profesor patrocinante: dr. rafael burgos a. instituto
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PROFESOR PATROCINANTE: Dr. Rafael Burgos A. INSTITUTO: Farmacología y Morfofisiología FACULTAD: Ciencias Veterinarias
PROFESOR CO-PATROCINANTE: Dra. M. Angélica Hidalgo G. INSTITUTO: Farmacología y Morfofisiología FACULTAD: Ciencias Veterinarias
“EVALUACIÓN DE ANDROGRAFÓLIDO COMO ANTIINFLAMATORIO EN ELMODELO DE INFLAMACIÓN AGUDA SUBPLANTAR INDUCIDA CON
CARRAGENINA EN RATAS"
Tesis de grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título de Químico Farmacéutico.
ALEX RODRIGO FRÍAS FLORES
VALDIVIA-CHILE
2009
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Dedicado a mi madre.
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AGRADECIMIENTOS
En primer lugar deseo agradecer al Dr. Rafael Burgos por la oportunidad de
participar en este trabajo, gracias por la confianza en mi a pesar de los traspiés vividos
en este tiempo y a la Dra. María Angélica Hidalgo por todo su apoyo y enseñanzas sin
los cuales habría sido muy difícil salir adelante.
Deseo agradecer también a todos los miembros del instituto de farmacología en
el que desarrollé esta tesis, especialmente a Katty y Paola a quienes agradezco su
buena disposición hacia mi y su amistad. Gracias también a Don Darío Salazar, quién
me enseñó el manejo de animales de laboratorio y me apoyó en todo lo que estuvo a su
alcance, al igual que Mariana, quien colaboró conmigo en el desarrollo del trabajo
experimental.
Gracias a todos los integrantes de la familia Oyarzun Rodríguez: Francisco,
Marcela y los Tíos Eudocio y Nelly, a quienes siento como parte de mi familia.
Gracias a mi querida hermana Jeanette, su esposo Rodrigo y mis sobrinos Alan
y Tiara por darme tanto cariño y apoyo.
Gracias a todas las personas con las que compartí en los años de universidad,
amigos y conocidos, gracias de corazón por cada pequeña cosa que fueron capaces de
dar por mí y para mí.
Quiero agradecer especialmente a mi Yenny, quién además de todo su apoyo
en el ámbito laboral, me enseñó una nueva forma de ver la vida, gracias por hacerme
sonreír y por estar junto a mí, has llenado de amor mi corazón y mi espíritu.
Muchas gracias a mi adorada madre, quien representa la fuerza que me
impulsó a emprender este larguísimo proceso de obtener una carrera profesional,
gracias por todo su amor y confianza, sin ella jamás podría haber llegado hasta aquí.
Finalmente, deseo agradecer a la fuente de financiamiento que hizo posible
este trabajo, el proyecto FONDEF D04I1240.
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ÍNDICE
1. RESUMEN ................................................................................................................ 4
2. SUMMARY ................................................................................................................ 5
3. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 6
4. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................... 21
5. RESULTADOS ........................................................................................................ 27
6. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 44
7. CONCLUSIONES.................................................................................................... 52
8. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................... 53
9. ANEXOS ................................................................................................................. 63
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1. RESUMEN
Andrografólido, un producto natural obtenido de hojas de Andrographis
paniculata, ha demostrado ser un efectivo inmunomodulador capaz de inhibir la vía del
NF- B, implicada en producción de proteínas proinflamatorias. Esto lo hace impidiendo
la unión de NF- B al DNA y reduciendo de esta manera la expresión de proteínas como
COX-2, clave en el proceso inflamatorio. El presente trabajo evaluó el efecto de
andrografólido en el modelo de inflamación aguda inducida con carragenina en ratas.
Para ello se consideró la evaluación de la inflamación mediante caliper y por análisis
histológico e inmunohistoquímica en los animales, incluyendo grupo placebo,
andrografólido 1 mg/kg y 4 mg/kg y diclofenaco 2 mg/kg administrados
intraperitonealmente. Los resultados obtenidos demostraron que andrografólido 4 mg/kg
reduce el grado de inflamación después de 1 hora y 24 horas post-inducción (p<0.05),
demostrando mejor efecto antiinflamatorio que andrografólido en dosis 1mg/kg y similar
efecto a diclofenaco 2 mg/kg, demostrando diferencias significativas en el efecto
antiinflamatorio determinado por área bajo la curva entre 0 y 24 horas respecto a
placebo (p<0,01). La inmunohistoquímica y la histología demostraron que
andrografólido en dosis 4mg/kg disminuye la presencia de COX-2 de manera
importante a las 6 y 24 horas post-inducción respecto de las demás terapias, así como
la presencia de leucocitos. Se concluye por tanto, que Andrografólido posee efecto
antiinflamatorio en inflamación aguda inducida por carragenina en ratas.
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2. SUMMARY
Andrographolide, a natural product obtained from Andrographis paniculata
leaves, has shown to be an effective immunomodulator capable to inhibit the NF- B
way, involved in the production of proinflammatory proteins. That is possible by
obstructing the binding between NF- B to DNA and reducing the production of proteins
like COX-2, a very important enzime in the inflammatory process. In this work we
evaluated andrographolide inducing acute inflammation with carrageenan in rats. The
evaluation was made with a digital caliper and with histological analysis and
immunohistochemistry for the inflammated hind paws in the animals, including a placebo
group, 1 mg/kg and 4 mg/kg of Andrographolide and diclofenac 2 mg/kg by
intraperitoneal way. The obtained results shows 4 mg/kg andrographolide reduced the
inflammation 1 hour and 24 hours after induction (p<0.05), that was much better than 1
mg/kg of andrographolide and so similar to 2 mg/kg of diclofenac in those times,
showing differences founded by area under curve between 0-24 hours in comparison
with placebo (p<0.01). Immunohistochemistry and histology shows an important
decrease of COX-2 at 6 hours and 24 hours post-induction for 4 mg/kg andrographolide
in a comparative between this and the other therapies, also in the cellular presence of
leukocytes. As a conclusion, andrographolide has shown it is an effective anti-
inflammatory on carrageenan induced inflammation in rats.
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3. INTRODUCCIÓN
3.1 Inflamación y proceso inflamatorio
La inflamación (del Latín, inflammatio: encender, hacer fuego) es una respuesta
tisular inespecífica, caracterizada por 4 signos clásicos descritos por Cornelius Celsus
(30a.c.-38d.c.), estos son: Rubor, Dolor, Calor y Tumor. El organismo tiende a
responder con inflamación en casos en los que requiera una respuesta defensiva para
mantener su integridad y salud. Galeno (130d.c.-200d.c.) introdujo un nuevo signo a
esta definición, la pérdida de función.
La inflamación se manifiesta como una reacción de la microcirculación,
caracterizada principalmente por desplazamiento de líquido y leucocitos desde el
compartimiento sanguíneo al extravascular, involucrando una serie de cambios en un
tejido que ha sido lesionado (Rivera, 1997; Laso y Pastor, 1998).
El proceso inflamatorio se inicia con una vasodilatación arteriolar, con la
consiguiente hiperemia tisular e incremento de la permeabilidad celular. Seguidamente
tiene lugar la marginación y adherencia de los leucocitos a las paredes de los vasos
capilares, proceso mediado por selectinas e integrinas. Finalmente, los leucocitos
abandonan el capilar por diapédesis. Este proceso permite la constitución del exudado
inflamatorio, fluido rico en proteínas plasmáticas y fagocitos (leucocitos
polimorfonucleares y monocitos-macrófagos) encargados de destruir los agentes vivos
o restos celulares, una vez fagocitados (Laso y Pastor, 1998).
Existen diversos agentes capaces de producir inflamación: agentes biológicos
(bacterias, virus, parásitos y hongos), agentes físicos (radiaciones, frío y calor), agentes
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químicos (venenos o toxinas), traumatismos y cuerpos extraños, alteraciones
vasculares (por ejemplo las que producen isquemia) o alteraciones inmunitarias tales
como la hipersensibilidad (Rivera, 1997)
La inflamación puede clasificarse dependiendo del tiempo en que ésta afecte al
organismo, como aguda o crónica: la aguda corresponde a aquella que se produce
como respuesta inmediata frente al agente extraño y se caracteriza por aumento del
flujo sanguíneo, alteración de permeabilidad de la microvasculatura y migración de
leucocitos hasta el foco de lesión; la inflamación crónica, considera una duración
prolongada (semanas o meses) en la que se pueden observar simultáneamente signos
de inflamación activa, de destrucción tisular y de intentos de curación (Rivera, 1997).
Inflamación aguda puede evolucionar en diferentes formas: Resolución,
formación de abscesos o puede tomar la forma crónica. En los dos últimos casos puede
terminar en curación ya sea por vía de regeneración y/o cicatrización (Cotran et al,
2000).
La inflamación aguda comprende muchos cambios que continúan a la
presencia de un agente extraño en la zona afectada, estos se pueden clasificar en
fases, las que comprenden:
La primera fase se inicia con la llegada del agente y hasta una hora después.
