Odgovori na pitanja

▪ 1. Koje su dvije osnovne razlike između „običnog“ PCR i Sangerovog

sekvenciranja?

▪ - jedna početnica i osim dNTP i ddNTP , kapilarna elektroforeza

▪ 2. Koje su sličnosti između „običnog“ PCR i Sangerovog

sekvenciranja?

▪ - dNTP, DNA polimeraza, početnice, denaturacija DNA

▪ 3. Ako je gen duži od 3000 pb je li ga moguće sekvencirati

Sangerovom metodom i kako?

▪ - da, korištenjem više početnica

▪ 4. Na kojem principu radi metoda nanopore?

▪ Najjdnostavnije objašnjenje je da duga jednolančana DNA prolazi

kroz proteinsku nanoporu i uzrokuje promjenu struje u uređaju. Ovu

promjenu struje uređaj bilježi te prikazuje kao slijed nukleotida.

▪ 5. Po čemu je mikročip drugačiji od metode Northern blot? Koje

novo pitanje sad možemo postaviti (i dobiti odgovor)?

▪ - Pomoću mikročipova možemo direktno usporediti ekspresiju više

gena odjednom u dva uzorka.

Biljke oplemenjene

genetičkim inženjerstvom

GMO

genetički modificirani organizmi

▪ organizmi čiji je genetički materijal

promijenjen ljudskom intervencijom

▪ organizmi promijenjeni genetičkim

inženjerstvom

1) Udomaćivanje – početak

genetičkih modifikacija

(prije oko 10 000 godina)

Spontane mutacije

Spontane mutacije

2) Odabir (selekcija) sjemenskog

materijala

teozinta

3) Kontrolirano križanje

4) Poticanje mutacija

5) Genetičko inženjerstvo

Genetička modifikacija biljaka

Klasičan uzgoj “Transgenetički” “Cisgenetički”

Trenutna

sorta

Divlji

srodnik

Nesrodan

organizam

Divlji

srodnik

Koristan genKoristan gen Koristan gen

Nepoželjni

geni

Nepoželjni

geni

Trenutna

sorta Trenutna

sorta

Nepoželjni

geni

Nova

sorta

Nova

sorta

Nova

sorta

F1

generacija

F2

generacija

puno

križanja s roditeljem

Prijenos u

plazmid pa u

Agrobacterium

Prijenos u

plazmid pa u

Agrobacterium

Geni potrebni

za prijenos

Geni potrebni

za prijenos

Najnoviji pristup: uređivanje genoma (engl. genome editing)

• Tehnike kojima se na točno određenom mjestu u genomu mogu napraviti željene promjene – zapravo se uvode mutacije

• Ideja je postojeće gene promijeniti u korisnije na primjerimaiz srodnih vrsta ili prirodnim populacijama

• Alati za ovu tehniku su:• Zink-finger nukleaze (nukleaze s cinkovim prstima)• TALEN (transcription activator like effector nuclease)• CRISPR-Cas9 – najveće mogućnosti!

Primjenom genetičkog inženjerstva postižu

se nove značajke organizama:

- ugradnjom novog gena u genom

- promjenom kodirajuće regije postojećeg gena

- pojačavanjem aktivnosti postojećeg gena

- smanjenjem aktivnosti postojećeg gena

- inaktivacijom/odstranjivanjem postojećeg gena

Biljke oplemenjene

genetičkim inženjerstvom

Stvaranje transgeničnih biljaka

općenito

▪ Stvaranje transgeničnih biljaka je jednostavnije nego

transgeničnih životinja jer su biljne stanice totipotentne – iz

jedne biljne stanice može se razviti cijeli biljni organizam

dodavanjem biljnih hormona

▪ Za unošenje strane DNA koristi se bakterija Agrobacterium

tumefaciens koja prirodno inficira biljne stanice i stvara

tansgenične biljke

▪ Ova bakterija sadrži plazmid Ti (tumor inducing plasmid) koji

uzrokuje nastanak tumora nakon infekcije biljke

Agrobacterium tumefaciens – prirodni

prenositelj gena u biljni genom

Dio plazmida Ti, T DNA, rekombinacijom se ugrađuje u kromosomsku

DNA biljne stanice i uzrokuje nekontroliran rast stanica - tumor

https://www.youtube.com/watch?v=hv6aPDtb7aY

https://www.youtube.com/watch?v=hv6aPDtb7aY

“Crown gall” – tumor vrata korijena(uzročnik bakterija A. tumefaciens)

