manizales, kilómetro 11 vía al Magdalena, a una altura de 2280
msnm, con una precipitación media anual de 1800 mm, humedad relativa del 78% y una
temperatura promedio de 17,5ºC.
4.1 Fermentación en estado sólido a nivel piloto para la obtención de ligninasas
La ejecución del primer objetivo permitirá evaluar la producción de enzimas
ligninolíticas además de otras enzimas y sustancias sintetizadas por el hongo T. versicolor
mediante fermentación en estado sólido, específicamente en un biorreactor de lecho fijo
con convención natural y tiro forzado. La aplicación de este sistema de fermentación
permitirá evaluar el comportamiento de la velocidad de colonización del sustrato por el
hongo y analizar la influencia de las condiciones de operación sobre el comportamiento
de la variable actividad enzimática ligninolítica.
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4.1.1 Preparación del inóculo y del medio de cultivo
Previamente a la realización de los ensayos en el biorreactor de lecho fijo y tiro
forzado se requiere la preparación de la semilla del hongo y la selección del medio de
cultivo sólido. Se realizarán pruebas bioquímicas a las cepas del hongo Trametes
versicolor PSUWC861 y PSUWC430 suministradas por la Pennsylvania State University
(EUA) las cuales serán mantenidas en agar papa dextrosa (PDA) a 4°C. Los resultados de
las pruebas bioquímicas permitirán seleccionar la cepa del hongo Trametes versicolor que
exhibe mayor actividad enzimática. La preparación de la cepa madre del hongo T.
versicolor se llevará a cabo sobre un grano de cereal el cual deberá ser hidratado,
autoclavado e inoculado; posteriormente se llevará a incubación hasta colonización
completa. La preparación de la semilla del hongo T. versicolor se realizará nuevamente
sobre granos de cereal hidratados, autoclavados e inoculados al 4-5% con la cepa madre
obtenida, llevando a incubación a 25°C hasta colonización completa. La formulación del
medio de cultivo propuesto para la fermentación en estado sólido en el biorreactor piloto
consiste de aserrín de roble 52%, cascarilla de café 24%, salvado de maíz 20% , carbonato
de calcio (CaCO3) 2%, azúcar 2%; todos los porcentajes se especifican en base seca.
4.1.2 Influencia de condiciones de cultivo sobre producción de ligninasas en un
biorreactor piloto
El cultivo del macromiceto T. versicolor se llevará a cabo en un biorreactor piloto de
lecho fijo con convección natural y tiro forzado con una capacidad de 30 kg. Se
alimentará el biorreactor con un medio de cultivo formulado conforme se describió en la
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subsección anterior 4.1.1. El sustrato será esterilizado a 121°C utilizando el método de
tindalización; asimismo se esterilizarán las piezas móviles del biorreactor como bandejas,
mezcladores, tapas y rejillas, entre otras. El sustrato será inoculado a una tasa de 4-5% de
semilla en base húmeda del sustrato. La temperatura ideal de crecimiento del hongo T.
versicolor oscila entre 25-30°C, por lo que se espera mantener esta temperatura en el
lecho de cultivo empleando el sistema de refrigeración del biorreactor, para lo que se
requiere su adaptación y puesta en marcha. Para el control de la temperatura se dispone de
una termocupla y de un sistema de enfriamiento por medio de serpentines que tienen
contacto con las bandejas de incubación. Durante la FES en el biorreactor de lecho fijo se
modificarán los niveles de aireación (por convención natural o tiro forzado).