Comprende una vasoconstricción momentánea seguida de una vasodilatación con
incremento del flujo sanguíneo (hiperemia) y enrojecimiento de la zona (eritema). Los
mastocitos o células cebadas son determinantes de esta fase. Éstas células están
presentes en el tejido conectivo y rodeando vasos sanguíneos y linfáticos. Poseen
gránulos conteniendo sustancias tales como histamina, serotonina y heparina, las que
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son esenciales para que ocurran cambios vasculares del área afectada (Alving et al,
1991).
Tras los primeros 10 minutos de comenzar la inflamación, ya es posible
encontrar presente gran cantidad de fluido extravascular, formado básicamente por
agua y electrolitos, cuya presencia es dependiente del estímulo de los mediadores
anteriormente mencionados, principalmente histamina (Al-Haboubi y Zeitlin, 1983). A
partir de aquí comenzarán a ingresar sustancias proteicas como el factor XII, que inicia
la activación de diversas vías para la producción de cininas (Colman, 1999). Las cininas
más comunes son bradicinina, calidina y T-cinina, que actúan a través de receptores B1
y B2, generándose acción vasodilatadora, por lo que aumenta la permeabilidad
vascular. Es el receptor B1 presente en macrófagos el que induce síntesis de factor de
necrosis tumoral- (TNF- ) e interleucina 1 (IL-1) (Dray y Perkins, 1993).
Otras sustancias que se producen en esta fase son la sustancia P (SP) y el
óxido nítrico (NO), ambos potentes vasodilatadores, además de tener cierta
participación en la quimiotaxis de leucocitos y en la adhesión. El NO requiere de
activación por óxido nítrico sintasa (NOS) cuya isoforma inducida, denominada iNOS,
es expresada en muchos tipos de células como mastocitos, plaquetas, macrófagos,
entre otros (Lippe et al, 1993; Coleman, 2001).
La segunda fase se inicia unas 2 horas después de iniciada la inflamación y se
caracteriza por el aumento de los eicosanoides, sustancias generadas a partir del ácido
araquidónico (AA) que se libera por acción de fosfolipasas A y C. En estado libre, la
metabolización se debe a la acción de la ciclooxigenasa-1 (COX-1), enzima constitutiva
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implicada en homeostasis en general y por la ciclooxigenasa-2 (COX-2) (Hinz y Brune,
2002).
A partir de la acción de COX, se comienzan a generar Prostaglandinas,
leucotrienos y tromboxanos. Prostaglandinas como la PGE2, PGI2 o PGF son
vasodilatadores, promueven la formación de edema entre otras acciones (Yoshikai,
2001). Leucotrieno LTB4 es un potente agente quimiotáctico, mientras LTC4 y LTD4
causan hipotensión y aumentan el paso de contenido líquido al sitio de inflamación
(Piper, 1984).
Las proteínas del complemento son fragmentos de moléculas generados por
diversos procesos proteolíticos en cascada. Estos fragmentos son 9 y se designan con
la letra C (C1 al C9). Participan desde el inicio en el proceso inflamatorio uniéndose a
receptores presentes en diferentes células, favoreciendo la transmigración por
quimiotaxis de las células inflamatorias hacia el tejido lesionado, induciendo
degranulación de mastocitos y basófilos, además de la secreción de aminas
vasoactivas y síntesis de prostaglandinas y leucotrienos (Kirschfink, 1997).
Las primeras células en llegar a la zona lesionada, inducidas directamente por
la quimiotaxis de C5a, C3a y PG son los neutrófilos. Estas células poseen gran
capacidad para fagocitar y eliminar agentes extraños. También son capaces de
estimular a otras células para liberar quimioatrayentes como por ejemplo la IL-8 (Van
Wetering et al, 2002).
A continuación vienen los monocitos, que derivan a macrófagos en la zona
afectada. Su función es ingerir y procesar el agente extraño para luego presentarlo a las
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células linfocitarias. Los linfocitos y los macrófagos liberan TNF- , IL-1 entre otros
amplificando la respuesta inflamatoria (Marino et al, 1997).
Para facilitar la transmigración de leucocitos, existe participación de variadas
sustancias mediadores como C5a, PAF, LTB4, IL-1, IL-8, y TNF- . Todas estas
sustancias generan la expresión de selectinas por las células endoteliales, lo que
genera adhesión de leucocitos al endotelio venoso postcapilar. (Thurston et al, 2000). A
continuación actúan las integrinas, proteínas de superficie que participan en la
interacción célula-célula. Estas acciones, además de la participación de fibrinógeno e
inmunoglobulinas provocan migración de leucocitos (Springer, 1994).
Dependiendo de la naturaleza e intensidad de la lesión, la zona y el tejido
afectados, y el tipo de respuesta del huésped, la inflamación aguda puede derivar en
cuatro formas de evolución: resolución completa, formación de absceso, fibrosis o
inflamación crónica (Cotran et al, 2000).
La resolución completa es la situación ideal y representa el regreso a la
normalidad del tejido en el que se produjo la lesión. Este tipo de evolución implica la
neutralización de los mediadores químicos con el retorno de la permeabilidad vascular
normal, la interrupción de la infiltración leucocitaria; apoptosis de neutrófilos y
eliminación del líquido de edema, proteínas, leucocitos, cuerpos extraños y restos
necróticos (Laso y Pastor, 1998).
El absceso es una acumulación de pus en un área localizada, producto de una
infección por agentes piógenos. Está formado por células de la línea blanca, vivos y
muertos, tejido necrótico y restos celulares.
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La fibrosis es una evolución común en tejidos que no pueden regenerar o
cuando se ha producido abundante exudación de fibrina.
La inflamación crónica se genera por acción prolongada de diversos agentes
que no pueden ser controlados en la fase aguda como: Infecciones persistentes
producidas por ciertos microorganismos, exposición prolongada a agentes
potencialmente tóxicos, exógenos o endógenos (silicosis, aterosclerosis); además de
las enfermedades autoinmunitarias (artritis reumatoídea, entre otras) (Cotran et al,
2000).
Como ya se explicó, en una inflamación aguda, los rasgos que la caracterizan
son: alteraciones vasculares, edema e infiltración por neutrófilos polimorfonucleares. En
cambio, en una inflamación crónica hay otras características como infiltración por
células mononucleares (macrófagos, linfocitos y células plasmáticas), demostrando
reacción persistente a la noxa o agente injuriante; también existe destrucción tisular
(daño inducido por productos de células inflamatorias) e intentos de reparación del
tejido lesionado, mediante sustitución por tejido conectivo, con proliferación de vasos de
pequeño calibre (angiogénesis) y especialmente proliferación fibroblástica, es decir,
tejido de granulación, el cual conduce a fibrosis (Cotran et al, 2000).
En la inflamación crónica, la figura central es el macrófago, un derivado del
monocito, encargado de fagocitar agentes extraños, que es activado por acción de
células T por medio del interferón gamma (IFN- ), endotoxina y otros mediadores
químicos. Los linfocitos y las células plasmáticas son otras células cruciales en el
proceso crónico, estas son activadas por antígenos a través de macrófago o célula
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dendrítica; las células plasmáticas se generan por activación de células B y son
capaces de generar anticuerpos (Cotran et al, 2000).
3.2 NF- B
El factor nuclear kappa B (NF- B) es un factor de transcripción encontrado en
una gran variedad de células inmunes participando en la regulación de genes
involucrados en procesos celulares y fisiológicos, tales como el crecimiento y apoptosis
y tiene un importante rol en la respuesta inmune e inflamatoria al inducir la transcripción
de genes inflamatorios (Baeuerle y Baltimore, 1996).
Mediadores proinflamatorios como iNOS, COX-2 y molécula-1 de adhesión
intercelular, son proteínas reguladas por el factor NF- B. (Barnes y Karin, 1997)
NF- B existe como homo o heterodímero de 5 proteínas enlazadas a DNA (Rel
A/p65, Rel B, C-Rel, p52 y p50), las que están unidas a las proteínas inhibidoras I B.
Cuando la I B es fosforilada por I B quinasas (IKK), se degrada el I B con lo que se
libera NF- B, el que puede translocar al núcleo (Karin y Lin, 2002).
En neutrófilos, NF- B es activado por estímulos proinflamatorios tales como
fMLP y factor activador de plaquetas (PAF) (Mcdonald et al, 1997), estos últimos son
factores que median diversas funciones en neutrófilos tales como quimiotaxis,
producción de superóxido y expresión de COX-2 (Chao y Olson, 1993).
