Preparao de amostras para anlise microbiolgica

1. INTRODUOOs mtodos usados para o isolamento e contagem de microrganismos presentes em alimentos slidos ou pastosos exigem o tratamento prvio da amostra, de forma a transferir para uma fase lquida (geralmente uma soluo isotnica, designada diluente) os microrganismos presentes no seu interior ou aderentes sua superfcie. H pois que garantir uma homogeneizao correcta da amostra, que feita, normalmente, por processos mecnicos.O procedimento mais vulgarmente utilizado consiste na triturao da amostra na presena do diluente, recorrendo-se, para tal, a trituradores elctricos munidos de hastes com ps que giram a alta velocidade. Tal procedimento, ainda que prtico e eficiente em termos de homogeneizao, no totalmente correcto do ponto de vista microbiolgico. Por um lado, porque a aco mecnica violenta que exercida sobre a amostra a analisar, pode provocar o seu aquecimento e, consequentemente, afectar a flora microbiana presente. Por outro, porque pode fragmentar estruturas filamentosas dos microrganismos (hifas de fungos, bactrias agrupadas, pseudomiclio de leveduras, etc.), conduzindo a resultados por excesso. Este procedimento desaconselhado em amostras que contm microrganismos patognicos, devido formao de aerossis.Para limitar as variaes dos resultados, tornando-os minimamente reprodutveis, necessrio que as condies de homogeneizao sejam normalizadas. Ainda que tais parmetros possam variar um pouco como tipo de alimento a analisar, a experincia mostra que a velocidade do triturador deve estar compreendida entre 8000 e 45000 r.p.m. e o tempo de homogeneizao ser o suficiente para se conseguir um total de 15-20000 rotaes.No sentido de ultrapassar os inconvenientes da homogeneizao por triturao desenvolveu-se, posteriormente, um outro processo mecnico, mais suave, em que a amostra sujeita a um batimento dentro de um saco esterilizado, preparado para o efeito na presena do agente diluente.Ainda que tal processo evite os inconvenientes atrs referidos, no permite uma homogeneizao to perfeita da amostra em determinados alimentos slidos, obrigando o analista a ponderar, cuidadosamente, a sua escolha.Outro factor de grande importncia a considerar na preparao da amostra para anlise microbiolgica, tem a ver com o agente diluidor a utilizar. Muitos dos agentes habitualmente utilizados- solues salinas, soluo de Ringer, tampo fosfato, gua destilada ou gua peptonada - podem ser txicos para alguns microrganismos, particularmente se se prolonga de forma excessiva o seu tempo de contacto. Os vrios estudos que tm sido realizados nesta perspectiva, tm mostrado que os agentes diluidores mais adequados so os que contm 0,1% de peptona em gua destilada ou em soluo salina. Para anlises especiais, contudo, pode ter de se usar diluidores especficos, como acontece no caso das bactrias halfilas ou outros microrganismos osmfilos.

2. MATERIAL2.1. Alimentos slidos1. Balana(sensibilidade - 0,1 g).2. Faca, pina e tesoura esterilizadas.3. Provetas graduadas de 50 ml esterilizadas.4. Frasco de vidro com tampa roscada de 125 ml, esterilizado.5. Marcador para vidro.6. Homogeneizador apropriado (frasco com prolas; almofariz; Stomacher).7. Diluentes: soluo de triptona sal (diluente genrico); soluo de Ringer (diluente para leite e produtos lcteos); gua peptonada tamponada (diluente para produtos base de ovo). A composio e preparao so descritas em anexo.2.2. Gorduras alimentares1. Balana (sensibilidade-0,1 g).2. Banho-maria a 42 0,5C.3. Diluente (soluo de Ringer a 1/4 ou tampo fosfato). A composio e preparao descrita em anexo.4. Pipetas graduadas de 10 ml divididas em dcimos, esterilizadas.5. Esptula esterilizada.6. Frasco com prolas de vidro esterilizado.7. Centrfuga.8. Tubos de centrfuga.

3. PROCEDIMENTO

3.1. Alimentos slidos1. Tarar o saco2. Pesar para dentro do saco, assepticamente, a quantidade de amostra necessria, segundo as normas portuguesas para cada produto (10 g o mais usual (ICMSF, 1983)). No caso de no haver norma portuguesa, adoptar critrio semelhante ao existente numa norma para um produto do mesmo tipo.3. Juntar, assepticamente, o volume do diluidor necessrio para obter uma diluio de 1/10 (p/v). Utilizar para tal uma proveta graduada esterilizada.4. Colocar a amostra no homogeneizador. A velocidade de homogeneizao no deve ultrapassar as45000 r.p.m. e o tempo de homogeneizao deve ser o suficiente para se obter um total de 15-20000 rotaes. No caso de se utilizar um homogeneizador do tipo "Stomacher" a durao da homogeneizao ser de 60 segundos a uma velocidade de 230 r.p.m.5. Deixar em repouso temperatura ambiente durante 30 minutos.6. Aps o perodo de repouso, proceder, com brevidade, s diluies necessrias para as diferentes anlises e, logo em seguida, s sementeiras.

3.2. Gorduras alimentares1. Tarar o frasco.2. Pesar ou pipetar (a pipeta deve estar aquecida a 45C) para o frasco, assepticamente, a quantidade necessria de gordura (ver Norma Portuguesa do produto).3. Juntar, assepticamente o volume de diluidor na proporo de 9 vezes a do produto. conveniente que o diluidor esteja a uma temperatura superior do ambiente.4. Colocar o frasco em banho-maria (420,5C). Agitar o frasco periodicamente durante 30-60 minutos.5. Proceder com a brevidade desejada s diluies necessrias para a anlise microbiolgica.Se pretender realizar a anlise num volume conhecido da fase aquosa dever seguir o seguinte procedimento, aps a liquefao da gordura.1. Transferir, assepticamente, o contedo do frasco para tubos de centrifuga.2. Centrifugar a 5 000 r.p.m. durante 25 minutos.3. Decantar a gordura sobrenadante.4. Juntar fase aquosa mais diluidor na mesma proporo.5. Repetir o ponto 2.6. Recolher a fase aquosa com uma pipeta e medir o volume obtido com uma proveta graduada.Registar este valor.7. Proceder imediatamente anlise microbiolgica.