Se propone realizar un diseño experimental aleatorizado de un factor a tres niveles
para evaluar el efecto de las condiciones de aireación en el biorreactor piloto sobre la
producción de ligninasas por T. versicolor. El factor a evaluar es la aireación con tres
niveles (aireación natural, flujo de aire bajo y flujo de aire alto). Cada una de los
tratamientos del diseño experimental se realizará por triplicado. Las variables de respuesta
serán las actividades enzimáticas de manganeso peroxidasa, glioxal oxidasa, peroxidasa
versátil y lacasa. Adicionalmente, durante el proceso de fermentación en cada
experimento (observación) del diseño se tomarán muestras diarias de los lechos para
determinar: producción de biomasa como NAGA, azúcares reductores, contenidos de
fibra, actividad celulolítica total (FPU) y actividades enzimáticas de manganeso
peroxidasa, lacasa, glucosa oxidasa, xilanasa y β-glucosidasa. Los métodos para la
determinación de las actividades enzimáticas, la producción de biomasa estimada a partir
de la concentración de NAGA, la cuantificación de componentes de la fibra, la
cuantificación de actividad celulolítica total (FPU) y la determinación de azúcares
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reductores se relacionan en la Tabla 1. A los resultados obtenidos del diseño experimental
se les aplicará un análisis de varianza (ANOVA) para determinar si existe diferencia
estadísticamente significativa entre los tratamientos. Se utilizará el software Statgraphics
(Statpoint Technologies, Inc., EUA) para el análisis de los datos. Con la determinación de
las anteriores variables se realizará el estudio de las cinéticas de fermentación en estado
sólido en el biorreactor piloto a fin de obtener los perfiles en el tiempo de las actividades
enzimáticas. De los perfiles en el tiempo de cada una de las variables del diseño
experimental para cada corrida de fermentación, se llevará a cabo el modelamiento
matemático del proceso con base en modelos desarrollados previamente para
fermentación en estado sólido del hongo T. versicolor (Montoya, 2012). Se determinarán
los parámetros del modelo por regresión no lineal, se resolverá el modelo y se validará
estadísticamente a fin de evaluar si las expresiones matemáticas describen adecuadamente
el comportamiento de la fermentación.
Tabla 1. Métodos para la determinación de actividades enzimáticas y otras variables.
Variable Longitud de Onda
(nm) Referencia
β-glucosidasa 430 Nidetzky et al. (1994)
Endo-β-D-1,4-xilanasa 540 Miller (1958)
Manganeso peroxidasa
Peroxidasa versátil
Glioxal oxidasa
610
598
610
Paszczynski et al. (1988)
Heinfling et al. (1998)
Heinfling et al. (1998)
Lacasa 420 Paszczynski y Crawford (1991)
Azúcares reductores 540 Miller (1958)
Biomasa (NAGA) 530 Plassard et al. (1982)
Celulasas totales (FPU) 540 Ghose (1987)
Componentes de las fibras - Leterme y Estrada (2010)
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4.2 Obtención de un preparado enzimático de ligninasas
Para el desarrollo de este objetivo se ha planteado un esquema de separación y
concentración de una solución con actividad ligninolítica obtenida del sustrato fermentado
del cultivo en estado sólido empleando residuos agroindustriales y T. versicolor. Este
esquema involucra un conjunto consecutivo de operaciones unitarias. El proceso de
separación inicia con el tratamiento mecánico de la materia prima, teniendo en cuenta que
durante los procesos de fermentación se obtiene posteriormente dos materiales ricos en
ligninasas. Por un lado, el sustrato sólido fermentado contiene una cantidad concentrada
de enzimas ligninolíticas excretadas por el hongo. Por otro lado, como resultado de la
degradación del sustrato por parte del micelio del hongo, se obtiene un exudado líquido
ver figura 1.
Figura 1. Diagrama de flujo del proceso de extracción centrifugación y concentración de
un preparado enzimático de ligninasas a partir de FES.
Sustrato
colonizado Molienda
Sustrato molido Lixiviación
Sólido agotado
Lixiviado
Centrifugación Exudados
Evaporación
Concentrado enzimático
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Se considera que tanto el sustrato colonizado como el exudado tienen
concentraciones importantes de enzimas ligninolíticas y biosustancias como polisacáridos.
El tratamiento mecánico se realizará con el fin de disminuir el tamaño de partícula y solo
se someterá a dicho fraccionamiento el material sólido (sustrato colonizado).
