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光学活性基幹化学品を

余剰バイオマスから製造する技術

産業技術総合研究所健康工学研究部門

河田 悦和

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研究背景・概略

社会要請 ・余剰バイオマス(バイオエネルギーの生産に伴って、

副生するＣ５糖や廃グリセロール)の利活用

・石油を原料とする化成品の再生資源化

余剰になるには訳がある → 難しい利用

独自の好塩好アルカリ・ハロモナス菌を発見、余剰バイオマスを直接活用を検討、有望な基幹化学品

3-ヒドロキシ酪酸(3HB)の生産手法を開発した。

3

廃グリセロールとは

• バイオディーゼル生産の副生物, 原料油脂に対し10重量％程度生じる.

• 世界で年間100万トン以上生産される.

• 組成

グリセロール 60-65 %

アルカリ触媒 2-3% メタノール 2 %以下

pH 10 - 11

• 用途

現在は 精製グリセロール(コストに難), 廃棄(燃焼など)

将来は Epichlorohydrin, 1,2-propanediol, 1,3-propanediol, Succinic acid, Lactic acid,

Hydrogen, Dihydroxyacetone, Polyesters,

Polyhydroxyalkanoates (PHA バイオプラスチック) と リファイナリー

CH2-COOR1 ＋ CH3OH R1COOCH3 CH2OH

CH -COOR2 ＋ CH3OH R2COOCH3 ＋ CH OH

CH2-COOR3 ＋ CH3OH R3COOCH3 CH2OH

ｱﾙｶﾘ触媒KOH

60～70℃

油脂 ﾊﾞｲｵﾃﾞｨｰｾﾞﾙ廃グリセロールメタノール ﾊﾞｲｵﾃﾞｨｰｾﾞﾙBDF

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木材、ソフトバイオマス糖化液とは

・木材

セルロース C6糖 グルコース

ヘミセルロース C6糖 グルコース C5糖 キシロース、アラビノース

リグニン

・ソフトバイオマス

農業残渣、草本など 主に、セルロース、ヘミセルロースから構成

・糖化手法

化学法 (主に硫酸糖化)

生物分解法 (酵素処理、物理的な前処理が必要)

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PHA (poly-3-hydroxylkanoate) とは

微生物中に蓄えられる

Courtesy: Metabolix & Biomeryより

PHA R PHB - CH3

PHV -CH2CH3

PHBV (Biopol®) - CH3 & CH2CH3

として1990年代に商業化

PHBHx -CH3 & - CH2CH2CH3

PHBO -CH3 & -(CH2)4CH3

O

R

OH

O

H

x

n

PHA の構造

R =Alkyl group

(up to C13)

x = 1 to 3 PHA

Ralstonia eutropha の例

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廃グリセロール利用菌のスクリーニング

培地組成

NaHCO3 16.8 g/l

K2HPO4 0.5

NaNO3 2.5

K2SO4 1.0

NaCl 1.0

MgSO47H2O 0.2

CaCl22H2O 0.04

FeSO47H2O 0.01

EDTA・2Na 0.32 他トレース金属

Glycerol pH 9.0

土壌サンプル

プレート培養 集積培養 水などに懸濁

液体培養 １ 液体培養 ２

分析へ

→ Halomonas sp. KM-1など取得

トリプトン、酵母エキスを含まない

安価な培地で培養

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Halomonas sp. KM-1は

栄養塩と廃グリセロールで培養できる.

