PLATELIA™ ASPERGILLUS EIA96 TESTS 62796IL PLATELIA™ ASPERGILLUS EIA È UN TEST IMMUNOENZIMATICOSU MICROPIASTRA, A SANDWICH, PER IL RILEVAMENTODELL’ANTIGENE GALATTOMANNANO DELL’ASPERGILLUS NELSIERO.

1- USO PREVISTOIl Platelia™ Aspergillus EIA è un test immunoenzimatico su micropiastra, a sandwich, per ilrilevamento dell’antigene galattomannano dell’ Aspergillus in campioni di siero.

2- ISTRUZIONI PER L’USOIl test Platelia™ Aspergillus EIA, utilizzato in combinazione con altre procedure diagnostichequali coltura microbiologica, esame istologico di campioni bioptici e prove radiografiche, puòessere utilizzato come ausilio nella diagnosi dell’aspergillosi invasiva.

3- SOMMARIO E SPIEGAZIONE Le infezioni da Aspergillus si verificano solitamente a seguito dell’inalazione di spore di Aspergilluspresenti nell’ambiente. Le forme invasive, in aumento negli ultimi 10 anni, rappresentano le infezionipiù gravi. Esse si verificano soprattutto in pazienti neutropenici (a seguito di un trattamentoantitumorale) e in pazienti trattati con immunosoppressori (nei trapianti d’organo, in particolaretrapianti di midollo osseo) e corticosteroidi 7.L’Aspergillus è raramente isolato da colture ematiche. La diagnosi si basa spesso su provediagnostiche o radiologiche non specifiche (sintomi clinici, TC, raggi X del torace, ecc.)Attualmente il test per l’antigene galattomannano solubile nel siero sembra essere un metodosierologico in grado di aiutare la diagnosi dell’aspergillosi invasiva 6, 9, 14, 34, 39.

4- PRINCIPIO DEL METODO 27

Il Platelia™ Aspergillus EIA è un test immunoenzimatico su micropiastra, a sandwich, one step, cherileva il galattomannano nel siero umano. Il test fa uso di anticorpi monoclonali di ratto EBA-2 diretticontro il galattomannano di Aspergillus e caratterizzati in studi precedenti 16, 28. Gli anticorpimonoclonali sono utilizzati (1) per rivestire i pozzetti della micropiastra e legare l’antigene e (2) perrilevare l’antigene legato alla micropiastra sensibilizzata (reagente coniugato: anticorpi monoclonalilegati alla perossidasi). I campioni di siero sono trattati al calore in presenza di EDTA allo scopo didissociare il complessi immuni e precipitare le proteine del siero che potrebbero interferire con iltest 15. I campioni di siero trattati e il coniugato sono aggiunti ai pozzetti rivestiti con anticorpimonoclonali e incubati. In presenza dell’antigene galattomannano si forma un complesso anticorpomonoclonale – galattomannano – anticorpo monoclonale/perossidasi. Le strip dei pozzetti vengono lavate per eliminare eventuale materiale non legato. Successivamente,viene aggiunta la soluzione substrato, che reagisce con i complessi legati al pozzetto per formareuna reazione di colore blu. La reazione enzimatica è arrestata dall’aggiunta di acido, che fa virare ilcolore da blu a giallo. L’assorbanza (densità ottica) dei campioni e dei controlli è determinata conuno spettrofotometro impostato ad una lunghezza d’onda di 450 e 620 mm.

5- REAGENTIPlatelia™ Aspergillus EIA : cat n. 62796 (96 test) Conservare il kit a 2-8°C. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (18-25°) prima dell’uso.Subito dopo l’uso riportare tutti i reagenti, ad eccezione dei controlli, a 2-8°C. Dopo laricostituzione, il controllo negativo, il controllo di cut-off e il controllo positivo inutilizzati devonoessere congelati a –20°C. Riporre le strip/piastre nella busta e richiuderla. Non rimuoverel’essiccante. Le strip devono essere utilizzate entro 5 settimane dall’apertura e richiusura dellabusta. Dopo la diluizione, la soluzione di lavaggio può essere conservata per 14 giorni a 2-8°C.Tutti gli altri reagenti sono stabili dopo l’apertura fino alla data di scadenza. I reagenti sonoforniti in quantità sufficiente per eseguire 96 test in un massimo di 9 sedute analitiche.

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♦Note: la TMB (tetrametilbenzidina) è un cromogeno non-carcinogenico e non-mutageno per laperossidasi.

*Note: qb = quanto basta

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Componente Contenuto QuantitàR1 Microwell

Strip Plate

Micropiastra :- 96 pozzetti (12 strisce di 8 pozzetti ciascuna)

rivestiti con anticorpi monoclonali anti-galattomannano

1 Piastra /12 x 8 pozzetti

R2 ConcentratedWashing Solution

Soluzione di lavaggio concentrata (10X): - Tampone Tris NaCl - 1% Tween® 20- 0,01% thimerosal

1 x 100 mL

R3 NegativeControlSerum

Siero di controllo negativo:- Siero umano liofilizzato negativo al galattomannano- Negativo agli anticorpi anti-HIV-1, anti-HIV-2 e anti-

HCV e all’antigene HBs

3 x qb* 1 mL

R4 Cut-off Control Serum

Siero di controllo di cut-off:- Siero umano liofilizzato contenente galattomannano- Negativo agli anticorpi anti-HIV-1, anti-HIV-2 e anti-

HCV e all’antigene HBs

3 x qb* 1mL

R5 Positive Control Serum

Siero di controllo positivo:- Siero umano liofilizzato contenente galattomannano- Negativo agli anticorpi anti-HIV-1, anti-HIV-2 e anti-

HCV e all’antigene HBs

3 x qb* 1 mL

R6 Conjugate Coniugato (pronto all’uso):- Anticorpo monoclonale anti-galattomannano /

marcato con perossidasi- Conservante: 0,01% thimerosal

1 x 8 mL

R7 Serum TreatmentSolution

Soluzione di trattamento del siero (pronta all’uso):- Soluzione acida EDTA

1 x 10,5 mL

R8 TMBSubstrate

Buffer

Tampone substrato TMB (pronto all’uso):- Acido citrico e soluzione di acetato di sodio- Perossido di idrogeno allo 0,009% - dimetilsulfossido (DMSO) al 4%

1 x 60 mL

R9 Chromogen: TMB

Solution

Soluzione di cromogeno TMB (concentrata):- Soluzione di dimetilsulfossido (DMSO) al 90%

contenente tetrametilbenzidina (TMB) allo 0,6%♦

1 x 1 mL

R10 Stopping Solution

Soluzione bloccante (pronta all’uso):- Acido solforico (H2SO4) 1,5 N

1 x 12 mL

Plate sealers - Fogli adesivi per micropiastre 1 x 8 fogli

6- AVVERTENZE PER GLI UTILIZZATORI1. Per uso diagnostico in vitro.