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3.3 Ciclooxigenasa (COX)
Las prostaglandinas sintasas o ciclooxigenasas, son enzimas que catalizan la
síntesis de prostaglandina H2 a partir de ácido araquidónico. Este producto es el
precursor de la síntesis de prostaglandinas, prostaciclinas y tromboxanos (Smith et al,
1991). Existen 2 isoformas de la ciclooxigenasa, denominadas COX-1 y COX-2. La
COX-1 es una enzima constitutiva expresada en muchos tejidos tales como plaquetas,
células endoteliales, riñón e intestino con el fin de generar prostaglandinas implicadas
en la regulación autocrina y paracrina de la homeostasis. (Funk et al, 1991). COX-2 es
una enzima inducible que no se detecta en la mayoría de los tejidos bajo condiciones
normales, pero es inducida en varios tejidos por factores de crecimiento, oncogenes,
estímulos inflamatorios y promotores tumorales. Puede ser liberada por células como
monocitos, macrófagos y células sinoviales. (Jaeckel et al, 2001).
3.4 Terapia antiinflamatoria
La terapia antiinflamatoria clásica comprende 2 grandes grupos de fármacos:
los antiinflamatorios no esteroidales (AINEs) y los corticoides.
Los antiinflamatorios no esteroidales, son fármacos de estructura química
diversa, que tienen como característica común no ser derivados de estructuras
esteroidal. Ejercen su acción a través de la inhibición de COX, con lo que se impide la
síntesis de prostaglandinas a partir de ácido araquidónico. Por tanto, la inhibición de
COX-2 tiene importancia en la terapéutica antiinflamatoria, mientras que la inhibición de
COX-1, está en estrecha relación con la producción de efectos colaterales gástricos
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(pirosis, dispepsia, gastritis, dolor gástrico, diarrea o estreñimiento), renales (reducción
de la función renal y retención de agua, sodio y potasio, nefropatía intersticial crónica)
alteraciones de la función plaquetaria (impidiendo la agregación plaquetaria) (Insel,
2001). En general, los AINEs inhiben a ambos tipos de ciclooxigenasa, con mayor o
menor afinidad sobre una u otra isoforma (Insel, 2001). Entre los más comúnmente
usados se encuentran Ibuprofeno, Diclofenaco, Ketoprofeno, entre otros.
Inhibidores selectivos de COX-2, también denominados Coxibs, son un grupo
de fármacos de la familia de los AINEs capaces solo de inhibir la acción de la COX-2,
por tanto no generan los efectos adversos asociados a inhibición de COX-1. Fueron
desarrollados en un intento de inhibir síntesis de prostaciclina por la isoenzima COX-2
inducida en sitios de inflamación. Los Coxibs se unen y bloquean el sitio activo de COX-
2 mucho más efectivamente que el de COX-1 (Katzung y Furst, 2005). Tienen menor
efecto gastrointestinal, además de no tener impacto en la agregación plaquetaria,
ambos efectos mediados por COX-1. Los Coxibs por tanto no ofrecen propiedades
cardioprotectoras (Katzung y Furst, 2005). Los más conocidos son Celecoxib y
Rofecoxib. Existe otro fármaco no Coxib con propiedades selectivas sobre COX-2
llamado Meloxicam, un derivado del Piroxicam. Los efectos adversos con el uso de los
coxibs tienen relación con riesgo cardiovascular debido a reducción de prostaglandinas
antitrombóticas (katzung y Furst, 2005; Solomon et al, 2006; Topol y Falk, 2004). Se ha
demostrado también que los coxibs y meloxicam, de igual modo que los demás AINE,
pueden producir daño gastrointestinal en algunos pacientes, además de posible daño
hepático en usos prolongados (Katzung y Furst, 2005; Simon et al, 1999).
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Los corticoides, son fármacos que tienen como característica común ser
derivados del colesterol. Poseen múltiples propiedades supresoras, siendo capaces de
suprimir las manifestaciones tempranas de la inflamación (rubor, tumor, dolor, etc),
además de las tardías tales como la cicatrización o proliferación celular, inhiben la
dilatación vascular y la formación de edema, además de reducir el depósito de fibrina
en la zona afectada (Flórez y Amado, 1997). El mecanismo por el que logran su efecto
es múltiple: inhiben el acceso de los leucocitos al foco inflamatorio, interfieren en la
función de los fibroblastos y de las células endoteliales y suprimen la producción o los
efectos de numerosos mediadores químicos de la inflamación (Flórez y Amado, 1997).
La inhibición de la entrada de los neutrófilos al foco inflamatorio se debe a que
bloquean la expresión de las moléculas de adhesión celular que permiten la fijación de
los leucocitos al endotelio inflamado (Flórez y Amado, 1997).
Los corticoides también inhiben diversos procesos que conducen a la activación
de linfocitos T: disminuyen la producción de IL-2, impiden la síntesis de IL-3, IL-4 e IL-6.
En cuanto a los linfocitos B, estos no son afectados a menos que el corticoide se
administre antes que los linfocitos se activen (Flórez y Amado, 1997).
Los efectos adversos son variados: inhiben la función suprarrenal, provocan un
cuadro denominado síndrome de Cushing iatrogénico, cuya intensidad dependerá de la
dosis, estos son: aumento de peso, redistribución de la grasa en cara, cuello y
abdomen, acné, retención de sodio y agua, hipertensión, tendencia a instaurar diabetes,
hiperlipidemia, osteoporosis, detención del crecimiento en niños, adelgazamiento de la
piel y trastornos en la cicatrización de heridas.
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Los corticoides además alteran la barrera mucosa, reducen la actividad
regeneradora del epitelio y, en ocasiones, aumentan la acidez del jugo gástrico. Pueden
ocasionar alteraciones psicológicas en forma de cambios de humor (euforia o
depresión) y psicopatías de tipo maníaco-depresivo o esquizofrénico, incluso con
intentos suicidas (Flórez y Amado, 1997). Los corticoides más conocidos son
Betametasona, Fluticasona, Prednisona, entre otros.
3.5 Andrographis paniculata
Andrographis paniculata es una planta medicinal de origen Chino utilizada para
desórdenes gástricos, resfríos, influenza y otras enfermedades infecciosas (Bensky y
Gamble, 1993)
Andrographis paniculata pertenece a la división de las angiospermas, clase de
las dicotiledóneas y a la familia Acanthaceae. Es un arbusto de follaje anual, de sabor
extremadamente amargo en todo el cuerpo de la planta, por eso en India se le conoce
como “Maha-tita” que significa literalmente “Rey de los Amargos”. El género
Andrographis consiste de 28 especies de pequeños arbustos anuales esencialmente
distribuidos en Asia tropical. Crece recto con una altura de 30 a 110 cms,
principalmente en lugares sombríos. Las flores que da son blancas con manchas rosa-
púrpura en los pétalos. (Ajaya et al. 2004). Solo unas pocas especies son medicinales,
de los cuales A. paniculata es el más popular.
Andrographis paniculata contiene diversos principios activos, entre ellos se
destacan Andrografólido, neoandrografólido y deoxiandrografólido.
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3.6 Andrografólido
Andrografólido es el mayor componente del Andrographis paniculata.
Químicamente corresponde a una lactona , insaturada (ver anexo 1), con un peso
molecular de 350,4 gr/mol y puede ser extraída por medio de alcohol o solventes
orgánicos (Zheng, 1982). El extracto se ha usado para la elaboración de medicamentos
enfocados al tratamiento de infecciones virales y enfermedades inflamatorias (Coon y
Ernst, 2004). Se sabe que ejerce diversas acciones antiinflamatorias, incluyendo
inhibición de la expresión de la molécula-1 de adhesión intercelular en monocitos
activados por el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (Habtemarian, 1998), supresión
de la expresión de óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS) en células RAW264.7,
estimuladas por lipopolisacáridos (LPS) e Interferón- (Chiou et al., 2000).
Se ha descrito que Andrografólido inhibe la activación microglial a través de la
inhibición de iNOS y expresión de ciclooxigenasa-2 (COX-2) (Wang et al., 2004). En
neutrófilos, se ha visto que Andrografólido reduce la adhesión inducida por N-formil-
metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) y producción de especies oxígeno reactivas y
expresión de MAC-1 inducida por miristato de forbol y fMLP (Shen, et al., 2002).
Se ha demostrado que Andrografólido inhibe la expresión de diversas proteínas
pro-inflamatorias generadas por la vía del NF- B tales como COX-2, iNOS molécula-1
de adhesión intercelular, entre otros; lo que es posible gracias a que Andrografólido
impide la unión del NF- B al DNA, por lo que no se activan los genes que generarán las
proteínas pro-inflamatorias (Hidalgo et al, 2005).
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3.7 Modelo de Inflamación aguda con carragenina subplantar
El modelo de inflamación aguda por medio de administración subplantar de
carragenina es el más usado para estudiar procesos inflamatorios o terapias
antiinflamatorias. Fue introducido en 1962 por Winter, Risley y Nuss para probar drogas
capaces de reducir edema y que no tenían un mecanismo completamente definido.
Estudios posteriores han demostrado que este modelo es muy útil para el estudio de
AINEs convencionales, inhibidores de COX-2 y anticuerpos monoclonales a
prostaglandina E2, los que actúan de forma muy efectiva como antiinflamatorios en este
modelo (Chan et al, 1995; Khanna et al, 1997).