El material sólido fraccionado se llevará a un proceso de lixiviación donde se
evaluarán procesos de extracción utilizando como solvente agua con ayuda de un co-
solvente. Para el proceso de lixiviación se propone plantear un diseño experimental
bifactorial completamente aleatorizado. El primer factor es la relación de sólido-solvente
(sustrato colonizado-solvente) con tres niveles. El segundo factor es la relación solvente-
cosolvente a tres niveles (sin cosolvente, concentración baja de cosolvente, concentración
alta de cosolvente). Las variables de respuesta para este diseño serán las actividades
enzimáticas lacasa, glioxal oxidasa, manganeso peroxidasa y peroxidasa versátil; las
variables de respuesta serán medidas tanto en la torta (sólido agotado) como en los
lixiviados obtenidos con el fin de estimar el rendimiento de la operación. Los resultados
experimentales del proceso de lixiviación se analizarán por medio de un análisis de
varianza ANOVA con el fin de determinar el grado de significancia de cada uno de los
tratamientos y de las combinaciones entre los factores. De otro lado, el arreglo estadístico
será evaluado con la prueba Tukey para someter a rechazo o aprobación la hipótesis nula
e inferir la significancia global del mejor tratamiento estadístico. Se utilizará el software
Statgraphics (Statpoint Technologies, Inc., EUA) para realizar el análisis de los datos así
como para determinar la dependencia de las variables y su normalidad.
Los resultados de las variables de respuesta y de los tratamientos serán analizados
utilizando la metodología de superficies de respuesta. De esta manera se podrán definir las
mejores condiciones de extracción para las concentraciones de solvente-cosolvente y la
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relación sólido-solvente. Al finalizar cada tratamiento experimental los resultados
obtenidos de la actividad enzimática del extracto y de la torta (sólido agotado) serán
comparados con la actividad enzimática inicial del sustrato para verificar la presencia de
las enzimas y el aumento en sus actividades específicas. Asimismo, durante el desarrollo
experimental de la lixiviación se fijará la temperatura de operación considerando que las
enzimas de interés a extraer son proteínas termolábiles. Se propone establecer un rango de
temperatura inferior en 5°C a la temperatura de desnaturalización de las ligninasas.
La corriente de lixiviado obtenida de la etapa de extracción sólido-líquido será
sometida a centrifugación para retirar material sólido y los sólidos suspendidos.
Asimismo, se realizarán centrifugaciones a fin de separar las fracciones de proteínas de
otras fracciones de compuestos disueltos en el lixiviado. Para ello se calcularán el tiempo
de centrifugación y la velocidad del rotor de la centrífuga (en revoluciones por minuto,
rpm) en los cuales se obtiene una mejor separación de la fracción proteica. Este mismo
procedimiento será aplicado a los exudados obtenidos durante la FES en el biorreactor
piloto.
Con el objetivo de retirar agua y concentrar el extracto enzimático, los lixiviados y
los exudados centrifugados se someterán a evaporación por lotes. Se evaluarán tres
temperaturas de evaporación (30, 35 y 40°C) seleccionadas con base en la temperatura de
máxima actividad enzimática de las enzimas contenidas en los lixiviados; para las
ligninasas la temperatura máxima de actividad enzimática es 30°C y para las celulasas y
hemicelulasas la temperatura máxima de actividad enzimática es de 45°C (Ordaz, 2008).
Se recolectarán los productos concentrados en cada proceso de evaporación y se medirá la
actividad enzimática lacasa, manganeso peroxidasa, glioxal oxidasa y peroxidasa versátil;
asimismo se recolectarán los condensados (vapor de agua) para realizar los balances de
24
materia y energía del proceso y determinar las condiciones de temperatura en donde
mayor remoción de agua se alcanzó. El proceso de evaporación terminará cuando no se
obtengan más condensados.
Finalmente se evaluará la capacidad de degradación y adsorción del preparado
enzimático de ligninasas empleando los colorantes xilidina, índigo carmín y verde de
malaquita a una concentración de 50 µM. Se prepararán soluciones de colorante-agua a
una relación de 1:3 durante 2 horas; se tomarán muestras de las soluciones cada 30
minutos se centrifugarán y se medirá la absorbancia para cada una de las soluciones
coloreadas. La absorbancia de las soluciones se medirá a una longitud de onda de: 505 nm
para la xilidina, 609 nm para el índigo carmín, y 615 nm para verde de malaquita.
