Enzymy

Ogólne właściwości

Kinetyka i inhibicja reakcji enzymatycznych

Regulacja aktywności enzymatycznej

Enzymy jako biokatalizatory

głównie białka (także RNA – rybozymy, DNA – DNA-zymy)

wytwarzane tylko przez żywe komórki (ale mogą działać pozakomórkowo)

przyspieszają reakcje biochemiczne, aby zachodziły z dostateczną

wydajnością (106-1011 razy) – wysoka efektywność

nie zużywają się, nie zmieniają się trwale podczas reakcji

działają selektywnie → regulują procesy metaboliczne

– wspomagają utrzymanie homeostazy

Enzymy jako biokatalizatory

⚫

⚫

⚫

⚫

nie zmieniają końcowego składu mieszaniny

(odtwarzają się po reakcji)

nie zmieniają stałej równowagi danej reakcji

odwracalnej

przyspieszają osiągnięcie równowagi w

reakcjach termodynamicznie możliwych

zmieniają mechanizm reakcji – tworzą związki

przejściowe

Enzymy zmieniają szybkość reakcji poprzez:

⚫ lokalne zwiększanie stężenia substratu i utrzymania substratów w konformacji,

która sprzyja specyficznym reakcjom chemicznym

⚫ dostarczenie reszt aminokwasowych, których grupy funkcyjne odgrywają

specyficzną rolę w katalizie

⚫ obniżenie energii aktywacji dla tworzenia stanów przejściowych

Nazewnictwo enzymów

Nazwy powszechnie używane:

⚫ oksydaza ksantynowa – (substrat)

⚫ lipaza (gr. lípos – tłuszcz)

⚫ rybonukleaza trzustkowa – (źródło)

⚫ lipaza wrażliwa na hormon – (regulacja)

⚫ proteaza cysteinowa (mech. działania)

⚫ pepsyna (gr. pepsis – trawienie) - (funkcja w organizmie)

⚫ lizozym (od lizujących właściwości wobec bakterii)

Nazewnictwo enzymów

hydrolaza acetylocholiny

przyrostek -aza substrat/ykatalizowana reakcja

oksydoreduktaza alkohol:NAD

Nazewnictwo enzymów

Numer EC• numer przypisany każdemu enzymowi wg zasad klasyfikacji opracowanejprzez Komitet Nazewnictwa Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej (ang. International Union of Biochemistry and Molecular Biology, IUBMB), 1984

• Enzyme Commission (Komisja Enzymatyczna) lub Enzyme Catalogue

XX.XX.XX.XX

klasa . podklasa . podpodklasa . nr w podpodklasie

2.6.1.1

2. -. -.- Transferazy2. 6. -.- Przenoszące grupy azotowe2. 6. 1.- Transaminazy (aminotransferases)2.6.1.1 Transaminaza asparaginianowa

Klasyfikacja enzymówze względu na rodzaj katalizowanej reakcji

EC 1- Oksydoreduktazy− przenoszą ładunki (elektrony i jony H3O+ - protony) z cząsteczki

substratu na cząsteczkę akceptora (dehydrogenazy, oksydazy)

EC 2 – Transferazy

− przenoszą daną grupę funkcyjną (tiolową, aminową, itp.) z cząsteczkijednej substancji na cząsteczkę innej substancji (transaminazy, kinazy)

EC 3 – Hydrolazy

− powodują rozpad substratu pod wpływem wody (hydroliza)− rozczepienie wiązań C-C, C-O, C-N, innych

EC 4 – Liazy

− powodują rozpad substratu bez hydrolizy− rozszczepienie wiązań (C-C, C-O, C-N,inne) przez eliminację atomu i

wytworzenie wiązania podwójnego)

EC 5 – Izomerazy

− zmieniają wzajemne położenie grup chemicznych bez rozkładu szkieletu związku (geometryczne zmiany w obrębie cząteczki)

EC 6 – Ligazy (syntetazy)

− powodują syntezę (połączenie) różnych cząsteczek; powstają wiązania chemiczne przy udziale energii z ATP

Klasyfikacja enzymówze względu na budowę chemiczna

⚫ Enzymy proste

⚫ zbudowane tylko z aminokwasów

⚫ grupa czynna – specyficzne zespoły aminokwasów

⚫ przykłady: proteazy, amylaza, RNaza

⚫ Enzymy złożone

⚫ złożone z części białkowej (apoenzym) i niebiałkowej (kofaktor)

cz. niebiałkowa trwale związana z białkową – grupa prostetyczna

⚫ gr. prostetyczna – integralna część enzymu

⚫ przykłady: katalaza, peroksydaza,oksydaza cytochromowa

cz. niebiałkowa luźno związana z białkową – koenzym

⚫ obie części dają łatwo się oddzielić

⚫ żadna z nich nie jest czynna katalitycznie

⚫ ponowne połączenie przywraca aktywność

⚫ przykład: dehydrogenazy

Budowa enzymu

substrat - H2O2

centrumaktywne centrum

aktywnesubstrat

Centrum aktywnezgrupowanie wlaściwych reszt aa (często z odległych łańcuchów polipeptydowych) o odpowiednim ułożeniu przestrzennym decyduje o właściwościach katalitycznych enzymudeterminuje wysoką sprawność katalityczną odpowiada za specyficzność reakcji

Budowa enzymu

metalo-β-laktamaza, MβL (model wstęgowy)

centrum aktywne = miejsce wiązania + miejsce katalityczne

miejsce wiązania substratu

miejsce katalityczne (grupa czynna)

Centrum aktywne

1. W konformacji natywnej enzymu aminokwasy, które są rozproszone zgodnie z

sekwencją struktury pierwszorzędowej skupiają się i formują centrum aktywne.