Control 1% 3% 5% 10% 15%

副生グリセロール濃度

・pH 調整 なし

・滅菌操作 なし

濁度

60

0n

m

8

Halomonas sp.KM-1によるPHA生産状況

廃グリセロール 10%

乾燥菌体重量 23.4 g/L

PHA の割合 52.8%

グリセロール 10%

乾燥菌体重量 34.8 g/L

PHA の割合 63.6%

滅菌なし、直接添加して48 h培養

9

培養条件改善によるPHA高収率化

0

5

10

15

20

25

10 20 30 40 50 60 70 80

O

D

6

0

0

培養時間

ｸﾞﾘｾﾛｰﾙ10%

ｸﾞﾘｾﾛｰﾙ5%+12h後5% 計10%

ｸﾞﾘｾﾛｰﾙ5%+24h後5% 計10%

0

5

10

15

20

25

30

10 20 30 40 50 60 70 80

P

H

B

m

g

/

m

l

培養時間

ｸﾞﾘｾﾛｰﾙ10%

ｸﾞﾘｾﾛｰﾙ5%+12h後5% 計10%

ｸﾞﾘｾﾛｰﾙ5%+24h後5% 計10%

培養時間

40h 84h

培養時間

炭素源

PHA

content

(wt.%)

CDW

(g l−1)

PHA

concentration

(g l−1)

Volumetric

productivity

(g l−1 h−1)

当初は

160時間

グリセロール

5%

72.4

3.5

0.03

現在は

84時間

グリセロール

計 20%

８６．４

４７．３

１．１４

２．５３

４０．９

研究当初の16倍以上に

10

C5,C6糖利用の検討

→ キシロースとグルコースの代謝は競合しない.

0

5

10

15

20

25

10 15 20 25 30 35 40 45 50

O

D

6

0

0

培養時間 (h)

グルコース 5%

キシロース 5%

グルコース 2.5% + キシロース 2.5%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

10 15 20 25 30 35 40 45 50

P

H

B

%

培養時間 (h)

グルコース 5%

キシロース 5%

グルコース2.5%+キシロース2.5%

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

10 15 20 25 30 35 40 45 50

P

H

B

m

g

/

m

l

培養時間 (h)

グルコース 5%

キシロース 5%

グルコース2.5%+キシロース2.5%

0%

1%

2%

3%

4%

5%

0 10 20 30 40 50

残存糖量%

培養時間 (h)

グルコース 5%

キシロース 5%

混合培養グルコース量

混合培養キシロース量

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木材糖化液の利用

木材糖化液をほぼ利用できる

0

5

10

15

20

25

30

0 20 40

OD

60

0

Culture time (h)

Glucose 5%

Glucose 8%

ダグラスファー50%

Glucose 5%+ダグラス

ファー50%

ユーカリ50%

Glucose 5%+ユーカリ

50%

12

Organism Carbon source

PHA

content

(wt.%)

CDW

(g l−1)

PHA

concentration

(g l−1)

Volumetric

productivity

(g l−1 h−1)

Reference

Halomonas sp. KM-1 廃ｸﾞﾘｾﾛｰﾙ 60.0 24.8 14.9 0.58

本成果 Halomonas sp. KM-1 ｸﾞﾘｾﾛｰﾙ 86.4 47.3 40.9 1.14

Halomonas

boliviensis ショ糖 54.0 14.0 7.7 0.40

Quillaguamán et al.

2007

Alcaligenes latus ショ糖 83.0 14.0 11.5 0.39 Wang and Lee 1997

Azotobacter

vinelandii a グルコース 74.0 10.0 7.5 0.30 Page 1992

Escherichia coli a グルコース 80.8 8.9 7.2 0.15 Lee et al. 1994

Wautersia eutropha H2/CO2 76.0 17.0 13.0 0.18 Heinzle and Lafferty

1980

Wautersia eutropha a グルコース 54.0 9.4 5.1 0.11 Doi et al. 1988

Pseudomonas

oleovorans Octane 25.0 2.0 0.5 0.02 Lageveen et al. 1988

Haloferax

mediterranei

デンプン

67.0

9.7

6.5

-

Lillo and Rodriguez-

Valera 1990;

Rodriguez-Valera

and Lillo 1992 a Cultivation of the microorganism was performed in shake flasks

バッチ培養によるPHA 生産の比較 (shake flasks and fermentors)