T-DNA sadrži dvije skupine gena:

1) Geni za regulatore rastenja (biljni hormoni)

2) Geni za proizvodnju opina - tvari koje bakterije koriste kao

hranu

Upotreba plazmida Ti (vektor) u genetičkom inženjerstvu:

- izolirati plazmid Ti

- ukloniti T-DNA i ostaviti samo rubne sekvence T-DNA duge

oko 25 pb i to ubaciti u drugi plazmid

- umjesto T-DNA ubaciti željenu sekvencu DNA (gen)

- ligirati i transformirati A. tumefaciens

- uzgojiti transformirane bakterije i dodati biljne stanice

Primjena bakterije A. tumefaciens za unošenje

željenih gena u biljne stanice i regeneracija biljaka

Alternativno: uroniti cvjetne pupove u bakterijsku suspenziju - dobiti

genetički promijenjeno sjeme

selekcija

transformiranih stanica

+ biljni hormoni

“genegun”

Ne mogu se sve vrste biljaka transformirati s A. tumefaciens. Postoje

i drugi načini unosa DNA.

Poželjna svojstva u biljaka

▪ Biljke otporne na insekte

▪ Biljke otporne na bolesti (npr. viruse, bakterije i gljivice)

▪ Biljke otporne na herbicide (otpornost na glifosat)

▪ Poboljšana kvaliteta proizvoda

▪ Proizvodnja vakcina, antitijela i farmaceutskih proizvoda

▪ Mnoge transgenične biljke su dozvoljene za ljudsku

upotrebu

Prva komercijalizirana biljka (1995. god.)

Rajčica s utišanim genom za enzim

poligalakturonazu

Ovaj enzim

razgrađuje pektin

što čini rajčicu mekanom.

Međutim, nije postignut

komercijalni uspjeh.

Nove ideje s rajčicom

▪ „divlja” rajčica rasla je u uvjetima svjetla od 12 sati dnevno kroz cijelu godinu – što je u ekvatorijalnom dijelu

svijeta uobičajeno ali nije u ostalom

▪ Ako je više svjetla – rajčica se štiti proizvodnjom proteina

koji suprimira rast cvijeta – time se odgađa rast plodova

do kraja sezone. Udomaćene sorte rajčice proizvode

manje ovog proteina ljeti

▪ Pomoću tehnike CRISPR-Cas9 ovaj gen je posve

uklonjen i rajčice mogu cvjetati i dati plodove sa manje

svjetla – mogle bi se uzgajati i u sjevernijim krajevima!

▪ PROBLEM – kako klasificirati boljke dobivene tehnikom

CRISPR-Cas9 – je li to klasična GMO biljka?

Duhan – pojačana aktivnost gena

odgovornog za otpornost na jednu gljivicu

Krumpir otporan na krumpirovu zlaticu s

ugrađenim genom iz bakterijeBacillus thuringiensis (Bt toxin –insekticid)

Problem: selektivni pritisak za pojavu otpornih kukaca

Prijavljeni slučajevi otpornih kukaca na biotech pamuk u Indiji

Komercijalne biljke su još i Bt kukuruz i Bt pamuk – uspješne.

Inaktivirani geni za glavne

alergene u soji, riži i pšenici

Glavni proizvođač transgeničnih biljaka u svijetu je kompanija

Monsanto, SAD

Prvi patenti istječu 2014. godine

Kompanija Bayer kupila je Monsanto 2016. za 66 milijardi dolara!