Centrum to wiąże i aktywuje substraty.

2. Wiązanie substratów powoduje często zmiany konformacji w enzymie (indukowane

dopasowanie), które umacniają to połączenie.

3. Stan przejściowy prezentuje aktywna formę substratów, bezpośrednio

poprzedzającą formowanie się produktu.

4. Precyzyjna orientacja łańcucha bocznego aminokwasów w centrum aktywnym

enzymu zależy od sekwencji aminokwasów, pH, temperatury, siły jonowej.

5. Mutacja lub niefizjologiczne czynniki, które zmieniają centrum aktywne zmieniają

też aktywność enzymu.

Koenzymy - niebiałkowe składniki enzymów (białek)

niezbędne dla ich aktywności , rodzaj kofaktorów.

W przeciwieństwie do grup prostetycznych,

s ą nietrwale (niekowalencyjnie), luźno związane z białkami.

Białko bez swojego koenzymu to apobiałko (apoproteina,apoenzym),

natomiast wraz z nim - holoenzym (holobiałko).

Biorą udział w reakcjach przez oddawanie

lub przyłączanie reagentów (atomów , grup atomów czy elektronów).

Koenzymy mogą mieć charakter zarówno organiczny

(np. nukleotydy i ich pochodne) lub nieorganiczny (np. jony metali).

Wiele organicznych koenzymów to pochodne witamin.

KOFAKTORY

Przyk łady k o e n z y m ó w

Koenzym A (CoA)

Koenzym Q10 (CoQ10, ubichinon)

NAD – pochodna witaminy B3

NADP – pochodna witaminy B3

Fosforan pirydoksalu (PLP) – pochodna witaminy B6

Pirofosforan tiaminy (TPP) – pochodna witaminy B1

S-adenozylometionina (SAM) – przen. grup

metylowych

Tetrahydrofolian – pochodna kwa su fol iowego

Grupy prostetyczne - niebiałkowe składniki enzymów (białek)

niezbędne dla ich aktywności , rodzaj kofaktorów.

W przeciwieństwie do koenzymów, s ą trwale związane z białkami

(np. miejscem aktywnym enzymów),

często za pomocą wiązań kowalencyjnych lub koordynacyjnych,

i nie opuszczają one swojego miejsca wiązania w trakcie reakcji.

Białko bez swojej grupy prostetycznej to

apobiałko (apoproteina, apoenzym,

wraz z nią holobiałko (holoproteina).

Grupy prostetyczne mogą mieć charakter zarówno organiczny

(np. cukry czy l ipidy) lubnieorganiczny ( jony metali i małe cząsteczki nieorganiczne).

Wiele organicznych grup prostetycznych to pochodne witamin.

Jony metali

Kofaktory- jony metalu zasocjowane są niekowalencyjnie z enzymami i mogą pomagać w zorientowaniu substratu lub funkcjonować jako nośnik elektronów.

1. Magnez (Mg): kinazy

2.Cynk (Zn): anhydraza węglanowa, kolagenaza, dehydrogenaza alkoholowa, dysmutaza ponadtlenkowa (neutralizuje wolne rodniki tlenowe)

3.Miedź (Cu): oksydazy (np. oksydaza lizylowa dla mostków krzyżowych w syntezie kolagenu), ferroksydaza (przekształca Fe 2+ w Fe 3+ podczas łączenia z transferyną).

4. Żelazo (Fe): cytochromy

5. Selen (Se): peroksydaza glutationowa

ATP i ADP zawsze z magnezem

Grupy funkcyjne w centrum aktywnym

Grupa funkcyjna E

Intermediaty kowalencyjneCys-SH Dh aldehydu 3- P-glicerolowegoSer-OH Acetylocholinesteraza

Lyz-NH 2 Aldolaza

His-NH Fosfoglukomutaza

Kwasowe i zasadowe His - NHAsp - COOH

Chymotrypsyna Pepsyna

Formowanie anionuReszta –NH ChymotrypsynaArg-NH Karboksypeptydaza A

Ser-OH Dehydrogenaza alkoholowa

Formowanie kationu Asp-COO - Lizozym

Funkcja

Mononukleotyd flawinowy (FMN) Reakcje redoks

Dinukleotyd flawinoadeninowy(FAD) Reakcje redoks

Fosforan pirydoksalu Transaminacja, dekarboksylacja i deaminacja

Biotyna

Metylkobalamina

Pirofosforan tiaminy

Porfiryna

Tetrahydrobiopteryna

Kwas liponowy

Karboksylacja

Metylacja i izomeryzacja

Dekarboksylacja

Wiązanie tlenu i reakcje redoks

Hydroksylacja

Dekarboksylacja -ketokwasów

Specyficzność enzymów

Specyficzność substratowa

− określa, jaki rodzaj substratu ulega

przemianie przy udziale danego enzymu

− zależy od budowy miejsca wiązania

Specyficzność działania

− katalizowanie reakcji tylko jednego typu

− katalizowanie tylko jednego z wielu możliwych przekształceń danej substancji

(cz. białkowa enzymu)

− zależna od budowy centrum katalitycznego

⚫enzym i jego substrat są do siebie

geometrycznie dopasowane w taki sposób, że

idealnie pasują do siebie jak klucz i zamek

⚫

⚫

model wyjaśnia specyficzność enzymów

nie wyjaśnia, w jaki sposób stabilizowany jest stan

przejściowy podczas reakcji enzymatycznej

Model "klucza i zamka" (Emil Fisher, 1894)

