PEMBENTUKAN SEAFOOD-LIKE FLAVOUR SECARA ENZIMATIS

Ferrell Auryn/6132005Robert Yasaputera/6132018

Rafael Reynaldi/6132021Johan Gunardi/6132023

Abstrak

Pembentukan flavour seafood pada makanan-makanan ringan dapat diperoleh melalui hidrolisa secara enzimatis dengan enzim bromealin pada makhluk hidup di laut. Protein yang terhidrolisa oleh enzim ini, digunakan sebagai bahan dasar pembuatan seafood-like flavour. Dengan penambahan enzyme ini, dapat meningkatkan kandungan dari asam amino dan menyebabkan terbentuknya seafood-like flavour.

Latar Belakang

Dewasa ini, tingginya tuntutan masyarakat akan flavouring pada makanan yang beragam menyebabkan industri pangan di Indonesia bersaing untuk menciptakan suatu flavour pada makanan. Salah satunya dengan memanfaatkan bahan baku organisme dari laut yang banyak ditemukan di perairan ASEAN. Potensi yang cukup besar ini dapat dimanfaatkan pula untuk dijadikan produk lain yang bernilai lebih, dibandingkan jika hanya diperjualbelikan dalam bentuk segar. Pada pengolahan proteinnya, flavour seafood-like dapat diperoleh dengan penambahan enzyme bromealin yang banyak ditemukan pada nanas.

Tujuan

• Menentukan sifat fisik dan kimia dari protein yang terhidrolisis oleh enzym bromealin

• Mempelajari komponen utama pembentukan flavour pada seafood-like

Manfaat• Meningkatkan nilai jual produk laut sebagai produk

flavouring• Menciptakan seafood-like flavour dari bahan baku

organisme laut

• Alat yang digunakan dalam analisa :– Screen 80-mesh– Inkubator– Sentrifuge– Kertas saring Whatman No.1– Rotary evaporator– HS-SPME-GC-MS (Headspace solid-phase

microextraction-gas chromatography-mass spectrometry).

• Bahan yang dibutuhkan dalam analisa :– G. fisheri– Air steril– HCl 1 N– Enzim bromelain– Perak Nitrat

Cara Kerja pada Rumput Laut• Ekstraksi dan PemisahanPengerjaan awal dilakukan dengan mengekstraksi agar dari G. fisheri, dimana prosesnya dirahasiakan oleh produsen. By-product yang dihasilkan dari ekstraksi agar ini berupa bubuk yang akan diolah selanjutnya. Komposisi dari by-product adalah 27.84% protein, 0.6% lemak, 9.07% abu, 20.65% serat, dan 41.83% karbohidrat. By product ini dipisahkan dari komponen lainnya dengan screen 80-mesh. Bubuk by-product disimpan dalam suhu 20oC sebelum masuk ke dalam proses hidrolisa proteolitik.• Hidrolisa ProteolitikCampuran 10 gr bubuk by-product dan 50 ml air steril dicampur, dan diadjust pHnya sampai mencapai nilai 6 menggunakan HCl 1 N. LArutan yang sudah dibuat diinkubasi pada 50oC selama 10 menit agar suhu optimal untuk reaksi enzim bromelain. Persiapan sample dibuat dengan konsentrasi ( 0%, 5%, 10%, 15%, 20%. Setiap konsentrasi kemudian diberikan perlakuan pemeraman selama 0.5, 3, 6, 12, 18 dan 24 jam. Didapatkan aktivitas enzim sebesar 0, 27415,54831, 82247 dan 109663 unit/gram. • Satuan unit adalah adalah jumlah enzim yang membebaskan 1 mg tyrosine dalam 10 menit pada

kondisi pH=6 dan suhu 50oC. Penghentian proses hidrolisis dihentikan dengan pemanasan pada suhu 95oC dalam kurun waktu 15 menit. Hasil hidrolisis disentrifuge (5000g) selama 15 menit pada suhu 25oC. Supernatant diambil dan disaring denggan kertas Whatman No.1. Larutan supernatant disebut dengan SWPH (Sea Weed Protein Hydrolysate), yang kemudian dianalisa sifat physicochemicalnya.

