발간등록번호 NIER-SP2014-31511-1480523-002206-01

신속한 노로바이러스 진단을 위한 검사방법 연구

Study for Rapid Diagnostics Methods of Norovirus

대구가톨릭대학교 산학협력단

국립환경과학원

제 출 문

국립환경과학원장 귀하

본 보고서를 “신속한 노로바이러스 진단을 위한 검사방법 연구” 용역 사

업의 결과보고서로 제출합니다.

2014. 12.

연구기관명 대구가톨릭대학교 산학협력단

연구책임자 대구가톨릭대학교 박 승 원

연 구 원 가톨릭대학교 백 순 영

연구보조원 대구가톨릭대학교 강 래 형

대구가톨릭대학교 김 주 은

가톨릭대학교 이 재 웅

가톨릭대학교 공 병 화

가톨릭대학교 양 수 정

가톨릭대학교 최 혜 림

가톨릭대학교 박 지 선

가톨릭대학교 하 현 주

요 약 문

Ⅰ. 연구개요

연구과제명국문 신속한 노로바이러스 진단을 위한 검사방법 연구

영문 Study for Rapid Diagnostics Methods of Norovirus

연구기관대구가톨릭대학교

산학협력단연구책임자

소속 대구가톨릭대학교

성명 박승원

연구기간 2014. 5. 30 ～ 2014. 12. 15 (6.5 개월)

연구개발비 99,000천원

참여연구원수 총 10명 내부 : 3명, 외부 : 7명

Ⅱ. 연구목적 및 필요성

전 세계적으로 식중독 및 장염을 일으키는 노로바이러스는 그 위험성이 이미 알려져 있으며 그중

노로바이러스 GⅡ.4 type이 가장 많이 검출되고 최근에는 그 변종이 나타나고 있다. 그럼에도 불구하고

보건 환경에 중요한 영향을 미치는 노로바이러스는 아직 효과적으로 배양이 되지 않고 배양할 수

있는 동물모델 또한 아직 없는 실정이며 항체가 인지할 수 있는 항원부위의 변이가 빨라 다른 감염성

바이러스에 비하여 연구가 부족한 실정이다.

따라서, 본 연구에서는 국내에서 주로 발견되어 분리된 노로바이러스를 이용하여 rVLP

(Recombination Virus-Like Particle)를 제작하여 항체를 생산함으로써 노로바이러스를 보다 정확하고

신속하게 진단할 수 있는 검사방법을 개발하고자 한다.

Ⅲ. 연구내용 및 방법

노로바이러스를 면역학적 방법을 이용하여 신속하게 진단하기 위한 rVLP 제작과 항원의 특이성

연구 및 분자생물학적방법 (hybridization)을 이용한 노로바이러스의 특이적 유전자 probe를 제작하고,

위의 결과를 바탕으로 면역학적 방법과 분자생물학적 방법의 이용가능성 및 신속진단 키트의 적용가능

성을 평가한다.

Ⅳ. 연구결과

임상 시료를 통하여 확보한 국내 환자에서 분리된 노로바이러스 VP1 region의 rVLP를 제작하여

순수 분리하고 size chromatography 방법을 이용하여 고역가의 항원을 얻었다. rVLP를 항원으로 동물모델

을 통해 항체를 생산하였으며, 생산된 항체는 (1) ELISA test를 통해 항원에 대한 민감성 test를 실시한

후, (2) RT-PCR 방법으로 양성 판명된 임상시료의 ELISA test 분석결과 동일한 검출 결과를 나타내었고,

(3) 현재 시판 중인 노로바이러스 검출 키트와 비교 실험을 진행한 결과, 민감도의 향상을 보여주었다.

제작한 probe 간의 Dot-hybridization 실험에서 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity) 평가 그리고

임상시료를 이용한 실험결과 모두 긍정적으로 나왔으며, 이러한 결과로 볼 때 향후 임상시료에서도

충분히 Dot blot의 방법을 적용할 수 있을 것으로 예상된다.

Ⅴ. 기대성과

국내에서 검출되는 노로바이러스 분리주를 이용하여 rVLP를 제작하고 항체를 생산함으로써 국내

특이적인 노로바이러스 유전자형에 맞는 진단방법 개발 연구와 함께 국내 환경에 적합한 노로바이러스

신속 진단법을 상용화에 기여하며, 또한 국내·외 출현 가능한 노로바이러스 변이주에 신속하게 대응할

수 있는 연구의 활성화와 신속진단키트를 통한 환경오염의 예방관리 등 공중 보건 증진에 기여할

수 있을 것으로 기대된다.

- i -

차 례

차례 ···························································································································································· ⅰ

표 차례 ······················································································································································ ⅱ

그림 차례 ··················································································································································· ⅲ

I. 서 론 ························································································································································ 1

Ⅱ. 연구내용 및 방법 ······························································································································· 6

1. 연구내용 ······································································································································· 6

2. 연구방법 ······································································································································· 6

3. 연구 추진체계 ··························································································································· 13

Ⅲ. 연구결과 및 고찰 ····························································································································· 15

Ⅳ. 결 론 ··················································································································································· 36

Ⅴ. 기대성과 ··············································································································································· 40

참고문헌 ···················································································································································· 41

- ii -

표 차 례

<Table 1> Immunization schedule ··········································································································· 23

<Table 2> 1st Bleeding ELISA test ········································································································· 24

<Table 3> 2nd Bleeding ELISA test ········································································································ 25

<Table 4> Norovirus GⅠ, GⅡ Probe design ························································································ 32

- iii -

그 림 차 례

<Figure 1> Organization of the Norovirus ······························································································ 2

<Figure 2> Norovirus structure protein ··································································································· 3

<Figure 3> Food poisoning occurrence during 2002~2013 in South Korea ··········································· 5

<Figure 4> Baculovirus Expression Vector System ·················································································· 8

<Figure 5> Verification of VP1(ORF2) gene expression by Western Blotting ······································ 9

<Figure 6> Probe design ···························································································································· 9

<Figure 7> Membrane blotting diagram ·································································································· 11

<Figure 8> Comparison of sensitivity to detect of Norovirus RNA by RT-PCR and Real time PCR 12

<Figure 9> BEVS-EGFP expression system ···························································································· 15

<Figure 10> Confirmation of the BEVS-EGFP expression system by EGFP ······································· 16

<Figure 11> Sequences of Norovirus VP1 and VP2 regions ································································ 17

<Figure 12> Verification of VP1 and VP2 gene in shuttle vector by PCR ········································· 18

<Figure 13> Schematic diagram for recombinant Baculovirus propagation containing Norovirus VP1

and VP2 genes ····················································································································· 18

<Figure 14> Schematic diagram for rVLP propagation using recombinant Baculovirus expression system

and confirmation of VP1 and VP2 proteins expression by Western Blotting method ···· 20

<Figure 15> Expression of ORF2, verification by Western Blotting ···················································· 21

<Figure 16> Verification by Coomassie blue staining and Western Blotting ······································· 22

<Figure 17> Verification of concentrated rVLP by coomassie blue staining and Western Blotting

··································································································································································· 22

<Figure 18> 1st Bleeding ELISA test ······································································································ 24

<Figure 19> 2nd Bleeding ELISA test ····································································································· 25

<Figure 20> Anti rVLP antibody sensitivity test ···················································································· 26

<Figure 21> Human Norovirus detection by RT-PCR ··········································································· 27

<Figure 22> Anti rVLP antibody ELISA test with human Norovirus stool sample ···························· 28

<Figure 23> Commercial Norovirus detection kit test ··········································································· 29

<Figure 24> Norovirus GⅠsequence analysis using Meg-align program ·············································· 30

<Figure 25> Norovirus GⅡ sequence analysis using Meg-align program ············································ 31

- iv -

<Figure 26> Probe design using Oligo 6 program ··················································································· 32

<Figure 27> GⅠ, GⅡ probe specificity test ··························································································· 33

<Figure 28> GⅠ, GⅡ probe sensitivity test ··························································································· 34

<Figure 29> Human norovirus GⅠ, GⅡ hybridization test with designed probe ································· 35

- 1 -

I. 서 론

전 세계적으로 식중독 및 장염을 일으키는 노로바이러스는 그 위험성이 이미 알려져 있으며 각 국에서는

연구에 대한 투자와 보건증진에 노력을 기하고 있다. 노로바이러스 type 중 GⅡ.4 type이 가장 많이

검출되고 최근에는 그 변종이 나타나고 있는 것으로 알려져 있으며 실제 2014년도 일부 논문에 변종

노로바이러스 type인 GⅡ.4 2012 type이 스페인에서, GⅡ.Pg_GⅡ.12, GⅡ.Pg_GⅡ.1, GⅡ.P16_GⅡ.13,

GⅡ.P16_GⅡ.3 type이 미국, 이탈리아, 벨기에 및 독일에서 발견되었다고 보고되어진 바 있다1. 또한

국내에서도 GⅡ12/13 type이 새로 발견되어 학계에 보고되는 등 그 심각성이 증가되어지는 추세이다2.