Model „klucza i zamka” – sztywność miejsca aktywnego ogranicza zmiany

HeksokinazaGLU

Uwolnienie produktu

Glukozo6P

SUBSTRATY

Substraty przyłącząne do enzymu

Centrum aktywne

Przekształcenie

substratu w produkt

ATPATP

ADP

produkty

Kompleks E-S

Model indukowanego dopasowania (Daniel Koshland, 1958)

⚫pod wpływem przyłączenia substratu enzym przybiera

konformację niezbędną do katalizy (jak rękawiczka

zakładana na rękę)

⚫powoduje to zbliżenie i ustawienie w odpowiedniej pozycji

substratu i grup czynnych enzymu, a także niekiedy wzrost

naprężeń w substracie, co ułatwia rozerwanie określonych

wiązań (kataliza przez odkształcanie substratu)

RReeaakckcjjee sseekwkweennccyyjjnnee wwgg CClleellananddaaReakc je s e k w e n c y j n e w g Cle landa

Podwójne przeniesienie p i n g - p o n g – jeden lub więcej produktów jest

uwalnianych przed związaniem przez enzym wszystkich substratów

aminotransferazy

⚫ enzymy reagują z tylko jedną odmianą

stereoizomeryczna danego

substratu

⚫połaczenie enzymu z substratem musi zachodzić co

najmniej w 3 miejscach

⚫nawet symetryczna cząsteczka staję się „asymetryczną” dla

centrum aktywnego – możliwe jest tylko jedno „właściwe”

położenie substratu

⚫ STEREOSPECYFICZOŚĆ

Model "trzypunktowego dołączenia" (Alexander G. Ogston, 1948)

Teoria kinetyczna – teoria zderzeń

1.reakcja może zajść tylko wtedy, gdy reagujące cząsteczki się zderzają

2.dla każdej reakcji istnieje bariera energetyczna, która musi być przekroczona, aby zaszła reakcja

3.reagujące cząsteczki muszą mieć dostateczną ilość energii, aby przekroczyć tę barierę

Wszystko, co zwiększa energię lub częstość zderzeń substratów, zwiększa szybkość reakcji.

Enzymy jako biokatalizatory

⚫ Enzymy zmieniają szybkość reakcji poprzez:

• lokalne zwiększanie stężenia substratu i utrzymania substratów w konformacji,

która sprzyja specyficznym reakcjom chemicznym

• dostarczenie reszt aminokwasowych, których grupy funkcyjne odgrywają

specyficzną rolę w katalizie

• obniżenie energii aktywacji dla tworzenia stanów przejściowych

⚫ Enzymy ustawiają substrat w przestrzeni w sposób najbardziej

sprzyjający zajściu reakcji

⚫ Zapewniają ścisłą orientację przestrzenna reagujących cząsteczek

(eliminowana jest przypadkowość sposobu ich zetknięcia)

⚫ Zwiększają bliskość substratów i ich lokalne stężenie

Teoria kinetyczna – teoria zderzeń

Enzymy obniżają energię aktywacji i ułatwiają zajście reakcji.

substrat

enzym

centrum

aktywne

kofaktorwolny enzym kompleks przejściowy

wiązania

dodatkowe

miejsce wiązania

substratu

kompleks E-S wolny enzym

produkt

Katal iza e n z y m a t y c z n a

W centrum aktywnym może znajdować się kofaktor.

W wyniku przyłączenie substratu do enzymu, zmienia się jego konformacja.

Po odłączeniu produktu enzym wraca do konformacji początkowej

Enzymy mogą składać się z podjednostek: katalitycznej i regulatorowej.

Kinetyka reakcji enzymatcznej

⚫ opisuje mechanizmy wiązania substratów przez enzymy oraz ich przekształcania w produkty

⚫ kinetyka Michaelisa-Menten - dwuetapowy przebieg reakcjikatalizowanej przez enzymy

⚫ substraty wiążą się odwracalnie z enzymem, tworząc ze stałą szybkości k1, kompleks enzym-substrat (ES)

⚫ kompleks ES może się rozpaść na dwa różne sposoby. Może dysocjować do E i S ze stałą szybkości k-1 lub może dojść do chemicznej zmiany substratów i uwolnienia produktów ze stałą szybkości k2, przy czym zakłada się, że produkt reakcji nie może ulec powrotnemu przekształceniu w wyjściowy substrat.

Model Michaelisa-Menten

Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznych

zwiększają energię kinetyczna reagujących cząsteczek obniżają barierę energetycznązwiększają częstość zderzeń

⚫ stężenie substratu⚫ stężenie produktu⚫ stężenie enzymu⚫ temperatura⚫ pH⚫ obecność inhibitorów i aktywatorów

Wpływ stężenia substratuna szybkość reakcji enzymatycznej

⚫

⚫

⚫

zwiększenie liczby cząstek mających dostateczną energię zwiększenie prawdopodobieństwa zderzeń ogółem, a przez to zderzeń efektywnychwzrost prędkości reakcji mam miejsce do momentu wysycenia wszystkich cząsteczek enzymu