• Penentuan Sifat SWPH CairBeberapa sifat SWPH yang akan dianalisa adalah warna, kandungan garam, degree of hydrolysis, % yield, optimalisasi aktivitas enzim dengan RSM (Response Surface Methodology), dan penentuan komponen volatil. Warna dievaluasi dengan menggunakan metode CIE*a*b*. Kandungan garam dianalisa dengan menggunakan titrasi perak nitrat dengan menggunakan metode AOAC. Degree of hydrolysis dilalukan dengan penambahan 10 ml sample dengan 20% TCA terlebih dahulu, lalu disentrifugasi selama 1 menit (5000g). Nitrogen terlarut kemudian dihitung dengan menggunakan persamaan :%Degree of hydrolysis =. % yield diestimasi dengan metode Sonklin, dimana perhitungan diawali dengan penggunakan rotary evaporator pada suhu 40oC, tekanan 5 kPa, selama 2 jam. Optimalisasi dengan RSM dilakukan dengan teknik plotting antara 2 variable (konsentrasi enzim vs. waktu hidrolisa). Optimal point ditentukan dengan bantuan polynomial second-order :Y=bo+b1x1+b2x2+b12x1x2+b11x1

2+b22x22

Y = predicted response (warna, %total salt, %yield, dan % DH)x1 & x2= independent variable (konsentrasi enzim & waktu hidrolisa)

b1 & b2 = linear effects

b12 = interaction effect

• Penentuan Komponen VolatilMenggunakan (HS-SPME-GC-MS) Headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry. Komponen volatile akan ditangkap oleh serat SPME, proses dilakukan selama 20 menit. Setelah SPME tidak dapat menyerap lagi (kesetimbangan), komponen volatile dilepaskan (Desorbed) dengan menggunakan helium sebagai carrier dalam injector port selama 20 menit pada suhu 240oC. Helium lalu dipisahkan dari komponen volatile menggunakan DB-Wax (kolom kapiler. Lalu komponen volatile dideteksi menggunakan MSD. Hasil yang didapat berupa retention index (RI).

Cara Kerja pada Anadara Granose• Optimalisasi hidrolisat protein menggunakan CCRD (Central Composite Rotable Design)

Hidrolisat protein didapatkan melalui proses yang menggunakan enzim bromelain. Bromelain dipilih karena memiliki gugus α-amino dibandingkan dengan protease yang lain (alkalase, neutrase, dan papain). Dimana hidrolisis dilakukan dengan metode Monteclavo et al (1984), dengan metodologi RSM (response surface methodology) menggunakan CCRD.

A. granosa yang digunakan berasal dari Kuala Selangor, Selangor, Malaysia. Proses pertama yang dilakukan adalah memisahkan cockles dari cangkangnya dengan air mendidih selama 10 menit. Daging cockles yang sudah dipisahkan kemudian dicincang dengan alat A-FW 88100, Beem-Gigant, W. Germany. Baru setelah pencincangan, daging tersebut dicuci dengan perbandingan daging cincang : air suling = 1:3. Perlakuan yang diberikan pada campuran tersebut adalah pengadukan selama 20 menit pada kecepatan 600 rpm dengan overhead stirrer (RW20, Ika labortechnik, Germany). pH cucian daging cockle disesuaikan sampai dengan pH 6.85, disaring dengan siever, dan disimpan pada suhu -20oC.

PH protein yang didapatkan dari penyaringan air daging cockle disesuaikan pHnya sampai dengan 4 dengan menggunakan 4N HCL dan 0.1 N NaOH. Sample diaduk dengan magnetic stirrer selama 30 menit dan dibiarkan selama 1 jam. Sestelah didiamkan, supernatant larutan diambil dengan sentrifugasi 7800 g selama 30 menit. Supernatant yang diambil kemudian dibuang, dan presipitat disimpan pada suhu -20oC (proses freeze drying) selama 25 jam.

• Air presipitat diekstrak lemaknya dan dibuang, dan daging non-fat kemudian di tambahkan dengan air suling. Campuran daging non-fat dan air suling kemudian dihidrolisa dengan oven 95oC dan didinginkan sebelum diubah pHnya sampai 6 dengan menggunakan 4N NaOH. Saat sampai tahap proses inilah bromelain ditambahkan seperti pada table.1. Enzim bromelain diaktifkan dengan 2 ml 0.1 M L-Cystein.Sample dipanaskan sampai suhu 95oC pada 15 menit untuk mendeaktifasi enzim.

• Setiap campuran dipisahkan menjadi 2, untuk menjalani analisa NC(Nitrogen Content) dan DH (Degree of Hydrolysis). Kedua sample di sentrifugasi secara terpisah pada 7800 g selama 30 menit. Supernatant diambil dari hasil sentrifugasi dan dibekukan pada suhu -20oC selama 24 jam, sebelum digunakan untuk analisa NC (Nitrogen Content) dan DH (Degree of Hydrolysis).