2. Solo per uso professionale.

3. Non utilizzare questo kit di analisi con campioni di siero non umano.

4. Il controllo positivo, il controllo del valore soglia (cut-off) e il controllo negativo sono prodotti dasiero umano analizzato e risultato non reattivo per HBsAg e anticorpi anti-HIV-1, HIV-2 e HCV contest con marchio CE. Tuttavia, tutti i reagenti devono essere trattati come potenzialmente infetti.Tutti i test devono essere condotti conformemente allo standard OSHA sui patogeni portati dalsangue, livello di biosicurezza 2 o altre pratiche di biosicurezza appropriate.

5. Indossare indumenti protettivi, compreso il camice da laboratorio, protezioni per gli occhi/il viso eguanti monouso (si raccomandano guanti sintetici privi di lattice) e manipolare i reagenti dei kit e icampioni dei pazienti secondo le buone prassi di laboratorio richieste. Al termine del test, lavarsiaccuratamente le mani.

6. Non pipettare con la bocca.

7. Non fumare, bere né mangiare nei locali in cui sono stati utilizzati i campioni o i reagenti dei kit.

8. Evitare di schizzare campioni o soluzioni.

9. Asciugare accuratamente eventuali fuoriuscite di materiale biologico non contenente acido con undisinfettante efficace. I disinfettanti che possono essere utilizzati comprendono (in via nonlimitativa) una soluzione di candeggina al 10% (soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,5%), etanoloal 70% o Wescodyne Plus™ allo 0,5%. Tutti i materiali utilizzati per asciugare eventuali fuoriuscitesono considerati rifiuti a rischio biologico, soggetti alle relative procedure di smaltimento.

ATTENZIONE: non introdurre soluzioni contenenti candeggina nell'autoclave.

10. Assorbire (asciugare) o neutralizzare opportunamente eventuali fuoriuscite di materiale contenenteacido con bicarbonato di sodio, quindi risciacquare e asciugare l'area contaminata; in presenza dimateriale a rischio biologico, pulire l'area con un disinfettante chimico.

11. Smaltire tutti i campioni e i materiali utilizzati per eseguire il test come potenzialmente infettivi.I rifiuti chimici di laboratorio e a rischio biologico devono essere manipolati e smaltiticonformemente a tutte le normative locali, regionali e nazionali.

12. ATTENZIONE: di seguito viene fornito un elenco di potenziali rischi chimici contenuti in alcunicomponenti del kit (consultare la sezione 5- REAGENTI):

Poiché la soluzione bloccante di acido solforico 1,5 N (7.2% H2SO4) è corrosiva, puòcausare ustioni agli occhi e alla cute; può essere nociva se ingerita o se entra incontatto con la cute; può causare gravi danni agli occhi, compreso l'indebolimentopermanente della vista o cecità. Materiali da evitare: basi forti e agenti riducenti.

R34-41 Provoca ustioni. Rischio di gravi danni agli occhi. S24/25-26-30-36/37/39-60. Evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. In caso di contatto congli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Nonversare acqua sul prodotto. Indossare indumenti protettivi idonei, guanti e protezioni per gli occhi/ilviso. Questo materiale e la relativa confezione devono essere smaltiti conformemente allenormative vigenti in materia di rifiuti pericolosi. I rifiuti di questo materiale sono considerati rifiuti acidi pericolosi, tuttavia se consentito dallenormative locali, regionali e nazionali, potrebbero essere neutralizzati a pH 6-9 per lo smaltimentocome rifiuti non pericolosi, purché si sia addestrati e attrezzati a tale fine.Il Thimerosal allo 0,01% (sodio mertiolato), un conservante biocida organo-mercurio che colpisce ilsistema nervoso centrale (SNC), è tossico per la riproduzione e notevolmente sensibilizzante;l'esposizione prolungata o ripetuta può causare reazione allergica nei soggetti sensibili; esistonodiversi casi di sensibilizzazione dovuta all'esposizione a soluzioni di Thimerosal diluite. Nondisperdere nell'ambiente, pericolo di effetti cumulativi. Le soluzioni contenenti mercurio con unaconcentrazione superiore a 0,2 ppm devono essere smaltite conformemente alla normativa USAper i rifiuti pericolosi (RCRA) (D009); smaltire tutti i rifiuti conformemente alle normative vigenti.

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C-Corrosivo

(Nota: il mercurio (Hg) rappresenta fino al 49,55% delle molecole Thimerosal, di conseguenza uncomponente con lo 0,01% di Thimerosal contiene ~0,005% (~50 ppm) di mercurio peso/volume). In caso di contatto con la pelle, lavarsi immediatamente e abbondantemente con acqua.Avvertenza: il Thimerosal è noto allo Stato della California per essere tossico per la riproduzione.

13. La scheda dei dati di sicurezza (MSDS) è disponibile su richiesta.

7- PRECAUZIONI PER GLI UTILIZZATORI1. I CAMPIONI DI SIERO CONGELATI, CONSERVATI IN CONDIZIONI NON NOTE, POSSONO

GENERARE RISULTATI FALSI POSITIVI A CAUSA DI CONTAMINAZIONE CON FUNGHI E/OBATTERI.

