ozm rad

Univerzitet u Niu Prirodno-matematiki fakultet

Departman za hemiju

Validacija gasno-hromatografskih metoda za odreivanje organskih zagaivaa

Master rad

Mentor: Autor: Dr Violeta MIti Bojana Stojanovi

Ni, 2015.

O - M

, :

, :

, :

, : / , :

, :

, :

, : -

, :

, :

, : .

, : .

, : 2015. , :

, : , 33. , : (// ////)

6 / 63 / 13 / 42 , :

, :

/ , : (), ,

, ,

, :

, :

, :

-

-

. .

.

-

"QuEChERS" / .

.

. , : 15.01.2014.

, :

, : :

:

, :

Q4.09.13 - 1

-

KEY WORDS DOCUMENTATION Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph Type of record, TR: textual / graphic Contents code, CC: University master degree thesis Author, AU: Bojana Stojanovi Mentor, MN: Violeta Miti Title, TI: Validation of the gas-chromatographic method for the

determination of organic contaminants

Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2015. Publisher, PB: authors reprint Publication place, PP: Ni, Viegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

Chapter 6/ 63 pages / 13 tables / 42 images Scientific field, SF: Chemistry Scientific discipline, SD: analytical chemistry Subject/Key words, S/KW: Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), validation of

analytical methods, gas chromatography, mass spectrometry

UC

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: In this master work was performed validation of the gas-chromatographic methods with the aim of selecting appropriate recording methods for the quantification of PAHs. It was perfomed the validation of the SCAN and SIM mode. For the purposes of analysis were used two models of sample. PAHs from the soil sample were extracted with acetonitrile, "QuEChERS" extraction, and quantified by GC / MS analysis. The results showed that, for the purposes of quantifying, adequate was SIM mode. It is characterized by the highest recovery value and the lowest value for the relative standard deviation.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 15.01.2014. Defended on, DE:

Defended Board, DB: President:

Member:

Member, Mentor:

Q4.09.13 - 1

Eksperimentalni deo ovog master rada je uraen u labaratorijama Departmana za hemiju Prirodno - matematikog fakulteta u Niu.

elim da se zahvalim svojoj mentorki, profesorki dr Violeti Miti, vanrednom profesoru na Departmanu za hemiju Prirodno - matematikog fakulteta Univerziteta u Niu, na ukazanoj

pomoi prilikom definisanja teme rada, njenih teorijskih okvira i tokom organizovanja izvoenja eksperimentalnog rada. Takoe, zahvalila bih se i profesorki dr Vesni Stankov Jovanovi na

savetima i sugestijama pri pisanju rada. Neizmernu zahvalnost dugujem i doktorantima Mariji Dimitrijevi i Jeleni Cvetkovi, na

nesebinoj pomoi prilikom izrade eksperimentalnog dela ovog diplomskog rada. Srdano se zahvaljujem i svojoj porodici i prijateljima na bezgraninoj podrci tokom studija i

izrade masetr rada.

1

Sadraj 1. Uvod ............................................................................................................................................ 2 2.Teorijski deo ............................................................................................................................... 4

2.1. Policiklini aromatini ugljovodonici (PAU, PAH) ........................................................ 5 2.1.1. Definicija i struktura PAHova ................................................................................. 5 2.1.2. Osobine PAHova ....................................................................................................... 9 2.1.3. Mehanizam formiranja PAHova ........................................................................... 10 2.1.4. Prisustvo PAH-ova u ljudskom okruenju ............................................................. 11 2.1.5. Toksinost PAH-ova ................................................................................................. 12 2.1.6. Metabolizam PAH-ova ............................................................................................. 13

2.2. Validacija analitikih metoda ......................................................................................... 15 2.2.1. Specifinost/selektivnost ........................................................................................... 16 2.2.2. Linearnost .................................................................................................................. 16 2.2.3. Analitiki opseg metode (radno podruje) ............................................................. 17 2.2.4. Preciznost ................................................................................................................... 17 2.2.6. Granica detekcije/kvantifikacije.............................................................................. 20 2.2.7. Robusnost................................................................................................................... 21

2.3. Metode pripreme uzorka ................................................................................................. 22 2.4. Metode analize PAH-ova ................................................................................................. 26

2.4.1. Gasna hromatografija (GC) ..................................................................................... 26 2.4.2. Masena spektrometrija ............................................................................................. 28

3. Eksperimentalni deo ............................................................................................................... 32 3.1. Faze eksperimentalnog rada ........................................................................................... 33 3.2. Aparati .............................................................................................................................. 33 3.3. Pribor ................................................................................................................................ 33 3.4. Reagensi ............................................................................................................................ 33 3.5. Priprema uzoraka zemljita za anlizu primenom QuEChERS ekstrakcije ............... 34 3.6. Priprema serije standardnih rastvora smee PAH-ova za izradu kalibracione prave................................................................................................................................................... 35 3.7. Parametri metode............................................................................................................. 36 3.8. Obrada rezultata .............................................................................................................. 38

4. Rezultati i diskusija................................................................................................................. 42 5. Zakljuak ................................................................................................................................. 61 6. Literatura................................................................................................................................. 63

2

1.Uvod

3

Intenzivna urbanizacija, razvoj industrije, saobraaj i poljoprivredne delatnosti dovode do prekomernog zagaenja ivotne sredine, ukljuujui i zemljite. Optereenje povrinskih slojeva zemljita velikim koliinama otpadnih materija koje se ne mogu razgraditi procesima samopreiavanja dovodi do degradacije zemljita i poremeaja normalnih procesa u njemu, sa negativnim posledicama po ekosistem i zdravlje ljudi.

Sastav i sanitarno stanje zemljita direktnim, ali i indirektnim uticajem preko zagaenja povrinskih i podzemnih voda, vazduha i ivotnih namirnica predstavlja faktore od znaaja za zdravlje populacije.

Organski zagaivai koji nastaju pre svega kao posledica ljudske aktivnosti obuhvataju grupu brojnih jedinjenja razliite strukture i fiziko-hemijskih osobina. Svrstani su u grupu perzistentnih organskih zagaivaa, koja se dalje moe podeliti na podgrupe u koje spadaju: pesticidi (dihloro difenil trihloroetan DDT, heksabromo bifenil i heksahloro cikloheksan HCH, hlordan, endrin, heptachlor, aldrin, heksahloro benzene HCB); organski halogeni derivati (polihlorovani bifenili PCBs, heksahloro benzene HCB, polihlorovani dibenzo-p-dioksini/ dioksini/ - PCDDs, polihlorovani dibenzo-p-furani/ furani/ - PCDFs); i policiklini aromatini ugljovodonici.

Policiklini aromatini ugljovodonici PAU, (Polycyclic aromatic hydrocarbons PAH), su najzastupljeniji organski polutanti koji predstavljaju hemijska jedinjenja sa dva ili vie kondenzovanih benzenovih prstenova, koji ne sadre hetero atome niti su supstituisani. Formiraju se u procesu nepotpunog sagorevanja uglja, nafte, gasa, drveta, otpada i drugih organskih materija.

U zemljitu veina PAH-ova je snano sorbovana na organskoj materiji, to ih ini relativno nedostupnim za procese degradacije, pa stoga PAH-ovi mogu ostati u zemljitu tokom nekoliko vekova, to predstavlja dugoronu opasnost za ivotnu sredinu.

Analiza policiklinih aromatinih ugljovodonika i njihovih proizvoda degradacije u uzorcima emljita, obuhvata primenu velikog broja metoda kako u pripremi uzoraka za analizu, tako i za njihovo odreivanje. Njihova identifikacija veoma je sloena, a praenje niskih koncentracija u nekim sluajevima nalae primenu veoma osetljivih analitikih tehnika, gasne hromatografije (GC), tene hromatografije visokih performansi (HPLC), superkritine tene hromatografije (SPF), kapilarne elektorforeze. GC metoda sa masenom spektrometrijom ima primat u ispitivanjima, zbog vee selektivnosti i osetljivosti u odnosu na druge metode analize.

Cilj rada bio je da se validiraju odgovarajue metode za kvantifikaciju policiklinih aromatinih ugljovodonika u zemljitu primenom GCMS metode. Za analizu su korieni PAH-ovi koje Evropska Unija propisuje kao vane pokazatelje zagaenja ivotne sredine: antracen, acenaften, benzo[a]antracen, benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[ghi]perilen, benzo[k]fluoranten, krizen, dibenzo[a,h]antracen, fluoranten, fluoren, naftalen, fenantren, piren.

4

2.Teorijski deo

5

2.1. Policiklini aromatini ugljovodonici (PAU, PAH)

2.1.1. Definicija i struktura PAHova

Policiklini aromatini ugljovodonici (PAU, PAH) su grupa sloenih organskih jedinjenja koja sadre dva ili vie kondenzovana aromatina prstena. Po definiciji, PAHovi sadre samo atome ugljenika i vodonika, meutim poto se ugljenikovi atomi u benzenovim prstenovima mogu lako supstituisati atomima azota, sumpora i kiseonika u i na taj nain formirati hetericiklina aromatina jedinjenja sva i na taj nalin nastala jedninjenja zajedniki su grupisana pod nazivom policiklini aromatini ugljovodonici.

Ova grupa hemjskih jedinjenja sadrzi preko 100 razliitih PAHova iji kondenzovani prstenovi mogu biti postavljeni u linearnom, ugaonom ili loptastom rasporedu. Fiziko hemijske osobine su u korelaciji sa brojem prstenova dok male razlike u svakom homologom prstenu mogu biti pripisane meusobnom rasporedu prstenova (Lundstedt S., 2003.).

PAHovi se detaljno prouavaju zbog svoje toksinosti, perzistentnosti a sve sa ciljem zatite ivotne sredine. Takve studije su esto zasnovane na kvantifikaciji 16 PAHova oznaenih kao prioritetnim zagaivaimae od strane Agencije za zatitu ivotne sredine (eng. Environmental Protection Agency, EPA). Njihovi nazivi i strukturne formule prikazani su u Tabeli 1.

Tabela 1: Prioritetni policiklini aromatini ugljovodonici

8

Fenantren i antracen su najprostiji PAHovi, sainjeni od po tri kondenzovana prstena. Najee se susreu PAHovi sa po pet ili est kondenzovanih aromatinih prstenova. PAHovi koji sadre pet ili vie od pet aromatinih prstenova se nazivaju tekim PAHovima (heavy PAHs), a oni sa manje od pet prstenova su laki PAHovi (light PAHs). lanovi obeju grupa su nepolarna jedinjenja sa izrazitim lipofilnim karakterom, sa tim to su teki PAHovi stabilniji i toksiniji u odnosu na lake. Zbog dostupnosti uzoraka malih PAHova, istraivanja se uglavnom izvode na njima.