Beberapa metode untuk penentuan kandungan dalam flavour ini :

1. Nitrogen content (NC) and degree of hydrolysis (DH)NC ditentukan dengan metode Kjedahl, DH dihitung secara persamaan Hoyle&Merritt,

dan Fonkwe&Singh.20 ml dari protein terhidrolisa ditambahkan ke 20 ml 20% trichloroacetic acid (TCA) untuk mendapatkan konsentrasi TCA 10%. Kemudian campuran tersebut didiamkan agar terjadi presipitasi selama 30 menit, kemudian disentrifudge berkecepatan tinggi selama 15 menit. Kemudian larutan hasil sentriduge (supernatant) dapat dianalisa kandungan nitrogennya dengan metode Kjedahl menggunakan protein analyzer. DH dapat dihitung dengan persamaan :2. Analisa Bahan Volatil

Bahan volatil diekstrak dengan menggunakan teknik Head Space Solid Phase Microextraction (HS-SPME). Sekitar 5 ml dari sample dimasukkan kedalam wadah headspace ( 12 ml ), dan ditutup dengan silicone septum. Kemudian sample dipanaskan dalam air bersuhu 50oC selama 10 menit. Kemudian sebuah jarum SPME yang mengandung divinylbenzene-carboxen-polydimethylsiloxane (DVB-CARBOXEN-PDMS) fibre dimasukkan ke dalam wadah sample tersebut dalam headspace, untuk mengambil komponen volatilnya. Kemudian setelah diambil, segera diinjeksikan ke dalam Gas Kromatografi untuk diidentifikasi kandungan volatil yang ada, dengan menggunakan gas inert Helium sebagai gas pembawa.

Amino acid compositionKomposisi asam amino terkandung dalam sample dapat ditentukan dengan

metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography ). Kandungan Asam amino dianalisa dengan 3 metode yang berbeda, untuk semua tipe asam amino, analisa menggunakan hidrolisa oleh 6N HCL. Untuk deteki Cysteine dan Methionine, digunakan analisa asam untuk menghasilkan bentuk asam derivativenya ( asam crsteic dan sulphonated methionine). Untuk trytophan ini akan rusak juga menggunakan metode hidrolisa asam, sehingga digunakan 4.3N LiOH. 3-MCPD

3-MCPD ini merupakan protein terhidrolisa oleh enzim bromealin yang menyebabkan rasa seafood like. Untuk deteksi 3-MCPD ini, protein terhidrolisa dari daging Anadara Granosa ini diekstract dengan menggunakan ekstrasi fasa solid, dan kemudian mengubah 3-MCPD ke to 2,2-dimethyldioxolane yang merupakan molekul turunannya untuk memudahkan analisa pada GC-MS, kemudian setelah itu, sample diinjeksikan pada analisa GC-MS dimana menghasilkan 2ng/ml sample.

Hasil pada Rumput Laut• Hasil proses ekstraksi agar rumput laut Gracilaria fisheri memiliki kandungan protein yang cukup tinggi

yaitu 28%, sedangkan kandungan lemaknya yang sangat rendah yaitu 0.6%. Tingginya kandungan protein ini membuat cocoknya hasil ekstraksi agar Gracilaria fisheri untuk dijadikan sumber hidrolisa protein dengan menggunakan enzim bromealin, sehingga kandungan protein ini dapat dikonversi menjadi salah satu komponen flavour seafood sekaligus untuk meningkatkan nilai mutu produk rumput laut.

• Untuk dapat mengetahui kondisi optimal enzim bromealin dalam menghasilkan flavour seafood, maka dilakukan percobaan dengan menggunakan berbagai konsentrasi enzim dan dengan waktu proses hidrolisa yang berbeda – beda. Konsentrasi enzim (berat enzim / berat produk samping rumput laut) yang digunakan adalah 0%, 5%, 10%, 15%, 20%. Sedangkan waktu hidrolisa yang digunakan 0.5, 3, 6, 12, 18, 24 jam. Dari percobaan yang telah dilakukan, akan diukur beberapa variabel terkait hasil hidrolisa yang dilihat secara kimia fisika seperti warna hasil hidrolisa, kandungan garam, yield produk dan derajat hidrolisis.