이처럼 전 세계적으로 장관계 감염 질병의 주된 원인으로 알려진 노로바이러스는 1972년 미국 오하이오

주 Norwalk 지역 초등학교에서 발생한 비박테리아성 식중독 원인체로 처음 확인되었다3. 그 후 노로바이

러스는 식중독 환자에서 계속하여 발견 되었으며 전 세계적으로 바이러스성 식중독의 대표 원인체로서

장관계 질병을 일으키는 바이러스로 인식되어져 왔다. 또한 장관계 질병뿐만 아니라 전장염(全腸炎)의

괴사(壞死), 유아의 발작(發作), 뇌병(腦病)증, 장(腸)의 기종(氣腫), 파종성(播種性) 혈관(血管) 응고(凝固)

에도 관련이 있다고 보고되어 있으며, 특히 개발도상국의 5세 미만 유아 중 20만 명이 이 노로바이러스에

의한 장관계 질병으로 사망한다고 추정하고 있으며 매년 미국에서는 800명 가까운 사람이 사망하는

것으로 보고되고 있다4. 국내에서도 노로바이러스는 식중독 원인체 중에서 압도적 1위를 차지하고 있으며

언론에서도 그 문제성을 자주 접할 수 있다. 그럼에도 불구하고 노로바이러스는 아직 효과적으로 배양이

되지 않고 감염 동물 모델 또한 아직 없는 실정이며5 항체가 인지할 수 있는 항원부위의 변이가 빠르기

때문에 배양할 수 있는 감염성 바이러스에 비하여 연구가 부족하다6.

노로바이러스는 Caliciviridae 과에 속하며 여기에는 Vesivirus, Lagovirus, Nebovirus, Sapovirus,

Norovirus의 5개의 속이 포함되어 있다. 이중 노로바이러스와 사포바이러스는 사람에게 감염되어 식중독

등 장관계질환을 일으킨다. 노로바이러스는 외피가 없는 단일가닥 RNA (positive-sense) 바이러스이며

5개의 유전자 그룹 (GⅠ-Ⅴ type)으로 나뉠 수 있다. 그 가운데 GⅠ, GⅡ, GⅣ 유전자형의 바이러스들이

사람에게 감염 되며, 돼지 (GⅡ), 양 (GⅢ), 쥐 (GⅤ) 등에서도 서로 다른 유전자형의 바이러스가 감염

된다고 알려져 있다. 특히 최근에는 개에게도 감염을 일으키는 새로운 유전자형으로 GⅥ type이 보고된

바 있다7. 이처럼 노로바이러스에는 다양한 유전자형 (genotype)이 있으며, 최근에는 사람에게 감염되는

GⅡ.4 type의 유전자형 하나에서 유전자변이가 주기적으로 일어나 전 세계적인 유행을 일으키고 있으며

특히 최근 10여 년간 전 세계적으로 새로운 노로바이러스 유전자형의 출현이

계속 보고되고 있다14. 노로바이러스는 비 박테리아성 장염의 약 90% 이상의 발병원인으로 알려져

- 2 -

있으며 최근의 미국 질병관리본부 (Center for Disease Control and Prevention (CDC))의 조사에 의하면

미국에서 발생하는 수질관련 장염환자의 약 70% 이상 그리고 식품관련 장염환자의 50% 이상이 노로바이

러스에 의해 발병한다고 한다. 그중 62%는 최근 유행하고 있는 노로바이러스 GⅡ.4 바이러스주 (strain)에

의해 발생하는 것으로 보고되었다. 2001년부터 2007년까지 GⅡ.4 strain으로부터의 변이주가 5개 대륙,

15개 연구소로부터 확보한 3,098개 중 8개가 보고된바 있다. 2006년부터 2009년까지 일본에서 GⅡ.4

2006b와 이 유전형에 속하는 7종의 GⅡ.4 2006b subtype을 확보하였음을 보고하였다. 노로바이러스

GⅡ.4 1996, 2002, 2004, 2006b는 세계적인 분포를 보이고 있다. 이처럼 GⅡ.4 type 노로바이러스와 그

변이주는 세계적인 감염 유행을 주기적으로 일으키는 매우 위험한 바이러스이다. 1990년대 후반에 최초로

확인된 이래 일본에서는 2003 ~ 2004년, 2005 ~ 2006년 시즌에 아시아형 GⅡ.4 변종이 다른 아시아지역과

함께 크게 유행하였고, 2002 ~ 2003년에는 이와 다른 변종주가 유럽과 미국을 중심으로 대유행 하였으며

2004 ~ 2005년, 2006 ~ 2007년도에는 GⅡ.4의 변종이 크게 유행하였다15,16. 변종바이러스인 GⅡ.4 Sydney

type이 2012년 3월 처음 호주에서 관찰되어 영국, 프랑스, 뉴질랜드, 일본 등 여러 나라와 우리나라에서

확보된 2012년도 이후의 식중독 환자의 가검물에서도 실제 변종바이러스인 GⅡ.4 Sydney type이 꾸준히

발견되고 있으며, 미국에서는 2012년 9월~11월 동안 일어난 노로바이러스에 의한 발병 중 53%가 GⅡ.4

Sydney type이 원인임이 보고되었다. 또한 변종 바이러스인 GⅡ.4 2012 type이 스페인에서, GⅡ.Pg_G

Ⅱ.12, GⅡ.Pg_GⅡ.1, GⅡ.P16_GⅡ.13, GⅡ.P16_GⅡ.3 type이 미국, 이탈리아, 벨기에, 독일에서 발견이

되었으며1, 국내에서도 GⅡ12/13 type이 새로 발견이 되어 학계에 알려진 바 있다2. 이처럼 노로바이러스

는 질병을 일으키는 국내·외로 중요한 바이러스이며 그 중 GⅡ.4 type에 의한 감염이 가장 활발히 일어나고

있으나, 최근 그 변이주의 발생으로 인해 예방과 진단이 쉽지 않은 상황이다.

Fig 1. Organization of the Norovirus

노로바이러스의 유전자 크기는 7.3 ~ 7.5 kb로 세 개의 단백질을 코딩하고 있고 (Fig 1)8, 5´ 말단에는

virus-encoded protein 인 VPg 가 3´ 말단에는 polyadenylate 로 구성 되어 있다. 첫 번째 단백질을

- 3 -

코딩하고 있는 ORF1은 큰 polyprotein이며 바이러스가 코딩하고 있는 단백질중 하나인 protease에 의해

co- 또는 post- translation cleave 되어 NTPase/RNA helicase, VPg, protease, RNA-dependent RNA

polymerase, p48, p22 등 총 6개의 단백질로 나눠진다. ORF2는 capsid 단백질이 되는 주요한 부분으로

VP1이라고 불리며 이 VP1은 다시 shell domain의 S-domain과 protruding domain의 P-domain으로

구성되어져있다. 특히 P-domain은 다시 P1과 P2 sub-domain 으로 나뉠 수 있고, P2 domain은 노로바이러

스 strain들 사이에서 가장 적은 conserved region을 가지고 있다. 이들은 가장 최외각에 위치해 있어서

쉽게 변하고 receptor 결합과 면역 반응성에 가장 중요한 역할을 한다. ORF3는 VP2라고도 불리며 ORF2에

의해 합성된 capsid 단백질의 안정화를 위한 보조적인 역할을 수행하는 structure protein을 전사하는

것으로 알려져 있다(Fig 2)9.

Fig 2. Norovirus structure protein

이처럼 노로바이러스는 전 세계적으로 가장 많은 장염을 일으키는 병원성 미생물로 알려져 있으며,

비 박테리아성 장염 발병원인의 약 90% 이상을 차지하는 것으로 알려져 있다20. 노로바이러스는 보건

및 위생의 중요성으로 인하여 미국 환경보호청 (EPA, Environmental Protection Agency)의 중요 수인성

미생물 (CCL, Contaminant Candidate List)로 지정되어 있고 국내에서도 질병관리본부에서 Virus

Sequence Database를 구축하여 염기서열 뿐만 아니라 논문검색을 통한 세부적인 역학정보 및 임상정보를

제공하고 있다.

노로바이러스는 10 ~ 100개의 적은 입자수로도 감염이 되고 감염경로 또한 분변에서 경구 이외에

- 4 -

타액, 물방울, 사람 대 사람의 전파, 의복이나 침구, 에어로졸 감염, 오염된 물과 음식을 통한 감염 등이

모두 가능하고 주변 환경오염에 의한 감염도 쉽게 일어나 가족이나 주변사람에 의한 2차, 3차 감염도

많이 발생한다10,11. 또한 노로바이러스에 감염이 되었음에도 불구하고 증상이 나타나지 않은 상태에서

노로바이러스가 배출될 수 있어 2차 감염의 위험이 높으며, 환경에 안정적이라 60℃ 가열이나 낮은

온도에서도 활성을 잃지 않고 감염능력을 지닌다21

. 겨울철에 노로바이러스에 의한 식중독 사태가 나타나

는 이유도 이와 같이 환경에 매우 안정적이기 때문이다. 또한 유전자 다양성이 크며 바이러스의 변종

또한 다양하여 예방이 어렵고, 어패류 오염이나 오염된 물로 인한 경우 두 가지 이상의 변종 노로바이러스

에 의한 동시 감염도 흔하여 진단이 쉽지 않다. 이러한 노로바이러스에 의한 식중독 증세는 오심(주요

증상), 구토, 복통, 설사, 발열로 어린이들에게는 주로 구토가 나타나고 어른들에게는 설사가 많이 나타난

다12. 감염 환자의 절반 이상은 구토를 동반하며 드물지만 노인이나 영유아환자에서는 심한 탈수현상으로

사망하는 경우도 있다. 잠복기는 24 ~ 48시간이며, 보통 발현 후 12 ~ 72시간 내 호전된다10. 이와 같이

노로바이러스는 감염성이 매우 높고 상대적으로 적은 양의 오염에도 집단 식중독을 일으킬 가능성이

많아 세심한 주의가 필요하다. 과거 바이러스 검출이 가검물의 전자현미경 검경만이 유일한 방법이었을

때 원인균을 찾기도 어려웠으나 1980년대 면역학적 방법이 개발되면서 검출률이 향상되어 노로바이러스

가 비박테리아성 식중독의 19 ~ 42%를 차지하고 있음이 밝혀졌다. 또한 1990년대에는 바이러스의 클로닝

과 염기서열 규명 등으로 보다 민감한 방법인 RT-PCR, nucleotide hybridization probe, ELISA 방법들이

개발되어 식중독 원인체의 확실한 검사가 가능하게 되었다. 하지만 상업적으로 판매되고 있는 ELISA

키트는 낮은 민감도 및 특이도가 단점이며13,19 현재까지도 환경 중 노로바이러스 검출을 위하여 사용되는

RT-PCR 및 nested PCR, semi-nested PCR 방법은 위양성 및 위음성이 빈번하게 발생하고 있어, 자주

발생하는 노로바이러스의 변이주에 의한 감염의 경우진단이 가능한 새로운 표준 primer의 개발이 시급하다.