Wpływ temperaurtyna szybkość reakcji enzymatycznej

⚫ zwiększenie energii kinetyczne reagujących cząsteczek

⚫ zwiększenie ilości cząsteczek o energii wyższej niż bariera energetyczna

⚫ zwiększenie częstości zderzeń

⚫ wzrost możliwości wytwarzania połączeń,

które są mało prawdopodobne

w normalnych warunkach

⚫ zbyt wysoka temperatura

– denaturacja białka enzymatycznego

⚫ gorączka, hipotermia – zmiana aktywności enzymów organizmu

Wpływ pHna szybkość reakcji enzymatycznej

⚫ optymalne wartości zwykle w przedziale 5,0 – 9,0

⚫ zmiana ładunków elektrycznych grup dysocjujących lub zwiększenie/zmniejszenie

liczby wiązań jonowych wewnąrz- i międzyłańcuchowych → zmiana układ

łańcucha

⚫ zmiana ładunków elektrycznych w cząsteczkach substratów

⚫ denaturacja białka enzymatycznego przy dużych i małych wartościach pH

⚫ kwasica, zasadowica – zmiana aktywności enzymów organizmu

Inhibicja

Zjawisko hamowania aktywności enzymów przez różnego rodzaju związki (inhibitory)Mechanizm kontrolny dla procesów fizjologicznych!

⚫ Inhibicja odwracalna:

⚫ kompetycyjna

⚫ niekompetycyjna

⚫ akompetycyjna

⚫ Inhibicja nieodwracalna - cząsteczki inhibitora wiążą się z enzymem trwale

(np. kowalencyjnie), co doprowadza do sytuacji zablokowania aktywności

danej cząsteczki enzymu na stałe

Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)

Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)

⚫

⚫

⚫

⚫

⚫

inhibitor i substrat współzawodniczą o miejsce aktywne cząsteczki enzymu

związanie przez enzym cząsteczki inhibitora uniemożliwia związanie

substratów (i vice versa)

maksymalna szybkość reakcji, Vmax, nie zmienia się

V max może być osiągnięta poprzez zwiększenie stężenia substratów,

które przezwycięży inhibicję

wraz ze wzrostem stężenia inhibitora rośnie wartość Km

1/v0

1/Vmax

-1/KM

Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)

⚫ inhibitor jest strukturalnie bardzo podobny do prawdziwego substratu dla

danego enzymu

⚫ przykład: metotreksat – inhibitor kompetycyjny reduktazy dihydrofolianu

(dihydrofolian → tetrahydrofolian)

kwas foliowy(koenzym) metotreksat

Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)

⚫ Glikol etylenowy – składnik płynów

niezamarzających do chłodnic silników

⚫ Etanol

⚫ inhibitor kompetycyjny dla

dehydrogenazy alkoholowej

⚫ stos. w zatruciach glikolem

HO

O H

e t h y l e n e g l yc o l

A l c o h o l dehydrogenase

HO

O

g l y c o a l d e h y d e

O

HO

OH

g l y c o l i c a c i d

O

OH

O

glyoxylic acid

HO

O

o x a l i c a c i d

Inhibicja niekompetycyjna

Inhibicja niekompetycyjna

⚫inhibitor wiąże się do wolnego enzymu, jednak nigdy do jego miejsca

aktywnego → brak konkurencji z substratem

⚫kompleksy enzym-inhibitor (EI) i enzym-inhibitor-substrat (EIS) są

enzymatycznie nieaktywne

⚫ wiązanie inhibitora całkowicie niezależne od substratu → wartość Km ł

pozostaje stała, wartość Vmax maleje

1/v0

1/Vmax

-1/KM

1/[S]

Inhibitory nieodwracalne - „trucizny” enzymów

⚫ inhibitor wiąże się kowalencyjnie (a więc nieodwracalnie) do łańcuchów

białkowych enzymu lub tak silnie, że dysocjacja kompleksu EI jest bardzo

powolna→ trwałe unieczynnienie enzymu

⚫

⚫

chemiczna modyfikacja aminokwasów w enzymie

nie daje się odwrócić ani przez usuniecie inhibitora ze środowiska, ani przez

zwiększenie ilości substratu

⚫ penicylina - inhibitor enzymów

zawierających serynę

⚫ aspiryna – inhibitor cyklooksygenazy

⚫ zw. fosforoorganiczne (insektycydy) –

inhibitory acetylocholinoesterazy

Kontrola (regulacja) aktywności enzymatycznej

Wpływ na ilość:

− regulacja syntezy enzymów (indukcja lub represja genu kodującego białko

enzymu) i degradacji (półokres rozpadu białka t½)

Wpływ na rozmieszczenie przestrzenne:

• kompartmentacja

Wpływ na aktywność katalityczną:

•

•

•

•

przez sprzężenie zwrotne (hamowanie)

przez efektory allosteryczne (enzymy allosteryczne - regulatorowe)

przez zmianę struktury enzymu

• odwracalne modyfikacje kowalencyjne (fosforylacja, defosforylacja),

• aktywacja proteolityczna (proenzymy = zymogeny)

kompleksy (układy) wieloenzymowe

Kompartmentacja

⚫ fizyczne rozdzielenie przeciwstawnych szlaków metabolicznych

⚫ w obrębie komórki:

biosyteza kw. tłuszczowych – cytozol

utlenianie kw. tłuszczowych – mitochodrium

⚫ w organizmie:

niektóre szlaki tylko w wyspecjalizowanych typach komórek

⚫ kompartmentacja chemiczna

⚫ przeciwstawne szlaki biegną poprzez inne metabolity pośrednie –

rozdzielenie molekuł przeznaczonych do szlaku katabolicznego i

anabolicznego

Regulacja przez sprzężenie zwrotne

⚫

⚫

⚫

⚫

produkt hamuje proces enzymatyczny, w którym powstał

zwykle dotyczy szlaków syntezy (etapu

imitującego)

hamowany jest początkowy etap syntezy

inhibitor: ostatnia mała cząsteczka przed

utworzeniem związku wielkocząsteczkowego

Hamowanie przez sprzężenie zwrotne

• produkt powoduje represję genu

kodującego dany enzym

• nie wpływa na jego aktywność katalityczną,

ale na jego ilość

• przykład: cholesterol i reduktaza HMG-CoA

Efektory allosteryczne

⚫ zwykle nie podobne od substratów czy koenzymów danego enzymu

⚫ łączą się z miejscem allosterycznym („inna przestrzeń”)