2. Non utilizzare il kit o i reagenti del kit dopo la data di scadenza indicata. 3. Ad eccezione della soluzione di lavaggio concentrata (R2) e della soluzione bloccante (R10),

non miscelare reagenti provenenti da altri kit con numeri di lotto diversi. 4. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente per almeno 15 minuti prima dell’uso. 5. Durante la ricostituzione dei reagenti, miscelare accuratamente facendo attenzione ad evitare

contaminazione microbica. 6. Non eseguire il test in presenza di vapori reattivi (acidi, alcali, aldeidi) o polvere che

potrebbero influire sull’attività enzimatica del coniugato. 7. Per preparare la soluzione di reazione substrato-cromogeno utilizzare contenitori puliti

monouso in polipropilene. Se è necessario utilizzare contenitori in vetro, lavarli prima in acidocloridrico 1N, risciacquarli con acqua distillata e asciugarli.

8. Per pipettare i controlli e i campioni utilizzare puntali da pipetta monouso per evitare lacontaminazione dei campioni.

9. Per garantire che i pozzetti siano adeguatamente lavati, rispettare il numero consigliato dicicli di lavaggio e assicurarsi che tutti i pozzetti siano completamente riempiti e quindicompletamente svuotati. Il lavaggio non va effettuato manualmente.

10. Non lasciare che la micropiastra si asciughi tra la fine del ciclo di lavaggio e l’aggiunta di reagenti. 11. Non utilizzare lo stesso recipiente per il coniugato e le soluzioni di substrato. 12. Evitare che il coniugato o le soluzioni per la reazione substrato-cromogeno vengano a contatto

con metallo o ioni metallici. 13. Evitare di esporre il cromogeno o la soluzione per la reazione substrato-cromogeno a luce intensa

durante la conservazione o l’incubazione. Evitare che le soluzioni di cromogeno vengano acontatto con agenti ossidanti.

14. Evitare il contatto tra la soluzione bloccante ed agenti ossidanti. Evitare che la soluzione bloccantevenga a contatto con metallo o ioni metallici.

15. Utilizzare materiali puliti e privi di polvere (provette, puntali, recipienti, ecc.) per ridurre al minimo lepossibilità di contaminazione con spore di Aspergillus presenti nell’ambiente. Poiché ilgalattomannano è stabile al calore, la sterilizzazione del materiale utilizzato non garantiscel’assenza di antigeni contaminanti. I materiali apirogeni sono ottimali ma, con le dovuteprecauzioni, è possibile anche utilizzare materiali standard.

16. Limitare l’esposizione all’aria delle soluzioni (sieri, soluzioni di trattamento, coniugato) o direcipienti aperti (piastre, provette, pipette).

17. Non rimettere il coniugato inutilizzato nel recipiente originale. 18. La soluzione per la reazione substrato-cromogeno deve essere incolore. La comparsa di colore blu

dopo la diluizione indica che il reagente è contaminato e non deve essere utilizzato. Eliminarlo epreparare nuovo reagente.

8- PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEL REAGENTE

Piastra con strisce di micropozzetti (R1)Dopo l’apertura della busta contenente la piastra, le strisce di micropozzetti sono stabili per5 settimane se conservate a +2-8°C nel sacchetto originale accuratamente chiuso e in presenzadell’essiccante fornito.

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Soluzione di lavaggio di lavoro (R2)Preparare la soluzione di lavaggio di lavoro secondo necessità aggiungendo una parte di soluzione dilavaggio concentrata a 9 parti di acqua deionizzata o distillata sterile. La soluzione di lavaggio dilavoro può essere conservata per 14 giorni a 2-8°C. Prepararne una quantità sufficiente percompletare il ciclo (80 mL per una striscia: 8 mL R2 + 72 mL di acqua distillata). Dopo l’apertura, la soluzione di lavaggio concentrata conservata a +2-25°C, in assenza dicontaminazione, è stabile fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta.

Siero di controllo negativo (R3)

Ricostituire il contenuto di una provettina di controllo con 1000 µL (1 mL) di acqua distillata sterile(preferibilmente acqua apirogena). I sieri devono essere reidratati immediatamente primadell’esecuzione del test. Miscelare accuratamente dopo avere atteso 2-3 minuti per la reidratazionedel siero. Suddividere in aliquote da 300 µL in 3 provette in polipropilene da microcentrifuga.Congelare immediatamente a –20°C le provette che non verranno utilizzate dopo la reidratazione.

Nota: i sieri di controllo precedentemente reidratati e congelati immediatamente a –20°C possonoessere scongelati ed utilizzati senza ulteriore reidratazione. I controlli reidratati congelati possonoessere conservati a –20°C per un massimo di cinque settimane. Trattare i sieri di controllo allo stessomodo dei campioni paziente (300 µL di siero + 100 µL di soluzione di trattamento, ecc.)

Siero di controllo di cut-off (R4) e siero di controllo positivo (R5)Prepararli come descritto per il siero di controllo negativo.

Soluzione per la reazione substrato-cromogeno (R8 + R9)Preparare la soluzione per la reazione substrato-cromogeno aggiungendo una parte disoluzione TMB di cromogeno concentrato, R9, a 50 parti di tampone di substrato TMB, R8.Preparare 2 mL di soluzione per la reazione substrato-cromogeno per strip: 40 µL di R9 + 2 mLdi R8. La soluzione è stabile per 6 ore se conservata al buio a temperatura ambiente (+18-25°C). Dopo l’apertura, i reagenti R8 ed R9 conservati a +2-8°C, in assenza di contaminazione, sonostabili fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta.

Coniugato (R6), soluzione di trattamento del siero (R7) e soluzione bloccante (R10)Dopo l’apertura, i reagenti R6, R7 ed R10 conservati a +2-8°C, in assenza di contaminazione,sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta.

9- RACCOLTA DEI CAMPIONIRaccogliere i campioni ematici secondo le procedure standard di laboratorio. Il test viene eseguito susiero. I campioni di siero non devono essere contaminati da spore fungine e/o batteri. Trasportare econservare i campioni in provette sigillate non esposte all’aria. I campioni non aperti possono essereconservati a 2-8°C per un massimo di 5 giorni prima del test. Dopo la prima apertura, i campionipossono essere conservati a 2-8°C per un massimo di 48 ore prima del test. Tale durata può essereprolungata conservando il siero a –70°C.I campioni di siero possono essere sottoposti a un massimo di 4 cicli di congelamento/scongelamento. I campioni precedentemente congelati devono essere miscelati accuratamente dopolo scongelamento prima di eseguire il test.I risultati non sono influenzati da campioni contenenti 20 mg/L di bilirubina, campioni lipemicicontenenti l’equivalente di 2 g/L di trioleina (trigliceride) o campioni emolizzati contenenti 165 mg/L diemoglobina. Non sono state testate interferenze legate ad albumina in eccesso.Non eliminare il complemento dai sieri.