• Apabila dilihat dari sisi warna, produk SWPH (hasil penambahan enzim) dan hasil ekstraksi agar rumput laut (sebelum penambahan enzim) memiliki warna yang hampir sama yaitu hijau kuning muda. Selain itu, adanya perbedaan konsentrasi enzim dan lama proses hidrolisa ternyata juga tidak mempengaruhi warna dari produk. Warna ini muncul karena pigmen warna dari rumput laut. Sehingga, adanya penambahan enzim untuk proses hidrolisis tidak mempengaruhi warna hasil produk penambahan enzim. Disamping itu, warna ini bisa juga menjadi agen flavour. Kandungan garam pada hasil penambahan enzim ternyata juga tidak dipengaruhi oleh konsentrasi dari enzim serta lama proses hidrolisa. Setiap hasil variasi konsentrasi enzim serta lama hidrolisa menghasilkan kandungan garam sekitar 0.43% – 0.48%.

• Dari hasil percobaan, dapat dilihat bahwa yield produk dan derajat hidrolisa dipengaruhi oleh konsentrasi enzim dan lama proses hidrolisa. Untuk yield produk, meningkatnya konsentrasi enzim akan mengakibatkan naiknya yield produk. Sedangkan, untuk lama proses hidrolisa, pada 3 jam pertama, yield produk akan meningkat cukup signifikan, namun, pada proses hidrolisa yang dilakukan diatas 3 jam, yield produk yang dieproleh sudah tidak meningkat lagi. Sehingga, yield tertinggi dapat diperoleh saat konsentrasi enzim 20% dan lama proses hidrolisa 3 jam yaitu sebesar 38.15%. Derajat hidrolisa pun juga dipengaruhi oleh konsentrasi enzim serta lama proses hidrolisa. Derajat hidrolisa ini akan meningkat cukup besar selama 3 jam pertama. Peningkatan derajat hidrolisa ini akan terjadi hingga mencapai 6 jam proses hidrolisa, dimana saat proses hidrolisis berlangsung selama 6 jam didapat derajat hidrolisis maksimum. Pengaruh konsentrasi enzim pada derajat hidrolisis meningkat cukup besar pada konsentrasi enzim 5% ke 10%. Sedangkan pada konsentrasi 15% dan 20%, tidak menghasilkan derajat hidrolisis yang berbeda jauh. Hal ini disebabkan karena enzim atau substratnya sudah masuk dalam keadaan jenuh atau adanya efek inhibitor di produk akhir. Apabila dilihat dari sisi derajat hidrolisa dan yield produk yang diperoleh, maka kondisi optimum enzim bromealin untuk bekerja adalah pada konsentrasi enzim 10% dan lama proses hidrolisa adalah selama 3 jam.

• Ditinjau dari sisi kimia protein, penambahan enzim bromealin ini menyebabkan protein yang ada didalam hasil ekstraksi agar rumput laut akan terhidrolisa mayoritas menjadi ikatan peptide yang lebih kecil (oligopeptida atau di atau tripeptida). Sedangkan sisanya akan dapat dihidrolisa menjadi asam amino bebas. Ikatan – ikatan peptide yang lebih kecil ini akan memberikan kontribusi rasa umami pada hasil produk. Asam amino bebas yang dihasilkan dari penambahan enzim bromealin ini juga akan berkontribusai dalam pembentukan rasa yang ada didalam produk. Ditemukan bahwa 16 jenis asam amino yang terbentuk melalui proses hidrolisa protein ini yaitu methionin, alanin, valin, leusin, isoleusin, prolin, phenyalanin, glycine, serin, threonin, tirosin, aspartic, asam glutamate, lysine, arginin, histidine. Rasio rasa pahit / umami dan manis / umami berturut – turut adalah 1.3 dan 1.09.

Proses hidrolisa protein dalam hasil ektraksi agar rumput laut juga menghasilkan komponen – komponen flavor pada hasil produk. Melalui hasil kromatografi, dapat dilihat bahwa terdapat 10 komponen flavor yang diperoleh. 10 komponen flavor tersebut adalah heksanal, asam heksanoat, asam heptanoat, asam oktanoat, asam nonanoat, asam dekanoat, dihidroactindiolide, asam dodeanoat, asam heksadeanoat, dan benzaldehid. Dari 10 komponen ini, komponen mayornya adalah heksanal, asam heksanoat, asam nonanoat, dan dihidroactindiolide. Dari komponen – komponen flavor ini, produk rumput laut yang dihasilkan memiliki bau – bau rumput laut, kepiting, udang, caramel, rasa umami, manis, pahit dan asin. Terdisitribusinya asam amino bebas dan ikatan peptide yang kecil ini menyebabkan timbulnya bau dan rasa yang ada pada produk, seperti leusin yang member rasa pahit, alanin dan arginin yang memberikan rasa manis, asam glutamate dan asam aspartat yang memberikan rasa umami.