4.3 Diseño del esquema de separación y purificación para la producción de un
concentrado ligninolítico
Para el desarrollo de este objetivo se utilizarán herramientas de modelamiento y
simulación con el fin de evaluar y definir la mejor configuración del diagrama de proceso
para la obtención de un preparado enzimático de ligninasas en sus etapas de separación y
purificación. La selección de una configuración eficiente requiere la generación y
evaluación de varios esquemas tecnológicos o diagramas de proceso. Para ello se requiere
definir las entradas del sistema tales como la composición de materias primas, tipo de
proceso y flujos de materias primas, así como las salidas del sistema (especificaciones del
producto y corrientes de efluentes). Posteriormente se construirán a nivel de diseño
conceptual diferentes configuraciones de la etapa de separación y purificación y se
25
evalúan con el fin de seleccionar la de mejor desempeño. Los criterios de evaluación que
se tendrán en cuenta para la elección del mejor esquema tecnológico serán tecno-
económicos (valor presente neto) y ambientales (impacto ambiental potencial).
La construcción de los diferentes diagramas de proceso propuesto cubrirá las
operaciones unitarias involucradas en la obtención y concentración del preparado
enzimático (caudal, presión, temperatura, y composición) y el tratamiento de efluentes
hídricos. Inicialmente, se definirá la secuencia de operaciones unitarias necesarias para
obtener un preparado enzimático de ligninasas a partir del sustrato colonizado y del
exudado obtenido durante la fermentación en estado sólido. Para la generación del
esquema tecnológico de separación y purificación de enzimas ligninolíticas (caso base)
así como de las configuraciones alternativas se seguirá la estrategia de síntesis de
procesos basada en conocimiento utilizando elementos del método heurístico de
descomposición jerárquica (Sánchez y Cardona, 2012). Para ello se partirá de la corriente
de sustrato fermentado y se irán proponiendo en cada alternativa diferentes tipos de
operaciones unitarias de separación y purificación evaluando en cada caso los criterios de
valor presento neto (NPV, por sus siglas en inglés) y el impacto ambiental potencial (PEI,
por sus siglas en inglés) conforme el esquema se desarrolla hasta obtener el producto final
(ver Figura 2).
Se emplearán como simuladores de procesos los paquetes comerciales Aspen Plus
(Aspen Technology, Inc., EUA) o SuperPro Designer (Intelligen, Inc., EUA) para el
cálculo de los balances de materia y energía de cada una de las operaciones unitarias de
los diagramas de proceso obtenidos. La información de las materias primas relacionadas
en los procesos así como sus propiedades físico-químicas se obtendrá de fuentes
bibliográficas como artículos, patentes, informes técnicos, y bases de datos;
26
alternativamente, estas propiedades se estimarán utilizando correlaciones adecuadas para
este tipo de compuestos. En el caso de las operaciones de molienda, extracción sólido-
líquido, centrifugación y evaporación se tendrán en cuenta, además los datos
experimentales obtenidos a nivel piloto (ver sección 4.2). De ser necesario se realizará el
modelamiento de las operaciones unitarias de separación que no se encuentren en los
módulos del simulador; para ello, se utilizará el software Matlab (The Math works Inc.,
EUA). Para el modelamiento de cada operación específica se tendrán en cuenta las
ecuaciones de diseño, las relaciones físico-químicas y las propiedades termodinámicas de
las sustancias involucradas en el desarrollo de las operaciones unitarias (ver Figura 2).
Figura 2. Proceso de definición del esquema tecnológico de separación y purificación.
SPD-SuperPro Designer, WAR-Algoritmo de Reducción de Residuos (por sus siglas en
inglés).
Recolección de información inicial
(Propiedades físico-químicas)
Generación de configuraciones
(Caso base y alternativas)
Balances de materia y energía
Evaluación de configuraciones
(Técnica, económica y ambiental)
Diseño final
Aspen Plus o SPD
Aspen Plus o SPD
Process Economic Evaluator o
SPD
WAR
27
Una vez se hayan simulado los diferentes diagramas tecnológicos, (caso base y
alternativas) se realizará su evaluación teniendo en cuenta criterios tecno-económicos y
ambientales. Para la evaluación tecno-económica se calculará el valor presente neto
(NPV) el cual exhibe la eficiencia técnica de los procesos calculando el costo de
producción en un intervalo de tiempo evaluando su factibilidad en términos de
rentabilidad. Para el análisis y la evaluación económica de los esquemas tecnológicos se
empleará el programa de Process Economic Evaluator (Aspen Technology, Inc., EUA), o
las funciones correspondientes del paquete Superpro Designer.