10-PROCEDURA

Materiali fornitiVedere la sezione REAGENTI.

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Materiali richiesti ma non forniti1. Acqua distillata o deionizzata sterile per la diluizione della soluzione di lavaggio. 2. Acqua distillata apirogena sterile per la ricostituzione dei sieri di controllo. 3. Carta assorbente. 4. Guanti monouso. 5. Occhiali protettivi. 6. Ipoclorito di sodio (candeggina) e bicarbonato di sodio.7. Pipette o pipette multiple, regolabili o fisse, per misurare ed erogare 50 µL, 100 µL, 300 µL e

1000 µL.8. Provette in polipropilene da microcentrifuga da 1,5 mL con tappi ermetici, in grado di

sostenere un riscaldamento fino a 120°C (blocco termico) o 100°C (bagnomaria bollente). a. Provette con tappo a vite: provette coniche da 1,5 mL, Bio-Rad cat. n.224-0100 o

equivalenti.b. Provette con tappo a pressione: provette EZ Micro Test da 1,5 mL, Bio-Rad cat. n. 223-

9480 o equivalenti.9. Chiusure per tappi per microprovette (VWR cat. n. 6054001 o equivalenti). Queste chiusure

consentono di sigillare in modo sicuro i tappi delle provette evitando che si aprano durante icambiamenti di temperatura e pressione e consentono inoltre di estrarre con facilità leprovette dal blocco termico o dal bagnomaria bollente.

10. Centrifuga da banco per provette 1,5 mL in polipropilene in grado di ottenere 10.000 g.11. Rack per micro-centrifuga 12. Agitatore Vortex. 13. Thermoblock : Si consigliano riscaldatori dei seguenti modelli:

a. modello a 1 blocco (1x24): Grant cat. n. QBD1 (VWR cat. n. 460-0074) b. modello a 2 blocchi (2x24): Grant cat. n. QBD2 (VWR cat. n. 460-0076)

14. Blocco intercambiabile: entrambi i thermoblocks devono essere usati con il blocco Grant cat.n. QB-E1 (1x24) (VWR cat. n. 460-8517)

15. Bagnomaria bollente a 100°C16. Incubatore per micropiastra a 37 ± 1°C. 17. Lavatore automatico o semiautomatico per micropiastra .18. Lettore per micropiastra dotato di filtri a 450 nm e 620 nm.

Commenti proceduraliI controlli negativo, positivo e cut-off devono essere testati in ogni seduta per convalidarne irisultati.

Trattamento dei sieriTutti i sieri di controllo, negativo (R3), cut-off (R4) e positivo (R5), devono essere trattati allo stessotempo dei campioni del test :1. Pipettare 300 µL di ciascun siero e controllo del test nelle provette singole in polipropilene da

1,5 mL. 2. Aggiungere 100 µL di soluzione di trattamento del siero (R7) ad ogni provetta. 3. Miscelare le provette accuratamente agitandole vigorosamente o al vortex. Chiudere

saldamente la provetta per evitarne l’apertura durante il riscaldamento. Per le provette contappo a pressione: utilizzare una chiusura per tappo. Non perforare il tappo.

4. Opzione blocco termico:Scaldare le provette per 6 minuti in un blocco termico a 120°C. Le provette devono essereinserite nel blocco solo quando viene raggiunta la temperatura consigliata.(*)

OPPUREOpzione bagnomaria:Se si utilizza un bagnomaria bollente: riscaldare le provette per 3 minuti a 100°C. (*)

5. Rimuovere con cautela le provette dal blocco termico o dal bagnomaria bollente e collocarlenella centrifuga. Centrifugare le provette a 10.000 x g per 10 minuti.

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6. Per il rilevamento dell’antigene galattomannano è utilizzato il supernatante.7. Testare i supernatanti con la procedura seguente. Dopo la preparazione il supernatante può

essere rimosso e conservato a 2-8°C per un massimo di 48 ore prima del test. Se l’analisi deirisultati indica la necessità di ripetere il test, occorre trattare un’altra aliquota di siero.

(*) Affinché il test vada a buon fine è necessario rispettare rigorosamente la temperatura e iltempo di esecuzione indicati ed utilizzare i materiali consigliati. Non fare affidamento allatemperatura indicata sul dispositivo. Controllare che la temperatura corrisponda alle specificheutilizzando un termometro calibrato che verrà inserito in una provetta contenente olio minerale:all’interno della provetta si dovranno raggiungere 120°C se posta in un bocco termico e 100°Cin bagnomaria bollente.

Metodo EIAAttenersi rigorosamente al protocollo proposto.Rispettare la buona pratica di laboratorio.1. Portare i reagenti a temperatura ambiente (18-25°C) per almeno 15 minuti prima dell’uso. 2. Preparare la soluzione di lavaggio, la soluzione per la reazione substrato-cromogeno e controlli

negativo, positivo e cut-off. 3. Preparare una tabella per l’identificazione dei sieri e dei controlli del test nella micropiastra.

Utilizzare un pozzetto per il siero di controllo negativo (R3), due pozzetti per il siero di controllo cut-off (R4) ed un pozzetto per il siero di controllo positivo (R5).

4. Rimuovere dal contenitore il supporto della piastra e le strisce dei pozzetti (R1) . Rimettere nellabusta le strisce non utilizzate, unitamente all’essiccante e richiudere la busta.

5. Miscelare il contenuto del flacone di coniugato (R6) capovolgendolo prima dell’uso. Aggiungere50 µL di coniugato (R6) ad ogni pozzetto. Successivamente, aggiungere ad ogni pozzetto 50 µL disupernatante di siero trattato, come specificato sopra. Non aggiungere i campioni di siero aipozzetti prima del coniugato.