El procedimiento consiste en inyectar, bajo anestesia, un agente extraño
(carragenina), específicamente en la zona subplantar de la pata trasera izquierda de
una rata Sprague Dawley, con el fin de generar una respuesta inflamatoria aguda
completa con etapas claramente definidas de inicio y recuperación. De manera
comparativa, se inyecta un volumen similar de la solución pero sin el agente extraño, a
modo de control, en la extremidad trasera contraria. El fármaco a estudiar debe ser
inyectado alrededor de 30 a 60 minutos antes de inducir inflamación (Otterness y
Moore, 1985).
El modelo de inflamación aguda en ratas se ha usado para estudios de COX-2,
donde se pudo demostrar que elevados niveles de COX-2 eran concomitantes a
incremento en la producción de prostaglandinas (Kennedy et al, 1993). Los niveles de
COX-2 en la inflamación aguda en ratas inducidas con carragenina son demostrables a
través de técnicas histológicas de tinción inmune, por medio de marcado con
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anticuerpos anti COX-2, lo que permite estimar la acción de un fármaco antiinflamatorio
sobre los niveles de COX-2. (Nantel et al, 1999).
3.8 Presentación del problema
La búsqueda de nuevas terapias farmacológicas en el campo de los
antiinflamatorios que no produzcan los efectos adversos asociados a los AINE (tales
como irritación y erosión gástrica, entre otros), en general producidos por su mecanismo
de acción inespecífico sobre COX-2 (Insel, 2001), y que tampoco produzcan las
complicaciones relacionadas con el uso de corticoides (síndrome de Cushing,
hipercorticalismo, entre otros), generalmente asociado al uso prolongado de la terapia
(Flórez y Amado, 1997) ha llevado a pensar en diferentes tipos de productos como
terapia alternativa o bien como producto de primera línea. Estas investigaciones han
conducido a buscar productos de origen natural, entre los cuales se encuentra
andrografólido, principio activo de la planta Andrographis paniculata y que posee
propiedades inmunomoduladoras como ya se ha descrito en este trabajo.
La vía del NF- B está relacionada con la producción de sustancias
proinflamatorias (Hidalgo et al, 2005) y debido a que andrografólido inhibe esta vía, se
espera que este producto sea capaz de reducir los efectos de la inflamación.
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3.9 Hipótesis
Andrografólido disminuye la inflamación aguda producida por administración
subplantar de carragenina en ratas.
3.10 Objetivo general
Evaluar el efecto de Andrografólido administrado por vía intraperitoneal en la
evolución de la inflamación aguda generada en ratas Sprague Dawley mediante
inyección subplantar de carragenina.
3.11 Objetivos específicos
• Desarrollar el método de inducción de inflamación aguda por administración
subplantar de carragenina en ratas.
• Evaluar el efecto de Andrografólido en casos de inflamación aguda inducida en
ratas.
• Comparar Andrografólido respecto de diclofenaco en inflamación aguda, de
manera de estimar la eficacia de Andrografólido.
• Evaluar el efecto a nivel histológico por inmunohistoquímica y tinción con
hematoxilina-eosina.
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4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Materiales
4.1.1 Material biológico
Se utilizaron ratas macho de la cepa Sprague Dawley, con un peso entre 150 a
200 grs., obtenidos en el bioterio del Instituto de Farmacología y Morfofisiología de la
Facultad de Ciencias Veterinarias. Los animales se mantuvieron todo el tiempo en un
ambiente controlado, a temperatura entre 22o a 24º Celsius, con ciclo día-noche de 12
horas por etapa, además de libre acceso a comida y agua. (Winyard y Willoughby
2003).
4.1.2 Material para evaluar inflamación
• Caliper digital
4.1.3 Material farmacológico
• Carragenina lambda (Sigma)
• Ketamina (Dragpharma)
• Andrografólido (Sigma)
• Diclofenaco (Mintlab)
• Solución salina 0,9%
• Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma)
• PBS 1X (Buffer fosfato salino 1X)
• Formalina 10%
22
4.1.4 Material para inmunohistoquímica y hematoxilina-eosina
• Kit para inmunohistoquímica PK7200 (Vector)
• Diaminobenzidina (DAB), SK-4105 (Vector)
• Bloqueador de peroxidasa (Vector)
• Hematoxilina, RE7107 (Novocastra)
• Eosina 10%
4.1.5 Otros materiales
• Balanza
• Jeringas de tuberculina
• Agujas hipodérmicas
• Frascos con tapa
• Guantes desechables
• Tijera y bisturí
• Microscopio Olympus BX-51
• Software Image Pro® Plus Version 4.5.1
23
4.2 Métodos
4.2.1 Distribución de animales e inyección de fármaco
Todas las ratas fueron pesadas y separadas en 4 grupos, para ello se
identificaron con marcador permanente en la cola.
Por medio de caliper digital se midieron las patas traseras a cada animal. Esto
se hizo en la zona metacarpiana de la pata, desde el dorso hasta la planta, siempre en
el mismo punto en todos los animales. El procedimiento continuó con la inyección de
fármaco por vía intraperitoneal para cada grupo de la siguiente forma:
Grupo 1 o Control: recibió solo vehículo (6,4 % DMSO en PBS)
Grupo 2 o AINE: recibió diclofenaco 2 mg/kg peso
Grupo 3 o Ap4: recibió Andrografólido 4 mg/kg peso
Grupo 4 o Ap1: recibió Andrografólido 1 mg/kg peso
Debido al carácter hidrófobo del Andrografólido, se utilizó como medio de
disolución DMSO, sustancia en la que solubiliza el producto, completando el volumen
de la solución final con PBS 1X. Esto hizo necesario que el grupo control recibiera
DMSO en PBS (6,4 % de DMSO en PBS).
Luego de administrar el fármaco, se esperó por 30 minutos, antes de proseguir
con la inducción de inflamación.
24
4.2.2 Inducción de inflamación en las patas de cada rata
Se inyectó intraperitonealmente ketamina 100 mg/kg para anestesiar a los
animales, luego se procedió a inyectar 100 µl de carragenina al 1 % en solución salina
en la pata trasera izquierda de cada animal, seguido de administración de 100 µl de
solución salina en la pata trasera derecha. Para inyectar los animales se utilizó jeringa
de tuberculina cargada con la solución a administrar, por vía subplantar en ambas patas
(Winyard y Willoughby 2003).
4.2.3 Valoración de la inflamación
Se midió la pata derecha e izquierda a cada animal a la altura del cojinete
plantar, en el área metatarsiana, desde el dorso hasta la planta. Esta medición se
realizó antes de iniciar la inducción y luego, transcurridas 1, 2, 3, 4, 5, y 6 horas post-
inducción, para luego medir 24 horas después de iniciado el proceso. Los datos
registrados fueron: grupo terapéutico, número de animal, hora a la que se midió, la
extremidad medida y el valor en milímetros.
4.2.4 Sacrificio de animales
Transcurrido el tiempo estimado de análisis para cada grupo de ratas, se
procedió a sacrificar los animales por sobredosis de anestesia. Las patas traseras
fueron retiradas por cirugía y guardadas en formalina al 10% en frascos
individualizados. A fin de obtener muestras a distinto tiempo, se repitió el procedimiento
para los 4 grupos y se realizaron sacrificios a las 6 horas después de inducida la
inflamación con carragenina.
25
4.2.5 Procesamiento de muestras
Las muestras fijadas en formalina fueron deshidratadas, incluidas en parafina y
seccionadas en cortes de 5 micras sobre portaobjetos protegidos en xilano. La parafina
fue removida posteriormente y los tejidos se re-hidrataron por lavado con xilol por 3
minutos, 2 veces; luego 2 veces en etanol 100 %, 3 minutos por vez; 2 veces en etanol
95 % por 3 minutos cada una y una vez en agua por 5 minutos. Los tejidos fueron
sometidos a inmunohistoquímica según el procedimiento indicado por el fabricante del
kit PK-7200. Para ello se sometió cada muestra a bloqueador de actividad peroxidasa
(Vector Lab.) por 30 minutos y luego lavados con agua por 5 minutos. Después se
incubó por 20 minutos en suero normal de caballo diluido al 2,5 %. A continuación se
incubaron las muestras por 30 minutos en anticuerpo anti COX-2 murino obtenido de
conejo (Cayman Lab.), diluido en proporción 1:100 en solución de albúmina 1 % en
PBS. Se lavaron las muestras con PBS. Posteriormente se incubaron los tejidos por 30
minutos con anticuerpo secundario biotinilado diluido (Vector Lab.) y se lavaron en PBS.
Después se incubaron las muestras en solución peroxidasa unida a Avidina (Vector
Lab.) y lavados en PBS por 5 minutos. Las muestras fueron reveladas usando
Cromógeno DAB. Se utilizó hematoxilina como tinción de contraste. (Nantel et al, 1999;
Manual de producto Vector PK-7200).
