13.2.KROMATOGRAFIJA

Odjel za kemiju

Kromatografiju je izumio ruski botaniar Tswett (Cvet) poetkom 20. st. Primijenio je kromatografsku tehniku za odjeljivanje otopine biljnih pigmenata klorofila i ksantofila prolaskom kroz staklenu kolonu napunjenu usitnjenim Ca-karbonatom. Odjeljeni sastojci vide se na koloni kao obojene vrpce po kojima je ta tehnika dobila ime (gr. Chroma = boja)

13.2.1. KROMATOGRAFSKE METODEDefinicija i osnovni pojmovi

Kromatografija je fizikalna metoda koja se koristi za razdvajanje smjesa kojom se sastojci koji se razdvajaju raspodjeljuju izmeu dvije faze:

nepokretne ili stacionarne faze (stationary phase, adsorbent, SP) pokretne ili mobilne faze (mobile phase, eluent, MP)

Stacionarna faza: kruta, tekua (vezana na vrstom nosau), gel

Mobilna fazaplinovita: plinska kromatografija (gas chromatography, GC),tekua: tekuinska kromatografija (liquid chromatography, LC)

Kromatografska kolona: cijev koja sadri stacionarnu fazu i kroz koju prolazi mobilna faza.Kromatograf: ureaj za izvoenje kromatografskih razdvajanjaKromatogram: grafiki prikaz odziva detektora (kromatografske analize)

13.2.1.1. PODJELA KROMATOGRAFSKIH METODAPlona kromatografijastacionarna faza nanesena je na ravnu plohu ili u pore papira. Mobilna faza prolazi kroz stacionarnu zbog kapilarnih sila ili gravitacije

Kromatografija na stupcustacionarna faza ispunjava usku cijev kroz koju se mobilna faza kree pod utjecajem tlaka ili gravitacije

PODJELA PREMA AGREGATNOM STANJU FAZA:

PODJELA PREMA FIZIKO KEMIJSKIM SVOJSTVIMA ANALITA

PODJELA PREMA IZVEDBENIM TEHNIKAMA:

13.2.2. Kromatografska analiza:

1. Unoenje (injektiranje) analitaunoenje uzorka u mobilnu fazu

2. Razdvajanje analita u kolonisastojci iz analita razdvajaju se u koloni na temelju razliite raspodjele izmeu dviju faza

3. Eluacija (ispiranje) komponenti iz kolone razliiti sastojci izlaze iz kolone u razliitim vremenima

4. Detekcijaeluirane komponente obino se analiziraju mjerenjem neke od fizikalnih svojstava komponente (indeks refrakcije, UV apsorpcija, elektrina vodljivost )

a) TEKUINSKA KROMATOGRAFIJA (LC)

Eluacija ispiranje sastojaka koji prolaze kroz kolonu dodavanjem novih koliina otapala.Ako je stacionarna faza polarna onda se za mobilnu uzima nepolarna.

Raspodjela analita izmeu faza

Analit se nalazi u ravnotei izmeu dvije faze:

Amobile Astationary

Konstanta ravnotee K te reakcije zove se koeficijent raspodjele:

cS molarna analitika koncentracija sastojka u stacionarnoj fazi,

cM molarna analitika koncentracija sastojka u mobilnoj fazi.

Vrijeme zadravanja (retention time) tR - vrijeme potrebno da analit nakon unoenja uzorka stigne u detektor

Mrtvo vrijeme tM - vrijeme potrebno da mobilna faza proe kroz kolonu

..... Faktor kapaciteta (faktor zadravanja) (retention factor, capacity factor)

za k'A znatno manje od 1 eluiranje je prebrzo, tR teko mjerljivo,

za k'A > 20-30 eluiranje je predugo,

k'A 1 5 idealno

b) KOLONSKA KROMATOGRAFIJA (CC)

Tiselius zaetnik kolonske kromatografije 1952.

