E.L.I.S.A

Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay

Elaborado por:

Br. Leomar Palacios

Antecedentes

• El nombre enzyme-liked immunosorbent assay, luego abreviado como ELISA, fue acuñado por los investigadores suecos Eva Engvall y Peter Perimann, los cuales describieron el procedimiento, publicado en 1971.

• Las aplicaciones mas interesantes se iniciaron en el campo de la microbiología y parasitología.

ELISA

Ensayo de InmunoAbsorción Ligado a Enzimas.

• Se considera ligado a enzima porque una enzima se une químicamente a un anticuerpo en las dos versiones de la prueba (indirecta y directa)

• El inmunoabsorvente, se refiere al hecho de que los antígenos o anticuerpos son adsorvidos a un plástico.

ELISA puede investigar la presencia de un antígeno o de un anticuerpo.

ELISADEFINICIÓN

• El ELISA se basa e el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad

tanto inmunológica como enzimática.

• Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e

insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-

anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un

substrato especifico

• El cual al actuar la enzima, producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.

Antígenos• Los antígenos son, por definición, generadores de

anticuerpos. • Incluyen proteínas, polisacáridos y varias moléculas

pequeñas, que estimulan la producción de anticuerpos.• Los antígenos son, a menudo, moléculas que se definen

como <no propias> o extrañas, para el organismo. • Hay <antígenos propios> que actúan como etiquetas de

identificación

Anticuerpo• Son la respuesta del organismo ante la presencia de un agente

infeccioso.• Los anticuerpos son moléculas proteicas secretadas por los

plasmocitos, y tienen una altísima afinidad por sus antígenos correspondientes.

• Anticuerpos se caracterizan por:– Ser Defensa natural– Tener Utilidad terapéutica– Tener Utilidad Diagnóstica

Marcador de Infección o exposición.Detección de antígenos

• Los anticuerpos utilizados en el método ELISA son de origen monoclonal o policlonal.

Anticuerpo

• Anticuerpos PoliclonalesHeterogéneosReconocen epítopes diferentes del AgProducidos por numerosos clones de

Linfocitos B• Anticuerpos Monoclonales

HomogéneosEspecificidad únicaProducidos por un único clon de Linfocitos

B

Controles

Se utilizan para asegurar que la prueba esta funcionando correctamente

• Control POSITIVO Incluyen una sustancia que se sabe que

reaccionara positivamente, proporcionando así, un patrón sobre el cual basar los resultados.

• Control NEGATIVOIncluyen sustancias que no deben

reaccionar .

Fundamento del ELISA

Ag o Acfijado auna faseSólida

Ag o Acen laMuestra

Conjugado:Ac unido aENZIMA

SUSTRATO

CAMBIODE

COLOR

Elementos del ELISA

• FASE SÓLIDA• Antígeno o Anticuerpo• Conjugado: ENZIMA• SUBSTRATO

Fase SólidaSE PUEDEN UTILIZAR DOS TIPOS DE SUSTANCIAS

• Las que favorecen la adsorción física (por fuerzas electroestáticas) de las moléculas de Ags o Acs: poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, nylon y silicona.

• Las que permiten la fijación covalente de esos reactivos: acrilamida, celulosa y isoticianato

• Los mejores resultados se obtienen con el peliestireno y el polvinilo, por su rigidez, transparencia y propiedades adsortivas.

Conjugado: EnzimaLa enzima escogida como marcador debe:

• Unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos,• Encontrarse en estado puro a un precio razonable y

• Tener un substrato cromogénico o fluorogénico conveniente y de fácil preparación.

Las enzimas más utilizadas son fosfatas alcalina,

peroxidasa de rábano y ß-galactosidas

SubstratoLa elección del substrato es de gran importancia para la estandarización del método ELISA y hay que tener

varios factores en cuenta, como son sensibilidad, especificidad, facilidad de lectura, así

como estabilidad después de lareacción.

Requerimientos del sustrato

• Solubles en agua• Fácil de manipular• No tóxicos, no mutagénicos• Bajo costo

Tipos de ELISALos métodos de ELISA dependiendo de la actividad

enzimática se dividen en dos tipos: • Competitivos • No competitivos • ELISA COMPETITIVO:

En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.

Tipos de ELISA• ELISA NO COMPETITIVO:

Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al

agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color

Dentro de los no competitivos tenemos:

• Los directos que detectan antígenos • Los indirectos que detectan anticuerpos

Tipos de ELISA

• Si la prueba se diseña para detectar un antígeno, es un ELISA DIRECTO porque esta buscando directamente, como su nombre lo dice, la sustancia extraña.

• En cambio, un ELISA INDIRECTO, por su parte, se diseña para detectar los anticuerpos que el paciente ha creado contra el antígeno

ELISA INDIRECTO

El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado

contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una

amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario.

MaterialesMateriales Orgánicos

• Las Muestras del Paciente (Saliva, orina, heces, sangre, etc.)• Antígenos• Anticuerpos• Enzimas

Materiales No Orgánicos

• Microplacas de 96 pocillos de plástico con fondos de pocillo ópticamente claros, pipeta multicanal, pipeta de 100µ.

• Espectrofotómetros de lectura de placas (lectores ELISA).

Fases del ELISA Indirecto• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los

anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.

• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

Fases del ELISA Indirecto• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los

cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.

• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado

Leyenda

Antígeno

Anticuerpo Primario

AnticuerpoLigado a Enzima

Sustrato

Prueba ELISA Indirecta

Aplicaciones del ELISA

• Detección de antígenos o anticuerpos:

VirusHongos ParásitosBacterias.

• Detección de autoanticuerpos:

IgG(Factor reumatoideo)DNA Proteína del núcleo

Aplicaciones del ELISA

• Medición de Hormonas:

Progesterona, estrógenos, cortisol, insulina, testosterona, gonadotropina coriónica humana, TSH.

• Detección de antígenos tumorales:

Antígeno prostáticoAlfa-fetoproteína Antígeno del ovario Antígeno carcinoembrionario

Importancia

• En estudios serológicos, hematológicos, endocrinológicos, oncológicos, en los transplantes, la medicina forense y la antropología.

• Con propósitos médicos se han aplicado en la determinación de hormonas y proteínas plasmáticas, antígenos tumorales, drogas, Ag y Ac de microorganismos (parásitos, hongos, bacterias, virus)

• Los resultados aportan elementos diagnósticos, información de una enfermedad y coadyudan en la planificación del tratamiento