국내 노로바이러스 연구는 2005년부터 질병관리본부에서 노로바이러스의 검사를 실시하여 노로바이러

스에 의한 장염/설사 사례를 보고하기 시작하였고, 굴과 같은 식품에서의 노로바이러스 검출 연구가

있었으나 그 외에는 거의 전무한 상황이다. 특히 최근 변종 노로바이러스에 의한 식중독 사고가 우리나라

를 비롯해 전 세계적으로 증가하여 분변을 통한 노로바이러스 환경오염이 우려되고 있어 이에 대한

대책 마련이 국내는 물론 전 세계적으로도 시급한 실정이다.

국내에서는 1999년에 노로바이러스 식중독이 처음으로 보고된 이래 2003년 집단 노로바이러스 식중독

이 보고되어 바이러스성 식중독의 위험이 크게 주목받게 되었다. 2006년 전국적으로 31개의 학교에서

노로바이러스 식중독이 발생하여 2,400여명이 치료를 받았으며, 최근까지 매년 1,000 ~ 2,000명의 노로바

이러스로 인한 식중독 환자가 발생하고 있으며 전체 식중독 환자 중 그 절반 이상이 노로바이러스가

주요 원인으로 알려져 있다 (Fig 3).

- 5 -

Fig 3. Food poisoning occurrence during 2002~2013 in South Korea(출처-식품의약품안전처 식중독통계시스템)

따라서, 본 연구에서는 국내에서 발견되어 분리된 노로바이러스를 이용하여 rVLP를 제작하고 항체를

생산하여, 1) 국내에서 주로 발견되는 노로바이러스를 신속하게 진단할 수 있는 방법을 개발하고, 2)

노로바이러스 genotype에 따른 특이적 유전자 probe를 제작하여 hybridization 방식을 통한 Dot blot

방법을 이용, 노로바이러스 진단조건의 효율을 검증하고자 한다.

- 6 -

Ⅱ. 연구내용 및 방법

1. 연구내용

가. 면역학적 방법을 이용하여 노로바이러스의 신속진단을 위한 rVLP 제작 및 이를 이용한 특이성

연구

1) 국내에서 유행한 노로바이러스 capside유전자를 이용하여 rVLP 제작

2) rVLP의 순수 분리주 및 고역가 바이러스 확보

3) rVLP의 특이성 연구로서 노로바이러스의 감염성 판단을 위하여, His- 항체를 이용한 용출 또는

비용출형태의 rVLP 형성 확인

4) 실험동물을 이용한 단일 또는 다클론 항체형성 조사

*rVLP (Recombination Virus-like particle:재조합 바이러스 유사 입자)

나. 분자생물학적방법 (hybridization)을 이용한 노로바이러스의 특이적 유전자 probe 조사 및 연구

1) 노로바이러스 genotype에 따른 특이적 유전자 probe 설정

2) Hybridization 방법을 이용한 노로바이러스 진단조건 확립 및 dot blot 방법을 이용한 효율검증

다. 면역학적 방법과 분자생물학적 방법의 이용가능성 및 신속진단 키트의 적용가능성 평가

1) 임상시료를 대상으로 기존 분자생물학적 진단법인 RT-PCR 방법과 면역학적 방법으로 개발된

키트와의 비교·분석

2) rVLP를 항원으로 하는 항체를 이용하여 ELISA 방법의 가능성 평가

3) 이용 가능성을 분석하고 신속진단 키트에 적용할 수 있는지 평가

2. 연구방법

가. 면역학적 방법을 이용하여 노로바이러스의 신속진단을 위한 rVLP 제작 및 이를 이용한 특이성

연구

사람 노로바이러스의 capsid 유전자 염기서열인 ORF2 유전자 영역 (VP1 region)을 기초로 하여

epitope 유전자 발현을 위해 베큘로바이러스 시스템 (Baculovirus Expression Vector System; BEVS)에

적용하였다. 베큘로바이러스 발현시스템은 곤충세포에서 특이적으로 외래 유전자를 발현하기 위해

광범위하게 이용되는 단백질 발현 체계로서 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV)

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로 부터 유래된 곤충 특이적 바이러스를 사용한다 (Fig 4). 베큘로바이러스 발현시스템은 동물세포를

이용한 단백질 발현체계보다 더 많은 양의 단백질을 생산할 수 있고, 대장균을 이용한 발현체계보다

고품질의 단백질 생산 가능성이 큰 것이 장점으로 알려져 있다. 최근 보고에 따르면 베큘로바이러스

발현시스템은 동물세포에서 증식하는 바이러스 벡터 (Adeno-와 Retrovirus 등)에 비하여 곤충세포에

서만 특이적으로 발현 및 증식이 가능하다는 이유 때문에 유전자 치료 등 여러 다양한 목적으로의

응용이 가능한 것으로 인정을 받고 있다17,18. AcNPV는 약 130 kb의 환형 이중나선의 DNA를 게놈으

로 가지기 때문에 다른 바이러스 벡터와 비교하여 상당히 큰 외부 유전자 (12 kb 이상)를 바이러스

게놈 내로 도입 가능한 것이 큰 장점으로 알려져 있다. 이러한 이유 때문에 BEVS는 여러 종류의

재조합 단백질을 생산하기 위한 발현 체계로서 이용되고 있으며 향후 적용 범위 역시 증대될

것으로 예상된다.

본 연구에서는 노로바이러스 ORF2(VP1)와 ORF3(VP2) 유전자를 발현하기 위해 사용하였다.

노로바이러스의 ORF2는 capsid 단백질이 되는 주요한 부분으로 알려져 있다. VP1은 shell domain의

S-domain과 protruding domain의 P-domain으로 구성되어져있다. 특히 P-domain은 다시 P1과 P2

sub-domain 으로 나뉜다. P2 domain은 노로바이러스 strain 사이에서 가장 적은 conserved region을

가지고 있다. 또한 P2-domain은 가장 최외각에 위치해 있으면서 가장 변하기 쉽지만 receptor 결합과

면역의 반응성에 가장 중요한 역할을 한다8,9. 또한 베큘로바이러스 발현시스템은 효과적인 단백질

정제를 위하여 목적하는 재조합 단백질의 C-말단에 6개의 His를 융합하여 발현될 수 있도록 디자인

되어 있다. 노로바이러스 ORF2(VP1)와 ORF3(VP2) 유전자를 포함하는 재조합 바이러스는 역가

측정 (플라크 분석) 방법을 통하여 바이러스의 정확한 수를 검사하였으며, 목적 유전자가 삽입된

재조합 베큘로바이러스를 순수 분리하기 위하여 각 플라크 별로 바이러스를 순수 분리하고 증식하

는 과정을 수행함으로써 노로바이러스 VP1과 VP2를 발현하는 재조합 베큘로바이러스만을 순수

분리하여 연구에 사용하였다.

- 8 -

Fig 4. Baculovirus Expression Vector System(출처-다카라 코리아바이오메디칼 연구개발센터:Baculovirus 발현벡터계를 이용한 단백질 생산)

노로바이러스 VP1 유전자를 포함하는 재조합 바이러스는 목적 유전자가 삽입된 재조합 베큘로바

이러스를 순수 분리하기 위하여 ganciclovir에 의한 negative selection을 하여 바이러스를 순수 분리하

고 증식하는 과정을 수행함으로써 노로바이러스 VP1를 발현하는 재조합 베큘로바이러스만을 순수

분리하여 본 연구에 사용할 것이다. 재조합된 베큘로바이러스에서 발현된 노로바이러스 rVLP는

size exclusion 방법을 통하여 분리, 정제되어 Western blotting을 통해 발현된 노로바이러스 capsid

protein을 확인 할 것이다 (Fig 5). 정제된 노로바이러스 rVLP를 이용 실험동물을 이용하여 단일

또는 다클론 항체형성을 조사한다.