La evaluación ambiental de las diferentes alternativas estudiadas se llevará a cabo
empleando el concepto de Impacto Ambiental Potencial (PEI, por sus siglas en inglés). El
valor del PEI de una cantidad específica de materia o energía es considerado como el
efecto que esta materia o energía tendría en promedio sobre el ambiente si estas fueran
descargadas fuera del proceso por medio de sus efluentes (Sánchez et al., 2007). El valor
del PEI se calculará utilizando el algoritmo WAR que está incluido en el software WAR
GUI (Environmental Protection Agency, EPA, EUA). El esquema tecnológico
seleccionado finalmente será el que exhiba lo menores índices de PEI y de NPV lo cual
indica la eficiencia del proceso a nivel ambiental y tecno-económico. Se calculará un
indicador combinado de desempeño económico y ambiental (F) para obtener un criterio
de evaluación y posterior elección del mejor esquema tecnológico de acuerdo a la
estrategia basada en conocimiento. El indicador combinado se genera de la unión del
índice tecno-económico (NPV) y del desempeño ambiental (PEI), el cual utiliza
comparaciones entre criterios cuantitativos o cualitativos con el fin de evaluar la
importancia relativa de cada criterio. Los indicadores se normalizarán de tal manera que
28
se puedan comparar en la misma escala y no excedan un valor de normalización dado. El
criterio combinado de diseño (F) de proceso representa la suma de los productos del
puntaje promedio del proceso para un atributo por la ponderación de ese atributo:
𝐹 = 𝑃𝑒𝑐𝑛 ∗ 𝑤𝑒𝑐𝑛 + 𝑃𝑎𝑚𝑏 ∗ 𝑤𝑎𝑚𝑏 (4.1)
Donde Pecn es el puntaje económico normalizado calculado a partir del NPV del
proceso, Pamb es el puntaje ambiental normalizado calculado a partir del PEI del proceso y
Wecn y Wamb son los factores de ponderación para los indicadores económico y ambiental
respectivamente. Para la estrategia de síntesis de procesos basada en conocimiento se
tomaron los siguientes valores de los factores de ponderación: 0,82 para el puntaje
económico y 0,18 para el puntaje ambiental. Estos valores son sugeridos por (Chen et al.
(2002) quienes los aplicaron a varios procesos químicos basados en una encuesta sobre la
comparación de atributos económicos y ambientales para un proceso químico realizada a
docentes y estudiantes de postgrado de la Michigan Technological University empleando
el enfoque del proceso jerárquico analítico.
29
5. RESULTADOS ESPERADOS
Del desarrollo de la tesis doctoral “Obtención de un preparado enzimático de
ligninasas por fermentación en estado sólido empleando Trametes versicolor y residuos
agroindustriales” se obtendrán los siguientes resultados:
Publicación de dos artículos sobre la obtención, separación y concentración de
ligninasas por fermentación en estado sólido a partir del hongo Trametes versicolor y
residuos agroindustriales.
Un preparado enzimático de ligninasas.
Modelo matemático de la cinética de fermentación.
Los protocolos de los procesos de fermentación en estado sólido a nivel piloto
empleando Trametes versicolor y residuos agroindustriales y de las operaciones de
extracción sólido-líquido y de evaporación por medio de operaciones unitarias a nivel
piloto.
Metodologías y técnicas aplicadas para determinar las actividades enzimáticas
ligninolíticas.
Formación de una estudiante de doctorado.
Simulación de los procesos de separación y purificación de enzimas ligninolíticas.