En el caso de muestras para hematoxilina-eosina, se realizó hidratación tal
como se describe antes y luego los tejidos se sometieron a hematoxilina por 5 minutos,
se lavaron en agua, tratamiento con borato de sodio al 1% por 2 minutos, lavado en
agua, tratamiento con eosina por 1 minuto y finalmente deshidratación y posterior
montaje.
26
4.2.6 Análisis estadístico
Para analizar los resultados correspondientes al ancho de las patas a distintos
tiempos y terapias, se realizó estudio estadístico consistente en análisis de varianza
(ANOVA). Se consideraron significativos valores p<0.05 y p<0.01.
Además el análisis incluyó diversos test:
• Test de normalidad de Kolmogorov-Smirnov (Zar,1999)
• Test de Bartlett, para comprobar homogeneidad de varianzas (Snedecor,
1989)
• Test de Dunnett: para comparar los tratamientos respecto del grupo control.
Para el análisis se utilizó el programa Graph Pad PRISM versión 3.0.
4.2.7 Análisis histológico
Para realizar los análisis histológicos e inmunohistoquímica, se utilizó
microscopio conectado a computador de escritorio, con el fin de fotografiar cada
muestra y demostrar la presencia de COX-2 en los cortes. Esto se hizo mediante el
software Image Pro® Plus Version 4.5.1. Las muestras a las que se realizó
inmunohistoquímica fueron comparadas por intensidad de color, elaborándose una
escala visual en orden creciente de la cantidad de inmuno-reactividad (color café)
debido a la presencia de COX-2. La hematoxilina-eosina se utilizó para observar edema
e infiltración celular en el tejido conectivo, lo que se observó como aumento del espacio
intercelular debido al ingreso de líquido. Para evaluar la infiltración celular se consideró
la cantidad de núcleos celulares presentes en el tejido conectivo.
27
5. RESULTADOS
Los resultados se presentan de modo tal que inicialmente pueda comprobarse
el éxito de los procedimientos empleados, ya sea mediante el grado de inflamación
como por análisis histológico, para posteriormente, analizar los datos correspondientes
al estudio en sí y poder realizar las comparaciones de los grupos con diferente
tratamiento farmacológico.
5.1 Determinación del éxito de los procedimientos realizados
5.1.1 Inducción de la inflamación
La Figura 1 corresponde a la inflamación en el tiempo para el grupo control.
Aquí se incluyeron los datos de la pata inflamada (carragenina) y la no inflamada
(solución salina). Se ha comparado estadísticamente cada hora respecto a su tiempo
basal para ver diferencias significativas, las que se representaron con (*) para p<0.05 y
(**) para p<0.01. En esta etapa se encontraron diferencias significativas en la
extremidad inflamada desde la primera hora (p<0,01) y también a la hora 24 (p<0.05).
La extremidad con solución salina (vehículo) no presentó diferencias significativas
respecto al basal.
28
Evolución en el tiempo del grupo control
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 254
5
6
7
8
9
Carragenina
Solución salina
****
** ** ** **
*
Horas
Anc
ho
de
pat
a (m
m)
Figura 1: Evolución en el tiempo del grupo terapéutico tratado con vehículo. El
ancho de pata en el área metatarsiana, desde el dorso hasta la planta, está expresado
en milímetros. Todos los animales recibieron Carragenina al 1% en solución salina en la
pata trasera izquierda (línea color azul) y solución salina en la extremidad trasera
derecha (línea color rojo). Cada punto representa el promedio con su correspondiente
error estándar. Las diferencias significativas respecto al basal (t=0), se representaron
como (*) = p < 0.05, (**) = p < 0.01.
5.1.2 Inmunohistoquímica
Para demostrar el éxito de la inmunohistoquímica se realizaron comparaciones
entre el grupo control, que incluyó una muestra de pata no inflamada (vehículo), una
inflamada (carragenina), además de una inflamada que no recibió primer anticuerpo
(anti COX-2), las cuales son presentadas en la figura 2. La inmuno-reactividad por
29
presencia de COX-2 corresponde a la cantidad de coloración café, por lo que debe
entenderse que a mayor cantidad de la enzima, mayor es la coloración de la muestra.
Las imágenes mostraron claramente una gran inmuno-reactividad en la muestra
inflamada y con primer anticuerpo, mientras que las muestras no inflamada y sin primer
anticuerpo no presentaron marca.
Figura 2: Inmunohistoquímica realizada a manera de comprobación de la
técnica. La coloración café expresa la cantidad de inmunoreactividad de la muestra.
(A) corresponde a muestra de extremidad no inflamada (solución salina), (B) pata
inflamada (carragenina). (C) es una muestra de pata inflamada con carragenina que
no fue tratada con primer anticuerpo durante la inmunohistoquímica. La intensidad de
coloración café indica cantidad de COX-2 presente en la muestra. (*) corresponde a
inmuno-reactividad positiva. Imágenes con aumento de 20X.
*
30
5.1.3 Edema e infiltración celular
Algunas muestras de grupo control fueron sometidas a hematoxilina-eosina
para este fin. Se compararon aquellos correspondientes a animales que recibieron
carragenina y vehículo a los tiempos 6 y 24 horas post-inducción para de este modo,
comparar visualmente una muestra con la otra con el fin de estimar el grado de edema
e infiltración celular en la muestra inflamada.
5.1.3.1 Edema e infiltración a las 6 horas post-inducción
Se puede observar en la figura 3 que el tejido conectivo de la muestra de
animales con extremidad no inflamada presentaron escaso edema o ausencia de este,
mientras que muestras correspondiente a animales que recibieron carragenina poseían
un gran espacio intercelular debido a edema, varios núcleos celulares de gran tamaño y
una tinción rojiza de parte del tejido, por gran presencia de sustancias proteicas. Los
signos histológicos indicaron una gran inflamación en las imágenes correspondientes a
la muestra inducida con carragenina (B y D), no así para la muestra con vehículo (A y
C).
31
Figura 3: Edema e infiltración celular en grupo control a las 6 horas. (A)
y (C), muestra de pata no inflamada con aumento de 10X y 40X
respectivamente. (B) y (D), muestra de pata inflamada con carragenina con
aumento 10X y 40X respectivamente. Las imágenes muestran el tejido
conectivo a fin de evidenciar edema e infiltración celular. Los cuadrados de las
fotos superiores indican el punto aproximado que se fotografió a mayor
aumento y que han sido puestos en las imágenes inferiores. Tinción
hematoxilina-eosina.
32
5.1.3.2 Edema e infiltración a las 24 horas post-inducción
La figura 4 corresponde a muestras de patas obtenidas a las 24 horas,
sometidas a tinción hematoxilina-eosina. En ella se observa gran similitud estructural, el
edema ha disminuido en la muestra inducida con carragenina, hasta asemejarse a la no
inflamada. El tamaño del tejido conectivo se ha reducido, observándose ordenamiento
de la estructura tisular.
Figura 4: Edema e infiltración celular en grupo control a las 24 horas.
(A) y (C), muestra de pata no inflamada con aumento de 10X y 40X
respectivamente. (B) y (D), muestra de pata inflamada con carragenina con
aumento 10X y 40X respectivamente. Las imágenes muestran el tejido
conectivo a fin de evidenciar edema e infiltración celular. Los cuadrados indican
el punto aproximado que se fotografió a más aumento. Hematoxilina-eosina.
33
5.2 Comparación de grupos terapéuticos respecto al control
Durante el proceso de inflamación aguda inducida, se midieron las
extremidades de todos los animales para todos lo grupos usados, estos datos fueron
usados para diseñar gráficos para cada hora post-inducción, en ellos se compararon
todos los grupos terapéuticos respecto al control que recibió solamente vehículo de la
terapia por vía intraperitoneal (DMSO+PBS).
En la figura 5 se presentan solamente aquellos gráficos en el tiempo en que hay
diferencias significativas en las terapias (1 hora y 24 horas) y el correspondiente al
tiempo en el que se ha realizado análisis histológico (6 horas), (hematoxilina-eosina,
inmunohistoquímica).
Andrografólido 4 mg/kg y diclofenaco 2 mg/kg presentaron diferencias
significativas a tiempo 1 hora (p<0.01), mientras que a tiempo 24 horas presentaron
diferencias significativas las 3 terapias empleadas en el estudio (p<0.01). No se
encontraron diferencias significativas a otras horas para ninguna de las terapias. (figura
5).