- 9 -

Fig 5. Verification of VP1(ORF2) gene expression by Western Blotting

나. 분자생물학적 방법 (hybridization)을 이용한 노로바이러스의 특이적 유전자 probe 조사 및 연구

NCBI, DDBJ, EMBL등의 GenBank를 통해 전 세계에서 유행하는 노로바이러스 분리주의 염기서열

을 수집한다. 수집된 노로바이러스의 염기서열을 기반으로 DNAStar의 Meg-align program을 이용하

여 특이적이 염기서열을 가진 probe를 제작하고, Oligio6 프로그램을 사용하여 melting temperature나

secondary structure를 계산 한다 (Fig 6).

Fig 6. Probe design

Hybridization 방법을 통해 probe test 수행 시 양성 샘플로 사용 될 노로바이러스가 필요하기 때문에

- 10 -

디자인된 probe의 염기서열이 포함된 부분을 target으로 하는 primer를 사용하여 PCR로 증폭시킨

뒤 cloning·transformation하였다. 효율적인 transformation을 위하여 competent cell을 제조 (E.coli

DH5a) 하였다. 대장균을 5 mL LB 액체배지에서 12시간 배양한 후, 다시 50 mL LB 액체배지에

500 ㎕를 접종한 후 약 1시간 배양하였다. 배양액을 플라스틱 시험관에 넣고 7,000 rpm, 4 ℃에서

10 분간 원심분리 하였다. 또 한번 상층액을 버리고 100 mM CaCl₂15 mL를 첨가하였다. 얼음에서

10 분간 방치한 후 7,000 rpm, 4 ℃에서 10 분간 원심분리 하였다. 또 한번 상층액을 버리고 50

mM CaCl₂와 MgCl₂혼합액을 10 mL 첨가하고 얼음에 10분간 방치 후 7,000 rpm, 4 ℃에서 10분간

원심분리하고 상층액을 버린 후 100 mM CaCl₂2 mL를 첨가하였다. 얼음에 반응액을 3분간 방치하

고 100% glycerol 300 ㎕를 첨가 후 200 ㎕ 씩 1.5 mL tube에 분주한 후 -70 ℃에 보관하였다.

Transformation 방법은 competent cell 200 ㎕에 ligation된 DNA를 30 ㎕ 첨가 후 얼음에서 한 시간

동안 반응시켰다. 이때 Competent cell과 ligation된 DNA는 얼음에 넣고 천천히 녹인다. 10분마다

손가락으로 살짝 쳐주어 섞어 주었다. 42 ℃에서 2분간 열 충격을 주고, 얼음에서 2분간 반응시켰다.

LB 액체배지를 800 ㎕ 첨가하고 37 ℃에서 1시간 동안 흔들면서 배양하였다. 항생제(Ampicillin)가

들어있는 배지에 X-gal (20 ㎕/mL) 40 ㎕와 IPTG (200 ㎕/mL) 4 ㎕의 혼합액을 뿌려주고 spreading하였

다. 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날 다시 4 ℃에 넣고 3시간 정도 colony의 색 변화를

관찰하였다. white colony만 취해 항생제(Ampicillin)가 들어있는 LB 배지에 접종하였다.

배양된 박테리아 세포를 1.5 mL tube에 옮긴 뒤 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하고 상층액을

버린다. Pellet의 재현탁(resuspension)을 위하여 남아있는 pellet에 RNase가 처리된 PD1 버퍼 200

㎕을 넣고 혼합하였다. 세포용해(lysis)를 하기 위해 PD2 버퍼 200 ㎕을 넣고 인버팅 10회 후 실온에서

2분간 방치 하였다. 중화(neutralization)를 위하여 PD3 버퍼 300 ㎕을 넣고 인버팅 10회 후 13,000

rpm에서 3분간 원심분리 하였다. 원심분리가 끝나면 collection tube에 결합된 column에 용해물을

모두 넣고 13,000 rpm에서 30초간 원심분리 하였다. Column은 새로운 collection tube에 옮긴 뒤

W1 버퍼 400 ㎕를 넣고 13,000 rpm에서 30초간 원심분리 하였다. 100% 에탄올이 첨가된 세척버퍼

600 ㎕을 column에 넣고 13,000 rpm에서 원심분리 하였다. Column은 새로운 collection tube에 옮긴

뒤 건조를 위하여 13,000 rpm에서 2분간 원심분리 하였다. 새로운 1.5 mL tube에 column을 옮기고

용리(elution)를 위해 Elution 버퍼 30㎕ 넣고 상온에 2분간 방치 후 13,000 rpm에서 2분간 원심분리

한다.

제작된 probe는 Dot blot hybridization을 수행하여 민감도와 특이도를 측정하였다. Dot blot

hybridization을 수행하기 위해 아래와 같은 방법으로 실험을 진행한다. Hybridization방법을 이용한

노로바이러스의 진단을 위해 본 과제에서는 membrane blotting을 이용한 방법을 적용하였다 (Fig 7).

- 11 -

Fig 7. Membrane blotting diagram

Nitrocellulose membrane에 95 ℃에서 10분간 반응하여 변성시킨 DNA 1 ㎕를 spot한 후, membrane에

고정하기 위해 80 ℃에서 2시간동안 baking 하였다.

고정이 끝난 membrane은 prehybridizaion solution (5X Denhardt's, 5X SSC, 0.1% SDS, 0.1mg/mL

denatured salmon sperm DNA)에서 65 ℃, 15분 동안 prehybridizaion 하였다. Biotin-labeled probe가

담긴 hybridization solution을 넣고 65 ℃에서 1시간 동안 hybridization을 한다. Nitrocellulose membrane

은 2X wash buffer (2X SSC, 0.1% SDS)로 2회 세척하고, 이를 다시 0.5X wash buffer (0.5X SSC,

0.1% SDS)로 2회 세척한다.

Wash 과정이 끝난 nitrocellulose membrane을 blocking solution에 넣고 30분간 반응시킨 후, blocking

solution에 streptavidin-AP conjugate를 75 mU/mL (1:5000)를 첨가하여 희석한 solution에 membrane를

담아 30분간 반응시킨 후, 15분간 wash buffer로 2회 세척한다.

Membrane은 detection buffer에 넣어 10분간 반응 후 발색기질로써 BCIP/NBT substrate solution을

첨가하여 암실에서 30분간 반응시킨 후 발색반응 정도를 확인한다.

위의 방법으로 각각의 probe는 민감도, 특이성을 Dot-blot방법을 통하여 검증을 진행하였다.

다. 면역학적 방법과 분자생물학적 방법의 이용가능성 및 신속진단 키트의 적용가능성 평가

임상 또는 환경시료를 대상으로 기존 분자생물학적 진단법인 RT-PCR 방법과 rVLP를 항원으로

생산된 항체를 이용한 면역학적 방법을 비교·분석하여 이용가능성을 분석하고 신속진단 키트에

적용할 수 있는지 평가한다.

환경시료의 경우 지하수, 하천수 약 500 ~ 1,000 L를 1 MDS (Cuno) 필터에 흡착시킨 후 1.5%

- 12 -

Beef extract를 이용하여 탈리하고 산 농축법에 따라 바이러스를 농축한다. 최종 농축한 20 ~ 30

mL를 제균하기 위하여 membrane 필터로 여과하고 임상시료와 마찬가지로 140 ㎕를 Qiagen viral

RNA mini kit로 viral RNA를 추출하고 마지막으로 80 ㎕의 Viral RNA 용액으로 하여 ‑70 ℃에

보관한다. 분변시료의 경우, stool의 무게를 측정한 후 stool 50 mg을 1X PBS 500 ㎕에 현탁시킨다.

그 후 강하게 30분간 vortex후 micro centrifuge로 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액 140

㎕를 Qiagen viral RNA mini kit로 viral RNA를 추출하고 최종적으로 80 ㎕의 Viral RNA 용액으로

하여 –70 ℃에 보관한다. 분자생물학적 진단법을 통한 민감도 분석방법으로는 위 과정을 통해

추출된 RNA를 100 ~ 1010까지 단계적으로 희석하여 RT-PCR과 Real-time PCR를 수행한다. RT-PCR의

조건으로는 45 ℃에서 30분 동안 reverse transcriptase를 활성화시키고 95 ℃에서 15분간 reverse

transcriptase를 불활성화 시켰다. 그 다음 94 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃ 에서 1분간 총

35 cycle로 증폭시켰고 final extension을 72 ℃에서 5분간 수행 한다 (Fig 8).

Fig 8. Comparison of sensitivity to detect of Norovirus RNA by RT-PCR and Real time PCR

제작한 항체는 신속 진단 키트로서의 가능성을 확인하기 위하여 항체의 민감도 test를 ELISA방법을

통하여 검증하였고 제작된 probe는 Dot blot hybridization을 수행하여 민감도와 특이도를 측정하여

신속 진단의 가능성을 판단하였다.