9

2.1.2. Osobine PAHova

Fiziko hemijska svojstva u velikoj meri odreuju ekoloko ponaanje PAHova, toksinost i njihov uticaj na bioloke sisteme. Iako se fiziko hemijske karakteristike svakog pojedinanog jedinjenja koje se sastoji od dva ili vie kondenzovana aromatina prstena meusobno znatno razlikuju, njihova zajednika osobina, polu ili laka isparljivost, ini PAH-ove visoko mobilnim kroz ivotnu sredinu. PAH-ovi se transportuju kroz vazduh na velike udaljenosti i zato prisustvo PAH-ova u atmosferi predstavlja univerzalni, globalni problem. Osnovne fiziko hemijske karakteristike 16 prioritetnih PAHova prikazane su u Tabeli 2. Moe se uoiti da vrednosti fiziko-hemijskih konstanti variraju i po nekoliko redova veliine za razliite pripadnike ove grupe jedinjenja.

PAHovi u vrstom stanju su bele, ute, bledo zelene boje, ali mogu biti i bezbojni. Odlikuju se karakteristinim UV spektrima koji pruaju mogunost njihove kvantifikacije, otpornou na fotorazgradnju, a u pobuenom stanju mogu da fluoresciraju. Imaju visoku taku kljuanja i malu vrednost napona pare, ali i pri takvim vrednostima, PAHovi mogu isparavati i lako se transportovati na velike udaljenosti kroz atmosferu.

Generalno PAHovi su lipofilne materije sa poveanim afinitetom prema organskoj materiji. Slabo se rastvaraju u vodi dok je njihova rastvorljivost u organskim rastvaraima znatno bolja. Sa porastom molekulske mase rastvorljivost u vodi opada a raste stabilnost molekula. Zbog tih karakteristika molekuli sa veom molekuskom masom vie su zastupljeni u zemljitu nego u vodi i atmosferi (Lundstedt S., 2003.).PAHovi su hemijski inertna jedinjenja, a mogu da podeu reakcijama elektrofilne supstitucije i adicije.

10

Tabela 2: Fizike osobine policiklinih aromatinih ugljovodonika

2.1.3. Mehanizam formiranja PAHova

Policiklini aromatini ugljovodonici predstavljaju najstabilniji oblik ugljovodonika, a poto imaju mali odnos atoma vodonika i ugljenika najee se javljaju u kompleksnim meavinama, pre nego kao izdvojena jedinjenja (Ravindra et al., 2008.).

Policiklini aromatini ugljovodonici se formiraju tokom termalne razgradnje organske materije koja dominantno sadri ugljenik i vodonik, u procesima pirolize i nepotpunog sagorevanja. Iako PAH-ovi dospevaju u ivotnu sredinu i prirodnim putem, poarima i vulkanskim erupcijuama, smatra se da najvei doprinos prisustvu PAH-ova u ivotnoj sredini daju antropogene aktivnosti.

11

PAH-ovi se relativno lako u laboratorijskim uslovima sintetiu iz zasienih ugljovodonika u anaerobnim uslovima. Pirosinteza i piroliza su dva glavna mehanizma koja mogu objasniti formiranje poliiklinih aromatinih ugljovodonika (Gaga i Tuncel, 2003; Ravindra et al., 2008.). Nii ugljovodonici (poput metana, etana) formiraju PAH-ove pirosintezom. Kada temperatura pree 5000C, raskidanjem ugljovodonine i ugljeninih veza formiraju se slobodni radikali. Radikali se kombinuju do acetilena, koji se dalje kondenzuje sa aromatinim prstenastim strukturama otpornim na termalnu degradaciju. Slika 1 ilustruje formiranje policiklinih aromatinih ugljovodonika, sa etanom kao poetnim jedinjenjem.

Slika 1. Pirosinteza PAH-a sa etanom kao poetnim jedinjenjem (Ravindra et al., 2008)

2.1.4. Prisustvo PAH-ova u ljudskom okruenju

PAH-ovi kao jedna od najrasprostranjenijih grupa organskih zagaivaa mogu se nai u vazduhu, vezani za estice praine, rastvoreni u vodi, biljkama i hrani. Neki PAH-ovi se koriste u industriji boja, plastike i pesticida. Mogu se nai i u asfaltu, sirovoj nafti, uglju, ai i katranu.

PAH-ovi u ivotnu sredinu dospevaju iz prirodnih i antropogenih izvora. Najznaajniji prirodni izvori PAH-ova su vulkanska aktivnost i umski poari. Znatne koliine PAH-ova se emituju iz antropogenih izvora. Ovako formirani PAH-ovi se akumuliraju u vodi, vazduhu i zemljitu, a kroz lanac ishrane dospevaju do oveka.

U vazduhu, PAH-ovi se nalaze u obliku estica i u gasovitoj fazi. Koncentracija PAH-ova u vazduhu varira od 5 do 200000 ng/m3. Deo PAH-ova se u povrinskim vodama vezujeza suspendovane estice, a deo se dalje transportuje procesom isparavanja. Njihova koncentracija u vodi je jako mala (do 100 ng/L), zbog niske rastvorljivosti u ovoj sredini, pa je to glavni razlog akumulacije PAH-ova u zemljitu i vodenim organizmima.

12

Unutar zemljita veina PAH-ova biva snano sorbovana na organskoj materiji, to ih ini relativno nedostupnim za procese degradacije, pa stoga PAH-ovi mogu ostati u zemljitu tokom nekoliko vekova. To predstavlja dugoronu opasnost za ivotnu sredinu, iako su se PAH-ovi male molekulske mase delimino izbubili kroz process degradacije, pretvaranjem u paru i luenjem. Efekat sorpcije se generalno poveava kako broj benzenovih prstenova u molekulu PAH raste, jer to podrazumeva veu lipofilnost. Dokazano je da se razgradnja i mogunost ekstrakcije organskih jedinjenja u tlu poveava sa produivanjem vremena kontakta PAH-ova sa tlom, i to predstavlja fenomen nazvan starenje. Starenje je uglavnom rezultat spore difuzije u organskoj materiji zemljita, ali i drugih mehanizma koji se odvijaju pri formiranju vezanih ostataka i fizikih klopki unutar mikropora u tlu. Procese sorpcije i starenja limitira sa jedne starne razgradnja zagaivaa, a sa druge strane, ovi procesi smanjuju toksinost zagaivaa, smanjujui nivo zagaivaa dostupan ivim organizmima (Lundstedt S., 2003.).

Koncentracije PAH-ova kao sve prisutnijih zagaivaa dosta variraju u zavisnosti od okoline. Koncentracije su generalno vee u blizini izvora emisije poput proizvodnje ili upotrebe fosilnih goriva, ili proizvoda dobijenih iz fosilnih goriva, kao to su katran ili kerozin.

Istraivanjem je ustanovljeno da su najvei prirodni izvori PAH-ova sagorevanje vrstog goriva u domainstvima i toplanama u toku zimskog perioda. Veina studija ukazuje da emisije izduvnih gasova motornih vozila koje potiu od sagorevanja dizela, kao i olovnog i bezolovnog benzina, najvie doprinose koncentracijama PAH-ova u urbanim sredinam. Opta populacija je svakodnevno izloena aktivnoj ili pasivnoj inhalaciji duvanskim dimom, koji kao produkat sagorevanja cigarete sadri PAH-ove.

Velika kolilina PAH-ova moe nastati i pri procesima prerade hrane, kao to su dimljenje i suenje, kao i kuvanje, rotiljanje i peenje. Ve na temperarurama veim od 200 0C, pirolizom masti dolazi do formiranja PAH-ova, a na temperaturama viim od 5000C, veze ugljenik-vodonik i ugljenik-ugljenik se kidaju uz formiranje radikala koji kao krajnji proizvod reakcija mogu da nagrade PAH-ove. Druge organske supstance prisutne u hrani, kao to su proteini i ugljeni hidrati, pirolizom mogu doprineti formiranju PAH-ova, dok se piroliza masti smatra glavnim izvorom nastanka PAH-ova. Tokom termike obrade mesa na rotilju osim koliine masti u mesu, znatan uticaj na formiranje PAH-ova ima blizina plamena. Neka istraivanja ukazuju na prisustvo ovih jedinjenja u hrani koja nije termiki obraena. Najee prisutan PAH u uzorcima hrane je benzo[a]piren, pa je njegova koliina odlian indikator za zagaenost hrane PAH-ovima.

2.1.5. Toksinost PAH-ova

Policiklini aromatini ugljovodonici su sveprisutni u atmosferi i jedni su od prvih polutanata koji su identifikovani kao visoko kancerogeni, toksini i mutageni. Neki od PAH-ova imaju dokazane kancerogene i/ili mutagene karakteristike, tako da je prisustvo i ponaanje

13

policiklinih aromatinih ugljovodonika u urbanim i industrijskim oblastima postao neophodan i imperativan predmet istraivanja (Venkataraman et al., 1999.). Najznaajniji metabolit banzo[a]pirena je benzo[a]piren-7-8-diol-9,10-epoksid, koji ima jako izraeno kancerogeno dejstvo zbog interakcije sa proteinima ili DNK. Ipak, samo se nekoliko policiklinih aromatinih ugljovodonika (PAH sa etiri, pet i est aromatinih prstenova) smatra veoma aktivnim kancerogenim supstancama. Sa poveanjem molarne mase raste i kancerogenost PAH-ova, dok se akutna toksinost smanjuje (Purcaro et al., 2013).

Imajui u vidu da su PAH-ovi prisutni u vazduhu, vodi, zemljitu i hrani, glavni naini unoenja ovih jedinjenja u organizam su respiratorni i peroralni dok je unoenje dermalnim putem slabije izraeno. Efekti na ivi svet su raznovrsni. Oni utiu na rast, razvoj, metabolizam, izazivaju formiranje i razvoj tumora, dovode do akutne toksinosti, razvojne i reproduktivne toksinosti, citotoksinosti i genotoksinosti. Kada se PAH-ovi nau u organizam, dospevaju u limfu i krv i metaboliu se u jetri i bubrezima (Agency for Toxic Substances and Disease Registry, 2009).

Nesupstituisani PAH-ovi nisu originalna jedinjenja koja reaguju sa DNK. PAH-ovi zahtevaju metabolitiku aktivaciju i konverziju da bi pokazali svoja genotoksina i kancerogena svojstva. To se deava jer se PAH-ovi metaboliu u viim organizmima. Oni se ne akumuliraju na isti nain kao i neka druga lipofilna organska jedinjenja. Umesto toga, oni se konvertuju u forme koje su u vodi rastvorne, to olakava njihovu naknadnu ekstrakciju iz organizama. Naalost, to moe da dovede do formiranja reaktivnih intermedijera koji mogu reagovati sa DNK i formirati adukte koji spreavaju normalno funkcionisanje gena i izazivaju pojavu karcinoma.