34
Inflamación de pata (metatarso) en milímetros para cada grupo terapéutico
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
* * * *
- 2 - - Diclofenaco (mg/kg)- - 1 4 Andrografólido (mg/kg)
Hora 1
An
cho
de la
zon
am
etat
arsi
ana
(mm
)
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
- 2 - - Diclofenaco (mg/kg)- - 1 4 Andrografólido (mg/kg)
Hora 6
An
cho
de
la z
on
am
etat
arsi
ana
(mm
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
* * * ** *
- 2 - - Diclofenaco (mg/kg)- - 1 4 Andrografólido (mg/kg)
Hora 24
Anc
ho d
e la
zo
nam
etat
arsi
ana
(mm
Figura 5: Efecto de andrografólido y diclofenaco sobre la inflamación inducida
con carragenina, a tiempos 1, 6 y 24 horas post-inducción. Cada gráfico incluyó a los
grupos terapéuticos comparados estadísticamente respecto al control. Los gráficos
corresponden al ancho medido con caliper digital en la zona metatarsiana de la
extremidad inflamada del animal tomada desde el dorso hasta la planta. Cada barra se
representó como el promedio con su error estándar. Diferencias significativas respecto
al control se representaron con asteriscos (*), donde * = p < 0.05, ** = p < 0.01.
35
5.3 Determinación de efecto antiinflamatorio
El efecto antiinflamatorio en el tiempo de cada grupo terapéutico, se obtuvo
considerando intervalos de tiempo hasta 6 horas y hasta 24 horas post-inducción. Los
gráficos representan área bajo la curva para los datos de inflamación obtenidos con
caliper digital en las extremidades inflamadas de los animales. Los gráficos presentados
en la figura 6 corresponden a cada terapia comparada contra el grupo control que
solamente recibió vehículo.
No se observan diferencias significativas en el gráfico correspondiente a 6
horas para andrografólido, aunque si las hay para diclofenaco (p<0.05). A las 24 horas
se observan diferencias significativas para andrografólido 4mg/kg peso y para
diclofenaco (p<0.05).
Gráficos efecto antiinflamatorio
0
5
10
15
20
- 2 - - Diclofenaco (mg/kg)- - 1 4 Andrografólido (mg/kg)
*
Efecto Antiinflamatorio 6hrs
AB
C0-
6 (
mm
x h
r)
0
20
40
60
80
* *
- 2 - - Diclofenaco (mg/kg)- - 1 4 Andrografólido (mg/kg)
Efecto Antiinflamatorio 24hrs
AB
C0-
24 (
mm
x h
r)
Figura 6: Efecto antiinflamatorio para cada grupo terapéutico respecto al
control, determinado por área bajo la curva (ABC) entre 0-6 horas y entre 0-24 horas.
Las diferencias significativas respecto al control se representaron como (*) = p < 0.05,
(**) = p < 0.01. Cada valor se consideró como el promedio con su error estándar.
36
5.4 Presencia de COX-2
Las imágenes correspondientes a la inmunohistoquímica son presentadas
según el tiempo en que fueron tomadas las muestras (6 horas o 24 horas post
inducción), de manera de comparar el efecto sobre la COX-2 de cada terapia respecto
del control correspondiente y respecto de otras terapias a la misma hora. La inmuno-
reactividad para todas las muestras puede verse como una coloración café que
dependiendo de la cantidad de COX-2 posee mayor o menor intensidad.
En los casos que hubo claras diferencias entre una muestra y otra se realizó
una escala de intensidad de inmuno-reactividad elaborada de manera visual.
5.4.1 Presencia de COX-2 a las 6 horas post inducción
La inmuno-reactividad a las 6 horas, mostrado en la figura 7, es notablemente
más alta en la muestra sin terapia, comparando respecto a las otras imágenes de la
misma hora. Existen claras diferencias en la inmuno-reactividad entre terapias, por lo
que ha sido posible realizar una escala visual de la intensidad de coloración.
La cantidad de inmuno-reactividad en orden creciente se asignó como No-
inflamada< Andrografólido 4 mg/kg < Diclofenaco 2 mg/kg < Control inflamado.
37
Figura 7: Presencia de COX-2 por inmunohistoquímica a las 6 horas.
Coloración café indica la cantidad de COX-2 presente en la muestra. (A) pata de
animal control inyectada con solución salina (no inflamada), (B) pata de animal
control inyectada con carragenina (inflamada), (C) pata de animal inyectada con
carragenina y que fue tratado con andrografólido 4 mg/kg peso (D) pata de animal
inyectada con carragenina y que fue tratado con diclofenaco 2 mg/kg. Imágenes con
aumento 20X.
38
5.4.2 Presencia de COX-2 a 24 horas post inducción
La inmunodetección de COX-2 a 24 horas (figura 8), no presentó diferencias
notables a esta hora. Se observó similitud con el control sin inflamación en todos los
grupos terapéuticos, aunque pudo verse algo más de marca en la muestra de
diclofenaco (D) y en la muestra de animal tratado solo con vehículo (B), pero en una
cantidad muy baja como para ser considerado relevante.
Figura 8: Presencia de COX-2 por inmunohistoquímica a las 24 horas. La
coloración café indica la cantidad de COX-2 presente en la muestra. (A) pata de
animal control inyectada con solución salina (no inflamada), (B) pata de animal
control inyectada con carragenina (inflamada), (C) pata de animal inyectada
carragenina y que fue tratado con andrografólido 4 mg/kg peso (D) pata de animal
inyectada con carragenina y que fue tratado con diclofenaco. Imágenes con
aumento 20X.
39
5.4.3 Inmuno-reactividad por presencia de COX-2 para todas las terapias
Las imágenes presentadas en esta sección corresponden a muestras de
inflamación inducida con carragenina para los grupos control, andrografólido 1 mg/kg,
andrografólido 4 mg/kg y diclofenaco, las que se organizaron según la hora en que
fueron tomadas las muestras. Se realizó inmunodetección de COX-2 en cada grupo y
se compararon entre si.
Con el fin de comprobar si el efecto de andrografólido en la inmuno-reactividad
estaba relacionado con la cantidad de fármaco presente, se incluyó además de la dosis
4 mg/kg, una dosis 1 mg/kg; ya que trabajos anteriores han hecho mención a una
acción farmacológica dependiente de la dosis.
5.4.3.1 Grupos terapéuticos a las 6 horas post-inducción
Todos los grupos terapéuticos presentaron gran inmuno-reactividad a esta hora,
aunque el control (figura 9 A) tuvo una coloración mucho más oscura, evidencia de una
gran presencia de COX-2 en la muestra.
La escala de intensidad asignada para las 6 horas, en orden creciente fue
Andrografólido 4 mg/kg < Diclofenaco < Andrografólido 1 mg/kg< Control inflamado.
40
Figura 9: Presencia de COX-2 por inmunohistoquímica a las 6 horas en
cortes de patas inyectadas con carragenina para inducir inflamación. Coloración
café indica la cantidad de COX-2 presente en la muestra. (A) muestra de animal
control (vehículo), (B) muestra de animal tratado con 4 mg/kg de andrografólido, (C)
muestra de animal tratado previamente con 1 mg/kg peso de andrografólido y (D)
muestra de animal tratado con diclofenaco 2 mg/kg. Imágenes con aumento 20X.
41
5.4.3.2 Grupos terapéuticos a las 24 horas post-inducción
La inmunodetección de COX-2 en muestras a las 24 horas (figura 10),
prácticamente no presentó evidencia de la enzima a esta hora. Diclofenaco presentó
algo de marca al igual que andrografólido 1 mg/kg, no así para andrografólido 4 mg/kg,
ya que no mostró inmuno-reactividad.
Figura 10: Presencia de COX-2 por inmunohistoquímica a las 24 horas en
cortes de patas inyectadas con carragenina para inducir inflamación. Color café
indica la cantidad de COX-2 presente en la muestra. (A) muestra de animal control
(vehículo), (B) muestra de animal tratado con 4 mg/kg peso de andrografólido, (C)
muestra de animal tratado previamente con 1 mg/kg peso de andrografólido y (D)
muestra de animal tratado con diclofenaco. Imágenes con aumento 20X.
42
5.5 Análisis comparativo del grado de edema e infiltración en todos los grupos
La Figura 11 demostró que la cantidad de edema a las 6 horas fue bastante
mayor que a las 24 en todas las terapias. En la muestra obtenida de animales que sólo
recibieron vehículo, se observa una gran cantidad de edema a las 6 horas, mientras
que las terapias de diclofenaco 2 mg/kg y andrografólido 4 mg/kg lograron un tejido
conectivo menos inflamado y con menos núcleos celulares en el tejido conectivo.
Aparentemente el edema no es muy distinto en las muestras de 6 horas pero si
ha podido verse claramente una menor cantidad de núcleos celulares en la muestra
andrografólido 4 mg/kg.
A las 24 horas se observó que diclofenaco y andrografólido 4 mg/kg tenían una
estructura mucho más ordenada del tejido aunque no se pudieron ver diferencias muy
relevantes a este respecto, aunque aparentemente el tejido conectivo en el grupo
tratado con diclofenaco se había recuperado mejor la estructura tisular a esa hora.
43
6 horas 24 horas
Figura 11: Edema e infiltración celular en todos los grupos terapéuticos. Las
muestras obtenidas a 6 horas se encuentran en la columna izquierda y las de 24 horas
en la derecha, (A) corresponde a control sin inflamación (vehículo), (B) control con
inflamación por carragenina, (C) andrografólido 1 mg/kg, (D) andrografólido 4 mg/kg y
(E) diclofenaco 2 mg/kg. Tinción hematoxilina-eosina. Aumento 40X.