6. Coprire la piastra con l’apposita pellicola o in altro modo per evitare l’evaporazione, assicurandosiche tutta la superficie sia coperta e a tenuta d’acqua.

7. Incubare la micropiastra in un incubatore a secco per micropiastre per 90 ± 5 minuti a 37°C (± 1°C).

8. Rimuovere la pellicola dalla piastra. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti e versarlo in unrecipiente per rifiuti (contenente ipoclorito di sodio). Lavare la piastra 5 volte, utilizzando un minimodi 370 µL di soluzione di lavaggio di lavoro. Dopo l’ultimo lavaggio, invertire la micropiastra epicchiettarla gentilmente su carta assorbente per eliminare il liquido rimanente.

9. Aggiungere rapidamente 200 µL di soluzione per la reazione substrato-cromogeno (R8+R9) adogni pozzetto, evitando l’esposizione alla luce intensa.

10. Incubare la micropiastra al buio a temperatura ambiente (18-25°C) per 30 ± 5 minuti.Non utilizzare pellicola adesiva in questa fase dell’incubazione.

11. Aggiungere 100 µL di soluzione bloccante (R10) ad ogni pozzetto, utilizzando lo stesso ordine diaggiunta della soluzione di substrato. Miscelare bene.

12. Pulire accuratamente il fondo di ogni piastra. 13. Leggere la densità ottica di ogni pozzetto a 450 nm (filtro di riferimento di 620 nm). Le micropiastre

devono essere lette entro 30 minuti dall’aggiunta della soluzione bloccante.

11-CONTROLLO DI QUALITÀ (CRITERI DI VALIDITÀ)

Controllo di cut-off : la densità ottica (O.D.) di ogni siero di controllo di cut-off deve essere≥ 0,300 e ≤ 0,800.

Controllo positivo : l’indice del siero di controllo positivo deve essere superiore a 2,00.

I =O.D. controllo positivo (R5)

> 2,00O.D. media del controllo cut-off

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Controllo negativo : l’indice del siero di controllo negativo deve essere inferiore a 0,40.

I =O.D. controllo negativo (R3)

< 0,40O.D. media controllo cut-off

Se uno qualsiasi dei controlli non risponde ai criteri di validità descritti sopra, il test non è validoe i risultati del campione paziente non vanno riportati. L’operatore può decidere di ripetere iltest, dopo aver riesaminato la procedura, oppure contattare il produttore per chiedereassistenza. Se il test viene ripetuto, occorre utilizzare una nuova aliquota dello stessocampione.

Esempio di calcolo:

Calcoli

Valore di controllo cut-off medio

Per calcolare l’O.D. media del controllo cut-off (R4), sommare i valori di O.D. per ogni duplicatodel controllo cut-off e dividere il risultato per 2:

(0,596 + 0,576) ÷ 2 = 0,586

Indice di controllo negativo

Per calcolare l’indice del controllo negativo, dividere l’O.D. del controllo negativo per l’O.D.media del controllo cut-off:

I =0,117

= 0,200,586

Indice di controllo positivo

Per calcolare l’indice del controllo positivo, dividere l’O.D. del controllo positivo per l’O.D.media del controllo cut-off:

I =2,602

= 4,440,586

Validità

Nell’esempio precedente:

• L’O.D. di ogni controllo cut-off è ≥ 0,300 e ≤ 0,800, pertanto il controllo di cut-off è valido. • L’indice del controllo negativo è < 0,40, pertanto il controllo negativo è valido. • L’indice del controllo positivo è > 2,00, pertanto il controllo positivo è valido.

Il test eseguito in questo esempio è considerato valido, poiché i risultati rispettano i criteri divalidità per ogni controllo.

12- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATILa presenza o assenza dell’antigene galattomannano nel campione del test viene determinatacalcolando un indice per ogni campione paziente. L’indice (I) è il valore O.D. del campionediviso per la densità ottica media dei pozzetti contenenti il siero di controllo cut-off.

Calcolo della densità ottica media del siero di controllo cut-off Sommare le densità ottiche dei due pozzetti contenenti siero di controllo cut-off (R4) e dividereil risultato per 2.

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Campione Assorbanza (O.D.)O.D. Controllo negativo (R3) 0,117

O.D. Controllo cut-off (R4) 0,5960,576

O.D. Controllo positivo (R5) 2,602

Calcolo di un indice (I) per ogni siero del test Calcolare il rapporto seguente per ogni siero del test:

I =O.D. campioneO.D. media del controllo cut-off

I sieri con indice < 0,50 sono considerati negativi all’antigene galattomannano. Nota: un risultato negativo può indicare che il risultato del paziente è inferiore al livello rilevabiledal test. Nota: i risultati negativi non escludono la diagnosi di aspergillosi invasiva. Se il risultato ènegativo ma si sospetta la presenza della malattia, è consigliabile ripetere il test. I sieri con indice ≥ 0,50 sono considerati positivi all’antigene galattomannano. Per tutti i pazienti positivi, si raccomanda di ripetere una nuova aliquota dello stesso campione e diprelevare un nuovo campione del paziente per un test di follow-up. Nota: un valore di assorbanza inferiore a 0,000 può indicare un errore procedurale o dello strumentoche deve essere valutato. Il risultato non sarà valido e il campione dovrà essere rianalizzato. Si raccomanda lo screening regolare (due volte alla settimana) dei pazienti ad alto rischio peraumentare la sensibilità e la positività precoce del test.Nota: il test Platelia™ Aspergillus EIA è concepito per essere utilizzato quale supporto nella diagnosidell'aspergillosi invasiva. I risultati positivi ottenuti con il test Platelia™ Aspergillus EIA devono esserevalutati congiuntamente ad altre procedure diagnostiche quali colture microbiologiche, esamiistologici di campioni di biopsia e prove radiografiche.

Esempio di calcolo:

CalcoliConsultare la sezione Controllo di qualità (criteri di validità) per avere un esempio dei calcoli perdeterminare la validità dei controlli del test.