⚫powodują zmiany konformacyjne w białku enzymatycznym (podjednostki

z którą się łączą) → zmiana powinowactwa innych podjednostek do substratu

⚫ enzymy allosteryczne nie dają się opisać kinetyką M-M → krzywa

sigmoidalna

Regulacja allosteryczna

E n z y my a l lo s te r yczne – e n z y my, k tó r ych a k t y w n o ś ć m o ż e by ć

r e g u l owa n a n a d ro d ze oddz i a ł y wań a l lo s te r ycznych , czy l i oddz ia ł y wa ń

m i ę d z y odda lony mi o d s i e b i e m ie j s ca mi w e n z y m i e – c e n t r u m

ka ta l i t y cznym i m i e j s c e m a l lo s te r yczny m.

Aktywność miejsca katalitycznego może być regulowana przez efektory

allosteryczne w miejscu allosterycznym – aktywatory lub inhibitory

allosteryczne.

E fe k t o r y a l l o s t e r y c z n e są drobnocząsteczkowymi metabolitami, które łącząc się

z białkiem enzymatycznym w miejscu allosterycznym modyfikują jego

strukturę IV-rzędową lub III-rzędową - indukują w enzymie zmiany

konformacyjne w centrum katalitycznym.

Efektem jest zmiana powinowactwa enzymu do substratu

Efektory al losteryczne:

Dodatnie – aktywatory allosteryczne – szybkość maksymalna reakcji zostaje

osiągnięta przy niższym stężeniu substratu

Ujemne – inhibitory allosteryczne

Negatywna kontrola al losteryczna Pozytywna kontrola al losteryczna

Efektory allosteryczne

inhibitory aktywatory

• Karbamoilotransferaza asparaginianowa (ATCaza)

• katalizuje pierwszą reakcje na szlaku syntezy pirymidyn

• złożona z 5 podjednostek – 3regulatorowe i 2 katalityczne

- CTP

+ATP

no effector

Efektory allosteryczne

Efektor a l lo s te ryczny

interpretacj a

Kataliza szybsza lub

wolniejszaPodjednostka

regulatorowa

+ lub -

Kataliza szybsza lub wolniejsza

+ lub -

Aktywność enzymuAllosteryczna aktywacja

Allosteryczna inhibicja

Stężenie substratu

W prz ypadku e n z y m ó w a l l o s t e r y c z n y c h , wykres

zależności Szybkości reakcji V

od stężenia substratu [S] często przybiera kształt

s igmoidalny, w odróżnieniu odkształtu

hiperbolicznego, przewidzianego równaniem

Michaelisa‐Menten.

Regu lac ja p r zez wiązan ie /od łączan ie p o d j e d n o s t e k r e g u l a c y j ny c h

Aktywność niektórych enzymów zależy od białek regulacyjnych. Mogą mieć one

strukturę IV-rzędową i składać się z podjednostek katalitycznych i regulacyjnych.

Podjednostki regulacyjne hamują aktywność podjednostek katalitycznych. Całość

jest nieaktywna. Aktywacja enzymu polega na dysocjacji kompleksu i uwolnieniu

podjednostek katalitycznych spod hamującego wpływu podjednostek

regulacyjnych.

Przykład:•

•kinaza bia łkowa

kalmodulina – białko regulatorowe powszechnie występujące w organizmach

eukariotycznych, wiąże cztery jony wapnia. Kompleks kalmoduliny z wapniem

wiąże się z enzymem i zmniejsza lub zwiększa aktywność enzymu.

Modyfikacje kowalencyjne

⚫

⚫

⚫

⚫

⚫

odwracalne zmiany struktury cząsteczki enzymu

przebiega po zakończeniu translacji

modyfikacje kowalencyjne - dodawanie dodatkowych grup funkcyjnych:

fosforylacja

glikozylacja

ADP-rybozylacja

metylacja

zmiana właściwości funkcjonalnych białek

(zmiana konfrmacji, ładunku)

zmiana sprawności katalitycznej,

powinowactwa do substratu,

wewnątrzkomórkowej lokalizacji,

regulacji przez ligandy allosteryczne

⚫ w momencie fizjologicznego zapotrzebowania

⚫ proenzym (zymogen)

⚫ nieaktywny prekursor enzymu

⚫ do uaktywnienia wymaga jedno- lub kilkustopniowej proteolizy – powstanie

centrum katalitycznego (odcięcie fragmentu, przecięcie łańcucha

polipeptydowego → zmiana konformacji)

⚫ przykłady:

⚫ pepsynogen (→ pepsyna)

⚫ trypsynogen (→ trypsyna)

⚫ proinsulina (→ insulina)

⚫ prokolagen (→ kolagen)

⚫ czynniki krzepnięcia i fibrynolizy

⚫ możliwe szybkie zaktywowanie w momencie zapotrzebowania

⚫ ochrona tkanek produkujące proenzymy przed samostrawieniem

Ograniczona proteoliza - proenzymy

Enzymy wielofunkcyjne i kompleksy wieloenzymowe

⚫ Enzym wielofuncyjny⚫ jeden łańcuch polipeptydowy posiadający co najmniej dwie różne aktywności katalityczne i

dwa miejsca aktywne

⚫ Przykład: syntaza kw. tłuszczowych – 3 domeny (1- transferaza acetylowa, syntaza ß-

ketoacylowa, transferaza malonylowa; 2- reduktaza ketoacylowa, dehydrataza, reduktaza

enoilowa, 3- tioesteraza)