Plava ruža – gen za plavi pigment delfinidin kloniran je iz maćuhica

Na sličan način napravljeni su i karanfili

Iz genetički modificirane mrkve Izraelska kompanija Protalix proizvela

je lijek zajedno s kompanijom Pfizer za Gaucherovu bolest

Biljke oplemenjene genetičkim inženjerstvom u

komercijalnoj uporabi (2003. god)

Kultura Svojstva Broj

sortiKukuruz otpornost na kukce, tolerantnost na herbicide, 18

Uljana repica tolerantnost na herbicide, sterilnost, sastav ulja 14

Pamuk otpornost na kukce, tolerantnost na herbicide 7

Soja otpornost na viruse, sastav ulja, tolerantnost na herbicide,

6

Rajčica usporeno mekšanje ili sazrijevanje, otpornost na kukce

6

Krumpir otpornost na krumpirovu zlaticu, otpornost na viruse 4

Karanfil produžen vijek trajanja, boja, tolerantnost na herbicide

3

Šećerna repa tolerantnost na herbicide 2

Bundeve otpornost na viruse 2

Duhan tolerantnost na herbicid, manje nikotina 2

Riža tolerantnost na herbicid 1

Cikorija tolerantnost na herbicid, sterilnost 1

Lan tolerantnost na herbicid 1

Dinja produženi vijek trajanja 1

Papaja otpornost na virus 1Ukupno 69

Udio transgenih kultura u ukupnoj proizvodnji

u SAD u 2010. godini

Smatra se da će do 2015. godine više od 40% novih GM biljaka

biti proizvedeno u Aziji

Uzgoj GMO biljaka u svijetu po površini

▪ SAD 73 x106 hektara

▪ Brazil 50 x106 hektara

▪ Argentina 24 x106 hektara

▪ Kanada 12 x106 hektara

▪ Indija 11 x106 hektara

▪ Španjolska 130000 hektara

▪ Portugal 7000 hektara

▪ Slovačka 140 hektara

▪ Češka 100 hektara

Procjena zdravstvene ispravnosti i ekološke prihvatljivosti

biljaka oplemenjenih genetičkim inženjerstvom

▪ stabilnost genetske preinake

▪ potencijalna toksičnost novog proteina/metabolita

▪ potencijalna alergenost novog proteina/metabolita

▪ temeljna nutricionistička analiza (npr. povećanje

▪ koncentracije postojećeg toksina ili alergena, promjena sastava)

▪ učinak na biogeokemijske procese

▪ promjena poljoprivredne prakse

▪ učinak na ciljane organizme (izravan i neizravan)

▪ učinak na druge organizme (izravan i neizravan)

▪ invazivnost u okolišu

▪ mogućnost i posljedice prijenosa genetske promjene u genom divljih

vrsta i drugih kultura

▪ i tako dalje ….

Učinak na okoliš (izvan agroekosustava)

1. Može li svaka pojedina sorta postati invazivna

i proširiti se izvan poljoprivrednog zemljišta?

2. Postoji li mogućnost križanja s divljim srodnicima

koji bi mogli postati invazivni u okolišu?

Procjena mora uzeti u obzir najgori mogući scenario!

Uzgoj GM kulture

Preživljavanje izvan oranice

Razmnožavanje izvan oranice

Stabilna populacija izvan oranice

Oprašivanje divljeg srodnika

Stvaranje križanca

Preživljavanje križanca

Razmnožavanje križanca

Genetička stabilnost

Širenje u okolišu

https://www.youtube.com/watch?v=OpYQf1Kas8U

https://www.youtube.com/watch?v=OpYQf1Kas8U

Životinje promijenjene

genetičkim inženjerstvom

▪ Uobičajeni način kloniranja gena je ugradnja kromosomskog gena u vektor koji se zatim ubacuje u žive mikroorganizme

▪ Klonirani geni se mogu ubaciti i u biljne i životinjske stanice, ali da bi se stabilno nasljeđivali iz generacije u generaciju, klonirani geni se moraju ugraditi (rekombinacijom) u jedan ili više kromosoma u jezgri

▪ Dodani gen može zamijeniti postojeći gen ili se klonirani gen može ugraditi nehomolognom rekombinacijom i tada se ugrađuje negdje drugdje (dodavanje gena)

Prijenos gena u biljke i životinje

Prijenos gena u životinje▪ Dodani gen može biti iz neke druge vrste – transgeni

genetički modificirani organizam

▪ Najpoznatiji primjer je riba zebrica (Danio rerio) u koju je dodan gen za crveni fluorescentni protein iz koralja vrste Discosoma sp = GloFish prvi komercijalni GMO kućni ljubimac 2003.

Postoje zelene i žute ribice a geni za fluorescentni protein su iz meduze

Zebrica Danio rerio(tropska akvarijska ribica, 6 cm)

gen za crveni fluorescentni

protein iz vrste Discosoma sp.