30
6. IMPACTOS
Esta investigación permitirá formular alternativas para el aprovechamiento de residuos
agroindustriales, mediante tratamientos biológicos eficientes para la conversión de la
biomasa lignocelulósica. De igual manera se pretende contribuir a la mitigación de la
contaminación ambiental por causa de la mala disposición de residuos agroindustriales y
contaminación con sustancias recalcitrantes en los efluentes hídricos, mediante el diseño
conceptual de una alternativa tecnológica eficiente para la utilización de estos residuos
Este trabajo aportará al desarrollo de un futuro paquete tecnológico para el
aprovechamiento de ligninasas en el sector productivo específicamente en la industria
textil, papelera, farmacéutica, y alimentación bovina. Este futuro paquete tecnológico
brindará un método en dichos sectores en el tratamiento de sus efluentes hídricos con
innovación biotecnológica y desarrollo tecnológico.
Con la realización de la presente tesis doctoral se contribuirá a la consolidación de las
actividades investigativas de la Planta de Bioprocesos y Agroindustria de la Universidad
de Caldas, así como al fortalecimiento investigativo del Grupo de Investigación en
Alimentos y Agroindustria y del Instituto de Biotecnología Agropecuaria de la
Universidad de Caldas.
31
7. PRESUPUESTO
RUBROS
FUENTES
TOTAL UNIVERSIDAD FINANCIACIÓN EXTERNA
RECURRENTEi V.I.P. SITEMA GENERAL
REGALÍAS
RECURSOS
FRESCOS
1. SERVICIOS PERSONALES 87.072.000 149.100.000 236.172.000
1.1 Matrículas del Investigador 149.100.000 149.100.000
1.2 Director y co-directora 77.952.000 77.952.000
1.3 Auxiliares 9.120.000 9.120.000
2. Equipos Requeridos 39.400.000 31.300.000 70.700.000
2.1 Biorreactor FES 8.000.000 8.000.000
2.1.1 Extracción L-S 4.000.000 4.000.000
2.1.2 Evaporador de doble efecto 16.000.000 16.000.000
2.1.3 Molino 3.000.000 3.000.000
2.1.4 Centrifuga 1.500.000 1.500.000
2.1.5 pH-metro 400.000 400.000
2.1.6 Balanza analítica 500.000 500.000
2.1.7 Cabina de flujo laminar 1.000.000 1.000.000
2.1.8 Autoclave 1.000.000 1.000.000
2.1.9 Caldera 2.500.000 2.500.000
2.10 Nevera 500.000 500.000
2.11 Cuarto frio 1.000.000 1.000.000
2.2 Materiales e insumos 2.2.1 De campo 10.000.000 10.000.000
2.2.2 De oficina (papel, tinta, fotocopias) 300.000 300.000
2.2.3 De laboratorio 16.000.000 16.000.000
2.3 Apoyo económico para gastos de viaje
y transporte
2.3.1 Auxilio para viaje 5.000.000 5.000.000
3. INVERSIÓN 3.1 Equipo requerido 3.1.1 Para comprar
3.1.2 Propio 3.2 Planta física 3.2.1 Adecuación 3.2.2 Alquiler
3.4 Material bibliográfico 3.4.1 Para comprar
4. Total 126.472.000 180.400.000 306.872.000
4.1 Porcentaje de fuentes 41.21% 58.78% 100%
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8. CRONOGRAMA
ACTIVIDAD
SEMESTRE
1 2 3 4 5
Revisión bibliográfica xxxxxx xxxxxx xxxxxx xxxxxx xxxxxx
Estandarización pruebas de FES en el biorreactor piloto xxxx
Desarrollo de fermentación en estado sólido en el
biorreactor piloto
xx xxxxxx xxxxxx xxxxxx
Puesta a punto de técnicas de laboratorio (actividades
enzimáticas) xxxxxx xxxxxx xxxxxx
Estandarización de pruebas de separación y concentración
del preparado enzimático de ligninasas xxx xxxxxx
Separación y concentración del preparado enzimático de
ligninasas xxx xxxxxx
Desarrollo de la simulación y modelamiento del proceso
de separación y purificación de enzimas ligninolíticas xxx xxxxxx
Pasantía Internacional xxx
Elaboración informe final xxxxxx xxxxxx
Divulgación de resultados xx xxxxxx xxxxxx
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