a) punjene kolonematerijal: elik, staklo, teflonduljina: 2-3 m, unutarnji promjer: 2-4 mmpunjenje: vrsti nosa (obino dijatomejska zemlja) na kojem je nanesen tanki sloj stacionarne (tekue) faze

b) kapilarne kolonematerijal: danas uglavnom kvarcno stakloduljina: 10-100 m, unutarnji promjer: 0.1 - 0.5 mmpunjenje: unutarnje stjenke prevuene samo slojem tekue stacionarne faze ili nosaem na kojem se nalazi adsorbirana stacionarna faza

c) KROMATOGRAFIJA NA PAPIRU (PC)

Primjena PC:identifikacija supstancija,ispitivanje istoe supstancija.Osobine PC:relativno brza metoda,potrebna mala koliina materijala. stacionarna faza: visokokvalitetni filter papir mobilna faza: otopina razvijaa http://www.youtube.com/watch?v=EUn2skAAjHk

d) TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA (TLC)E. Stahl - zaetnik tankoslojne kromatografije (TLC), 1950Isti je pricip kao kod papirne kromatografije.

Tankoslojna kromatografija (Thin layer chromatography (TLC))

e) PLINSKA KROMATOGRAFIJA (GC) Martin i James zaetnici plinske kromatografije (GC), 1952. (Nobelova nagrada)

Mobilna faza: - inertni plin koji eluira komponente smjese u koloni napunjenoj stacionarnom fazom. - Za razliku od tekuinske kromatografije u plinskoj kromatografiji analit ne reagira s mobilnom fazom te zbog toga njegova brzina kretanja kroz kolonu ne ovisi o kemijskoj strukturi mobilne faze.

Stacionarna faza: - za odjeljivanje komponenti male molekulske mase: stacionarna faza je vrsta tvar velike specifine povrine na koju se adsorbiraju analizirane komponente, - za odjeljivanje komponenti velike molekulske mase: stacionarna faza je tekua faza nanesena na povrinu vrstog nosaa adsorpcijom ili kemijskim vezanjem.

Analit:

ubrizgava se kao tekuina koja zbog visoke temperature u kromatografu prelazi u plinovito stanje, temperatura ulaza instrumenta postavlja se na 50C viu temperaturu od temperature vrelita najslabije hlapljive komponente iz analizirane smjese.

Plinski kromatograf

Sastavni dijelovi aparata:Plin nosilac (carrier gas):kemijski inertan (N2 He, Ar, H2)regulirani protok plinaSustav za unoenje uzorka:koliina uzorka: 0.1 20 Lmjesto unoenja uzorka je grijano (ca. 50C iznad temp. vrelita najmanje hlapljivog sastojka

Faze plinsko-kromatografske analize:

unoenje uzorka na vrh kolone,

transport uzorka mobilnom fazom kroz kolonu,

adsorpcija sastojaka u stacionarnoj fazi,

detekcija sastojaka.

http://www.wooster.edu/chemistry/analytical/gc/default.html

FIDECD

Plinska kromatografija

Slika prikazuje sofisticirani plinski kromatografski sustav, koji biljei koncentraciju akrilonitrila u zraku.

f) TEKUINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE DJELOTVORNOSTI (HPLC)

Mobilna faza: tekuinaStacionarna faza: punila vrlo finih zrnaTlak: nekoliko milijuna Pa (do 4 x 107 Pa = 400 bara) - tlana pumpa, sisaljka

Podjela HPLC (High Performance Liquid Chromatography):

(1) Razdjelna kromatografija (2) Adsorpcijska kromatografija (3) Ionsko-izmjenjivaka kromatografija (4) Kromatografija iskljuenjem na osnovi veliine estica (size-exclusion chromatography)

Doseg HPLC: najvei u separacijskim tehnikama, proizvodnja > mld USD godinje

Prednosti HPLC:

- osjetljivost, - prilagodljivost, - analiza neisparljivih i termiki osjetljivih spojeva, - iroki spektar uzoraka (industrija, znanost: aminokiseline, nukleinske kiseline, eeri, lijekovi, pesticidi, organometalni spojevi, anorganske tvari i dr.)