Valore medio del controllo di cut-off

Per calcolare l’O.D. media del controllo cut-off (R4), sommare i valori di O.D. per ogni replicatodel controllo di cut-off e dividere il risultato per 2:

(0,596 + 0,576) ÷ 2 = 0,586

Campione paziente n. 1

Per calcolare l’indice del campione paziente n. 1, dividere l’O.D. del campione paziente perl’O.D. media del controllo cut-off:

I =0,134

= 0,230,586

In questo esempio, il campione paziente n. 1 è negativo poiché l’indice di 0,23 è < 0,50.

Campione paziente n. 2

Per calcolare l’indice del campione paziente n. 2, dividere l’O.D. del campione paziente n. 2 perl’O.D. media del controllo di cut-off:

I =0,436

= 0,740,586

84

Campione Assorbanza (O.D.)O.D. Controllo negativo (R3) 0,117

O.D. Controllo cut-off (R4) 0,5960,576

O.D. Controllo positivo (R5) 2,602

Campione paziente n.1 0,134

Campione paziente n. 2 0,436

Campione paziente n. 3 1,196

In questo esempio, il campione paziente n. 2 è positivo poiché l’indice di 0,74 è ≥ 0,50.

Campione paziente n. 3

Per calcolare l’indice del campione paziente n. 3, dividere l’O.D. del campione paziente n. 3 perl’O.D. media del controllo di cut-off:

I =1,196

= 2,040,586

In questo esempio, il campione paziente n. 3 è positivo poiché l’indice di 2,04 è ≥ 0,50.

13-LIMITI DEL METODO1. Un test negativo non esclude la diagnosi di aspergillosi invasiva. I pazienti a rischio di

aspergillosi invasiva dovrebbero essere sottoposti a test due volte per settimana. 2. Quando si analizzano campioni per rilevare la presenza di antigene galattomannano è

necessario attenersi al metodo e all’interpretazione dei risultati Platelia™ Aspergillus EIA. Siconsiglia all’utilizzatore del kit di leggere attentamente il foglietto illustrativo della confezioneprima di eseguire il test. In particolare, è necessario attenersi scrupolosamente al metododurante le fasi di pipettatura del campione e reagente, lavaggio della piastra e tempi diincubazione.

3. Se il campione o il reagente non vengono aggiunti come descritto nel metodo, il testpotrebbe dare un risultato falso negativo. Nel caso di sospetto clinico di aspergillosiinvasiva o se si commette un errore di metodo, valutare l’opportunità di ripetere il testsu ulteriori campioni.

4. Se il contenuto di un pozzetto passa da un pozzetto all’altro in seguito a erratamanipolazione della micropiastra o se si utilizza una tecnica non idonea quando si pipettano ireagenti è possibile che i pozzetti con campione paziente negativo siano contaminati daipozzetti con campione paziente positivo/di controllo.

5. Il rendimento del Platelia™ Aspergillus EIA non è stato valutato con campioni di sieropediatrico o neonatale.

6. Platelia™ Aspergillus EIA potrebbe rilevare il galattomannano in modo meno efficace inpazienti affetti da malattia granulomatosa cronica (CGD) e sindrome di Job 36, 37.

7. L’uso concomitante di terapia antifungina attiva contro le muffe in alcuni pazienti conaspergillosi invasiva potrebbe ridurre la sensibilità del Platelia™ Aspergillus EIA 20.

8. Platelia™ Aspergillus EIA non è stato valutato per l’uso con plasma o altri tipi di campioni qualiurine, BAL o CSF.

9. Non è stato determinato il rendimento del Platelia™ Aspergillus EIA in caso di determinazionevisiva del risultato.

10. Altre specie di funghi quali Penicillium, Alternaria, Paecilomyces, Geotrichum e Histoplasmahanno mostrato reattività con gli anticorpi monoclonali di ratto EBA-2 utilizzati nel test perl'individuazione dell'Aspergillus galattomannano. L'istoplasmosi deve essere tenuta in debitaconsiderazione nelle aree endemiche comprese parti degli Stati Uniti 23, 32, 38.

11. Reazioni positive senza segni clinici: considerando il rilevamento precoce dell’antigene galattomannano nel siero anche primadella comparsa di caratteristiche cliniche e/o radiologiche, si osservano generalmentereazioni positive senza segni clinici; esse corrispondono a test “falso positivi” in pazienti per iquali viene successivamente stabilita aspergillosi invasiva accertata o probabile. Tuttavia, in alcuni casi particolari, durante l’interpretazione del test occorre tenere inconsiderazione alcuni fattori: a. Sono state riportate reazioni positive senza segni clinici, soprattutto in bambini piccoli 26.

Sebbene alcuni di questi casi possano essere collegati alla reale circolazione di antigenidi Aspergillus, possono essere considerati per la maggior parte dei falso positivi.

b. È stata dimostrata la presenza di galattofuranosi in vari cibi, soprattutto cereali, prodotti abase di cereali e dolci cremosi 1,17. A differenza del latte umano, i latti umanizzaticontengono spesso elevate concentrazioni di galattomannano 10. Occorre perciò tenereconto del fattore alimentare nell’interpretazione del corso dell’antigenemia nei bambini

85

piccoli e, più in generale, in tutti i pazienti con barriera intestinale alterata 4, 10. In talepopolazione di pazienti i casi di antigenemia non accompagnata da segni clinicidovrebbero essere interpretati con cautela ancora maggiore 17.

c. Sono stati riportati risultati positivi al test del galattomannano in pazienti che assumevanopiperacil l ina/tazobactam. Sono stati inoltre riportati alcuni lotti o partite dipiperacillina/tazobactam rivelatisi positivi all’antigene galattomannano. Pertanto, risultatipositivi del test in pazienti che assumono piperacillina/tazobactam devono essereinterpretati con cautela e confermati tramite altri metodi diagnostici. Il rilevamento delgalattomannano è stato inoltre riportato in alcune partite di amoxicillina associata apreparazioni parenterali di acido clavulanico. Pertanto, quando si interpreta il test occorreprendere in considerazione i trattamenti con b-lattame semi-sintetico 1, 21. Tuttavia, poichéPlatelia™ Aspergillus EIA può rilevare l’antigene galattomannano molto prima dellacomparsa di segni clinici o radiologici, l’insorgenza di aspergillosi invasiva non può essereesclusa. Per questo motivo i pazienti trattati con piperacillina/tazobactam con risultati deltest positivi, devono essere seguiti attentamente.