2.1.6. Metabolizam PAH-ova

PAH-ovi ispoljavaju karcinogenu aktivnost nakon transformacije u hemijski reaktivne intermedijere koji mogu kovalentno da se vezuju za elijske makromolekule (DNK) i tako dovedu do mutacija i inicijacije tumora. Reaktivni proizvodi metabolizma PAH-ova su epoksidi, dihidrodioli, fenoli i hinoni. Diolni epoksidi se lako konvertuju do karbonijum jona koji je mutagen i inicijator karcinogeneze.

Preduslov za konverziju u diolne epokside je prisustvo citohroma P-450 i drugih odgovarajuih enzima, pa se karcinogeni potencijal PAH-ova moe predvideti na osnovu stepena indukcije ovih enzima. Od posebnog znaaja za metabolizam PAH-ova je indukcija arilhidrokarbon hidrolize (AHH). Indukcijom ovog enzima od strane benzo(a)pirena, formira se reaktivni intermedijer, 7,8-dihidrodiol, koji je identifikovan u toku epitela koe. Vezivanjem za Ah receptor dolazi do ekspozicije Ah gena i indukcije enzima citohrom P-450 oksidaza. Smatra se da je nastajanje tumora kod ljudi upravo vezano za navedene mehenizme. Mehanizam dejstav benzo[a]pirena prikazana je na Slici 2 (Lundstedt S., 2003.).

14

Slika 2. Metabolotika aktivacija benzo[a]pirena

15

2.2. Validacija analitikih metoda

Osnovni zadatak svake analitike laboratorije je postizanje brzih, tanih i verodostojnih rezultata analize. Zbog toga je potrebno opisati analitike metode u onom obliku i opsegu kako bi se njenom primenom mogli da dobiju tani i pouzdani rezultati. Najbolji nain izbegavanja problema tokom primene metode je validacija analitike metode. Iako se samom validacijom ne mogu predvideti svi problemi koji se mogu javljati tokom primene metode, postupci razvoja i validacije metode upuuju na one najee.

Validacija analitikih metoda predstavlja postupak kojim se osiguravaju tani, precizni i reproduktivni rezultati tokom dugoronog korienja metode. Takoe, validacijom se mogu utvrditi uzroci moguih problema prilikom izvoenja metode, ime se postie veliki stepen pouzdanosti i pogodnosti metode.

Osnovna naela validacije prilikom razvoja metode svi savesni analitiari su primenjivali i davno pre, jer je to ono to nalae struka i logika rada u analitikoj laboratoriji. Meutim, tada se taj postupak nije nazivao validacijom analitikih metoda i nije bilo propraen danas potrebnom, temeljnom i opsenom dokumentacijom. Meutim, validaciju analitikih metoda ne treba prvenstveno smatrati kao regulatorni zahtev, ve kao proveru postupka analitike metode.

Analitike metode se trebaju validovati, verifikovati ili revalidovati prilikom razvoja i uvoenja nove metode promene bilo kojeg dela analitike metode koja je ve bila validirana

pri promeni parametara metode koji su izvan izvornoga opsega postojee metode poboljanje i prilagoavanje postojee metode prenoenje metode u drugu laboratoriju prenoenje metode na drugi instrument

Koraci validacije ukljuuju izradu validacionog protokola sa podrobnim uputstvima, i definiciju svrhe i opsega korienja metode definisanje parametara izvoenja i njihovih granica prihvatljivosti definisanje validacionih eksperimenata definisanje svojstava opreme, kvaliteta hemikalija i analitikih standarda izvoenje predvalidacionih ispitivanja u cilju prilagoavanja granica prihvatljivosti izvoenje validacionih eksperimenata definisanje detalja metode za njenu uobiajenu primenu definiranje parametara i granica testa prikladnosti sastava dokumentovanje validacionih eksperimenata i izrada validacionog izvetaja.

16

Optimalni redosled izvoenja validacionih eksperimenata zavisi od same metode, no najee se primenjuje sledei raspored kojim se odreuje

specifinost/selektivnost linearnost analitiki opseg metode (radon podruje) preciznost

- ponovljivost (eng. repeatability) - meupreciznost (eng. intermediate precision) - reproduktivnost (eng. reproducibility)

tanost (rikaveri vrednost) granica kvantifikacije granica detekcije robusnost

Kombinacijom ovih parametara oblikuje se plan validacije za svaku metodu.

2.2.1. Specifinost/selektivnost

Specifinost/selektivnost je svojstvo metode da tano i specifino odredi eljeni analit u prisustvu ostalih komponenata u matriksu uzorka pod utvrenim uslovima ispitivanja. Iako se u praksi esto poistoveuju, specifinost i selektivnost su dva razliita svojstva metode. Specifina metoda je ona kojom se moe odrediti samo jedan specifian analit (instrumentalni signal daje samo jedan analit). Metoda kojom se moe odreivati vie komponenata istovremeno, ali pod uslovom da te komponente pri odreivanju ne smetaju jedna drugoj, naziva se selektivnom. U praksi samo mali broj analitikih metoda daje odgovor na samo jedan analit, zato formu selektivnosti mnogo ee koristimo od specifinosti. Nain prikazivanja rezultata zavisi od karakteristike metode koja se koristi u navedenu svrhu.

2.2.2. Linearnost

Linearnost predstavlja mogunost da se metodom, unutar radnog opsega koncentracije analita, dobije linearna zavisnost analitikog signala od koncentracije analita. Opseg linearnosti zavisi od prirode analita i tipa detektora. U praksi se linearnost odreuje merenjem odziva metode na razliite poznate koncentracije referentnog materijala (preporuuje se najmanje pet koncentracija uz tri ponavljanja). Procenjuje se matematiki i grafiki.

Matematiki nain procene se vri na taj nain to se primenom linearne regresije izrazi jednaina pravca (y = ax + b) i izrauna koeficijent korelacije (r). Nagib pravca (a) parameter je koji ukazuje na osetljivost metode. to je vea vrednost nagiba pravca metoda je osetljivija. Odseak pravca (b) moe ukazivati na sistematsku greku. Za koeficijent korelacije obino se postavlja kriterijum r 0,99. Za vrlo niske koncentracije prihvata se uslov r 0,98.

17

Najee se upotrebljavaju dva naina grafikog prikaza: grafiki prikaz odstupanja od regresijskog pravca u odnosu na koncentracu ili logaritam koncentracije za linearna podruja odstupanja su jednako rasporeena izmeu pozitivnih i negativnih vrednosti (Slika 3a) grafiki prikaz relativnih signala (odnos signala i odgovarajue koncentracije) na osi y i odgovarajuih koncentracija na osi x log skale. Dobijena linija treba da bude horizontalna u celom linearnom podruju, a podruje linearnosti prestaje pri koncentracijama gde linija relativnog odziva see paralelne linije koje odgovaraju 95% ili 105% koncentraciji (Slika 3b).

Slika 3. Dva naina grafikog prikaza linearnosti

2.2.3. Analitiki opseg metode (radno podruje)

Opseg analitike metode predstavlja interval izmeu gornjeg i donjeg nivoa koncentracije merenog analita u uzorku (ukljuujui i te koncentracije) u kome se analiza moe vriti sa odreenom tanou, preciznou i linearnou. Za odreivanje ovog parametra nije potrebno izvoditi zasebne eksperimente, opseg se moe odrediti ispitivanjem tanosti i linearnosti metode. U puno sluajeva podruje je odreeno svrhom metode i nema potrebe za ispitivanjem krajnjih mogunosti metode. Naprotiv, suavanjem podruja na koncentracijski raspon uzorka postiu se bolja tanost i preciznost.

2.2.4. Preciznost

Preciznost je parametar koji daje procenu reproduktivnosti rezultata tj. slaganja izmeu numerikih vrednosti dva ili vie merenja izvedenih na isti nain. Eksperimenti preciznosti vre se na homogenom autentinom uzorku, dok se postupak merenja izvodi najmanje pet puta.

Preciznost se izraava kao: Ponovljivost (Repeatability) je parameter validacije kojim se izraava preciznost

rezultata analiza istog uzorka kojeg pod istim uslovima analizira isti analitiar, u istoj laboratoriji, na istoj opremi u kratkom vremenskom razdoblju

18

Srednja preciznost (Intermediate precision) je tip preciznosti koja odgovara merenjima izvrenim pod maksimalno promenljivim uslovima u jednoj laboratoriji. Merenje se vri istom metodom, na istom uzorku, u istoj laboratoriji, a izvodi ga razliit operater, na razliitoj opremi u , srednje dugom vremenskom period razmaka izmeu merenja.

Reproduktivnost predstavlja podudaranje rezultata dobijenih uzastopnim merenjem nekoliko istih uzoraka istom metodom u razliitim laboratorijama (razliit operater, razliiti radni uslovi unutar specifinih parametara metode). Preciznost se izraava standardnom devijacijom S (1), koeficijentom varijacije Cv (2) i varijancom S2 (3).

(1)

S - standardna devijacija xi - pojedinani sadraj svake probe, dobijen odreivanjem

- srednja vrednost odreivanja

(2)

Cv koeficijent varijacije S - standardna devijacija

- srednja vrednost odreivanja

(3)

S2 - varijanca xi - pojedinani sadraj svake probe, dobijen odreivanjem n - broj odreivanja

- srednja vrednost odeivanja Vano je napomenuti da preciznost ne podrazumeva tanost. Tanost mernog sistema je

bliskost izmerene koliine njenoj stvarnoj (pravoj, sertifikovanoj) vrednosti, dok preciznost,

19

takoe zvana i ponovljivost ili reproduktivnost, jeste stepen u kojem ponovljena merenja pod neporomenjenim uslovima pokazuju isti rezultat.

Rezultati na Slici 4(a) su precizniji za razliku od onih na slici 4(b). Vea preciznost rezultata na Slici 4(a) ne znai i da je taj set rezultata precizniji. U stvari, oba seta razultata mogu biti vrlo naprecizna. Kao i kod tanosti, preciznost zavisi od faktora koji utiu na odnos izmeu signala i analita.

Slika 4. Dva odreivanja koncentracije u serumu, pokazujui efekat preciznosti. Podaci na prvoj slici su manje rasuti, i stoga, precizniji nego oni na slici b.

2.2.5. Tanost (Recovery vrednost)

Tanost analitike metode je stepen saglasnosti izmeu stvarne i vrednosti dobijene primenom analitikog postupka odreeni broj puta, odnosno ona ukazuje na ispravnost merenja.