⚫ Kompleks wieloenzymowy⚫ układ kilku białek eznymatycznych o różnych aktywnościach katalitycznych połaczone

niekowalencyjnie

⚫ Przykład: synataza kw. tłuszczowych u E.coli (α6β6)

⚫Intemediaty przenoszone bezpośrednio z jednego miejsca

aktywnego na drugie bez rozpraszania składników reakcji

(reagujące cząsteczki nie ulegają rozcieńczeniu w cytozolu, nie

muszą odnajdywać się w przypadkowym procesie dyfuzji)

⚫Oddzielenie intermediatów od innych substancji – ochrona

przed reakcjami współzaodniczącymi

Izoenzymy, izoformy, makroenzymy

Enzymy w diagnostyce laboratoryjnej

Znaczenie enzymów w diagnostyce klinicznej

zmiany aktywności enzymów we krwi – odbicie zmian zachodzących w narządach

rodzaj uszkodzenia determinuje rodzaj enzymów uwalnianych z uszkodzonej

tkanki - „konstelacja zmian enzymatycznych”

uszkodzenie narządu = uszkodzenie struktur komórkowych lub zmiana przepuszczalności błon komórkowych

ucieczka enzymów

zwiększenie zmniejszenieich ilości w płynach ustrojowych i wydalinach

spadek syntezy enzymów

Izoenzymy

enzymy katalizujące tę samą reakcję, które występują w różnych tkankach/typach komórek, mogą różnić się strukturą cząsteczki

produkty różnych, choć blisko spokrewnionych genów

różne właściwości fizyczne i chemiczne:

punkt izoelektryczny

ruchliwość elektroforetyczna

powinowactwo do substratów

wrażliwość na czyniki regulatorowe

wykrywanie: bad. aktywności po zablokowani za pomocą mAb

niepożądanych izoenzymów

dotyczy dehydrogenaz, oksydaz, aminotransferaz, fostataz i proteaz.

znacznie zwiększa swoistość tkankowa niż ta, którą można

przypisać ich aktywności enzymatycznej!

Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)

enzym cytoplazmatyczny, wyst. we wszystkich komórkach organizmu

katalizuje odwracalną reakcję mleczan ←→pirogronian

największa aktywność w tkankach o wysokim metabolizmie energetycznym

mózg, mięsień sercowy,

erytrocyty, leukocyty, płytki krwi (hemoliza ↑akt.)

nerki, wątroba, płuca

występuje 5 izoenzymów

wykrywanie:

elekroforeza (różna ruchliwość elektroforetyczna poszczególnych

izoenzymów)

dla LDH1 – reakcja z β-hydroksymaślanem (swoisty substrat) – kiedyś w

diagnostyce zawału mm sercowego

Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)

cząsteczka zbudowana z 4 podjednostek – tetramer

dwie różne podjednostki syntetyzowane w organizmie:

M – typu mięśniowego, (ang. muscle); gen LDHA (chr. 11)

H – typu sercowego (ang. heart); gen LDHB (chr. 12)

geny LDHA i LDHB podlegają różnej ekspresji w różnych tkankach

w różnych tkankach różne ilości różnych podjednostek enzymu

wytwarzane

rożne połączenia podjednostek – 5 izoenzymów:

LDH1 – HHHH

LDH2 – HHHM

LDH3 – HHMM

LDH4 – HMMM

LDH5 – MMMM

Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)

w surowicy ludzkiej obecne wszystkie izoenzymy LDH

ich proporcje zmieniają się w różnych stanach chorobowych, w

zależności od tego, które izoenzymy są produkowane przez uszkodzony

narząd

u osób zdrowych - LDH2>LDH1

zawał serca, uszkodzenie mięśnie szkieletowych – LDH1>LDH2

anemia hemolityczna - ↑LDH1, ↑LDH2, LDH2>LDH1

dystrofia mięśniowa, nowotwory, ch. wątroby - ↑LDH4, ↑LDH5

(10-20x)

zawał serca z niewydolnością w krążeniu wrotnym – ↑LDH1,

↑LDH2, ↑LDH5

nasieniak najądrza – ↑ LDH1 izolowany

Izoformy enzymów

produkty tego samego genu

katalizują tę samą reakcję chemiczną

inna budowa cząsteczki enzymu na skutek:

zmian posttranslacyjnych struktury białka

fosfataza alkaliczna (ALP) – izoformy kostna i wątrobowa

degradacji proteolitycznej po ich wydzieleniu do pł.śródtkankowego i

osocza

kinaza kreatynowa – CKMM1, CK-MM2, CK-MM3, CK-MB1, C-MB2

wykrywanie: elektroforeza, oznaczenia immunochemiczne z użyciem

przeciwciał moloklonalnych

Fosfataza zasadowa (ALP)

hydrolaza – odszczepia monofosforany od reszt organicznych w środowisku silnie zasadowym (pH 10)

białko zewnętrznej błony plazmatycznej lub w kompleksach z innymi

białkami błonowymi

funkcja:

transport jonów fosforanowych przez błony

uczestniczy w interakcji między osteoblastami a macierzą

nieorganiczną

transport IgG z osocza matki do płodu (?)