d. Nei pazienti che assumono per via parenterale o per via orale (in presenza diun'alterazione della barriera intestinale) prodotti contenenti galattomannano si potrebberoosservare reazioni positive in assenza di segni clinici.Spesso, la presenza di galattomannano in questi prodotti è riconducibile all'utilizzo di unprocedimento di fermentazione a partire da microrganismi fungini.Tuttavia, un risultato positivo sarà osservato nel paziente solo se la concentrazione sericadel galattomannano esogeno raggiunge o supera la soglia di individuazione del test.In presenza di un risultato positivo sospetto in assenza di altri segni evocatori,raccomandiamo di prendere in esame i prodotti assunti dai pazienti e in particolare ilprocedimento di fabbricazione e l'origine delle materie prime utilizzate 11, 24, 31.

14-VALORI PREVISTILa prevalenza attesa di aspergillosi invasiva varia in base alla popolazione di pazienti; sono statiriportati tassi del 5-20% 7, 13. Per determinare le caratteristiche di rendimento del Platelia™ Aspergillus EIA è stato condotto unostudio clinico presso due centri europei su un totale di 4873 campioni di siero provenienti da239 episodi (203 pazienti) con tumori maligni ematologici o trapianto ematopoietico di cellulestaminali diagnosticati con e senza aspergillosi invasiva. Poiché un paziente poteva essere incluso nello studio in più di un’occasione, l’analisi è stata eseguitain base a episodi per trattamento. Per episodio si intende il periodo di tempo prima e dopo un evento clinico (ad es. trapianto, GVHD,ecc.). Ne consegue che per uno stesso paziente può essere stato osservato più di un episodio.Il tasso medio di prevalenza per questo studio era del 16% (38/239). La distribuzione di valori indiceper tali popolazioni è rappresentata nei grafici che seguono.

Pazienti diagnosticati senza aspergillosi invasiva (popolazione di controllo)

In due centri europei, sono statitestati con il test Platelia™Aspergillus EIA 3691 campioni disiero ottenuti da 201 episodi(168 pazienti). La distribuzionedei valori indice è rappresentatanel grafico che segue.

86

Distribuzione del valore di indice siericodalla popolazione di pazienti controllo N= 3691

3240

33054 32 13 4 4 3 0 1 0 0 3 1 0 6

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1000

1500

2000

2500

3000

3500

Indice

Nu

mer

o d

i sie

ri

Questo grafico a disper sioneriporta i risultati del test per ilgalattomannano su 3691campioni di siero provenienti da201 episodi (168 pazienti dicontrollo) (pazienti sottoposti aterapia immunosoppressiva perHSCT o per curare un tumoremaligno ematologico).

Pazienti diagnosticati con aspergillosi invasiva

Questo grafico a dispersione riporta i risultati del test per il galattomannano su 1182 campionidi siero provenienti da 38 episodi (35 pazienti di controllo), diagnosticati con aspergillosiinvasiva accertata o probabile in base alle definizioni EORTC/NIAID.

Non si prevede che tutti i campioni di siero di ogni paziente siano positivi. La prevalenza attesa diaspergillosi invasiva varia in base alla popolazione di pazienti; sono stati riportati tassi del 5-20% 7, 13. Il grado di prevalenza per questo studio era del 16%.

I grafici seguenti rappresentano rispettivamente esempi di un paziente senza segni clinici osintomi di aspergillosi invasiva (negativo per Aspergillus) e di un paziente con aspergillosiinvasiva accertata (positivo per Aspergillus).

Paziente negativo:

87

ASPERGILLOSI INVASIVA PROBABILE/ACCERTATA:DISTRIBUZIONE DELL'INDICE / EPISODIO

(N=38 episodi da 35 pazienti)

0,0

1,0

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3,0

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5,0

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0 5 10 15 20 25 30 35 40

Numero episodi

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0 10 20 30 40 50 60

Giorni

Índ

ice

POPOLAZIONE DI CONTROLLO:DISTRIBUZIONE DELL'INDICE / EPISODIO

(N= 201 episodi da 168 pazienti)

0

0,5

1

1,5

2

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Numero episodi

Índ

ice

Paziente positivo:

15. CARATTERISTICHE SPECIFICHE DI RENDIMENTO

A. Studi di riproducibilitàLa variabilità nel test e fra i test di Platelia™ Aspergillus EIA è stata determinata in uno studioutilizzando un pannello di 6 campioni di siero (uno negativo, uno debolmente positivo, due positivi edue fortemente positivi) provenienti da tre siti in Nord America. Ognuno dei 6 campioni del pannello èstato testato in triplicato (x3) in 3 giorni diversi, su un lotto, presso due centri (numero totale direplicati in ogni centro = 9). Ognuno dei 6 campioni del pannello è stato testato in duplicato (x2) in3 giorni diversi, su un lotto, presso un terzo centro (numero totale di replicati in ogni centro = 6).

Un solo (1) operatore ha eseguito tutte le analisi di precisione presso ogni centro. I dati sono statianalizzati in conformità con il National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Leseguenti tabelle presentano i valori per densità ottica media (O.D), valore di indice medio, deviazionestandard (SD), coefficiente di variazione percentuale (CV%), precisione nella serie (nel test) eprecisione nel centro (fra i test) per tutti i campioni del pannello presso ogni centro.

88

ASPERGILLOSI INVASIVA ACCERTATA

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

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B. Reattività crociataÈ stato eseguito uno studio su un lotto del kit Platelia™ Aspergillus EIA al fine di valutare l’effetto dicondizioni mediche non legate all’aspergillosi invasiva che potrebbero interferire con il test. I seguenticampioni di siero sono stati analizzati per reattività crociata con Platelia™ Aspergillus EIA. Sono statitestati complessivamente 151 sieri.

* Uno per ognuno dei seguenti tipi: vescica, seno (2), colon, endometrio, polmone, prostata, reni ecancro squamoso (3).