Hasil untuk Anadara Granose• Untuk mengetahui kondisi optimum enzim bromealin untuk menghidrolisa protein yang

dikandung Anadara Granosa , maka akan dilakukan percobaan dalam berbagai suhu, kosnentrasi enzim bromealin yang berbeda – beda, serta lama proses hidrolisis. Kondisi optimum enzim bromealin ini ditentukan berdasarkan nilai kandungan nitrogen dan derajat hidrolisanya. Derajat hidrolisis menyatakan persentase banyaknya ikatan peptide yang terpotong. Dari hasil percobaan diperoleh bahwa, ketiga variabel yaitu suhu, konsentrasi enzim, serta lama proses hidrolisa mempengaruhi nilai kandungan nitrogen serta derajat hidrolisisnya. Untuk kandungan nitrogen yang setelah ditambahkan enzim bromealin, kandungan nitrogen akan meningkat apabila konsentrasi enzim ditingkatkan hingga mencapai titik optimumnya. Apabila melewati titik optimumnya maka nilai kandungan nitrogen akan mulai menurun.

• Peningkatan suhu juga akan menyebabkan naiknya nilai kandungan nitrogen. Namun, peningkatan suhu pada konsentrasi enzim yang lebih rendah akan memberikan efek peningkatan kandungan nitrogen yang cukup besar. Lama proses hidrolisa juga akan menyebabkan meningkatnya nilai kandungan nitrogen. Untuk derajat hidrolisa, peningkatan masing – masing variabel akan menyebabkan peningkatan derajat hidrolisa pula. Dimana, suhu yang meningkat, konsentrasi enzim yang semakin besar, serta proses hidrolisa yang semakin lama akan menyebabkan meningkatnya derajat hidrolisa. Dimana, bila derajat hidrolisa semakin tinggi maka memungkinkan untuk mengurangi rasa pahit dan meningkatkan keefektifan dalam memproduksi flavor.

• Keadaan optimum untuk enzim bromealin bekerja dalam menghidrolisis protein dalam Anadara Granosa adalah menggunakan konsentrasi enzim 1.45%, dengan suhu 33.7 0C, dan proses hidrolisa yang berlangsung selama 28.42 jam, dimana diperoleh hasil kandungan nitrogen 0.6101% dan derajat hidrolisa sebesar 48.3675%.

• Asam amino yang dihasilkan dalam proses hidrolisis dengan menggunakan enzim bromealin ini adalah asam aspartat, asam glutamat, serine, glycine, histidine, arginin, threonine, alanin, prolin, tirosin, valine, methionine, cystine, isoleusin, leusin, phenylalanine, tryptophan and lisin. Dari 18 asam amino yang ada ini, asam glutamate-lah yang paling banyak terkandung. Selain asam amino, juga dihasilkan flavour seafood like seperti flavour kerang dan flavour tiram. Kedua flavour ini dapat diperoleh melalui adanya senyawa 1-Butanol 3-Metil dan 1-pentanol yang dideteksi menggunakan GC-MS (Gas Chromatography – Mass Spectrofotometry) yang diperoleh melalui proses hidrolisis oleh enzim bromealin.

Kesimpulan• Pada rumput laut, adanya penambahan enzim untuk proses hidrolisis

tidak mempengaruhi warna hasil produk penambahan enzim. Untuk yield produk, meningkatnya konsentrasi enzim akan mengakibatkan naiknya yield produk. Apabila dilihat dari sisi derajat hidrolisa dan yield produk yang diperoleh, maka kondisi optimum enzim bromealin untuk bekerja adalah pada konsentrasi enzim 10% dan lama proses hidrolisa adalah selama 3 jam. Protein yang ada didalam hasil ekstraksi akan terhidrolisa menjadi ikatan peptide yang lebih kecil.

Pada kerang darah, suhu yang meningkat, konsentrasi enzim yang semakin besar, proses hidrolisa yang semakin lama akan menyebabkan meningkatnya derajat hidrolisa. Keadaan optimum untuk enzim bromealin bekerja dalam menghidrolisis protein dalam Anadara Granosa adalah menggunakan konsentrasi enzim 1.45%, dengan suhu 33.7 0C, dan proses hidrolisa yang berlangsung selama 28.42 jam

• Pada rumput laut, terdisitribusinya asam amino bebas dan ikatan peptide yang kecil ini menyebabkan timbulnya bau dan rasa yang ada pada produk, seperti leusin yang memberi rasa pahit, alanin dan arginin yang memberikan rasa manis, asam glutamate dan asam aspartat yang memberikan rasa umami. Pada kerang darah, diperoleh adanya senyawa 1-Butanol 3-Metil dan 1-pentanol yang memberi flavour kerang dan flavour tiram.