występują izoenzymy, izoformy i frakcje

hemoliza, tłusty posiłek, menstruacja, doustne estogeny –

podwyższenie akt. ALP

Fosfataza zasadowa (ALP)

1. Izoenzym tkankowoniespecyficzny

wyst. praktycznie w każdej tkance

cztery izoformy (glikozylacja): kostna, wątrobowa i nerkowa

izoforma kostna

uwalniana przez aktywne osteoblasty

dominuje u dzieci w okresie wzrostu

wzrost akt. w chorobach kości (osteomalacja, krzywica, osteoporoza)

wzrasta w okresie rekonwalescencji, podczas zrastania kości, po

zabiegach operacyjnych

Obecnie oznacza się masę izoformy tech. immunoenzymatycznymi

Fosfataza zasadowa (ALP)

izoforma wątrobowa

produkowana przez hepatocyty

wzrost akt. w chorobach wątroby i cholestazie

w cholestazie i przerzutowych guzach wątroby pojawać się

mogą frakcje (nawet, gdy całkowita ALP w normie)

f. żółciowa – wielonzymatyczny kompleks błonowy

f. makromolekularna – kompleks e. z lipoproteiną X

izoforma nerkowa

nie wyst. u osób zdrowych

w chorobach nerek (bez znaczenia diagnostycznego)

Fosfataza zasadowa (ALP)

1. Izoenzym tkankowo niespecyficzny

2. Izoenzym jelitowy

gr. krwi O i B

produkowana przez enterocyty

wzrost w chorobach wątroby: przewlekłe zap. wątroby, marskość

(osłabione usuwanie przez wątrobę)

3. Izoenzym komórek zarodkowych

nie obecny w osoczu osób zdrowych

ektopowo w nowotworach zarodkowych, przysadki i grasicy

4. Izoenzym łożyskowy

fizjologicznie u ciężarnych, od II trymestru, zanika wkrótce po porodzie

ektopowo w nowotworach płuc, jajnika, macicy, jąder, ukł.

żołądkowo-jelitowego

Makroenzymy

enzymy występujące we krwi, które tworzą kompleksy o dużej masie cząsteczkowej poprzez:

polimeryzację

łączenie z immunoglobulinami (IgG, rzadziej IgA) lub lipidami

prawdopodobnie związane z powstawaniem autoprzeciwciał,

niekiedy u chorych z nowotworami

u 1,5 – 2,5% populacji ogólnej, najczęściej u osób starszych

dotyczy przede wszystkim amylazy i aminotransferazy asparaginowej (AspAT)

najczęściej zjawisko niezwiązane z chorobą

kiedy? - izolowana, kilkakrotnie stwierdzana podwyższona aktywność enzymu bez

objawów klinicznych lub z symptomami nietypowymi dla danej enzymopatii

duża masa cząsteczkowa → osłabiona filtracja kłębkowa → wydłużony czas

półtrwania → podwyższona aktywność

wykrywanie: strącanie makromolekuł glikolem etylenowym, HPLC, elektroforeza

Klasyfikacja enzymów

ze względu na rodzaj katalizowanej reakcji

EC 1 – oksydoreduktazy

EC 2 – transferazy

EC 3 – hydrolazy

EC 4 – liazy

EC 5 – izomerazy

EC 6 – ligazy (syntetazy)

ze względu na sposób, w jaki dostają się ne do przestrzeni pozakomórkowej

(podział kliniczny)

e. wskaźnikowe

e. sekrecyjne

e. ekskrecyjne

Enzymy wskaźnikowe (indykatorowe)

enzymy wewnątrzkomórkowe

uwalniane w wyniku uszkodzenia bł. komórkowej lub rozpadu komórki –

wzrost aktywności we krwi

zawartość enzymu wskaźnikowego w pł. pozakomórkowym jest zależna od:

jego ilości w uszkodzonej tkance

liczby uszkodzonych komórek i stopnia ich uszkodzenia

rozmieszczenia wewnątrzkomórkowego enzymów

przykłady:

kinaza kreatynowa (CK)

dehydrogenza mleczanowa (LDH)

aminotrasferazy asparaginianowa (AspAT) i alaninowa (AlAT)

Aminotransferaza alaninowa (AlAT, ALT)

występowanie:

cytoplazma komórek wątroby

komórki ścian cewek nerkowych

mięśnie poprzecznie prążkowane, w tym serce

w niewielkich ilościach – wszystkie tkanki (hemoliza zawyża wynik)

fizjologicznie niewielkie ilości w osoczu, pł. mózgowo-rdzeniowym, moczu

wzrost akt. w osoczu – gł. przyczyny wątrobowe

uszkodzenie wątroby (stany zapalne, gł. zakażenia HBV, HCV,

poalkoholowe, toksyczne uszkodzenia)

uszkodzenie mięśni szkieletowych (urazy, niedokrwienie, mioliza)

zawał serca

często oznacza się wraz z akt. aminotransferazy asparaginianowej (AspAT)

– wskaźnik de Ritisa

Enzymy sekrecyjne

fizjologicznie wydzielane do pł. pozakomórkowego, np. do krwi

tam pełnia swą funkcję - funkcjonalne enzymy osocza

niewydolność narządu produkującego i wydzielającego

powoduje obniżenie ich aktywności (synteza na rybosomach

wątroby)

przykłady:

czynniki krzepniecia i fbrynolizy

esteraza cholinowa

ceruloplazmina

lipaza lipoproteinowa

Cholinoesteraza, pseudocholinoesteraza (ChE)

katalizuje hydrolizę estrów choliny do choliny i kw. tłuszczowego

acetylocholinesteraza (AchE) ukł. nerwowego i erytrocytów, rozkłada

acetylocholinę

pseudocholinoeateraza (ChE) – produkowana przez wątrobę, wydzielana do

krwi, funkcja nieznana

znaczenie diagnostyczne:

diagnostyka/monitorowanie osób narażonych na kontakt ze związkami

fosforoorganicznymi (niodwracalne inhibitory AchE)