U praksi se tanost analitike metode proverava: - Analizom Standardnih Referentnih Materijala -SRM - Odreivanjem procenta prinosa - rikaveri vrednosti - Uporeivanjem sa drugom metodom, (ili sa vie) koja je potvrena kao tana Dobijena tanost u velikoj meri zavisi od naina pripreme uzorka, matriksa i koncentracije

uzorka. Za odreivanje tanosti treba koristiti najmanje tri razliite koncentracije analita u uzorcima i analizu ponoviti tri puta.

Odreivanje procenta prinosa ili tzv. recovery vrednost se tako to se uzorku i slepoj probi doda se poznata koliina istog standarda i meri se porast analitikog signala.

Za svaku probu Recovery vrednost se izraunava na osnovu sledeeg izraza

Recovery [%] = ()()

))))x100 (4)

20

Slikovita ilustracija pojmova preciznost i tanost odreivanja prikazana je na Slici 5.

mala tanost velika tanost mala preciznost mala preciznost

mala tanost velika tanost velika precizna velika preciznost

Slika 5. Ilustracija preciznosti i tanosti metode

2.2.6. Granica detekcije/kvantifikacije

Granica detekcije se jo naziva i Limit detekcije (LOD). Najnia koncentracija analita koja se moe detektovati u uzorku, ali ne i kvantitativno odrediti, naziva se granicom detekcije (eng. Limit of Detection LOD). Postoji nekoliko pristupa odreivanju LOD:

vizuelno na osnovu odnosa signal/um bazne linije (S/N) na osnovu standardne devijacije odgovora detektora i nagiba kalibracione prave

(S/N) se odreuje merenjem signala analita koji se nalazi u poznatoj, veoma niskoj koncentraciji i uzorka bez analita, pri emu se utvruje najnia koncentracija analita koju je mogue detektovati. Za granicu detekcije obino se uzima vrednost koncentracija koje daju S/N = 3 ili S/N = 2.

Teorijski limit detekcije se izraunava po formuli: LOD =

.

(5)

21

gde je: standardna devijacija odgovora detektora dobijena viestrukim merenjem slepe probe, a nagib kalibracionog grafika. se dobija kao standardna devijacija serije merenja signala uzorka bez analita, ili kao

standardna devijacija odseka na ordinate dobijenog iz kalibracione prave sa koncentracijama bliskim LOD.

Granica kvantifikacije se naziva i Limit kvantifikacije (LOQ) i definie se kao najmanja koliina analita u uzorku koja se moe kvantitativno odrediti sa prihvatljivom preciznou i tanou. Ovaj parameter je naroito vaan kod analize neistoa ili degradacionih produkata. Odreuje se analogno odreivanju detekcionog limita, koristei S/N = 10, ili korienjem jednaine:

LOQ =

(6) gde je:

standardna devijacija odgovora detektora dobijena viestrukim merenjem slepe probe,

a nagib kalibracionog grafika.

2.2.7. Robusnost

Robusnost se definie kao mera otpornosti analitikog postupka na male, namerne promene radnih uslova metode. Ispitivanje robusnosti je vaan deo razvoja metode jer pomae otkrivanju optimalnih uslova za izvoenje metode i na taj nain upuuje na one parametre koje treba kontrolisati. Tokom eksperimenata menjaju se radni uslovi unutar stvarnih granica i prati kvantitativna promena rezultata. Ako promena nekog radnog uslova ne utie bitno na rezultat, kae se da je on u podruju robusnosti metode. Uslove za koje je utvreno da utiu na rezultat treba drati pod nadzorom i to jasno naznaiti u opisu metode. Prema podacima o robusnosti postavljaju se parametri za ispitivanje pogodnosti sistema. Robustnost, kao karakteristika izvoenja metode, nije neophodno odreivati u svakoj laboratoriji. Kada se koristi standardizovana metoda razumno je da se prihvati da je robustnost metode odreena procedurom standardizacije.

22

2.3. Metode pripreme uzorka

Priprema uzorka je vaan korak u svakom analitikom postupku. Priprema uzorka podrazumeva dekompoziciju i rastvaranje organskih i neorganskih uzoraka, u zatvorenim ili otvorenim sistemina primenom termalne ili energije zraenja.

Da bi bilo mogue analizirati eljeni analit u nekom odabranom uzorku, potrebno je taj analit izolovati, a po potrabi i koncentrovati. Metode izolovanja, odnosno ekstrahovanja mogu biti razliite i mogu se kombinovati, zavisno od vrste analita, ali i vrste uzorka.

Neke od najee korienih metoda ekstrakcije analita iz uzorka su: - ultrazvuna ekstrakcija smeom rastvaraa, - Soxhletova ekstrakcija, - mikrotalasna ekstrakcija, - ekstrakcija organskim rastvaraima na koloni, - ekstrakcija superkritinim fluidima, - mikroekstrakcija vrstom fazom, - QuEChERS.

Ultrazvuna ekstrakcija smeom rastvaraa: je jednostavan postupak koji ukljuuje upotrebu zvunih talasa kako bi se izdvojio analit iz uzorka koji je uronjen u organskom rastvarau. Ultrazvuna ekstrakcija uglavnom se koristi za analizu uzoraka u vrstom stanju. Uzorak sa odgovarajuom smeom rastvaraa se stavlja u ultrazvunu kadu koja je prikazana na Slici 6. Preporuuje se da se uzorci koji sadre male koncentracije PAH-ova ekstrahuju najmanje dva puta, uvek sveom porcijom rastvaraa. Od rastvaraa je najbolje pripremiti smeu aceton/metilen hlorid (1:1, v/v) ili aceton/heksan (1:1, v/v). Ultrazvuna ekstrakcija osigurava delotvorniju ekstrakciju od mukanja u balonu i Soxhlet-ove ekstrakcije. Uzrok poveanoj delotvornosti ultrazvune ekstrakcije je mnogo bolji kontakt izmeu vrste materije i rastvaraa. Prednosti ovog postupka su njena relativna brzina, jednostavnost, smanjenje estica, ubrzani prenos mase i ne zahteva skupocenu opremu, dok su nedostaci potreba za veom zapreminom upotrebljenog rastvaraa i potreba za estom viekratnom ekstrakcijom.

Slika 6. ematski prikaz ureaja za ultrazvunu ekstrakciju: ultrazvuna kada i ultrazvuna sonda

23

Soxhletova ekstrakcija: se najee koristi za ekstrakciju prakastih uzoraka pri emu se bira rastvara u kojem je rastvorljivost analita vea. Rastvara ili smea rastvaraa koja se koristi za ekstrakciju moraju imati veliki afinitet prema analitu, mali afinitet prema uzorku, malu viskoznost i veliku isparljivost tako da se lako uklanjaju iz ekstrahovanog uzorka. Soxhletova ekstrakcija izvodi se tako da se rastvara pogodno upari, kondenzuje i zatim proputa kroz usitnjeni i homogenizovani vrsti uzorak koji se nalazi u celuloznu auru, ema aparature prikazana je na Slici 7. Nakon toga se rastvara vraa u tikvicu zajedno sa ekstraktom. Osnovni nedostaci Soxhlet ekstrakcije su dugo trajanje (10-24h), zagaenje okoline zbog velike potronje organskih zagaivaa (300 ml/uzorak), a spojevi koji se ekstrahuju moraju biti stabilni na temperature kljuanja rastvaraa. Iskorienje Soxhlet ekstrakcije je od 50-100% .

Slika 7. Soxhlet aparatura za ekstrakciju

Mikrotalasna ekstrakcija: za razliku od Soxhletove ekstrakcije mikrotalasna ekstrakcija, iji je ureaj prikazan na Slici 8, omoguava smanjenje vremena trajanja ekstrakcije i koliine potrebnog rastvaraa za ekstrakciju. Upotrebom mikrotalasnog zraenja moe se izbei i razgradnja uzorka zbog visoke temperature, a energija mikrotalasa olakava desorpciju analita iz metrice. Loa svojstva mikrotalasne ekstrakcije su: - potreba za razdvajanje ekstrakta od uzorka dekantovanjem, filtriranjem ili centrifugiranjem - hlaenje elije za mikrotalasnu ekstrakciju nakon ekstrahovanja na sobnoj temperature pre

otvaranja, ime se gubi dosta vremena koje se dobija ovom brzom metodom ekstrakcije.

24

Slika 8. Ureaj za mikrotalasnu ekstrakciju

Tena ekstrakcija pod pritiskom: je moderna metoda ekstrakcije. Uzorak (esto pomean sa sredstvom za suenje) je smeten u ekstrakcionu eliju od nerajueg elika koja je pod pritiskom, zagreva se i puni rastvorom za ekstrakciju. Princip rada je prikazan na Slici 9. Visoka temperatura poveava brzinu difuzije, topljenje analita i time ubrzava ekstrakciju. Nakon ekstrakcije je potrebno dodatno ienje ekstrakta, a kod usled korienja povienih temperatura mogua je razgradnja nestabilnog analita pa ovo ini glavne nedostatke metode.

Slika 9. Tena ekstrakcija pod pritiskom

QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe): je skraenica za veoma koristan analitiki pristup koji znatno pojednostavljuje analizu kompleksnih uzoraka. Predstavlja brzu i prikladnu zamenu za tradicionalne postupke ekstrahovanja sa minimalnim brojem koraka pripreme i uz znaajno smanjenu potronju rastvaraa. Prednosti QuEChERS metode su: visoka iskorienja, efikasnost, jednostavnost, manja potronja ostalih reagenasa, robusnost, mogunost obrade veeg broj uzoraka, niska cena kao i adekvatnost za rutinski rad u laboratoriji. Pomenuta metoda ima i svoje nedostatke zbog ega nije uvek primenjiva u svim

25

laboratorijama. Glavni nedostatak QuEChERS metode je manja koncentracija u konanom ekstraktu nego u sliaju tradicionalnih postupaka i injenica da zahteva upotrebu osetljivih i visokoselektivnih hromatografskih sistema, uz dodatno koncentrisanje ekstrakta ili injektovanje velikih zapremina ekstrakta. Za uspenu primenu QuEChERS metode nuno je da je laboratorija opremljena visokoselektivnim sistemima. Analiza krajnjeg ekstrakta moe se direktno izvriti GC ili LC hromatografijom. Procedura QuEChERS ekstrakcije data je na Slici 10.

Slika 10. Procedura QuEChERS ekstrakcije

Upotrebom QuEChERS tehnike jedan analitiar moe pripremiti 8 uzoraka za 45 min, koristei potroni material u vrednosti od 1-3 .

