中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences

PCR 引物设计及软件使用技巧

←3’

5’

Sense primer

Antisense primer

→

王深浩

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引物设计是 PCR 技术中至关重要的一环

使用不合适的 PCR 引物容易导致实验失败：

a. 非特异性扩增

b. 扩增产物量较少

c. 无扩增产物

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2. 引物设计的原则

1. 引物与模板的序列要紧密互补

2. 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构

3. 引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应 ( 即错配 )

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引物设计时考虑的因素引物长度 碱基分布的均衡性Tm值引物二级结构引物3’端引物5’端引物的内部稳定性引物的保守性与特异性

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常用的是 18-27bp ，太短则特异性降低容易引起错配，太长则结合能量过高，不易结合。

1. 引物长度引物的长度一般为 15-30 bp

2. 引物 GC 含量在 40%~60% 间，上下游引物 GC 含量差异不要太大

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a. 引物 3’ 端的末位使用碱基 A 引物 3’ 端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较

大的影响，末位碱基为 A 的错配效率明显高于其他 3 个碱基

3. 引物的 3’ 端

b. 引物 3’ 端不要出现 3 个以上的连续相同碱基，如 GGG 或 CCC ，也会使错误引发机率增加

c. 引物的延伸从 3’ 端开始，因此 3’ 端的几个碱基与模板 DNA 均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致 PCR 扩增完全失败。

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5. PCR 反应的 Tm 值（退火温度） . 一般在 55 ～ 70 ℃ 之间。

（这个温度不同软件的计算差异很大，有时需要实验人员摸索条件）

4. 引物 5’ 端 引物 5’ 端可以有与模板 DNA 不配对碱基，在 5’ 端

引入一段非模板依赖性序列，如增加酶切位点等

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6. 引物中尽量避免发夹结构和引物二聚体的出现。

发夹结构：发夹结构：55’’-- ACATGAGGTACCAGCCCCATGT ACATGAGGTACCAGCCCCATGT --33’’

55’’-- ACATGAGGTACACATGAGGTAC……

||||| ||||||| ||

33’’-- TGTACCCCGACTGTACCCCGAC……

引物二聚体结构：引物二聚体结构：上游：上游：TACCGAACTCAGGGAACAGCTACCGAACTCAGGGAACAGC

|| ||| ||| ||| ||| ||| |

下游：下游： GACTCCATTGCCTAGCCTGGGACTCCATTGCCTAGCCTGG

Hairpin

Dimer

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7. 防止引物错误引发（ False priming ）

primer1 primer1

primer2 primer2

目的区域

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Primer Premier 5.0 的特点•人工操作，精度高•对于复杂结构引物设计可以结合试验条件 对引物做出取舍•总能设计出引物

•效率低，不适合大规模设计引物

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Primer Premier 3.0 （ on line ）的特点

•操作简单，方便•无需考虑太多的因素•设计的引物可信度较高

•不能对于复杂结构引物设计可以结合试验条件对引物做出取舍

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