生産効率が異なる？

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C2 C3 C4 C5 C6

ヒドロキシ化合物

CH3CH2OH

(エタノール） CH3CH2CH2CH2OH

(n-ブタノール）

HOCH2CH2CH2OH

(1,3-プロパンジオール） CH3CH（OH)CH（OH)CH3

(2,3-ブタンジオール）

HOCH2CH（OH)CH2OH

(グリセリン）

CH2OHCH（OH)CH

（OH)CH2OH

(エリスリトール）

カルボキシ化合物 CH3COOH

(酢酸） CH3CH2COOH

(プロピオン酸） CH3CH2CH2COOH

(酪酸） CH3CH2CH2CH2COOH

(カプロン酸）

HOOCCH2CH2COOH

(コハク酸）

HOOCCH=CHCOOH

(フマル酸） CH2=C(COOH)CH2COOH

(イタコン酸）

CH3CH（OH)COOH

(乳酸） HOOCCH2CH（OH)COOH

(リンゴ酸）

HOOCCH（OH)CH（OH)COOH

(酒石酸） HOOCCH2CH（COOH)CH（OH)COOH

(クエン酸）

CH3CH(OH)CH2CH2COOH

(4-ヒドロキシ吉草酸） （CH3CH(OH)CH2CH2CH2COOH） (5-

ヒドロキシヘキサン酸）

CH2(OH)CH2COOH

(3-ヒドロキシプロピオン酸） （CH2(OH)CH2CH2COOH）

(4-ヒドロキシ酪酸） CH2(OH)CH2CH2CH2COOH

(5-ヒドロキシ吉草酸）

（CH3CH(OH)CH2COOH） (3-ヒドロキシ酪酸）

CH3CH2CH(OH)CH2COOH

(3-ヒドロキシ吉草酸） （CH3CH2CH2CH(OH)CH2COOH）

(3-ヒドロキシヘキサン酸）

CH3COCOOH

(ピルビン酸） HOOCCH2CH2COCOOH

(ケトグルタル酸）

カルボニル化合物 CH3COCH3

(アセトン） CH3CH(OH)COCH3

(アセトイン）

アミノ酸 CH2(OH)CHNH2COOH

(セリン）

CH2CH(OH)CH（NH2）COOH

(スレオニン） HOOCCH2CH2CH(NH2）COOH

(グルタミン酸） H2NCH2CH2CH2CH2CH(NH2）COOH

(リジン）

HOOCCH2CH2（NH2）COOH

(アスパラギン酸）

バイオリファイナリーの出発中間体として期待しうる32化合物 （RITE 湯川氏発表より）

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Halomonas sp. KM-1の

菌体内代謝解析

依頼分析

CE-MSにより、はカチオンモード、アニオンモードの測定を行った。

カチオンモード Agilent CE-TOFMS system

Capillary : Fused silica capillary i.d. 50 μm × 80 cm

測定条件

Run buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)

Rinse buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)

Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 10 sec

CE voltage : Positive, 27 kV

MS ionization : ESI Positive

MS capillary voltage : 4,000 V

MS scan range : m/z 50-1,000

Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)

アニオンモード

測定条件

Run buffer : Anion Buffer Solution (p/n : H3302-1021)

Rinse buffer : Anion Buffer Solution (p/n : H3302-1022)

Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 25 sec

CE voltage : Positive, 30 kV

MS ionization : ESI Negative

MS capillary voltage : 3,500 V

MS scan range : m/z 50-1,000

Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)