Pored toga to se za ovu metodu koristi manje rastvaraa u odnosu na konvencionalne SPE metode, QuEChERS procedure omoguuju pogodno pojednostavljeno preiavanje ekstrakta.

26

2.4. Metode analize PAH-ova

Metode koje se koriste pri analizi PAH-ova su: - Gasna hromatografija (GC) - Tena hromatografija visokih performansi (HPLC) - Superkritina tena hromatografija (SFC) - Kapilarna elektroforeza (CE)

Imajui u vidu da su koncentracije ovih jedinjenja u uzorcima iz ivotne sredine vrlo male, pri radu potrebno je koristiti pogodne metode ija osetljivost i specifinost zadovoljava potrebe analize. Najiru primenu u analizi PAH-ova danas ima metoda tene hromatografije visokih performansi (HPLC) i gasna hromatografija kuplovana sa masenim detektorom (GC/MS). Zbog vee selektivnosti i osetljivosti u odnosu na druge metode analize gasna hromatografija u kombinaciji sa masenom spektrometrijom ima primat u analizi PAH-ova.

2.4.1. Gasna hromatografija (GC)

Gasna hromatografija (GC) je metoda razdvajanja i detekcije lako isparljivih organskih jedinjenja. Ovaj vid hromatografije primenjuje se za analizu onih jedinjenja koja se bez degradacije mogu prevesti u gasovito stanje. Kod gasne hromatografije mobilna faza je ujedno i nosei gas, obino inertan (najee argon ili helijum) ili gas koji ne reaguje sa ispitivanim uzorkom (najee azot). Stacionarna faza je mikroskopski sloj tenosti ili polimer na inertnoj vrstoj podlozi, unutar dela stakla ili metalne cevi koja se naziva kolona.

Ispitivani uzorak rastvoren u pokretnoj, mobilnoj fazi, kree se kroz nepokretnu, stacionarnu fazu, ime se njegove komponente razdvajaju, pa ih je mogue dalje analizirati i odreivati, ak iako su sline strukture ili fiziko-hemijskih osobina. Razliite komponente uzorka imaju razliit afinitet ka stacionarnoj fazi, pa usled interakcija koje se tom prilikom odvijaju, dolazi do usporenog kretanja istih kroz kolonu. Svaka komponenta se distribuira izmeu dve faze i uspostavlja se dinamika ravnotea, definisana koeficijentom raspodele, K:

K =

Nakon eluiranja, analit dospeva do detektora, koji je povezan sa raunarom na ijem se ekranu dobija hromatogram. Svaki signal, u takvom hromatogramu, odgovara jednom hemijskom jedinjenju i okarakterisan je kvalitativno i kvantitativno retencionim vremenom i povrinom.

27

Gasni hromatogram sastoji se iz sledeih delova (Slika 11): - boca sa noseim gasom i regulatorom pritiska - autosempler - injector - pe za regulisanje temperature - kolona - detektor - monitor ili tampa

Slika 11. ema gasnog hromatograma

Radi dobijanja boljih rezultata, pored dobre pripreme uzorka, korienje autosemplera omoguava dobru ponovljivost i oprimizaciju vremena, to je osnovna prednost autosemplera nad manuelnim uzorkovanjem. Za unoenje uzorka u kolonu koristi se injektor.

Prema nameni, kolone za gasnu hromatografiju se dele na preparativne i analitike, ali je mnogo rasprostranjenija podela prema nainu pripreme i preniku, i to na:

punjene kolone, koje su izraene od nerajueg elika ili stkla i inertnog punjenja presvuenog tenom ili vrstom stacionarnom fazom. Duine su od 1,5 do 10 m, prenika od 2 do 4 mm, sadraj tene faze iznosi od 5 do 10%, a proseni prenik zrna inertnog nosaa od 100 do 150 m. Inertni nosai obino su izraeni od materijala na bazi dijatomejske zemlje.

kapilarne kolone, iji su zidovi obloeni nekom aktivnom materijom. Veina kapilarnih kolona je napravljena od stopljenog silika gela sa poliimidnom oblogom. Duina im dosee ak i do 60 m dok je prenik izrazito mali, 0,125-0,256 mm.

28

U gasnoj hromatografiji se koristi vie vrsta detektora. Najpoznatiji i najkorieniji meu njima su plameno jonizacioni detektor (FID) i termalno provodljivi detektor (TCD). Oba detektora mogu detektovati veliki broj komponenanta u irokom intervalu koncentracija. Termalno provodljivi detektori su za nijansu ire primenljivi i mogu detektovati veinu komponenti ija je termalna provodljivost vea od termalne provodljivosti noseeg gasa na zadatoj temperaturi. Plameno jonizacioni detektori su osetljiviji na ugljovodonina jedinjenja i ne mogu detektovati vodu. Takoe, prednost TCD detektora nad FID detektorom je da ne unitava ispitivane komponente (plameno jonizacioni ih sagoreva) i mogu se postaviti u seriji prilikom analize to omoguava dodatna ispitivanja za jednu te istu komponentu. Detekcija organskih jedinjenja je najefektnija ako se koristi plameno jonizovani detector.

istoa noseeg gasa koji se koristi u gasnoj hromatografiji je 99.995% ili ak i vie. Protok noseeg gasa utie na analizu u istom obimu kao i varijacija temperature. Bri protok omoguava i bru analizu, ali i smanjuje mogunost potpunog razdvajanja komponenti smee (krae zadravanje pojedinih komponenti na teoretskim podovima kolone). Protok noseeg gasa se zato optimizuje zajedno sa optimizacijom duine kolone i temperaturnim reimom. Gasni hromatografi imaju mogunost elektronskog merenja i kontrole protoka noseeg gasa, ime je omogueno da se pritisak i brzina protoka noseeg gasa moe veoma precizno kontrolisati i tokom trajanja same analize, to daje veu efikasnost metode

2.4.2. Masena spektrometrija

Masena spektrometrija je analitika metoda koja zbog svoje osetljivosti, brzine i granice detekcije zauzima vodee mesto meu ostalim analitikim metodama. Primenu je nala u oblastima organske, neorganske, organometalne, analitike, medicinske, farmaceutske hemije kao a u drugim disciplinama.

Maseni spektrometar je analitiki instrument koji razdvaja naelektrisane estice prema odnosu mase i naelektrisanja, a u kome se deavaju sledei procesi:

- nastanak jona iz uzorka u jonizacionom izvoru - razdvajanje jona prema njihovim m/z vrednostima u masenom analizatoru - fragmentisanje selektivnih jona i analiziranje fragmenata u drugom analizatoru - detektovanje jona koji nastaju iz poslednjeg analizatora i merenje njihovih intenziteta

detektorom koji konvertuje jone u elektrine signale - obraivanje signala iz detektora koji su preneti od raunara i kontrolisanje instrumenata

kroz povratne informacije. Maseni spektrometar, prikazan na Slici 12, se sastoji od:

- sistema za uvoenje uzorka - jonskog izvora - masenog analizatora - detektora

29

Slika 12. Blok ema masenog spektrometra

Jonski izvor je deo masenog spektrometra u kom nastaju joni analiziranih molekula, putem izbijanja elektrona, zahvata elektrona, protonovanja, deprotonovanja ili graenja adukata. Pri tom procesu moe doi i do fragmentacije molekula u dva ili vie fragmenata, to u ovom delu masenog spektrometra nije poeljno. Jedan deo jona ostaje ceo i u spektru daje signal s najveom vrednosti mase. Taj jon se naziva molekulski jon i pokazuje molarnu masu molekula.

Postoji vie naina jonizacije, koji se razlikuju po koliini energije koja se predaje molekulu. Razlikuju se metode visoko energetske jonizacije ( engl. hard method) i metode nisko energetske jonizacije (eng. soft method).

U zavisnosti od vrste izvora energije za jonizaciju razlikuju se sledee metode jonizacije: - EI (engl. Electron Impact-elektronski udar) jonizacija - CI ( engl. Chemical ionization) - FD&FI (engl. Field desorption/ionization - desorpcija/jonizacija u jakom polju) - FAB (engl. Fast Atom Bombardment bombardovanje brzim atomima) jonizacija - MALDI (engl. Matrix Assisted Laser Desorption laserska desorpcija sa matriksa)

jonizacija - ESI (engl. Electrospray Ionization jonizacija elektrosprejom) Najee koriena tehnika u masenoj spektrometriji, u kombinaciji sa gasnom

hromatografijom je jonizacija elektronima, na Slici 13 prikazana je ema jednog elektronskog jonizatora.

30

Slika 13. ema elektronskog EI jonizatora

Kod ESI metode izvor jona se nalazi na atmosferskom pritisku. ESI omoguava maseno-spektralnu analizu velikih i termonestabilnih polarnih molekula pa je zbog toga izuzetno pogodna za analizu bio-molekula. Prua mogunost odreivanja analita u niskim koncentracijama i u kompleksnim matriksima, vrlo je pogodna za kuplovanje sa HPLC, a nalazi primenu u organskij hemiji.

Maseni analizator je deo masenog spektrometra, gde se joni razdvajaju na osnovu odnosa mase i naelektrisanja (m/z). Tu dolazi do disocijacije jona indukovane kolizijom. Joni u masenom analizatoru bivaju razdvojeni prema njihovim masama, koje moraju biti determinisane. Fiziko svojstvo koje je mereno masenim analizatorom je m/z vrednost, a ne samo masa m.

Postoji vie vrsti masenih analizatora koji se razlikuju po tome to koriste statiko ili dinamiko, elektrino ili magnetno polje ili njihovu kombinaciju, dele se na:

- kontinualne kvadripolni magnetni

- pulsne jon trap analizatori analizator na bazi vremena preleta sa dvostrukim fokusiranjem

Najee se koristi kvadripolni analizator (Slika 14), koji se sastoji od etiri meusobno paralelne elektorde, kojima se saoptava osnovni potencijal. Osnovni potencijal dve susedne elektrode je istog intenziteta, ali razliitog predznaka. Dok prolaze kroz analizator, joni se razdvajaju na osnovu m/z vrednosti, tako da samo pojedini bivaju proputeni, jer imaju stabilnu putanju, dok su ostali razelektrisani na elektrodama.

31

Odabirom odgovarajue radio frekvencije i potencijala, analizator e propustiti jone veeg m/z odnosa do detektora, a joni manjeg m/z odnosa bivaju privueni ka elektrodama.

Slika 14. ema kvadripolnog analizatora

Posle ubrizgavanja, joni razliitih masa se nalaze u jon trap-u i sada moraju biti analizirani na osnovu svojih masa. Na osnovu masa bivaju izbaeni u detektor, koji konvertuje jone u elektrini signal, koji se moe registrovati na pisau, raunaru ili na nekom drugom ureaju. Elektrini signali se detektuju u vidu masenih spektara.