C. Test cliniciI test clinici per la valutazione di sensibilità, specificità e valore predittivo del Platelia™ Aspergillus EIAsono stati condotti presso due centri in Belgio e nei Paesi Bassi. Lo studio è stato condottoretrospettivamente utilizzando complessivamente 4873 campioni di siero prelevati da 203 pazientidalle seguenti popolazioni*: • pazienti senza segni di aspergillosi invasiva (pazienti di controllo)• pazienti con aspergillosi invasiva probabile• pazienti con aspergillosi invasiva accertata* L’Invasive Fungal Infection Cooperative Group (IFICG) della European Organization for Researchand Treatment of Cancer (EORTC) ed il Mycosis Study Group (MSG) del National Institute of Allergyand Infectious Diseases (NIAID) hanno definito i criteri per la diagnosi dell’aspergillosi invasiva (IA) inpazienti con tumori maligni ematologici o trapianto ematopoietico di cellule staminali 2.

L’aspergillosi invasiva accertata è definita mediante coltura microbiologica positiva ottenuta conprocedura sterile dal sito colpito e dalla dimostrazione istopatologica delle morfologie appropriate inun ospite con sintomi attribuiti all’infezione fungina.

L’aspergillosi invasiva probabile è definita da almeno un criterio microbiologico e un criterio clinicomaggiore o da due criteri clinici minori relativi ad un sito le cui caratteristiche sono compatibili conl’infezione, in un ospite che presenta sintomi attribuiti all’infezione fungina.

L’aspergillosi invasiva possibile è definita da almeno un criterio microbiologico o un criterio clinicomaggiore o due criteri clinici minori relativi ad un sito con caratteristiche compatibili con l’infezione, inun ospite che presenta sintomi attribuiti all’infezione fungina.

90

PatologiaN. di campioni

testatiN. di positivi

Fattore reumatoide 10 0

Positivo ANA 10 0

Ipergammaglobulinemia lgG 10 0

Ipergammaglobulinemia lgM 10 0

Tumore * 11 0

Cirrosi non virale (biliare primaria;Indotta da alcool; indotta da droghe) 10 0

Trasfusioni multiple 10 0

Donne multipare 10 0

HAV 10 0

HCV 10 0

Rosolia 10 0

CMV 10 0

Sifilide (RPR+) 10 0

Toxoplasmosi 10 0

Micoplasma 10 0

Data la relativa rarità dell’aspergillosi invasiva probabile e accertata, viene fornita di seguito ladefinizione di sensibilità e specificità clinica per gli scopi del presente studio.

SENSIBILITÀI risultati di questo studio sono stati analizzati in termini di sensibilità del paziente. I test di sensibilitàsono stati eseguiti utilizzando Platelia™ Aspergillus EIA in due centri su un totale combinato di38 episodi da 35 pazienti sottoposti a trapianto di midollo osseo (BMT) e affetti da leucemia ai qualiera stata diagnosticata aspergillosi invasiva accertata o probabile.

1. Aspergillosi accertata (come definita da IFICG/EORTC; vedere quanto riportatosopra)

Siti combinati N = 19 episodi da 16 pazienti

Sensibilità: 100% (19/19).

Nota: non è stato possibile calcolare l’intervallo di confidenza del 95% a causa delle dimensioniinsufficienti del campione.

2. Aspergillosi probabile (come definita da IFICG/EORTC; vedere quanto riportatosopra)

Siti combinati N = 19 episodi da 19 pazienti

Sensibilità: 94,7% (18/19).

Nota: non è stato possibile calcolare l’intervallo di confidenza del 95% a causa delle dimensioniinsufficienti del campione.

3. Aspergillosi accertata e aspergillosi probabile combinate (come definita daIFICG/EORTC; vedere quanto riportato sopra)

Siti combinati N = 38 episodi da 35 pazienti

Sensibilità: 97,4% (37/38). L’intervallo di confidenza del 95% è 86,2 – 99,9%.

SPECIFICITÀ I test di specificità sono stati eseguiti utilizzando Platelia™ Aspergillus EIA in due centri su un totalecombinato di 3691 campioni da 201 episodi (168 pazienti) senza segni di aspergillosi invasiva(pazienti di controllo).

Centro 1: N = 3060 campioni da 103 episodi (70 pazienti)Specificità: 92,2% (95/103) L’intervallo di confidenza del 95% è 85,3 – 96,6%.

Centro 2: N = 631 campioni da 98 episodi (98 pazienti)Specificità: 88,8% (87/98) L’intervallo di confidenza del 95% è 80,8 -94,3%.

Siti combinati N = 3691 campioni da 201 episodi (168 pazienti)Specificità: 90,5% (182/201) L’intervallo di confidenza del 95% è 85,6 – 94,2%.

VALORE PREDITTIVOI valori predittivi positivo e negativo (PPV, NPV) sono stati analizzati per la popolazione di pazientidello studio, sulla base del tasso di prevalenza effettivo medio del 16% osservato nello studio.PPV: 66,1% (37/56) NPV: 99,4% (182/183) E’ stata inoltre effettuata una analisi considerando i risultati positivi quando 2 campioniconsecutivi avevano un indice pari o superiore a 0,5.

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Il rendimento è riassunto nella tabella che segue:

*: la sensibilità è stata calcolata su aspergillosi invasiva accertata e probabile.

16-CONTROLLO DI QUALITÀ DEL PRODUTTORETutti i reagenti prodotti sono preparati in base al nostro Sistema di Qualità, dal ricevimento dellematerie prime fino alla commercializzazione del prodotto.Ogni lotto è sottoposto a valutazioni di controllo qualità e viene immesso sul mercato solo dopo laconferma di criteri di accettazione predefiniti.I dati relativi alla produzione e al controllo di ogni singolo lotto sono conservati da Bio-Rad.

17-BIBLIOGRAFIAVedere la versione Inglese.

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Sensibilità* Specificità PPV NPV

Siti combinati considerando 1 campione ≥ 0,5

97,4%(37/38)

90,5%(182/201)

66,1%(37/56)

99,4%(182/183)

Siti combinati considerando 2 campioni consecutivi ≥ 0,5

92,1%(35/38)

97,5%(196/201)

87,5%(35/40)

98,5%(196/199)

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