Shema HPLC ureaja

Efluent s kolone mjea se s vodikom i zrakom i spaljuje.Organski sastojci sagorijevaju u plamenu stvarajui ione i elektrone koji mogu provoditi elektricitet kroz plamen. Na vrh plamenika dovodi se visoki elektrini potencijal, a iznad plamena postavljena je kolektorska elektroda. Mjeri se elektrina struja izazvana pirolizom organskih sastojaka. 13.2.3. DETEKTORI

DETEKTORI

Kljuni su dio HPLC-ureaja: stalno se usavravaju

Nema ope primjenljivih detektora (kao FID/TCD)

Zahtjevi: kao kod GC; dodatno: to manji volumen uzorka

Tipovi: (1) prate promjenu svojstava mobilne faze (indeks loma, dielektrina konstanta i dr.), (2) detektori analita (UV, fluorescencija...).

Zastupljenost: 71% UV, 15% fluorescencijski, 5% indeks loma

13.2.3.1. UV/VIS-apsorpcijski detektori

Svojstva: univerzalnost, jednostavnost, selektivnost, osjetljivost - vrlo su raireni

Naelo: apsorpcija elektromagnetskog zraenja u UV-(170 - 400 nm) i VIS-podruju (400 - 750 nm)

Lambert-Beerov zakon (za kvantitativnu primjenu):

A = b c

Tipini UV/VIS-detektor: volumen 1-10 l, duljina 2-10 mm, tlak < 40 bar (potrebni reduktori)

13.2.3.2. Detektori s filterima- Izvor zraenja: Hg-lunica iz koje filtar izdvaja = 254 nm (odnosno 250, 313, 334 nm) - primjena ograniena.Izvor zraenja: deuterijeva (D2) ili volframova (W) lampa s vie filtera (rotirajui) - za serijske analize uzoraka poznata sastava.

13.2.3.3. Detektori s monokromatorima- Prizme ili optike reetke (grating) razdvajaju polikromatsko svjetlo na komponente odreenih valnih duljina koje se potom djelovanjem pukotine odaberu prema uzorku da bi se snimio cijeli kromatogram.

Alternativa: za svaku komponentu uzorka (ako su dovoljne razlike tR) odabire se najpogodnija , uz moguu kompjutorsku podrku

- izvor D2-lunica (190-800 nm), uz izdvajanje putem reetke (grating) snopova irokih 2-4 nm (starije naprave 20-40 nm)

13.2.3.4. Detektor s nizom dioda (Diode Array Detector) Naelo: osvjetljivanje uzorka polikromatskim svjetlom (bijelim) D2-lunice, a potom disperzija optikom reetkom na snopove 2 nm koji istodobno padaju na niz od cca 316 dioda

- Cijeli snimak (scan): 0,1 sekunda (u praksi nekoliko sekundi) uz odlinu reproducibilnost. Dobiva se i pohranjuje cijeli spektar svake komponente.

Mogunost: 3-dimenzionalni graf A--t za razdvojene steroide u intervalu 5 sekundi

13.2.3.5. Fluorescencijski detektori

Fluorescencija neke tvari apsorbiraju elektromagnetsko zraenje i pri relaksaciji (prelazak iz pobuenog u osnovno stanje) emitiraju zraenje vie valne duljine (esto u vidljivom dijelu spektra, VIS)

Ogranieno na fluorescirajue spojeve (farmacija, prirodni i kliniki spojevi,naftni derivati); mogua je pretvorba nefluorescirajuih u fluorescirajue spojeve!

Izvori elektromagnetskog zraenja: (1) Hg-lunica (emitirano svjetlo izolira se s filtera) (2) Xe-izvor (monokromatori su optike reetke)

Emitirana svjetlost iri se u svim smjerovima pa je fotoelektrini detektor pod 900 prema upadne zrake

13.2.3.6. Detektori za mjerenje indeksa loma

Svojstva: pouzdanost, neovisnost o protoku, niska osjetljivost, ovisna o temperaturi (opi ureaj poput FID) Naelo: prisutnost otopljene tvari (solute) mijenja indeks loma mobilne faze (MF) Naprava: Diferencijalni detektor; u komoru odijeljenu staklenom ploicom s jedne strane prolazi otapalo a s druge eluat. Ploa uzrokuje lom ulazne zrake.