Postoje dva naina prikupljanja podataka tokom MS analize: - SCAN- podrazumeva snimanje masenih spektara u odreenim vremenskim intervalima, tako da se za svaku vrednost retencionog vremena sa gasnog hormatograma moe pripisati odgovarajui maseni spektar; ova metoda prua mogunost izbora jona koji e se koristiti za kvalitativnu i/ili kvantitativnu analizu - SIM (Selected Ion Monitoring) posle snimanja hromatograma, unapred se zadaju vrednosti m/z za jone koji se koriste u kvalitivnoj I/ili kvantitativnoj analiziprate se samo odabrani joni

SCAN tehnika podrazumeva skeniranje mase u zadatom opsegu uz istovremeno praenje retencionog vremena. Ovo omoguava identifikaciju analita i koristi se u kvalitativnoj analizi. Zadati maseni opseg i brzina skeniranja hromatograma odreuju vreme praenja odreene mase (dwell time).

SIM tehnika se koristi u kvantitativnim odreivanjima. Pre njene upotrebe, da bi se postigli optimalni uslovi, mora se izvesti analiza SCAN metodom. SIM tehnikom detektuju se vrednosti m/z samo reprezentativnih jona posmatranog molekula. Vreme praenja jona je due pa se samim tim poveava i osetljivost ak 100 do 1000 puta. Karakteristini joni, vreme poetka snimanja (start time) i vreme preenja jona (dwell time) odabiraju se na osnovu podataka dobijenih pomou SCAN tehnike.

Hromatogram se dobija kao zavisnost ukupne abudance sabrane tokom analize od vremena, a daje podatke o kvalitetu (retenciono vreme) i kvantitetu (povrina pika) posmatrane komponente. Svaka taka u hromatogramu predstavlja zbir zastupljenosti posmatranih jona.

32

3. Eksperimentalni deo

33

3.1. Faze eksperimentalnog rada

Eksperimentalni rad obuhvatao je sledee faze: - Priprema serije standardnih rastvora smee PAH-ova razliitih koncentracija - Primena i validacija razliitih metoda snimanja na GC-MS snimanjem standardnih

rastvora - Priprema uzoraka zemljita QuEChERS tehnikom - Odreivanje policiklinih aromatinih ugljovodonika primenom metoda gasne

hromatografije sa masenom spektrometrijom (GC-MS)

3.2. Aparati

- Triple Quadrupole GC/MS system Agilent 7000 Series - Vaga, Shimadzu AX20 - Centrifuga, Humax 14k , Srbija, - Sunica, SSW 800, Srbija - Aparat za dejonizovanu vodu TKA MICROMED

3.3. Pribor

- Kiveta za centrifugu - Vijale za GC - Automatska pipeta - Menzura - Normalni sudovi - QuEChERS kivete od 50 i 2 ml

3.4. Reagensi

- Acetonitril for HPLC, gradient grade, SIGMA-ALDRICH - PSA Primary secondary amine Selectra UCT Bulk Sorbents - PAH Kit 601 N Supelco, Bellefonte, Pennsylvania; koji sadri:, antracen,

benzo[a]antracen, benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[ghi]perilen, benzo[k]fluoranten, krizen (93%), dibenzo[a,h]antracen, fluoranten, fluoren, naftalen, fenantren, piren, acenaften, u vrstom obliku. Rastvor PAH mix 14 napravljen je rastvaranjem PAH-ova u smei aceton/metanol (1:1, v/v) ukupne koncentracije 700 g/ml, pri emu je koncentracija pojedinanih PAHova u smei 50 g/ml.

34

- Deuterisani acenaften d10, perilen d12 Supelco, Bellefonte, Pennsylvaniaprimenjeni kao unutranji stranadrdi obliku rastvora u dihlormetanu polazne koncentracije 80 g/mL.

- MgSO4, SIGMA-ALDRICH - NaCl, Merck

3.5. Priprema uzoraka zemljita za anlizu primenom QuEChERS ekstrakcije

Za pripremu uzoraka za analizu u ovom radu primenjena je metoda QuEChERS ekstrakcije. Odmerena koliina uzoraka (10 g prosejane zemlje) prenese se u kivetu za centrifugiranje (50 ml), doda se 10 ml dejonizovane vode, energino promuka, potom se dodaje rastvara za ekstrakciju (acetonitril) i dobro promuka (Slika 15).

Slika 15. Dodavanje acetonitrila i mukanje

Nakon ovoga, dodaje se sadraj QUEChERS pack a (8 g MgSO4 i 2 g NaCl), mea se energino (Slika 16).

Slika 16. Dodavanje QuEChERS adsorbenasa

35

Nakon ovog postupka centrifugira se 10 min na 3500 rpm U kivetu u kojoj se nalazi 150 mg MgSO4 i 50 mg PSA dodati 1 ml acetonitrilnog

ekstrakta. Kivete energino mukati 5 minuta a zatim centrifugirati 10 minuta na 8000 rpm. Nakon centrifugiranja preneti 0.6 ml ekstrakta u GC vijalu i dodati unutranji standard pa prebaciti u autosempler aparata (Slika 17).

Slika 17. Prenoenje ekstrakta u GC vialu i autosempler aparata

U cilju provere metode izvreno je spajkovanje zemljita. U istu, nezagaenu, zemlju dodaje se precizno odmerena koliina PAH mix-a i tako dobija model uzorak, u naem sluaju napravljena su dva model uzorka koji se upotrebljavaju kao zamena za realni uzorak u toku testiranja metode.

Model uzorak 1: uzorku iste zemlje dodato je 15 l PAH mix koncentracije 3.3830 mg/ml. Koncentracija ukupnih PAH-ova je 5 ppm.

Model uzorak 2: uzorku iste zemlje dodato je 22 l PAH mix koncentracije 3.3830 mg/ml. Koncentracija ukupnih PAH-ova je 7.5 ppm.

3.6. Priprema serije standardnih rastvora smee PAH-ova za izradu kalibracione prave

Za pripremu serije standardnih rastvora dodati redom 990, 950, 900, 750, 500, 375 i 250 l (Z0, Z1, Z2, Z3, Z4, Z5, Z6, Z7, Z8) smee rastvaraa, aceton/metanol (1:1, v/v) u 10, 50, 100, 250, 500, 625, 750 i 1000 l standardnog rastvora koncentracije 700 g/ml (Mix 14) (Tabela 6).

Unutranji standardi su analiti ili grupa analita (tano poznate koncentracije) dodati uzorku koji slue za kalibraciju i kvantifikaciju. Unutranji standard je hemijski slian kao odreivani analit. Obino se dodaje pri analizi PAH-ova primenom GC-MS metode. U kivete sa

36

standardnim rastvorima, odnosno uzorcima, dodavano je po 200 l rastvora unutranjih standarda (deuterisani acenaften d10 i perilen d12) koncentracije 80 g/ml. Surogat standardi su hemijska jedinjenja sa poznatom koncentracijom. Koriste se zbog utvrivanja ekstrakcione efikasnosti i obino su hemijski slini ekstrahovanim jedinjenjima. U ovom radu korien je p terpfenil d14 kao surogat standard koncentracije 100 g/ml i dodavan je uzorke u zapremini od 100l.

Tabela 6. Koncentracija serije standardnih rastvora PAH-ova

3.7. Parametri metode

Za analizu pripremnljenih uzoraka koriena je metoda gasne hromatografije sa masenom spektrometrijom. Snimanje serije standardnih rastvora i uzoraka raeno je na aparatu Triple Quadrupole GC/MS system Agilent 7000 Series, u SCAN i SIM modu. Parametri metode prikazani su u Tabeli 7.

Oznake Koncentracija

pojedinanih PAHova (g/ml)

Zapremina upotrebljenog Mix 14 (l)

Dodata zapremina smee rastvaraa (l)

Z1 0.3846 10 990 Z2 1.9231 50 950 Z3 3.8462 100 900 Z4 9.6154 250 750 Z5 19.2308 500 500 Z6 24.0385 625 375 Z7 28.8462 750 250 Z8 38.4615 1 000 /

37

Tabela 7. Parametri metode za SCAN i SIM module

Parametri SCAN mod SIM mod

Unoenje uzorka GC GC

Izvor injektovanja PAL Sampler PAL Sampler

Maseni spektrometar omogueno omogueno

Injektovana zapremina 2.5 l 1 l

Vreme trajanja procesa splitless splitless

Ravnoteno vreme 0 min 0 min

Maksimalna temperatura 325 0C 325 0C

Sporo hlaenje iskljueno iskljueno

Temperaturni programa inicijalno 3 min/75 0C ,

temperaturni gradijent 6 0C do 3000C, odravano 10 min

inicijalno 3 min/75 0C , temperaturni gradijent 6 0C do

3000C, odravano 10 min

Radno vreme 50,5 min

1.8942 min (posle rada) na 280 0C

50,5 min 1.8942 min (posle rada) na 280

0C

Vrsta kolone Agilent 19091S-433; 812.83871

HP-5MS; 5% phenyl methyl siloxane 3250C;

Agilent 19091S-433; 812.83871 HP-5MS; 5%

phenyl methyl siloxane 3250C;

Dimenzije kolone 30m x 250 m x 0.25 m 30m x 250 m x 0.25 m

38

3.8. Obrada rezultata

Za obradu dobijenih rezultata analize korien je program Mass Hunter. Nakon pokretanja programa iz File menija odabrati radnju New Batch i iz foldera odabrati eljenu datoteku. Nakon toga iz sekcije File/Add Sample odabrati eljene uzorke za analizu ( Slika 18).

Slika 18. Postavljanje nove serije uzoraka i standarda

Za postavljanje nove metode bira se standard sa najveom koncentracijom, markiranjem kursorom mia, a zatim se odabere sekcija Method/Edit ( Slika 19).

39

Slika 19. Postavljanje nove metode kvantifikacije

Odabirom sektora Method Setup Task/MRM Compound Setup moe se dobiti uvid u podatke o jedinjenjima i jonima koje ispitujemo. Uvid u retenciona vremena svake komponente postie se odabirom sekcije Method Setup Task/Retention Time Setup. U ovom odeljku mogu se izvriti ponovna podeavanja u vezi sa retencionim vremenima. Za odabir unutranjih standarda za svaku od komponenata koja se analizira u odeljku ISTD Compound Name iz sekcije Method Setup Task/ISTD Setup odabere se odgovarajui unutranji standard u odeljku ISTD Concentration unese njegova koncentracija ( Slika 20).

U sekciji Method task/Calibration curve setup, ekira se FORCE kako bi grafik proao kroz nulu.