↓ aktywności

miąższowe choroby wątroby

niedożywienie

wstrząs pourazowy

terapia promieniami X, lekami cytotoksycznymi

produkowane przez gruczoły i wydzielane do wydzielin ustrojowych:

śliny

światła przewodu pokarmowego (żółć, sok trzustkowy)

płynu nasiennego

ich pojawienie się w osoczu świadczy o zaburzeniu procesu wydzielania

(zastój wydzieliny) i/lub niszczeniu struktury gruczołu

przykłady:

amylaza

lipaza

fosfataza zasadowa

γ-glutamylotranspeptydaza

Enzymy ekskrecyjne

α-amylaza i lipaza

enzymy ekskrecyjne

lipaza – trzustka, zoładek, jelita

α-amylaza – trzustka, ślinianki , wątroba, mięśnie, neutrofile

↑ akt. amylazy

ostre zapalenie trzustki (max. ↑ po 12 h., potem ↓ - wyczerpanie

zdolności wydzielniczej trzustki

kolka nerkowa

kolka zółciowa

perforacja wrzodu

niedrożnośc jelit

zapalenie ślinianek (izoenzym śliniankowy)

↑ akt. Lipazy

proces zapalny trustki (wyższa swoistośc narżdowa niż amylaza)

hemoliza – zaniża akt. lipazy

MAKROAMYLAZEMIA

stan nie związany z chorobą

↑ akt. we krwi bez ↑ w moczu

polimeryzowanie cz. enzymu lub łączenie się z immunoglobulinami

duże kompleksy białkowe nie przechodzą do moczu

Triacyloglicerole (hipertriglicerydemia) hamują aktywność amylazy

Amylaza w moczu

odzwierciedla akt. we krwi

monitorowanie przebiegu ostrego zapalenia trzustki

α-amylaza i lipaza

Pośrednio - aktywność

badanie przemiany chemicznej substratu katalizowanej przez dany enzym

pomiar ilości enzymu w układzie na podstawie pomiaru szybkości reakcji

w określonych warunkach szybkość reakcji jest proporcjonalna do

ilości enzymu

szybkość reakcji wyrażona jako ubytek substratu lub przyrost produktu

szybkość rekcji maleje z czasem (hamujący wpływ produktu, stopniowa

inaktywacja enzymu) → mierzona jest prędkość początkowa vo

,

dostateczni duże stężenie substratu dla wysycenia enzymu

prędkość początkową – przed utworzeniem dostatecznej ilości produktu

umożliwiającej zachodzenie reakcji odwrotnej

Bezpośrednio - masa

oznaczanie ilości białka enzymatycznego met. immunochemicznymi

Oznaczanie enzymów

Badanie aktywności enzymatycznejw płynach ustrojowych

surowica/osoczemoczpłyn mózgowo-rdzeniowy

aktywność w surowicy/osoczu <<< aktywność w tkankach (także w kwinkach) –surowica z hemolizą – wyniki zawyżone

białka osocza, składniki surowicy (w tym leki) mogą być aktywatorami/inhibitorami

reakcji enzymatycznych

antykoagulanty (heparyna, fluorek) – pływ +/- na akt. enzymów

izoenzymy – różne powinowactwo do substratu i maks. aktywność przy różnych

stężeniach substratu

niekiedy krótki czas, w którym obserwuje się zmiany akt. enzymatycznej związane

ze stanem chorobowym

Jednostki aktywności enzymatycznej

Katal (kat)

ilość enzymu katalizująca przemianę 1 mola substratu w czasie 1 sekundy

układ SI; [mol/s]

duża jednostka → używane mikro- , nano-, pikokatal

Jednostka enzymu, jednostka enzymatyczna,

międzynarodowa jednostka standardowa (U, ang. unit)

ilość enzymu katalizująca przemianę 1 μmola substratu (lub odpowienich

grup chemicznych) w czasie 1 minuty w warunkach standardowych

(30°C, optymalne pH, maksymalne wysycenie enzymu substratem)

1U = 1/60 μkatala = 16,67 nanokatala

Jednostki aktywności enzymatycznej

Aktywność właściwa

liczba jednostek enzymu na 1 mg białka

określa czystość preparatu enzymatycznego

Aktywność molekularna

liczba cząsteczek substratu (lub odpowiednich grup chemicznych)

przekształconych przez 1 cząsteczkę enzymu w ciągu 1 minuty (przy

optymalnym stężeniu substratu)

Stężenie aktywności enzymatycznej w roztworze – kat(lub U)/1 ml roztworu

Test optyczny Warburga

wykorzystuje różnice w absorpcji światła o dł. fali 340 nm między formą utlenioną a zredukowaną NAD i NADP

utenianie/redukcja NAD+/NADH → proporcjonalny spadek/wzrost

absorbancji przy 340 nm

Pierścienie purynowyi pirmidynowy

Pierścień pirydynowy w amidzie kw. nikotynowego w NADH – układ dihydropirydy

Test optyczny Warburga

ilościowa analiza dehydrogenaz zależnych od NAD+ i NADP+

lub innych enzymów o reakcjach sprzężonych z dehydrogenazami

aktywność heksokinazyproporcjonalna do

wzrostu absorbancji przy 340 nm