- 13 -

3. 연구 추진체계

주관기관 대구가톨릭대학교 산학협력단

담당기술

내 용

○ 연구 총괄

○ rVLP 제작 및 특이성 연구

○ Hybridization 방법 개발 및 적용가능성 평가

○ 신속진단 키트의 적용가능성 평가

참여연구원 참여연구원

○ 연구책임자 1인○ 연구보조원 2인

○ 연 구 원 1인○ 연구보조원 6인

담당기술내용 담당기술내용

○ 노로바이러스 분리 및 확보

○ rVLP 제작 및 특이성 연구

○ 순수 분리주 및 고역가 바이러스 확보

○ 항체의 이용가능성 평가

○ 신속진단 키트의 적용가능성 평가

○ 노로바이러스 분리 및 확보

○ rVLP 제작 및 특이성 연구

○ 특이적 유전자 probe 조사 및 연구

○ Hybridization 방법개발 및 적용가능성

평가

○ 신속진단 키트의 적용가능성 평가

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구 분 소 속 직 위 성 명 전 공 담당분야 참여율

연구책임자 대구가톨릭대학교 조교수 박승원 분자생물학

총괄 과제 진도

관리 및 보고서

작성

15%

연구원 가톨릭대학교 교수 백순영 바이러스학 과제 진도 관리 5%

연구보조원

대구가톨릭대학교 연구보조원 강래형 미생물학노로바이러스 확보

및 분리19%

대구가톨릭대학교 연구보조원 김주은 미생물학노로바이러스 확보

및 분리19%

가톨릭대학교 연구보조원 이재웅 미생물학

rVLP 제작 및 정제

분리

항체 연구

19%

가톨릭대학교 연구보조원 공병화 생명과학

노로바이러스의

특이적 유전자 probe 조사 및 연구

19%

가톨릭대학교 연구보조원 양수정 생명과학

노로바이러스의

특이적 유전자 probe 조사 및 연구

19%

가톨릭대학교 연구보조원 최혜림 생명과학

노로바이러스의

특이적 유전자 probe 조사 및 연구

19%

가톨릭대학교 연구보조원 박지선 화학 Dot blot 방법 연구 19%

가톨릭대학교 연구보조원 하현주 생명공학 Dot blot 방법 연구 19%

- 15 -

Ⅲ. 연구결과 및 고찰

1. 면역학적 방법을 이용하여 노로바이러스의 신속진단을 위한 rVLP 제작 및 이를 이용한

특이성 연구

가. 베큘로바이러스를 reporter gene으로서 EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein) 발현 조사 (2013

년도 연구 결과)

본 과제 수행을 위하여 선택된 바이러스는 특이적으로 4개의 프로모터에 각 유전자를 삽입

하여 4개 유전자를 동시에 발현할 수 있도록 디자인, 효과적인 바이러스의 감염 및 증식 확인

을 위하여 EGFP 유전자를 미리 삽입하여 디자인 하였다. 전형적인 reporter gene인 EGFP 유전

자 절편은 곤충세포 발현계를 통한 생산체계를 구축하였다. 곤충 (누에) 특이적인 베큘로바이

러스를 벡터로 적용하기 위하여, 선택된 바이러스는 특이적으로 4개의 프로모터에 각 유전자

를 삽입하여 4개 유전자를 동시에 발현할 수 있도록 디자인 하였다. 이는 효과적인 바이러스

의 감염 및 증식 확인 및 노로바이러스의 감염특성 연구를 위하여 reporter gene으로서 EGFP를

발현하고 이를 통하여 외래의 단백질 발현성을 확인할 수 있었다 (Fig 9,10).

Fig 9. BEVS-EGFP expression system

우선적으로 베큘로바이러스 발현시스템이 곤충세포에서 정상적으로 형성되어 재조합 바이

러스를 형성하게 되면 이에 대한 결과를 우선적으로 확인하기 위하여 발현 벡터 구축 시 삽

입한 EGFP 유전자를 PCR 방법과 형광현미경 그리고 western blot으로 확인함으로써 노로바이

러스 유전자를 발현하는 재조합 베큘로바이러스의 형성을 확인하였다 (Fig 10).

- 16 -

Fig 10. Confirmation of the BEVS-EGFP expression system by EGFP

나. 노로바이러스 VP1, VP2 region의 epitope 유전자 확보 및 유전자의 베큘로바이러스 시스템 적용

평가 (2013년도 연구결과)

노로바이러스는 Caliciviridae에 속하는 약 7.6 kb의 single stranded RNA바이러스로서 3개의

ORF가 존재한다. 노로바이러스는 크게 5가지의 genogroup (GⅠ~GⅤ)으로 분류된다. Human

노로바이러스는 capsid 유전자와 RNA polymerase 염기서열을 기초로 하여 2가지 genogroup인

GⅠ and GⅡ로 나누어지고 GⅠ의 14개와 GⅡ의 17개의 genotypes으로 세분화 되어 나눠지고

있다. 그중 ORF2는 capsid 단백질이 되는 주요한 부분이다.

VP1의 S-domain과 P-domain중 P-domain은 다시 P1과 P2 sub-domain 으로 나뉜다. P2 domain

은 노로바이러스 strain 사이에서 가장 적은 conserved region을 가지고 있다. 또한 P2-domain은

가장 최외각에 위치해 있으면서 가장 변하기 쉽지만 receptor 결합과 면역의 반응성에 가장

중요한 역할을 한다.

- 17 -

Fig 11. Sequences of Norovirus VP1 and VP2 regions

따라서 본 연구에서는 환경 중 노로바이러스 변종에 관한 유전학적 특성 연구를 통하여 확

보한 VP1, VP2 region의 유전자를 베큘로바이러스 발현시스템에 적용하여 발현하였다 (Fig

11). VP1 (ORF2), VP2 (ORF3), 그리고 VP1 + VP2가 결합한 영역은 재조합 베큘로바이러스를

형성하기 위해 우선 shuttle vector에 각각의 서로 다른 세 개의 유전자를 삽입하였다. 노로바

이러스 유전자가 삽입된 shuttle vector clone들은 다음의 과정을 거쳐 유전자 재조합 베큘로바

이러스를 형성하였다 (Fig 12).

- 18 -

Fig 12. Verification of VP1 and VP2 gene in shuttle vector by PCR

1) VP1 (ORF2) 2) VP2 (ORF3) 3) VP1 + VP2

(1) Recombination 과정

Shuttle vector에 각각의 노로바이러스 유전자가 삽입된 entry clone들은 recombinase에 의

해 베큘로바이러스 전체 유전자 게놈과 유전자 재조합의 과정을 거쳐 새로운 유전자 재조

합 베큘로바이러스 게놈 DNA를 형성하게 되었다 (Fig 13).

Fig 13. Schematic diagram for recombinant Baculovirus propagation containing

Norovirus VP1 and VP2 genes

- 19 -

(2) 1st Passage Recombinant 바이러스 형성 과정

새롭게 형성된 유전자 재조합 베큘로바이러스 게놈 DNA는 숙주 세포주로서 곤충세포주

인 Sf9 또는 Sf21 세포에 Liposome을 이용해 도입하게 되고 이어서 숙주세포 내에서 유전자

재조합 베큘로바이러스가 형성하게 된다. 이때 노로바이러스가 삽입된 유전자 재조합 바이

러스를 제외한 wild-type의 바이러스 제거는 항생제(gangcyclovir)를 이용하여 처리하였다.

(3) 2nd Passage Recombinant 바이러스 형성

1st passage recombinant 바이러스들은 우선적으로 PCR 방법을 사용하여 정확하게 재조합

바이러스가 형성되었는지 확인할 수 있지만 본 연구에서는 이 과정을 생략하였다. 1st

passage recombinant 바이러스들은 우선 4 ℃ 또는 –70 ℃에 stock으로 보관하였으며, 일부는

숙주세포주로서 곤충세포주인 Sf9에 감염하여 2nd passage recombinant 바이러스를 형성하는

데 이용하였다.

(4) rVLP 형성 유무에 대한 확인

rVLP의 형성은 다음의 방법을 통하여 확인하였다. 먼저 2nd passage 재조합 바이러스를 형

성하였다. 각각의 노로바이러스 유전자는 C-말단에 6개의 His 아미노산 잔기를 발현하도록

디자인하였기 때문에 본 연구에서는 rVLP의 형성 유무는 6x-His에 대한 항체를 이용한

Western Blotting 방법을 사용하여 확인하였다. 이상의 연구를 통하여 3개 (VP1, VP2 또는

VP1+VP2)의 서로 다른 형태의 인간 노로바이러스 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러

스가 rVLP들을 정확하게 형성하고 있음을 확인할 수 있었다 (Fig 14).

- 20 -

Fig 14. Schematic diagram for rVLP propagation using recombinant Baculovirus expression system and

confirmation of VP1 and VP2 proteins expression by Western Blotting method

본 연구에서는 노로바이러스 변종에 관한 유전학적 특성 연구를 통하여 확보한 VP1, VP2

region의 유전자 중 베큘로바이러스 발현시스템에 적용하여 각각의 capside protein이 발현함을

확인하였다.

다. Major capside protein을 coding 하고 있는 VP1(ORF2)의 발현, 정제 및 rVLP의 항원으로서의 가능성

확인 (2014년도 연구결과)

본 연구에서는 노로바이러스 변종에 관한 유전학적 특성 연구를 통하여 확보한 VP1, VP2

region의 유전자 중 major capside protein을 coding 하고 있는 VP1(ORF2) 유전자가 삽입된 베

큘로바이러스를 발현시스템에 적용하여 인간 노로바이러스 rVLP를 발현시키고 rVLP를 정제

한 후 동물모델을 이용한 항체 생산을 실시하였다. VP1(ORF2) 유전자는 발현이 되면 노로바

이러스의 capside를 구성하는 protein 중 major 역할을 하는 protein을 coding하는 유전자로서

- 21 -

여러 다른 연구에서도 ORF2 유전자 부분만을 이용하여 insect cell이나 plant cell에서 발현시

킨 후 self-assembly 이용하여 rVLP를 제작하였다는 연구결과를 찾아볼 수 있다.