Da bi se izvrila kalibracija u odeljku Method/Create Levels from Calibration Samples za seriju standardnih rastvora potrebno je podesiti eljene koncentracije standarda. U sluaju da neki od standarda imaju istu koncentraciju moe se izvriti kopiranje vrednosti koncentracija odabranim jedinjenja sa istim koncentracijama u odeljku Method/Copy Calibration Levels to. Ukoliko su uneti svi potrebni podaci, nova metoda moe biti validirana i sauvana odabirom opcije Validate iz sekcije Save/Exit.

40

Slika 20. Podeavanje unutranjeg standarda

Podeavanje integratora vri se u odeljku Method/Edit/Method Tasks/Advaced Taska. Za sve uzorke podesi se MS-MS metod integracije i zapamtiti podeavanje (Slika 21).

Slika 21. Podeavanje integratora Analiza serije rezultata vri se klikom na dugme Analyze Batch, dok se uvanje

podataka postie odabirom komande Save Batch iz File sekcije ( Slika 22).

41

Slika 22. Analiza i uvanje rezultata

Ovako dobijeni rezultati se dalje mogu koristiti i obraivati.

42

4. Rezultati i diskusija

43

Cilj ovog rada je proveravanje valjanosti metoda snimanja masenih spektara, SIM i SCAN, za kvantifikaciju PAH-ova u odgovarajuim uzorcima zemljita. Analizirano je 14 PAH-ova koji su prioritetni po EU standardima: antracen, acenaften, benzo[a]antracen, benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[ghi]perilen, benzo[k]fluoranten, krizen, dibenzo[a,h]antracen, fluoranten, fluoren, naftalen, fenantren, piren. Metoda odvajanja koja je koriena za izolovanje PAH-ova iz izoraka zemljita je QuEChERS metoda, PAH-ovi su ekstrahovani acetonitrilom. Kvantifikacija je izvrena primenom GC-MS analize snimanjem u SIM i SCAN modu.

U Tabeli 8 su prikazana retenciona vremena analiziranih PAH-ova dobijena snimanjem hromatograma u SCAN modu.

Tabela 8. Retenciona vremena analiziranih PAH-ova

PAH

Retenciono vreme (min)

Naftalen 12.087

Acenaften 18.759

Fluoren 20.688

Fenantren 24.302

Antracen 24.478

Fluoranten 28.878

Piren 29.696

Benzo[a]piren 32.289 Krizen 34.360

Benzo[a]antracen 34.513 Benzo[b]fluoranten 38.258 Benzo[k]fluoranten 38.347

Dibenzo[a,h]antracen 43.161 Benzo[ghi]perilen 43.964

Kvantitativna analiza PAH-ova u uzorcima izvrena je korienjem kalibracionih prava dobijenih analizom serije standardnih rastvora, koja je snimana u SCAN i SIM modu. U Tabeli 9 su prikazane jednaine kalibracionih prava i R2 vrednost za svaki analizirani PAH, za oba naina snimanja.

44

Tabela 9. Jednaine prave (zavisnot odgovora od koncentracije) i R2 vrednosti za ispitivane PAH-ove

PAH

SCAN

SIM

Jednaina kalibracione prave R

2 Jednaina kalibracione prave R

2

Antracen y = 1.319748*x 0.99290987 y = 0.869407*x 0.99400013

Benzo[a]piren y = 0.993332*x 0.99015775 y = 1.068791*x 0.99505302

Benzo[b]fluoranten y = 1.242692*x 0.95608286 y = 1.437177*x 0.99585228

Benzo[ghi]perilen y = 0.557649*x 0.91980061 y = 0.358646*x 0.93099739

Benzo[k]fluoranten y = 1.587390*x 0.86902120 y = 1.657816*x 0.99706436

Krizen y = 3.612846*x 0.99031517 y = 2.572076*x 0.99110426

Benzo[a]antracen y = 3.416896*x 0.99645269 y = 3.911884*x 0.98864461

Dibenzo[a,h]antracen y = 0.489367*x 0.92677029 y = 0.372085*x + 0.275196 0.91391129

Fluoranten y = 0.937987*x 0.96920094 y = 0.714987 0.97292878

Fluoren y = 1.264707*x 0.99770999 y = 1.840924*x 0.99810118

Naftalen y = 2.280511*x 0.95664024 y = 2.616012*x 0.99658425

Fenantren y = 1.339867*x 0.99236116 y = 1.426939*x 0.99271569

Piren y = 11.610745*x 0.98884567 y = 8.154720*x 0.97075279

Acenaften y = 1.530035*x 0.99926440 y = 1.612326*x 0.99854610

U cilju odreivanja adekvatne metode za kvantifikaciju PAH-ova serija standardnih rastvora snimljena je prvo u SCAN a zatim u SIM modu.

45

Hromatogrami dobijeni snimanjem u SCAN modu.

Slika 23. Hromatogram ukupne jonske struje (TIC-toal ion current chromatogram) dobijen snimanjem Z1 standarda u SCAN modu



46




47



Sa ciljem da se dokae prisutnost analiziranih PAH-ova u uzorku, sainjena je Tabela 10 sa masenim spektrima nastali snimanjem najkoncentrovanijeg standarda, Z8.

48

Tabela 10. Maseni spektri najkoncentrovanijeg standarda

PAH Retenciono

vreme (min)

Maseni spektri

Antracen 24.450

Benzo[a]piren 39.280

Benzo[b]fluoranten

38.242

Benzo[ghi]perilen

43.975

Benzo[k]fluoranten

38.336

49

Krizen 34.333

Benzo[a]antracen

34.480

Dibenzo[a,h]antracen

43.164

Fluoranten 28.839

Fluoren 20.657

50

Naftalen 12.175

Fenantren 24.265

Piren 29.665

Acenaften 18.725

Uporeivanjem dobijenih MS spektara sa podacima iz biblioteke za GC-MS ustanovili smo da se radi o navedenim policiklinim aromatinim ugljovodonicima, ime je SCAN metoda primenjena u svrhu kvalitativne analize. Zatim su na osnovu povrine ispod pikova za odreene komponente konstruisane kalibracione prave koje predstavljaju zavisnost od koncentracije svakog od PAH-ova. Poto su za neke komponente dobijeni nesimetrini pikovi, sa podignutim baznom linijom u nekim sluajevima, vreno je runo integraljenje, to je dovelo do odreenih nedostataka u kvantifikaciji.

Na osnovu podataka o masenim fragmentima dobijenih na osnovu SCAN moda, izabrani su parametric SIM moda. Za svaku od komponenata izabran je karakteristian jon koji se pojavljuje na odreenom retencionom vremenu (quantifyier ion - jon za kvantifikaciju) i

51

kvantifikacija je vrena na osnovu njegove zastupljenosti. Na taj nain su postignuti bolji analitiki rezultati, odnosno vrednosti za tanost i preciznost metode.

Hromatogrami dobijeni snimanjem u SIM modu.

Slika 31. Hromatogram ukupne jonske struje (TIC-toal ion current chromatogram) dobijen snimanjem Z1 standarda u SIM modu


52




53




Analizom prikazanih hromatograma standardne serije moe se uoiti da hromatogrami dobijeni iz SCAN moda nisu adekvatni za primenu u kvantitativnoj analizi uzoraka. Naime, dobijeni pikovi nisu simetrini, prisutno je preklapanje pikova susednih komponenata a neki prilino odstupaju od bazne linije. Njihovim razmatranjem moe se izvriti samo indetifikacija, kvalitativna analiza prisutnih komponenata u uzorku. Proces odreivanja ometaju pikovi koji

54

potiu od oneienja prisutnih u uzorku, koji su prikazani na hromatogramima dobijenim u SCAN modu za razliku od onih dobijenih u SIM modu. Na osnovu podataka o prisutnosti odreenih komponenti u uzorku, koje omoguava snimanje u SCAN modu, moe se pratiti tano odreena komponenta u SIM modu i na osnovu toga izvriti kvantifikacija. SIM mod omoguava registrovanje pikova samo za zadate komponente, dok su kod SCAN metode registrovane sve prisutne prisutne komponenti ukljuujui i oneienja. SCAN mod se ne preporuuje za kvantitativnu analizu, jer na kraju dobijenih hromatograma dolazi do podizanja bazne linije, oko etrdesetog minuta analize. Do pojave ovog uma dolazi usled visoke temperature radne kolone, od oko 300 0C imajui u vidu da je maksimalna temperatura kolone 325 0C, usled ega dolazi do curenja kolone. Curenje kolone utie na oneienje analiziranog uzorka te tako i na pojavu uma na samom kraju hromatografskog snimanja. U cilju preglednijeg prikazivanja i uporeivanja rezultata dobijenih snimanjem dvema razliitim metodama sainjena je Tabela 11 u kojoj su uporedno prikazani parametri tanosti koji se odnose na SCAN i SIM mod snimanja.

55

Tabela 11. Uporedni pregled tanosti metode (izraen kao rikaveri) za svaki od analiziranih PAH-ova dobijenih razliitim metodama snimanja

PAH SCAN SIM

Tanost* (%) Tanost* (%)

Antracen 80.31 81.73

Benzo[a]piren 102.29 329.53

Benzo[b]fluoranten 98.23 95.93

Benzo[ghi]perilen 99.72 157.99

Benzo[k]fluoranten 89.29 99.90

Krizen 88.21 87.01

Benzo[a]antracen 89.83 95.52

Dibenzo[a,h]antracen 99.11 157.31

Fluoranten 84.00 77.86

Fluoren 95.18 84.70

Naftalen 86.06 94.79

Fenantren 78.85 77.47

Piren 104.36 120.30

Acenaften 85.95 87.66

* Tanost (Recovery) [%] = ()()

))))x100

Iz Tabele 11 se moe uoiti da se SIM mod snimanja odlikuje u veini sluajeva veom tanou, koja se ogleda kroz vee vrednosti tanosti. Veina dobijenih rikaveri vrednosti se nalazi u intervalu od 50 120 % to je analitiki poeljno. Izuzetno visoke rikaveri vrednosti koje se uoavaju kod benzo[a]pirena su posledica njegovog detektovanja na trideset devetom minutu analize kada se temperatura radne kolone poveava na 300 0C. Usled poviene

56

temperature dolazi do laganog otapanja kolone to prouzrokuje pojavu oneienja unutar uzorka, a to rezultuje podizanjem bazne linije. Zato se sa sigurnou ne moe potvrditi da se dobijeni rezultati odnose iskljuivo na benzo[a]piren.

Uporedni prikaz parametara preciznosti dva razliita modula snimanja dat je u Tabeli 12.