190種類の代謝中間体を分析

赤 廃グリセリン

青 グリセリン

廃グリセリンとグリセリンで

代謝が異なる候補は？

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赤 廃ｸﾞﾘｾﾛｰﾙ

青 ｸﾞﾘｾﾛｰﾙ

菌体の内と外で違うものを作る

・内でバイオプラスチックPHA

・外で代謝中間体 も可能か？

Halomonas sp. KM-1の

菌体外分泌物の代謝解析

PHA生合成に関与する代謝解析

190種類の代謝中間体を分析

培地の中に

a-ケトグルタル酸 18.5 g/L

3-Hydroxybutyric acid 0.24 g/L ・ケトン体としてアルツハイマー病等に有効

・光学活性のある化成品中間体

・ポリマーの原料

を分泌していることを発見

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Citrate

Isocitrate

Oxalosuccinate

a-Ketoglutarate

Succinyl-CoA

Succinate

Acetyl-CoA

Oxyaloacetate

Malate

Fumarate

cis-Aconiate

Pyruvate

Phosphoenolpyruvate

好気的条件 嫌気的条件

CO2

CO2

PHB

（R)-3-hydroxybutyryl-CoA

Acetoacetate

Acetoacetyl-CoA

（S)-3-hydroxybutyryl-CoA

（R)-3-hydroxybutyrate

ハロモナス菌の主要な代謝物の蓄積経路

糖など

Glutamate

GABA

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微好気培養による3-ヒドロキシ酪酸(3HB)生産

12時間後

バイオプラスチック

PHB顆粒(3HB原料) 3HB生産した跡

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余剰バイオマス資源からのリファイナリー生産

ゲノム、メタボローム解析終了

→ 安全性確認済み遺伝子改変・突然変異等可能

新しいホワイトバイオテクノロジーのためのインフラとして

バイオリファイナリー生産可能

Halomonas sp. KM-1株好塩、好アルカリ細菌

バイオエタノール関連

木材など

糖化糖化液

高塩、高アルカリ環境ゆえ雑菌の混入がない

滅菌処理不用簡易な設備で培養

(低エネルギー・低コストインフラでの生産可能)

ハロモナスKM-1株は・C5糖キシロース、アラビノースを,

C6 糖グルコースと同時代謝できる.・木材糖化液で培養阻害されにくい

バイオディーゼル工場油脂

バイオディーゼル関連

パームなど

バイオプラスチックPHB

菌体内に蓄積

菌体外に分泌

バイオリファイナリーαケト酸、乳酸など

PHB

PHBP

HB

αケト酸、乳酸など

培養液に対し数%は生産可能

PHB

PHBP

HB

菌体外に分泌

バイオリファイナリー3-ヒドロキシ酪酸

(3-HB)

微好気条件

好気条件

3-HB分解・生成エタノール発酵残液

廃グリセリン直接利用可能

海水利用可能

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従来技術とその問題点

余剰バイオマスの利用は世界的な課題

多くの研究機関で検討実施中

・純粋なグリセロール

・純粋なグルコース、キシロース、アラビノースは利用できるが、夾雑物に対しての抵抗性に難があり、広く利用されるまでには至っていない。

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新技術の特徴・従来技術との比較

• 余剰バイオマス資源(木材等糖化物、廃グリセロール)を直接利用可能(夾雑物抵抗性有り)

• 滅菌処理が不要な省エネルギープロセス

• 薬理活性があり、化成品等原料となる

3-ヒドロキシ酪酸の分泌レベルは世界最高

• 本技術の適用により、原料コスト、ランニングコストが低減できるため、全体のコストの著しい削減が期待される。

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実用化に向けた課題

• 生産規模の拡大について課題有り

• 培養残渣の処理を含めたシステムの精査

• 今後、生産規模の拡大に向け、対象とする余剰バイオマスの策定とともに、実験データを取得し、条件設定を行っていく。

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企業への期待

• 未解決の生産規模、密度については、化学工学的な手法を精査することで克服できると考えている。

• 培養技術、有機酸の精製技術を持つ、企業との共同研究を希望。

• また、バイオマスエネルギーを開発中の企業、余剰バイオマスの有効利用の分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。

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本技術に関する知的財産権

• 発明の名称 ： 3-ヒドロキシ酪酸又はその

塩の産生方法

• 出願番号 ：特願2011-222685

• 出願人 ：産業技術総合研究所

• 発明者 ：河田悦和

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お問い合わせ先

産業技術総合研究所

イノベーションコーディネータ 小高 正人

ＴＥＬ ０２９－８６１－６６８３

ＦＡＸ ０２９－８６２－６０４８

e-mail ｍ.ｋｏｄａｋａ＠ａｉｓｔ.ｇｏ.ｊｐ