(1) rVLP를 높은 농도로 얻기 위해 숙주세포주인 곤충세포주 Sf9에 recombinant 베큘로바

이러스를 감염하여 rVLP를 형성하는데 이용하였다. 감염시킨 5~7일 후 cell의 모양 변화

를 관찰한 후 cell을 수확한 다음 형성된 rVLP는 다음의 방법을 통하여 확인하였다. 베

큘로바이러스에 삽입된 노로바이러스 VP1(ORF2)유전자는 C-말단에 6개의 His 아미노산

잔기를 발현하도록 디자인하였기 때문에 본 연구에서는 rVLP의 형성 유무는 6x-His에

대한 항체를 이용한 Western Blotting 방법을 사용하여 확인하였다. 수확한 cell을 lysis한

다음 원심분리를 통해 supernatant와 cell pellet으로 나눈 후 Western Blotting 방법을 이용

하여 발현된 ORF2 protein을 예상하였던 size에서 supernatant와 pellet에서 확인할 수 있었

고 Human 노로바이러스 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스가 rVLP를 정확하게

형성하고 있음을 확인할 수 있었다 (Fig 15).

Fig 15. Expression of ORF2, verification by Western Blotting

(2) rVLP의 정제를 위하여 size exclusion chromatography 방법을 이용하였다. FPLC를 사용

하여 cell lysate의 supernatant만 column(GE Healthcare, HiPrep26/60 Sephacryl S-400 High

Resolution)에 loading 하였다. 노로바이러스 rVLP는 180개의 molecules가 90개의 dimer를

이루어 형성된다고 알려져 있으며 다른 cell 내의 protein 보다 크기가 크기 때문에 가장

먼저 elution이 될 것으로 예상하였고 실제 실험에서도 elution 된 1번 2번 fraction에서

- 22 -

rVLP가 정제되어진 것을 확인할 수 있었다. 각각의 fraction은 coomassie blue staining 방

법과 Western Blotting 방법으로 확인을 하였다 (Fig 16).

Fig 16. Verification by Coomassie blue staining and Western Blotting

(3) 정제한 rVLP는 동물모델을 통하여 항체 생산을 위한 항원으로 제공되기 위해 농축과

정을 거쳤다. 위 실험으로 확인한 결과 1번 2번 fraction에서 rVLP가 확인이 되었고 이

두 fraction의 elution된 solution은 Millipore사의 Centricon을 이용, 농축하였다. 농축된

rVLP는 coomassie blue staining 방법과 Western Blotting 방법으로 확인을 하였고 (Fig 17),

BCA Protein Assay(Thermo #23227) 방법과 알고 있는 농도의 BSA와 같이 gel상에서

coomassie blue staining 방법으로 비교하여 측정하였다(Data not shown).

Fig 17. Verification of concentrated rVLP by coomassie blue staining and Western Blotting

- 23 -

(4) 정제, 농축된 rVLP를 항원으로 이용하여 동물모델을 통해 항체를 생산하였다(AB

frontier). 본 실험에 사용된 동물모델은 Mouse BALB/C로 성별 Female, 나이 6주령을 사

용하였으며 총 3마리에서 mouse polyclonal antibody를 생산하였다. 처음 항원 주입 후 3

주후에 1st Boosting, 5주후에 1st Bleeding ELISA test를 통하여 항체합성 여부를 판단하

였고 6주후 2nd Boodting을 실시한 뒤 8주째에 2nd Bleeding ELISA test를 통하여 최종 항

체 생성 여부와 titer를 측정 후 9주째에 Heart Puncture를 통하여 각각 mouse의 antisera

를 받았다 (Table 1). ELISA test는 indirect ELISA 방법으로 실행하였으며 serum을 1:100

에서 1:100,000까지 단계적으로 희석하여 항원에 대한 면역력을 확인하며, 단계적 희석

에 따른 O.D값의 낙차를 기준으로 생성된 항체의 적합성을 판단하였다.

1st Bleeding ELISA test는 항원 250 ng에 각각 mouse에서 추출한 antiserum을 단계적

으로 희석하여 titer를 측정하는 방식으로 하였고 그 결과 mouse 3마리 중 2번을 제외하

고 O.D값이 1:1000 희석 비율에서 1.5 이상이며, 대체적으로 ELISA titer 값이 낮지 않

게 나왔다 (Table 2) (Fig 18). 2nd Bleeding ELISA test 역시 원 250 ng에 각각 mouse에서

추출한 antiserum을 단계적 희석하여 titer를 측정하는 방식으로 하였고 그 결과 mouse 3

마리 모두 1:1000 희석배율에서 1.5 이상이며, 전반적으로 ELISA titer값이 대체적으로

좋게 측정되었다 (Table 3) (Fig 19).

Time Description

Week 0 Injection

Week 3 1st Boosting

Week 5 1st Bleeding ELISA

Week 6 2nd Boosting

Week 8 2nd Bleeding ELISA

Week 9 Heart Puncture

Week 10 Sample 발송

Table 1. Immunization schedule

- 24 -

ELISA test 1st Bleeding Antibody coating 250 ng/well

Measurement filter 450 nm Mouse IgG HRP 1:10,000dilution

TMB 발색 5 min

Mouse#1 #2 #3Serum

dilution factor

PBS 0.096 0.093 0.121

0차 0.071 0.074 0.099

1:100 1.694 1.713 1.920

1:1,000 1.599 1.417 1.745

1:5,000 1.153 1.159 1.238

1:10,000 0.890 0.900 0.967

1:50,000 0.443 0.457 0.484

1:100,000 0.314 0.340 0.353

Table 2. 1st Bleeding ELISA test

Fig 18. 1st Bleeding ELISA test

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ELISA test 2nd Bleeding Antibody coating 250 ng/well

Measurement filter 450 nm Mouse IgG HRP 1:10,000dilution

TMB 발색 5 min

Mouse#1 #2 #3

Serumdilution factor

PBS 0.085 0.081 0.079

0차 0.078 0.077 0.085

1:100 1.764 1.739 1.943

1:1,000 1.697 1.617 1.846

1:5,000 1.310 1.377 1.372

1:10,000 0.997 1.302 1.238

1:50,000 0.595 0.849 0.699

1:100,000 0.398 0.631 0.502

Table 3. 2nd Bleeding ELISA test

Fig 19. 2nd Bleeding ELISA test

- 26 -

(5) 제작한 항체의 신속 진단 키트로서의 가능성을 확인하기 위하여 항체의 민감도 test를

ELISA방법을 통하여 실시하였다. 농축한 rVLP의 농도를 측정 후 1 ng/mL 부터 0.1

pg/mL 농도까지 serial dilution을 하여 ELISA plate에 4 ℃에서 over night로 incubation 하

였다. Blocking step은 PBS에 5% non fat milk를 녹여 만든 버퍼로 상온에서 3시간 진행

하였다. 제작한 antibody를 1:1000의 비율로 PBS에 2% non fat milk를 녹여 만든 버퍼에

희석시켜 coating한 rVLP와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 발색을 위해 secondary

antibody 는 anti mouse IgG labeled HRP (abcam #ab97051)를 1:10,000의 비율로 PBS에

2% non fat milk를 녹여 만든 버퍼에 희석시켜 상온에서 1시간 반응시켰다. ELISA 반응

확인을 위해 TMB substrate solution 100 ㎕를 10~15분 동안 처리하고 stop solution을 넣

어 반응을 종료시켰다. Absorbance 파장 450에서 결과 값을 읽어 수치로서 결과를 평가

하였다. 각각 rVLP 농도에서의 ELISA 반응 사진 (Fig 20, a)과 그 결과 값을 그래프로

나타내었다 (Fig 20, b). 제작한 항체는 항원의 0.1 ng/mL 농도에서도 negtive (blank)보다

높은 값이 나온 것을 확인하였다.

Fig 20. Anti rVLP antibody sensitivity test

- 27 -

(6) 임상시료 중 노로바이러스 감염을 확인하기 위해 RT-PCR 방법을 이용하여 노로바이

러스 GⅡ type에 감염된 시료를 확보하였다 (Fig 21, a). RT-PCR로 확인한 후 그 증폭된

DNA band의 sequencing을 실시하였고 blast를 하여 최종적으로 노로바이러스 GⅡ type에

감염된 시료임을 확인하였고 그중 10개를 확보하였다 (Fig 21, b).

Fig 21. Human Norovirus detection by RT-PCR

(7) RT-PCR 방법을 통해 노로바이러스 GⅡ type 양성 임상시료 10개를 ELISA 방법과 현

재 시판중인 2개의 노로바이러스 검출 키트와의 비교 분석 실험을 하였다 (Fig 22).

ELISA 방법은 위의 제작 항체 민감도 test와 동일 방법으로 시행하였으며 임상시료 샘

플을 coating buffer에 resuspension 하여 준비하였다. 모든 임상 시료에서 0.18 ~ 1.3 사이

의 값을 보여주었으며 negative(blank) 값과 비교하였을 시 모든 시료에서 반응을 함을

확인 하였고 (Fig 22, a) 그 값을 그래프로 나타내었다 (Fig 22, b). 반면에 시판 중인 2가

지 검출키트의 비교를 위하여 동일 양성 임상시료 10개를 이용하여 키트 매뉴얼을 따라

검출해 보았다. 각각 DENKA 사의 QuickNavi-Norovirus 검출 키트의 경우 50%의 검출율

(8,29,37,38,47번 시료)을 (Fig 23, a) SD사의 SD Norovirus 검출 키트역시 50%의 검출율

(8,29,37,38,47번 시료)을 (Fig 23, b) 보여주었다.