44
6. DISCUSIÓN
6.1 Éxito de las técnicas utilizadas
El análisis del gráfico evolutivo en el tiempo (figura 1), ha demostrado un
evidente proceso inflamatorio ocasionado por la inyección subplantar de carragenina en
la pata trasera izquierda, al compararla con la extremidad posterior derecha que
solamente recibió solución salina (vehículo de la carragenina). El método demostró
diferencias significativas desde la primera medición post inducción, realizada 1 hora
post-inducción. El máximo valor de inflamación se alcanzó a las 5 horas, aunque hay
autores que han obtenido valores máximos entre las 3 horas (Aquino et al, 1991 y
Fossati, 1999) y 9 horas (García et al, 2000).
A las 24 horas el valor de inflamación había retornado casi a los niveles basales,
aunque permanecía levemente inflamado, esto también fue comprobado por otros
autores en condiciones similares (Crunkhorn y Meacock, 1971; Winter y Nuss, 1962).
Estos datos compruebaron que el procedimiento de inducción de inflamación aguda en
ratas fue realizado exitosamente para nuestro trabajo.
La inmunohistoquímica de la muestra control (figura 2) demostró claramente que
la inmuno-reactividad se correlaciona con la presencia de COX-2 en el tejido (Nantel et
al., 1999). Una muestra carente de primer anticuerpo visualmente es similar a una
muestra que no se ha inflamado, lo que puede verse por la ausencia de inmuno-
reactividad. La muestra inflamada y con primer anticuerpo presentó una variación de
color dependiendo del tiempo post inducción, siendo muy intenso a las 6 horas y casi
nulo a 24 horas, esto nos comprobó que la presencia de COX-2 disminuye de forma
45
natural en el tiempo. Esta disminución fue visible en todos los grupos terapéuticos al
comparar las 6 horas y las 24 horas.
La inmuno-reactividad en la muestra inflamada y en presencia del primer
anticuerpo ha dado una intensa coloración café, mientras que los negativos a
inflamación y primer anticuerpo no se han marcado, con lo que se demostró que la
técnica fue realizada de forma exitosa.
La hematoxilina-eosina es una técnica muy usada en histología para poner en
evidencia núcleos celulares y contenidos citoplasmático a fin de comprobar cambios
morfológicos de tejidos. Las evidencias de inflamación en el grupo control a las 6 horas
entre muestras no inflamada e inflamada con carragenina (figura 3), dejó en evidencia
un aumento del tamaño del tejido conectivo, además de aparición de varias células de
tipo inflamatorio junto con edema en el conectivo (Laso y Pastor, 1998).
El aumento del volumen del tejido conectivo se produce por entrada de liquido
desde el sistema venoso, con el fin de lograr una dilución del agente externo que
provoca inflamación, por tanto es normal en un proceso inflamatorio de estas
características que ocurra un aumento del volumen de la zona por edema, lo que se
pudo evidenciar y comparar con la extremidad opuesta de cada animal, que solamente
recibió solución salina (Laso y Pastor, 1998). En general, la extremidad que no recibió
agente causante de inflamación no mostró signos de edema.
La imagen a 24 horas (figura 4) indicó una importante disminución del edema,
escasas células inflamatorias y una considerable recuperación del estado original del
tejido inflamado. Hubo similitud entre la extremidad inflamada y la no inflamada a este
tiempo. Esto dió cuenta de una recuperación natural de la inflamación entre las 6 y las
46
24 horas, aunque no llegaron a ser idénticas. Las imágenes 3 y 4 demostraron que se
obtuvo inflamación aguda, tal como se había comprobado con el gráfico en el tiempo
para el grupo control.
El proceso de reparación de la inflamación comprende diferentes procesos
dependiendo del tipo de agente inductor, el daño producido y la cantidad de desechos
resultantes del enfrentamiento del organismo contra este agente (Cotran et al, 1999).
En el modelo de inflamación aguda inducida con carragenina, el agente extraño no es
un microorganismo, por lo que no hay secreción purulenta. La reparación en
inflamación aguda por carragenina implica disminución del líquido extracelular,
reorganización del tejido conectivo y sustitución celular en el caso que sea necesario
(Cotran et al, 1999), esto fue demostrable comparando las tinciones hechas a tiempo 6
horas contra las de 24 horas, estas últimas mostraron una reorganización del tejido
inflamado y disminución de edema, comparadas con las anteriores.
En general el proceso de inflamación aguda inducida por carragenina induce una
respuesta inflamatoria local caracterizada por hiperalgesia, edema, extravasación
plasmática e infiltración leucocitaria (Winter et al, 1962). Todos los signos fueron
identificables en los análisis realizados en este trabajo, por lo que se acepta que el
método está correctamente realizado y es posible identificar núcleos celulares y edema
por hematoxilina-eosina, aumento del tamaño de la extremidad al medir con caliper y
tambien se pueden medir sustancias proinflamatorias como la COX o prostaglandinas,
esto último respaldado por trabajos de inmunohistoquimica (Nantel et al, 1999).
47
6.2 Evaluación del efecto de andrografólido
Al analizar los gráficos de inflamación en el tiempo para todos los grupos (ver
anexo 4), diclofenaco 2 mg/kg y andrografólido 4 mg/kg demostraron comportamiento
similar a tiempo 1 hora y a 24 horas post-inducción (figura 5), esto sin embargo ha
ocurrido puntualmente a estos tiempos, ya que al análisis de efecto antiinflamatorio que
se obtuvo por medio del cálculo del área bajo la curva entre 0 y 6 horas y 0 a 24 horas
(figura 6), solamente diclofenaco demostró tener diferencias significativas, lo que podría
deberse al mecanismo de acción de diclofenaco respecto al bloqueo de COX-2 (Todd y
Sorkin, 1988), el que difiere del mecanismo de andrografólido que se basa en inhibir la
expresión de COX-2 gracias a que interfiere la vía de NF- B (Hidalgo et al., 2005). Es
posible que pudiese existir algún tipo de mecanismo compensatorio en el mecanismo
de andrografólido, lo que implicaría que la inflamación igualmente ocurra pero con
participación de otra vía o bien de otros agentes proinflamatorios.
Los resultados a las 6 horas respecto de efecto antiinflamatorio no significan
necesariamente que andrografólido no hubiese sido efectivo, mas bien pudo deberse a
mecanismos compensatorios o la acción de otras vías en las que pueden generarse
sustancias proinflamatorias, situación que no ocurre en diclofenaco ya que este actúa
sobre la enzima y no sobre su síntesis.
A las 24 horas diclofenaco y andrografólido mostraron diferencias significativas
respecto al control, lo que hace suponer que la inflamación ocurre en menor intensidad
a ese tiempo o bien que se ha acortado el tiempo de recuperación gracias a los efectos
de la terapia antiinflamatoria.
48
La cantidad de inflamación y el efecto antiinflamatorio se contradicen con la
cantidad de COX-2 visible por la inmunohistoquímica, ya que a las 6 horas post-
inducción se pudo ver que había disminuido la presencia de COX-2 en el grupo tratado
con andrografólido 4 mg/kg mucho más que con diclofenaco (figura 7), esto se explica
nuevamente por el mecanismo de acción de los fármacos. Se vieron grandes
diferencias igualmente a 6 horas entre andrografólido 1 mg/kg y 4 mg/kg (figura 9),
siendo el último mucho mejor inhibidor de la producción de COX-2 que el primero. Este
resultado corrobora los estudios previos de andrografólido en los que se ha demostrado
que a mayores dosis del fármaco es mucho mejor el efecto inhibitorio sobre la expresión
de COX-2 (Wang et al., 2004 e Hidalgo et al., 2005), lo que se traduce en un mayor
efecto inmunosupresor.
A las 24 horas hubo una escasa inmuno-reactividad en todos los grupos (figuras
8 y 10), debido posiblemente a recuperación natural de la inflamación, aunque
visiblemente siguió existiendo la diferencia en la cantidad de marca en las muestras de
andrografólido por sobre la de diclofenaco, con lo que se asumió que el efecto del
fármaco se pudo haber prolongado hasta las 24 horas.
El edema e infiltración celular en el tejido presentaban muchas diferencias entre
el control con inflamación y las muestras de andrografólido. El daño a nivel del tejido
conectivo es bastante mayor visualmente a las 6 horas (figura 11). Se pudo ver una
gran cantidad de edema en el control inflamado, mientras que en las demás terapias si
bien existió inflamación, fue de menor intensidad. Si se considera el gráfico comparativo
a las 6 horas (figura 5) para aclarar este punto, no debiesen existir mayores diferencias
respecto al edema, pero las imágenes mostraban muchos núcleos de células
49
inflamatorias en el tejido. A las 24 horas existen diferencias en el tamaño y organización
del tejido que se correlacionan con los datos del grafico comparativo a ese tiempo
(figura 5, 24 horas). A las 6 horas, andrografólido 4 mg/kg mostró menor cantidad de
núcleos celulares que en las demás terapias, lo que pudo deberse a una disminución en
la migración leucocitaria asociada al efecto de andrografólido sobre la molécula de
adhesión intercelular-1, por medio de la inhibición de NF- B (Habtemariam, 1998,
Barnes y Karin, 1997).