Tabela 12. Preciznost metoda SCAN i SIM GC-MS analize

PAH SCAN SIM

Srednja vrednostSD* (%)

Srednja vrednostSD* (%)

Antracen 80.31 4.31 81.72 2.18

Benzo[a]piren 102.29 5.61 129.5251 7.58

Benzo[b]fluoranten 98.22 6.74 95.93 3.2567

Benzo[ghi]perilen 99.72 4.13 127.9854 3.44

Benzo[k]fluoranten 89.28 3.61 99.90 2.84

Krizen 88.21 2.64 87.01 2.32

Benzo[a]antracen 89.83 3.74 95.58 3.259

Dibenzo[a,h]antracen 99.10 4.69 157.308 3.97

Fluoranten 84.00 2.25 77.86 2.60

Fluoren 95.175 7.00 84.69 4.29

Naftalen 86.06 3.61 94.79 3.29

Fenantren 78.85 4.36 77.48 3.46

Piren 104.36 7.97 120.30 4.48

Acenaften 85.95 4.37 87.66 3.47

*RSD= ((stadnardna devijacija/srednja vrednost)*100) Tabelarni prikaz ukazuje da se za veinu komponenata SIM mod odlikuje manjom vrednou relativne standardne devijacije, to ukazuje na veu preciznost odreivanja. Kao izuzetak javlja se benzo[a]piren, sa izrazito veom vrednou relativne standardne devijacije pa se odreuje sa manjom preciznou.

57

Analiza model uzoraka zemljita

Dobijeni hromatogrami za uzorak 1 i 2 prikazani su na slikama 39-42. Model uzorak 1 dobija se dodavanjem 15 l PAH mix koncentracije 3,3830 mg/ml

uzorku istom emljitu. Koncentracija nastalog model uzorka je 5ppm. Model uzorak 2 nastaje tako to se uzorku istog zemljita dodaje 22,2l PAH mix

koncentracije 3,3830 mg/ml. Koncentracija dobijenog model uzorka je 7.5 ppm.

Model uzorak 1

Slika 39. Hromatogram ukupne jonske struje (TIC-toal ion current chromatogram) za uzorak 1 dobijen u SCAN modu

Zapaa se da je i kod ovog uzorka bazna linija posle retencionog vremena 40 minuta podigunta, to dovodi do problema u kvantifikaciji.

Slika 40. Hromatogram ukupne jonske struje (TIC-toal ion current chromatogram) za uzorak 1 dobijen u SIM modu

U SIM modu je bazna linija ravna, pa ovde oekujemo bolje rezltate kvantifikacije.

58

Tabelama 13 i 14 prikazane su tanost i preciznost, koje su najvaniji validacioni parametri dobijeni analizom model uzorka 1 i 2, u SCAN i SIM modu GC MS metode.

Tabela 13. Uporedni prikaz tanosti i preciznosti rezultata, dobijenih snimanjem u SCAN i SIM modu za uzorak 1

PAH SCAN SIM

B1 SD g/ml B1 SD g/ml

Antracen 0.0016 0,0003 0.0282 0.0034

Benzo[a]piren 0.3440 0.0259 1.3015 0. 1120


Benzo[ghi]perilen ND* ND*


Krizen ND* ND*

Benzo[a]antracen ND* ND*

Dibenzo[a,h]antracen ND* ND*

Fluoranten ND* 0.0092 0.0005

Fluoren 0.0055 0.0012 0.0180 0.0007

Naftalen 0.1391 0.0014 0.1755 0.0229

Fenantren 0.0016 0.00031 0.0149 0.0011

Piren ND* 0.0101 0.0018

Acenaften 0.1719 0.0143 0.1698 0.0228

ND* ispod granice detekcije metode

U analiziranom model uzorku, na osnovu prikazanih podataka, sa najveom preciznou odreuje se fluoren a sa najveom tanou benzo[a]piren. Uoava se da se SIM mod odlikuje veom preciznou za gotovo sve detektovane komponente.

59

Model uzorak 2

Slika 41. Hromatogram ukupne jonske struje (TIC-toal ion current chromatogram) dobijen za uzorak 2 u SCAN modu

Sa datog hromatograma opet se uoava podizanje bazne linije posle retencionog vremena od 40 minuta, to e i u ovom sluaju usloviti ometanje kvantifikacionog odreivanja.

Slika 42. Hromatogram ukupne jonske struje (TIC-toal ion current chromatogram) dobijen za uzorak 2 u SIM modu

SIM mod i u ovom suaju daje ravnu baznu liniju to e omoguiti bolje rezultate kvantifikacije.

60

Tabela 13. Uporedni prikaz tanosti i preciznosti rezultata, dobijenih snimanjem u SCAN i SIM modu, za model uzorak 2

PAH SCAN SIM

B2 SD g/ml B2 SD g/ml

Antracen 0.0013 0.0003 0.0374 0.0382

Benzo[a]piren 0.5617 0.0345 1.2751 0.0139


Benzo[ghi]perilen ND* ND*


Krizen ND* ND*

Benzo[a]antracen ND* ND*

Dibenzo[a,h]antracen ND* ND*

Fluoranten ND* 0.0125 0.0003

Fluoren 0.0084 0.0052 0.0325 0.0027

Naftalen 0.2626 0.02333 0.3250 0.0101

Fenantren 0.0033 0.0031 0.0206 0.0011

Piren ND* 0.0216 0.0067

Acenaften 0.3202 0.0021 0.3206 0.0093

ND* ispod granice detekcije metode

Sa najveom preciznou i tanou u SIM modu odreuje se benzo[a]piren. Generalno sve komponente SIM modom se odreuju mnogo preciznije u odnosi na SCAN mod.

61

5. Zakljuak

62

Policiklini aromatini ugljovodonici (PAU, PAH) su iroko rasprostranjeni ekoloki zagaivai. Nastaju kao rezultat nepotpunog sagorevanja i pirolitikih procesa. Ova jedinjenja su dugotrajni, slabo razgradivi zagaivai, akumuliraju se u zemljitu i sedimentima, povrinskim vodama i atmosferi. Zbog njihovih mutagenih i kancerogenih svojstava 16 PAH-ova su klasifikovana kao visoki zagaivai od strane Agencije za zatitu prirodne sredine (EPA): acenaftilen, antracen, acenaften, benzo[a]antracen, benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[ghi]perilen, benzo[k]fluoranten, krizen, dibenzo[a,h]antracen, fluoranten, fluoren, indeno[1,2,3-cd]piren, naftalen, fenantren, piren.

Cilj rada bio je da se izvriti validacija odgovarajue metode snimanja, SCAN ili SIM, radi kvantifikacije PAH-ova u uzorcima zemljita. Za postupak kvantifikacije koriena je GC/MS tehnika. PAH-ovi su iz zemljita ekstrahovani primenom QuEChERS ekstrakcije i acetonitrila kao rastvaraa. Koriena je QuEChERS ekstrakcija jer se metoda izvodi za najkrae vreme primenom vrlo jednostavne i lako dostupne laboratorijske opreme, uz korienje minimalne koliine organskih rastvaraa i drugih potrebnih reagenasa. U toku rada praena su 14 PAH-a radi jednostavnosti izvoenja analize

SIM mod snimanja uzorka se odlikuje veom rikaveri vrednou i manjom vrednou za relativnu standardnu devijaciju, te se ona preporuuje kao podesna metoda za kvantifikaciju PAH-ova u uzorcima zemljita. SCAN mod snimanja se vie preporuuje za kvalitativnu analizu, jer prua detaljne informacije o svim prisutnim komponentama u uzorku ukljuujui i prisutna oneienja. Ove podatke moemo iskoristiti i u SIM modu zadati odgovarajuu komponentu kao cilj njene pretrage ime dobijamo preciznu kvatifikaciju zadane komponente.

63

6. Literatura

64

1. Agency for Toxic Substances and Disease Registry (2009), Case Studies in Environmental Medicine Toxicity of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs)

2. Agilent MassHunter Workstation Software, Quantitative Analysis, Familiarization Guide (2012), Agilent Technologies Inc

3. Cvetkovi J., Dimitrijevi M., Stankov Jovanovi V., Miti V. (2013), Analiza policiklinih aromatinih ugljovodonika u hrani i uzorcima iz ivotne sredine, Hemijskipregled, god. 54, broj 6, Srpsko hemijsko drutvo

4. COMMISSION REGULATION (EU) No 836/2011 of 19 August 2011 Official Journal of the European Union

5. Fagbote O.; Olanipekun E. (2013), Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and polychlorinated biphenyls (PCBs) in soil of Agbabu, Nigeria, 1 st Annual International Interdisciplinary Conference, AIIC 2013, 24-26 April, Azores, Portugal

6. Gaga EO, Tuncel SG (2003): Occurence and Distribution of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Ankara Precipitation. Water, Air, and Soil Pollution: Focus 3, 127134

7. https://www.google.rs/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=5&cad=rja&uact=8&ved=0CDMQFjAE&url=http%3A%2F%2Fbib.irb.hr%2Fprikazi-rad%3Frad%3D482228&ei=AK0lVaeKIon0Uou5g9AN&usg=AFQjCNHU1yT1MamQwtWxZ0VtqYr8xvaocQ&bvm=bv.90237346,bs.1,d.bGQ

8. http://www.cecra.dh.pmf.uns.ac.rs/pdfww2011/Leovac%20Anita-Organski%20polutanti.pdf

9. http://www.tehnologijahrane.com/enciklopedija/maseni-spektrometar 10. http://www.belupo.hr/Default.aspx?sid=6941 11. Jira W., Ziegenhals K., Speer K., 2006., PAH in smoked meat products according to EU

standards, Fleischwirtschaft International, 4, 11-17 12. Lundstedt S. (2003), Analysis of PAHs and their transformation products in

contaminated soil andremedial processes, Ume University, Sweden 13. Marjanovi N., Kravi S., Suturovi Z., varc-Gaji J. (2004), Determination of

sensitivity limit in quantative analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons by GC-MS 14. Karajovi Zogovi M., Matovi V., (2006) VALIDACIJA METODA ISPITIVANJA,

Festival kvaliteta 15. Purcaro G., Moret S.,Conte L., (2013), Overview on polycyclic aromatic hydrocarbons:

Occurrence, legislation and innovative determination in foods.Talanta 105, 292305 16. Ravindra K, Sokhi R, Van Grieken R (2008): Atmospheric polycyclic aromatic

hydrocarbons: Source attribution, emission factors and regulation. Atmospheric Environment, DOI:10.1016/j.atmosenv.2007.12.010

17. Venkataraman C, Thomas S, Kulkarni P (1999): Size distributions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons - Gas/particle partitioning to urban aerosols. Journal of Aerosol Science 30, No. 6, 759-770

ozm rad

Documents