がんの浸潤・転移に関わる分子パスウェイの阻害解析

大阪大学基礎工学研究科 齋藤卓

2012/8/8 生命機能数理モデル検討会 第９回

1

2

3

CREST研究内容

初期浸潤過程における細胞内外分子機構の解明

東大医科研との共同研究

位相幾何学（ホモロジー）的不変量を用いた腫瘍組織自動診断

阪大医学部との共同研究

生体磁場による脊髄機能分析法

金沢工大との共同研究

4

初期浸潤過程における細胞内外分子機構の解明

阪大 鈴木貴研究室

東大医科研 市川一寿研究室 東大医科研 村上善則研究室

東大医科研 清木元治研究室

数理モデル, 数理解析 細胞生物学実験

示唆・予測

検証

Outline

5

1. イントロダクション：がんとは？

2. がん浸潤とマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)

3. MMP2活性化の数理モデル

4. 阻害解析

がんとは？

6

がん（悪性腫瘍）とは？

三大成人病の一つ（がん・心臓病・脳卒中）

日本人の死因第一位、三人に一人ががんで亡くなる

遺伝子の突然変異の蓄積によって発生する

主な死因

身体の衰弱 ←腫瘍は無制限に栄養を使い増殖

臓器の機能不全 ←正常組織との置き換え、圧迫

7

がんの進展プロセス

8

血管新生

化学物質、食物、放射線、紫外線、ウィルス

遺伝子突然変異

クローン増殖

原発腫

細胞外マトリックス浸潤

血管内浸潤

転移

腫瘍形成イベント

Hallmarks of Cancer(悪性がん細胞の特徴的な性質)

9

Hanahan D and Weinberg RA, “Hallmarks of cancer : the next generation” Cell, 2011 144(5):646-74.

細胞死に対する抵抗性

増殖シグナルの持続性

抗増殖シグナル回避

浸潤・転移能

無制限の複製能

血管新生誘導

がん浸潤とマトリックスメタロプロテアーゼ

10

上皮細胞

がん細胞

基底膜 基底膜

内皮細胞

血管

転移したがん

原発巣からの離脱

組織間移動

再増殖

転移のプロセス

転移プロセス

11

がん浸潤

12

XX

XX

XX

XX

浸潤は転移の始まり

がん浸潤突起（invadopodia）

細胞外基質(ECM)

間質

13

マトリックスメタロプロテアーゼ

マトリックスメタロプロテアーゼ（Matrix Metalloproteinase; MMP)は、がんの浸潤装置として働く蛋白質分解酵素である

1. 正常組織では殆ど発現せず、細胞ががん化すると発現する

2. 悪性がん細胞の浸潤先端部に発現する

3. がん細胞周囲のコラーゲンを分解しながら、がん細胞が増殖したり運動したりするスペースを作る

4. MMPを転移しないがん細胞に遺伝子導入すると、がん細胞が転移するようになる

がん浸潤におけるECM分解の中心的な役割をする酵素

Seiki, Curr Opin Cell Biol. 2002 14(5):624-32.

MMP family

14

MMP阻害剤(MMPI)

Overall et al. Nature Reviews Cancer 6, 227–239

これまで多くのMMP阻害剤が開発され、臨床試験が行われたが 副作用が強いことから失敗に終わっている

15

MMP阻害剤の問題点

Catalytic domain

MMP

Zn

Collagen I

HPX

Hemopexin domain

多くのMMPIはMMPの触媒ドメインに作用するが、触媒ドメインはMMP familyで保存しているためがんに関係ないMMPまで阻害してしまい、結果副作用が強くなってしまう →解決策 ： 選択性の高い阻害剤の開発 触媒ドメインに作用しない阻害剤の開発