Prijenos gena u životinje

▪ Unos strane DNA u animalne stanice u kulturi:

▪ Direktno ubrizgavanje DNA u jezgru stanice

▪ Koprecipitacija strane DNA s kalcijevim fosfatom

▪ Ugradnja DNA u lipidne vezikule (liposomi)

▪ Izlaganje stanica kratkim električnim pulsevima (elektroporacija)

▪ Transfekcijom (virusima)

Efikasnost ubacivanja strane DNA

▪ Većina strane DNA se prepisuje kraće vrijeme –prolazna ekspresija

▪ Oko 1 % i manje se stabilno (nasumično) ugrađuje u genom

▪ Strana DNA se može ubaciti ili u pronukleus oplođene jajne stanice ili u embrionalne matične (EM) stanice

▪ EM stanice su kulture stanica izvedene iz ranih mišjih embrija (blastocista)

Retrovirusni vektori

Kloniranje se napravi u bakterijama

Unošenje DNA u životinjske stanice

Ubacivanje strane DNA u pronukleus – stvaranje transgeničnih miševa

Ubacivanje strane DNA u EMstanice u kulturi stvaranje kimernihmiševa – sadrže stanice od dva organizma

EM= embrionalne matične stanice

Dio tkiva je odstanica koje sudodane u blastocistu

Losos - ugrađen gen za hormon rastadruge vrste lososa

(zbog stalne proizvodnje

hormona rasta riba raste

tijekom cijele godine)

- još 14 vrsta riba

s istim svojstvom

Životinje dostignu tržišnu težinu

Za 18 mjeseci umjesto 3 godine

Transgeni losos

19. 11. 2015. prva GMO životinja koja je dobila dozvolu od

FDA (Food and drug administration) za ljudsku konzumaciju.

Prijava podnesena 1995.

«pharming»

korisni proteini u mlijeku domaćih životinja

Herman (1990) s ljudskim genom za laktoferin. Umirovljen

2002. godine (Naturalis museum, Leiden, Holland).

«pharming»

korisni proteini u mlijeku domaćih životinja

U mlijeku koze luči se antikoagulans koji se zatim ekstrahira

Lijek odobren od FDA, ATryn

ksenotransplantacija

nadomještanje ljudskih tkiva i organa životinjskima

Praščići s inaktiviranim genom za

α-1,3-galaktozil transferazu (homozigoti)

MALARIJA prijenosnik – Anopheles gambiae,

uzročnik - Plasmodium falciparum,

gen SM1 kodira peptid od 12 ak koji se veže za isti ligand na epitelnim

stanicama probavila kao i parazit prilikom izlaska iz probavnog sustava

komarca - pojačana aktivnost gena SM1 umanjuje učinkovitost izlaska

parazita iz probavila komarca za 80%

Napravljeni mužjaci komaraca koji sadrže letalni gen protiv širenja

Dengue groznice

Pitanja

▪ 1. Probajte odgovoriti po čemu se GMO biljke dobivene

tehnikom CRISPR-Cas9 razlikuju od „klasičnih” GMO

biljaka? Koja opcija bi bila bolja i zašto?

▪ 2. Pronađite nova rješenja/ideje koje se predlažu za

suzbijanje malarije korištenjem tehnike CRISPR-Cas9

▪ 3. Što je zlatna riža?

Seminari

▪ 1. Helena Turk - rak – što je karcinom, kakve su to tumorske

stanice, kako se rak otkriva, metode liječenja i slično ) za 06. 05.

▪ 2. ateo Smetko, Cre-Lox rekombinacija 06.05.

▪ 3. Ana Grizelj – antibiotici - povijest, podjela, način djelovanja,

rezistenciji bakterija na antibiotike, alternativni pristupi u liječenju

bakterijskih infekcija 13.05.

▪ 4. Klara Herceg, western blot 13.5.2020

▪ 5. Patricija Knechtl - usporedba španjolske gripe i covid-19 za

20.05.

▪ 6. Leonarda Lazarin, teorije zavjere 20.05

▪ 7. Viktoria Mia Jepure, 27.05. razvoj cjepiva protiv covid-19

▪ 8. Sandra Strelec, GMO kućni ljubimci, 27.05.

▪ 9. Tin Kabalin?

https://meet.jit.si/

https://meet.jit.si/