- 28 -

Fig 22. Anti rVLP antibody ELISA test with human Norovirus stool sample

- 29 -

Fig 23. Commercial Norovirus detection kit test

- 30 -

2. 분자생물학적 방법 (hybridization)을 이용한 노로바이러스의 특이적 유전자 probe 조사

및 연구

가. Probe 디자인을 위한 염기서열 분석

Probe 디자인을 위해 NCBI, DDBI, EMBL 등의 GenBank를 통해 사람에게 감염되는 노로

바이러스 GenogroupⅠ(GⅠ-1~8), GenogroupⅡ(GⅡ-1~17)의 염기서열을 수집하였다. 전체 게

놈 (7.6Kb) 중 VP1 region(conserved region)을 target으로 specific한 염기서열을 분석하였다

(Fig 24, 25).

Fig 24. Norovirus GⅠ sequence analysis using Meg-align program

- 31 -

Fig 25. Norovirus GⅡ sequence analysis using Meg-align program

Specific한 염기서열을 기반으로 디자인된 probe는 DNAStar의 Meg-alingn program과 Oligo6

program을 이용하여 melting temperature, secondary structure를 계산하며 (Fig 26), GC content,

GC clamp, 3´ end stablity, cross homology를 고려하여 최종적으로 probe를 선별한다 (Table 4).

각각의 Genogroup 별로 4종류씩 최종 선별된 probe는 Cosmo Genetech을 통해 5’end에 biotin

을 modification하여 제작하였다.

가장 적합한 probe를 선정하기 위해 제작된 probe 8종은 민감도, 특이성, 재현성을 확립된

Dot-blot방법을 통하여 검증을 진행하였다.

- 32 -

Fig 26. Probe design using Oligo 6 program

Probe Sequence(5´-3´) Size,GC,Tem

GIBiotin.1 GGA CAG GAG ATC GCA ATC TCC TGC CCG AAT TYG TAA ATG ATG ATG GCG TCT AAG GAC 57mer,50%,74

GIBiotin.2 GGC AGG CCA TGT TCC GCT GGA TGC GNT TCC ATG AYC TBG GDY TDT GGA CAG GRG A 55mer,55%,79

GIBiotin.3 GGK GAT GAT GAR ATH GTN TCA ACT GAY ATA GAN TTT GAC CCA NCH MGV TTV ACM CAR RT 59mer,38%,75

GIBiotin.4 CCH TCY GAR ATG GAY GTK GGB GAC TAY RTN ATW AGR GTB AAR GAA GGN CTH CCC TCA GG 59mer,45%,79

GIIBiotin.1 GTG AAT GAA GAT GGC GTC GAR TGA CGC YRM YCC ATC KRM TGR KKS YGC HGC C 55mer,50%,77

GIIBiotin.2 CCC ATC TGA TGG GTC CRC AGC CAA CCT CGT CCC AGA GGT CAA CAA TGA GGT TAT GGC 57mer,56,76.8

GIIBiotin.3 CTA TGT TCC CCC AYA TAA TAG TRG ATG TTA GGC AAY TGG AAC CTG TGT TGA TCC CCT TAC C 61mer,45%,73

GIIBiotin.4 GGT TAT GCA GGT GGT TTT GAA GTG CAG GTR ATY CTC GCG GGG AAC GCG TTC ACC G 55mer,56%,76

Table 4. Norovirus GⅠ, GⅡ Probe design

- 33 -

(1) 특이성 검사

바이러스를 정확하게 검출해낼 수 있는지(특이성), 노로바이러스의 genogroup 간의

cross reaction 여부를 확인하기 위해 Dot-blot 방법을 통해 반응 여부를 조사하였다.

노로바이러스 GⅠ에 specific 하게 디자인한 4가지의 probe는 모두 노로바이러스 GⅠ이

spot 된 부분에서만 반응이 일어났으며 GⅡ와 Negative spot에서는 반응이 일어나지 않았

다. 노로바이러스 GⅡ에 specific 하게 디자인한 4가지의 probe 역시 GⅡ이 spot 된 부분

에서만 반응이 일어났으며 GⅠ와 Negative spot에서는 반응이 일어나지 않은 것을 확인

하였고 이 결과는 디자인한 probe의 특이성을 증명해 줄 수 있다 (Fig 27).

Fig 27. GⅠ, GⅡ probe specificity test

(2) 민감도 검사

바이러스 검출이 어느 정도까지 이루어지는지(민감도) 확인하기 위해 Plasmid DNA를 희

석하여 Dot-blot 방법을 통해 농도에 따른 반응 여부를 조사하였다.

모든 디자인된 probe는 0.5 ㎍ 까지 반응이 되었으며 각각의 probe 1,2 번의 경우 0.1 ㎍

에서도 반응이 일어난 것을 확인할 수 있었다. 이 실험 결과로 디자인한 probe들의 반응

에 대한 민감도를 알 수 있었으며 다른 3,4번 probe도 반응시간 조절을 통하여 민감도의

상향을 기대할 수 있을 것으로 예상 된다 (Fig 28).

- 34 -

Fig 28. GⅠ, GⅡ probe sensitivity test

- 35 -

나. 임상샘플에서의 hybridization 방법에 의한 검출

실제 임상샘플과 제작한 probe 간의 hybridization을 알아보기 위해 노로바이러스 양성 GⅠ,

GⅡ sample을 이용하여 Dot hybridization을 실시하였다. 사용한 probe는 앞의 두 실험결과에

서 가장 좋은 결과를 보여준 GⅠBiotin1과 GⅡBiotin1을 사용하였다. 각각 임상시료의 RNA

preparation 후 농도는 GⅠ- 109.2 ng/ul, GⅡ- 124.2 ng/ul 로 측정되었으며 10-1 부터 10-5 까

지 serial dilution 하여 농도를 희석하여 실험을 진행하였다. GⅠ의 경우 희석비율 10-2 까지

GⅡ의 경우 희석비율 10-3 까지 Dot hybridization에 의해 검출이 되는 것을 확인하였다 (Fig

29). 이 결과를 통하여 임상 시료에서도 충분히 Dot blot의 방법을 적용할 수 있을 것으로

예상된다.

Fig 29. Human norovirus GⅠ, GⅡ hybridization test with designed probe

- 36 -

Ⅳ. 결 론

1. 면역학적 방법을 이용하여 노로바이러스의 신속진단을 위한 rVLP 제작 및 이를 이용한

특이성 연구

급성위장관염의 대표적인 원인이 되는 노로바이러스는 로타바이러스와 함께 전 세계적으로 집단감

염을 일으켜 바이러스성 설사병을 유발하고 있다. 현재까지 로타바이러스의 경우 백신이 개발되어

있으나 노로바이러스의 경우 백신이 존재하지 않고 있어 문제점으로 지적되고 있다. 그러므로 노로바

이러스의 경우 급속한 확산을 방지하기 위해 신속한 진단방법의 개발이 시급한 실정이다. 이러한

이유로 현재 노로바이러스의 신속한 검사 및 진단을 위해, 국내외적으로 다양한 형태의 항원항체

반응 진단 키트는 물론 형광면역 반응 키트들이 개발 및 시판되고 있다. 이러한 신속진단 키트의

경우 CDC의 발표에 따르면 50% 이하의 정확성을 보이는 것으로 알려져 있으나 본 연구를 통해

국내외에서 대표적으로 개발 및 시판되고 있는 제품들에 대해 여러 연구자들의 연구보고서들을

확인한 결과 두 가지 형태의 서로 다른 진단 (ELISA와 ICT) 키트들이 비교적 높은 효율의 정확성을

보이는 것으로 보고되고 있었다. 따라서 신속항원검사법은 간편하고 신속하게 결과를 얻을 수 있으면

서 실시간 정량 RT-PCR법과 비교하였을 때 상호 높은 일치률을 보이므로 두 방법을 동시에 사용

할 경우 노로바이러스의 검사효율을 상당히 높일 수 있을 것으로 파악되었다.

(1) 형광유전자인 EGFP 유전자를 이용하여 재조합 베큘로바이러스의 발현성 조사

- 형광유전자인 EGFP 유전자는 reporter gene으로써 재조합 베큘로바이러스의 발현성 조사에

적용하였다.

- 재조합 베큘로바이러스의 게놈 DNA에 삽입된 EGFP 유전자는 바이러스의 증식과 동시에

단백질로 발현하게 됨으로써 형광현미경을 통하여 신속하게 확인할 수 있다. 이는 향후 노로바

이러스 rVLP와 함께 적용할 경우 감염성을 확인할 수 있는 중요한 수단이 될 수 있음을 확인하

였다.

- 대량의 단백질을 생산하고자 할 경우, 총 단백질 생산량은 한계가 있기 때문에 타겟 단백질의

발현양이 감소할 수 있다. 이러한 점을 고려하여 연구 및 개발의 목적에 적합하게 사용하여야

할 것이다.

- 본 연구에서는 발현성을 조사하는 목적으로만 사용하였으며 항체개발의 경우 비교적 많은

- 37 -

양의 단백질을 발현할 필요가 있으므로 EGFP를 포함하지 않는 발현 체계를 사용하였다.