コラーゲン分解のメカニズム

MMP

Zn

Collagen I

HPX

MMPIによる阻害

MMP

Zn

Collagen I

HPX

MMP

Zn

Collagen I

HPX

M MP I

16

MT1-MMPによる（分泌型酵素）MMP2活性化機構

16

• 腫瘍細胞表面で発現, MMP2を活性化 [Sato et. al. Nature. 1994] • MT1-MMP重合体と TIMP2-proMMP2複合体形成 [Strongin et. al. J Biol Chem. 1995] [Imai et. al. Cancer Res. 1996] • MT1-MMPによるproMMP2のprodomain切断 [Deryugina et. al. Exp Cell Res. 2001] • MT1-MMP多量体の生成 [Itoh et. al. EMBO J. 2001] [Lehti et. al. J Biol Chem. 2002] • MT1-MMPとTIMP2の結合 [Zucker et. al. J Biol Chem. 1998] • TIMP2とMMP2結合

[Howard et. al. J Biol Chem. 1991]

Zn

Zn

P

ro

ProMMP-2

MT1-MMP

N

C

Zn

Zn

Active MMP2

TIMP2

コラーゲンIV （基底膜）

運動先進部でMT1-MMPは ProMMP-2 を効率よく活性化する

研究の目的

17

MT1-MMP/TIMP2/MMP2複合体形成過程を記述する数理モデルに対して、阻害解析を行い、最も阻害効率のよい相互作用の同定を行う

効率的な薬剤開発の支援

Zn

Zn

P

ro

ProMMP-2

MT1-MMP

N

C

Zn

Zn

Active MMP2

TIMP2

MMP2活性化の数理モデル

18

MMP2活性化過程の複合体形成反応

19

Zn

Zn

Zn

dimerization

TIMP2 binding

MMP2 binding

N

C

Zn

N

C

Zn

Zn

N

C

Reaction 1

Reaction 2

Reaction 3

MT1_MT1MT1 MT1

11

11

MTMT

MTMT

kd

ka

MT1_TIMP2 TIMP2 MT1

21

21

TMT

TMT

kd

ka

TIMP2_MMP2 MMP2 TIMP2

22

22

MT

MT

kd

ka

MMP2活性化過程の複合体形成反応

20 Z

n

Zn

ProMMP-2

N

C

Zn

Zn

Active MMP2

Zn

Zn

Zn

dimerization

Zn

Zn

N

C

TIMP2 TIMP2 binding

Zn

Zn

N

C

Zn

Zn

Zn

Zn

N

C

MMP2 binding

N

C

Zn

N

C

Zn

Zn

N

C

Z

n

Scenario 1

Scenario 2

Zn

MMP2活性化過程の複合体形成パスウェイ

MT1 T2 M2

MT1_T2

MT1_T2_M2

T2_M2 MT1_MT1

MT1_MT1_T2

MT1_MT1_T2_M2 MT1_T2_MT1_T2

MT1_T2-MT1_T2_M2

MT1_T2_M2_MT1_T2_M2

Lines indicate possible connections between parent and daughter species.

Monomer

Dimer

Trimer

Tetramer

Pentamer

Hexamer

21

阻害解析

23

制御解析：阻害の効率を定量化する方法

応答係数 Inhibition of enzymatic reaction

Mathematical description of stationary state

Inhibition = K↗

K

K

F

F

K

FR

ln

ln

mKKFF ,...,1EI

I

ESSE

E : Enzyme S : Substrate I : Inhibitor

,][][

][][

,][][

][][

T

T

ESK

KEIE

ESK

SES

1][

1 IK

I constantmequilibriuSE: K

constantmequilibriuIE: IK

目的関数（定常状態）

平衡定数Kの微小変化に対するFの反応の度合いを測る量

Sの反応に関わるE濃度

Sの反応に関わらないE濃度

24

制御解析結果：Simple model

ESSE

.][][

][][ T

T

T ESK

SES

T

ES

SK

K

K

ESR

][ln

]ln[

-1

-0.9

-0.8

-0.7

-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0

0.1 10 1000 100000

The

resp

on

se c

oef

fici

ent

R

Equilibrium constant K [nM]