El mecanismo de acción de andrografólido, relacionado con impedir la activación
y translocación al núcleo del NF- B, implica, además de disminuir la expresión de COX-
2, a otras sustancias pro-inflamatorias como IFN- , iNOS y IL-8 (Chiou et al., 2000;
Hidalgo et al., 2005). La disminución de IL-2 e IFN- demostrado en células T
estimuladas con concavalina-A (Burgos et al., 2005), además de inhibición de la
molécula de adhesión intercelular-1 en monocitos activados por TNF- (Habtemariam,
1998), son una buena base para pensar en un efecto antiinflamatorio de andrografólido
en pacientes con inflamación aguda y crónica.
Un experimento para demostrar la propiedad anti-inflamatoria de andrografólido
ya ha sido demostrada en ratas, a las cuales se le administraron soluciones de
carragenina, kaolín, nistalim y un extracto de Mycobacterium tuberculosis que les
produce artritis. Las dosis de andrografolido fueron entre 100 a 300 mg/kg. Se observó
disminución del edema inducido por carragenina entre 27.8 a 52.08 %, este ultimo
resultado fue obtenido con las dosis más altas de Andrografolido. En este experimento
se utilizó como AINE a Fenilbutazona, el que fue capaz de disminuir en 72.22 % el
edema. Los resultados obtenidos con kaolín y nistalim fueron muy similares al anterior.
50
El granuloma producido por Mycobacterium tuberculosis en ratas, a las cuales se les
administró andrografolido en dosis de 100 mg/kg 300 mg/kg, disminuyó entre 20-30 %
respectivamente (Madav et al, 1996).
Prednisolona, la forma activa de prednisona, ha demostrado una inhibición de
alrededor de un 50 % del edema, estudio realizado bajo el modelo de inflamación
aguda con carragenina y con artritis inducida con adyuvante (Khanna y Sharma, 2001),
con esto podríamos suponer que existe una gran similitud entre el efecto
antiinflamatorio obtenido por corticoides y andrografólido en dosis altas, aunque se
debe considerar que el uso de corticoides generalmente produce alteraciones
hormonales y usados en forma crónica, generan un gran numero de efectos
secundarios bastante complejos (Flórez y Amado 1997).
Diclofenaco, un AINE clásico comúnmente usado en terapia antiinflamatoria, ha
demostrado que disminuye notablemente la inflamación en el modelo de inducción con
carragenina, efecto que se ve potenciado al aumentar la dosis (Tan-no et al, 2006), este
dato confirma la utilidad de diclofenaco como método comparativo en este modelo.
Los resultados obtenidos en este trabajo apuntan a un efecto de andrografólido 4
mg/kg muy similar a diclofenaco 2 mg/kg, por lo que se considera efectivo a
andrografólido como antiinflamatorio en inflamación aguda.
Las similitudes en la respuesta antiinflamatoria de andrografólido respecto a
diclofenaco en nuestro experimento, a pesar de su mecanismo de acción diferente debe
ser considerada para tratamientos antiinflamatorios crónicos, en los cuales se utilizan
comúnmente los AINE, lo que debido a la terapia prolongada con estos fármacos,
ocasiona los efectos adversos asociados a la inhibición de COX-1, con el consiguiente
51
daño a la salud del paciente. Un fármaco de efectos antiinflamatorios y sin los efectos
secundarios de un AINE o un corticoide, puede ser la mejor alternativa para tratar
problemas crónicos como la artritis, en los que la inflamación conlleva un daño
permanente al paciente y limita su calidad de vida, además, sabiendo que debe usar
este tipo de medicamentos durante mucho tiempo,
Los efectos adversos de los corticoides están relacionados con su estructura
química esteroidal, mientras que los AINEs producen estos efectos debido a su
mecanismo de acción sobre la síntesis de prostaglandinas, ambas situaciones son muy
importantes de considerar si aceptamos que andrografólido posee un efecto similar a
estos fármacos, sin que se hayan descrito efectos adversos importantes relacionados a
su uso. (Jarukamjorn y Nemoto, 2008)
52
7. CONCLUSIONES
Según los resultados obtenidos a partir del presente trabajo experimental luego
de administración de andrografólido 1 mg/kg y 4 mg/kg, se puede concluir que:
• La administración de andrografólido en dosis 4 mg/kg disminuye la inflamación
significativamente comparado contra grupo control o placebo a las horas 1 y 24
post-inducción, además que posee mejor efecto antiinflamatorio a esta dosis
comparada con la de 1 mg/kg, a las 24 horas.
• Andrografólido 4 mg/kg muestra un mayor efecto antiinflamatorio que diclofenaco 2
mg/kg en un periodo de 0 a 24 horas, pero relativamente similares respecto al
control o placebo.
• Andrografólido 1 mg/kg y 4 mg/kg inhiben la expresión de COX-2, comparados
contra un grupo control o placebo y contra diclofenaco, evidenciado por la inmuno-
reactividad a las 6 horas post-inducción.
• Andrografólido a dosis 4 mg/kg es mucho mejor inhibidor de la expresión de COX-2
que la dosis 1 mg/kg, evidenciado comparativamente por inmuno-reactividad a las 6
horas post-inducción.
• La administración de andrografólido 4 mg/kg previo a la inducción de inflamación
aguda disminuye la infiltración celular mucho mejor que todas las otras terapias,
comparando a todas ellas contra un grupo control o placebo a las 6 horas.
53
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63
9. ANEXOS
9.1 Anexo 1: Estructura química de Andrografólido
Andrografólido
9.2 Anexo 2: Inducción de inflamación exitosa:
Imagen de rata del grupo control con evidente inflamación de pata izquierda
comparada con pata derecha (fotografía tomada a las 5 horas post inducción), la
imagen fue tomada a un animal representativo del grupo control. La imagen muestra
claramente la inflamación de la pata izquierda, que posee además de edema,
enrojecimiento y calor, parte de los signos clásicos de la inflamación.
64
9.3 Anexo 3: preparación solución PBS 1X (buffer fosfato salino)
PBS 1X (pH=7.4)
Ø NaCl 8,00 grs
Ø KCl 0,20 grs
Ø Na2HPO4 0,12 grs
Ø KH2PO4 0,24 grs
Disolver en 1000ml de agua destilada
9.4 Anexo 4: Evolución en el tiempo de los grupos terapéuticos:
Gráfico de inflamación en el tiempo, los datos fueron obtenidos entre las horas 1-
6 y la hora 24. Diferencias significativas respecto al control (vehículo) se representaron
para p<0.05 (*) y para p<0.01 (**).
0 1 2 3 4 5 6 240.0
2.5
5.0
7.5
10.0
**** ****
VehículoDiclofenacoAP 1mgAP 4mg
**
Comparativa de inflamación por hora
Tiempo post-induccion (hrs)
Anch
o de
pat
a en
zon
am
etat
arsi
ana
(mm
)
Gráfico que representa la inflamación en milímetros (mm) a cada hora post-inducción
para todos los grupos terapéuticos- * p<0.01, ** p<0.05.
65
9.5 Anexo 5: preparación solución Andrografólido
Ejemplos de cálculo realizados para la preparación de soluciones con
Andrografólido usadas en el procedimiento
Stock 70mM Andrografólido (en DMSO 100%)
350grs 1 mol
Xgrs 0,07 mol /
X=24,53 grs Andrografólido
24,53grs 1000ml = 0,2453grs 10ml
Por tanto se disolvieron 0,2453grs de AP en 10ml de DMSO
Andrografólido 4mg/kg peso
Se realizó considerando volumen de administración de 500 l totales.
4mg AP 1000grs peso
Xmg 200grs /
X=0,8mg de Andrografólido por dosis
0,2453grs = 245,3mg, luego
245.3mg AP 10ml DMSO
0,8mg Xml /
X=0,032ml = 32 l Solución AP en DMSO
66
Cada rata debe recibir por tanto 32 l de AP en DMSO, el volumen se completa para
cada 500 l con PBS, por rata.
Andrografólido 1mg/kg peso
La preparación considera 500 l totales, además de la misma dosis de DMSO,
que se agrega por diferencia de lo agregado en la solución AP en DMSO.
1mg AP 1000grs peso
Xmg 200grs /
X=0,2mg de Andrografólido por dosis
0,2453grs = 245,3mg, luego
245.3mg AP 10ml DMSO
0,2mg Xml /
X=0,082ml = 8,2 l Solución AP en DMSO
Luego 32 l – 8,2 l = 23,8 l de DMSO deben agregarse
La preparación por tanto debe hacerse con 8,2 l de AP en DMSO + 23,8 l de DMSO,
completando a 500 l con PBS