(2) 국내에서 유행한 노로바이러스 capside유전자를 이용하여 rVLP 제작

- 바이러스의 경우 면역원으로 작용하는 최외각 capsid 단백질의 epitope 유전자를 확보하는

것이 가장 중요하다.

- Human 노로바이러스의 capsid 유전자 ORF2(VP1)은 capsid 단백질이 되는 주요한 부분이다.

이 capsid 단백질은 유일하게 환경에 노출되고 노로바이러스의 구조뿐만 아니라 숙주와 면역성

(immunogenicity)과 감염성(infectivity)을 결정함에 중요한 역할을 한다.

- 따라서 본 연구에서는 노로바이러스의 capsid 유전자 ORF2(VP1)를 rVLP 제작을 위하여 베큘로

바이러스 발현시스템에 적용하였으며 이 시스템은 향후 다양한 genotype의 노로바이러스 유전

자 삽입이 가능한 시스템으로 변이주가 빈번하게 발생하는 노로바이러스의 항원·항체 생산에

대응할 수 있는 시스템이 될 수 있을 것이라 예상한다.

(3) rVLP의 순수 분리주 및 고역가 바이러스 확보 및 rVLP 형성 확인

- 베큘로바이러스 시스템을 이용한 VP1 region 유전자의 발현을 항원-항체반응법을 활용하여

확인하였다.

- Size chromatography 방법을 이용하여 순수 분리 및 높은 농도의 항원을 얻었다.

(4) 실험동물을 이용한 단일 또는 다클론 항체형성 조사 및 신속진단 키트로서의 가능성 평가

- rVLP는 항원으로 사용되어 동물모델을 통해 항체를 제작하는데 사용되어졌다.

- 제작한 항체는 ELISA test를 통하여 항원에 대한 민감성 test를 실시하였고 RT-PCR 방법에

의해 양성으로 판명된 임상시료와의 ELISA test 통하여 동일한 검출 결과를 보여주었다.

- 현재 시판중인 노로바이러스 검출 키트와 비교 실험을 진행결과는 100% 증가한 민감도를

보여주어 이번과제 목표에 부합하는 긍정적인 결과를 도출하였다.

- 38 -

2. 분자생물학적 방법 (hybridization)을 이용한 노로바이러스의 특이적 유전자 probe 조사 및 연구

(1) 노로바이러스 genotype에 따른 특이적 유전자 probe 설정

- Probe 디자인을 위해 NCBI, DDBI, EMBL 등의 GenBank를 통해 사람에게 감염되는 노로바이러

스 GenogroupⅠ(GⅠ-1~8), GenogroupⅡ(GⅡ-1~17)의 염기서열을 수집하였다. 전체 게놈

(7.6Kb) 중 VP1 region(conserved region)을 target으로 specific한 염기서열을 분석하였다.

- Hybridization은 membrane 위에 spotting된 probe molecules와 상보적 관계에 있는 target molecule

가 결합하는 과정으로 상보적인 molecule 사이에만 안정한 결합을 이루며, 비 특이적 결합의

경우 post-hybridization(washing) 단계에서 충분히 제거된다.

- 이러한 과정은 반응시간과 온도 조건에 따라서 결과가 크게 좌우된다. 온도조건의 경우 상호결

합력을 위해서는 낮을수록 유리하지만 비 특이적 결합을 방지하기 위해서는 높일 필요가

있다. 따라서 본 연구에서는 70 ℃를 기준하여 probe를 제작하였고, hybridization 과정 시 70

℃를 적용하여 수행하였다.

- Bioin은 비타민 복합체의 하나로 난백에 존재하는 avidin이라고 하는 특정 단백질과 강하게

결합하는 특징을 가지고 있다. Biotin을 probe에 labelling함으로써 detection단계에서

avidin-enzyme complex를 결합시켜 고감도 검출이 용이하도록 하였다.

(2) Hybridization 방법을 이용한 노로바이러스 진단조건 확립 및 dot blot 방법을 이용한 효율검증

- 본 연구에서는 노로바이러스의 염기서열분석을 통해 GenogroupⅠ,Ⅱ을 검출 할 수 있는 각각의

biotin-probe을 개발하였고, dot-blot을 통해 특이성 및 민감도를 비교, 최적의 probe를 선별하였다.

- 특이성 분석 결과 제작된 probe 모두 예상된 지점에서만 spot을 형성하는 것을 알 수 있었다.

- 민감도 분석 결과 GⅠBiotin1, GⅠBiotin2, GⅠBiotin3은 0.1 ㎍의 DNA까지 검출할 수 있었으며,

GⅠBiotin4.은 0.5 ㎍의 DNA를 검출할 수 있었다. GⅡ의 경우 GⅡBiotin1, GⅡBiotin2, GⅡ

Biotin3은 0.1 ㎍, GⅡBiotin4은 0.5 ㎍의 DNA를 검출할 수 있었다.

- 실제 임상 샘플과 제작한 probe 간의 hybridization을 알아본 실험에서는 각각의 GⅠ, GⅡ

임상시료 RNA preparation 후 Dot hybridization에 의해 검출이 되는 것을 확인 하였다.

- 임상 시료에서도 충분히 Dot blot의 방법을 적용할 수 있을 것으로 예상되며 이러한 결과를

바탕으로 노로바이러스 genogroupⅠ,Ⅱ의 진단에 적용할 수 있는 특이성과 민감도를 검증

할 수 있었다.

- 39 -

3. 면역학적 방법과 분자생물학적 방법의 이용가능성 및 신속진단 키트의 적용가능성 평가

면역학적 방법의 경우 임상시료와의 ELISA test를 실시하여 현재 시판중인 노로바이러스 검출

키트와 비교 실험을 진행한 결과 긍정적인 결과를 보여주었다. 이는 향후 이 항체를 이용한 신속진단

키트에 적용할 수 있음을 보여주고 기존 키트보다 향상된 키트가 될 것이라 생각되어진다.

분자생물학적 방법의 경우 sensitivity와 specificity에서 좋은 실험 결과를 보여주었으며 실제 임상

샘플과 제작한 probe 간의 hybridization을 알아본 실험에서 각각의 GⅠ, GⅡ 임상시료 RNA의 낮은

희석비율에서 까지 Dot hybridization에 의해 검출이 되는 것을 확인하였다. 이 결과를 통하여 임상

시료에서도 충분히 Dot blot의 방법을 적용할 수 있을 것으로 예상되며, 이러한 결과를 바탕으로

노로바이러스 genogroupⅠ,Ⅱ의 진단에 적용할 수 있는 특이성과 민감도를 검증할 수 있었다.

- 40 -

Ⅴ. 기대성과

국내에서 발견되어 분리된 노로바이러스 분리주를 이용하여 rVLP를 제작하고 항체를 생산함으로서

국내 특이 type의 노로바이러스에 맞는 진단방법 개발에 대한 연구를 할 수 있음은 물론 국내에 적합한

노로바이러스 유전자형에 대한 신속 진단법 개발 및 더 나아가 백신개발, 국내외 분포하는 출현 가능한

변이주 노로바이러스를 탐지할 수 있는 연구의 활성화에 기여할 수 있을 것이다.

또한 Dot blot 방법을 이용한 노로바이러스 진단법 개발 및 조건의 효율검증을 함으로써 노로바이러스의

정확한 진단 기준을 마련하기 위한 중요한 자료 제시를 함과 동시에 신속진단 또는 검사에 활용 할

수 있을 것이라 생각된다.

본 연구를 통해 개발된 probe 및 hybridization방법은 기존 진단방법에 비해 신속한 검사방법의 기준

제시 및 상용화에 기여할 수 있을 것이며, 본 연구의 결과는 향후 발생할 수 있는 변종 노로바이러스

유전형 진단 등 노로바이러스 오염사고 예방에도 효율적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

- 41 -

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- 42 -

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1 8 . L iu , F ., W u , X ., L i, L ., L iu , Z . & W ang , Z . U se o f b a cu lo v iru s e xp re s s io n s y s tem fo r g e n e ra tio n o f

v iru s - lik e p a rt ic le s : su cce sse s an d ch a lle n g e s . P ro te in e xp re ss io n an d p u rif ica t io n 9 0 , 1 0 4 -1 1 6 (2 01 3 ).

1 9 . 김 현 수 , 김 경 희 , 권 혜 원 , 강 태 영 , 허 미 나 , 김 한 성 , 김 재 석 , 송 원 근 , 강 희 정 , 이 규 만 . 노 로 바 이 러 스 감 염

진 단 을 위 한 신 속 항 원 검 사 법 의 평 가 : 효 소 면 역 검 사 법 (EL ISA ) 및 실 시 간 정 량 역 전 사 중 합 효 소 연 쇄 반 응

검 사 법 과 의 비 교 . Lab M ed O n lin e . 2 0 11 ; V o l. 1 , N o . 4 : 1 8 4 -1 89 .

2 0 . 이 나 리 . 노 로 바 이 러 스 와 식 중 독 . 한 국 식 품 연 구 원 식 품 안 전 성 연 구 본 부 식 품 위 해 평 가 팀 . S a fe Fo od . 2 0 0 7 ;

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2 1 . 식 품 의 약 품 안 정 청 . 노 로 바 이 러 스 식 중 독 예 방 을 위 한 지 침 서 . 20 0 7

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주 의

1. 이 보고서는 국립환경과학원에서 시행한 연구용역과제 결과보고서

입니다.

2. 이 보고서 내용을 발표할 때에는 반드시 국립환경과학원에서

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