K dependence of R

[S]_T=10000nM

[S]_T=1000nM

[S]_T=100nM

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1 10 100 1000

[ES]

(n

orm

aliz

ed

)

Total inhibitor concentration [I] _T [nM]

Inhibitor dependence of [ES]

K=10nM

K=100nM

K=1000nM

Linear

TT SE ][][

応答係数

Non-linear

nMIC 72.5950

nMIC 89.6750

nMIC 20.5350

Kが大きいほうが阻害効率が良い

25

制御解析結果：multi-branched pathway

Linear

応答係数

Non-linear

Kが大きいほうが阻害効率が良い

26

321321

321321

AAAAAA

AAAAAA

,1

~1

,1

~1

,1

~

~

,1

~1

,1

~1

,1

~

~

,1

~

~

,1

~

~

2

2

2

1

2

1

2

223

2

1

23

1

2

12

2

1

112

1

2

2123

2

1

1123

1

KR

KR

K

KR

KR

KR

K

KR

K

KR

K

KR

)~

(123123

iii KRR

)~

(2323

iii KRR

)~

(1212

iii KRR

)~

(22

iii KRR

-1

-0.9

-0.8

-0.7

-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0

0.01 1 100 10000

R^1

23

_1

K_1 [nM]

K_2=100nM

K_2=1nM

K_2=0.01nM

TTT AAA ][,][][ 312

応答係数の独立性が成立

,~ln

]ln[,~

ln

]ln[,~

ln

]ln[ 112112321123

i

i

i

i

i

iK

AR

K

AAR

K

AAAR

MMPモデル

MT1 T2 M2

MT1T2

MT1T2M2

T2M2 MT1MT1

MT1MT1T2

MT1MT1T2M2 MT1T2MT1T2

MT1T2MT1T2M2

MT1T2M2MT1T2M2

Ka(MT1-MT1) 2/uM/s assume

Kd(MT1-MT1) 0.01/s assume

Ka(MT1-T2) 2.74/uM/s Toth2000

Kd(MT1-T2) 0.0001/s Toth2000

Ka(T2-M2) 0.14/uM/s Olson1997

Kd(T2-M2) 0.0047/s Olson1997

MT1-MMP 100nM

TIMP2 50nM

MMP2 100nM

Rate constants Concentrations

27

制御解析結果：MMP model

-1

-0.9

-0.8

-0.7

-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0

0.01 0.1 1 10 100 1000 10000

Res

po

nse

co

effi

cien

t

K [nM]

Response coefficient of [MT1MT1T2M2]

R_MT1MT1

R_MT1T2

R_T2M2

22

22

21

21

11

11

ln

]2211ln[

ln

]2211ln[

ln

]2211ln[

MT

MT

TMT

TMT

MTMT

MTMT

K

MTMTMTR

K

MTMTMTR

K

MTMTMTR

応答係数の独立性

)(

)(

)(

222222

212121

111111

MTMTMT

TMTTMTTMT

MTMTMTMTMTMT

KRR

KRR

KRR

平衡定数の大きい反応が最も阻害の効率が良い : T2-M2結合反応

応答係数

Reaction K R

MT1MT1 5nM -0.095

MT1T2 0.548nM -0.0024

T2M2 33.5714nM -0.15

28

結論

複合体形成反応に対して、反応係数を導入し、制御解析を行った

分岐のあるパスウェイネットワークモデルでは、反応係数の独立性が成り立っていることを示した

MT1-MMP/TIMP2/MMP2複合体形成モデルでは、T2-M2結合反応の阻害を行うことがMMP2活性化の阻害に最も効率的であることが解析からわ

かった

29

Zn

Zn

P

ro

ProMMP-2

MT1-MMP

N

C

Zn

Zn

Active MMP2

TIMP2