Laporan Praktikum Hari/tanggal : Selasa, 1 Oktober 2013

Biokimia Waktu : 11.00-12.40 WIB

PJP : Puspa Julistia Puspita, S.Si,M.Sc

Asisten : Resti Siti Mutmainah, S.Si

Lusianawati, S.Si

PROTEIN II

Kelompok III

Muhamad Ivan Abror J3L112184

Fika Muthia Kanza J3L112049

Rika Ussy Perdani J3L112107

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA

PROGRAM DIPLOMA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

Pendahuluan

Manusia memerlukan energi untuk melakukan kegiatan dan aktivitas

sehari - hari, energi tersebut dapat diperoleh dari berbagai bahan makanan. Secara

umum, bahan makanan tersebut mengandung karbohidrat, protein, dan lemak.

Protein merupakan biopolimer polipeptida yang tersusun dari sejumlah asam

amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Protein merupakan biopolimer yang

multifungsi, yaitu sebagai struktural pada sel maupun jaringan dan organ, sebagai

enzim suatu biokatalis, sebagai pengemban atau pembawa senyawa atau zat ketika

melalui biomembran sel, dan sebagai zat pengatur (Hawab 2004). Protein

merupakan suatu polimer dari asam amino yang dihubungkan dengan ikatan

peptida. Molekul protein mengandung unsur-unsur C, H, O, N, P, S dan terkadang

mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga. Ikatan peptida dalam struktur

primer protein dapat diuji dengan uji biuret (Winarno 2002).

Protein merupakan komponen terpenting atau komponen utama sel hewan

dan sel manusia. Karena sel merupakan penyusun tubuh manusia, maka protein

yang terdapat dalam makanan berfungsi sebagai zat utama dalam pembentukan

dan pertumbuhan tubuh. Akan tetapi, struktur protein tidak setabil karena mudah

mengalami denaturasi yaitu keadaan dimana protein terurai menjadi struktur

primernya, baik reversible maupun irreversible. Ada berbagai cara dalam

pengujian terhadap protein yaitu dengan reaksi uji asam amino dan reaksi uji

protein yaitu berdasarkan pada pengendapan oleh garam, pengendapan oleh

logam dan alkohol serta uji koagulasi dan denaturasi protein (Poedjiadi 2009).

Albumin adalah protein yang dapat larut dalam air serta dapat terkoagulasi

oleh panas. Albumin terdapat dalam serum darah dan putih telur (Poedjiadi 2009).

Denaturasi protein dapat diartikan suatu perubahan atau modifikasi terhadap

struktur skunder, tersier, dan kuartener molekul protein tanpa terjadinya

pemecahan ikatan-ikatan kovalen. Denaturasi dapat terjadi karena beberapa hal

yaitu karena pengaruh pH, panas, pelarut, logam berat, garam, kekuatan ion, dan

radiasi, oleh karenanya denaturasi dapat diartikan sebagai suatu proses

terpecahnya ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan terbukanya

lipatan molekul protein (Winarno 2002).

Tujuan

Percobaan bertujuan menunjukkan sifat dan struktur protein dan

mempelajari beberapa reaksi uji terhadap protein melalui uji pengendapan oleh

logam, pengendapan oleh garam, uji koagulasi, pengendapan oleh alkohol dan

denaturasi protein.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan ialah penangas air, pipet, tabung reaksi dan alat-

alat gelas lainnya. Bahan-bahan yang digunakan ialah larutan protein (putih telur),

HgCl2 2%, Pb-asetat 5%, AgNO3 5%, kristal (NH4)2SO4, pereaksi Milon, pereaksi

biuret, asam asetat 1 M, HCl 0,1 M, NaOH 0,1 M, buffer asetat pH 4,7, etanol

95%, aquades, dan kertas saring.

Metode Percobaan

Pengendapan oleh logam pada uji protein dilakukan dengan cara albumin

sebanyak 3mL ditambahkan dengan 5 tetes larutan HgCl2 2%, Pb-asetat 5% dan

AgNO3 5%. Perubahan yang terjadi diamati.

Pengendapan oleh garam dilakukan dengan cara larutan protein sebanyak

10 ml dijenuhkan dengan (NH4)2SO4. Penjenuhan dilakukan dengan penambahan

larutan (NH4)2SO4 sedikit demi sedikit hingga mencapai titik jenuh. Larutan

kemudian disaring. Uji kelarutan endapan dilakukan dengan melarutkan endapan

yang terbentuk dengan air, kemudian dilakukan uji milon untuk endapan yang

terbentuk dan uji biuret untuk filtratnya.

Uji koagulasi dilakukan dengan cara asam asetat 1 M sebanyak 2 tetes

ditambahkan ke dalam 5 mL larutan protein. Tabung kemudian diletakkan dalam

penangas air selama 5 menit. Endapan yang terbentuk diambil dengan batang

pengaduk. Setelah itu uji kelarutan dilakukan dengan air, kemudian dilakukan uji

milon untuk endapan yang terbentuk dan uji biuret untuk filtratnya.

Pengendapan oleh alkohol dan denaturasi protein dilakukan dengan cara 4

tabung reaksi disiapkan dan diisi dengan larutan protein sebanyak 5 mL,

kemudian ke dalam masing-masing larutan ditambahkan HCl 0,1 M, NaOH 0,1

M, buffer asetat pH 4,7 dan alkohol 95%. Perubahan yang terjadi diamati, Setelah

itu, campuran dipanaskan dalam penangas air selama 5 menit. Perubahan setelah

pemanasan diamati.

Denaturasi protein dilakukan dengan cara 3 tabung reaksi disiapkan

dan diisi dengan larutan albumin sebanyak 4.5mL, ke dalam masing - masing

larutan ditambahkan dengan HCl 0.1 M, NaOH 0.1 M, dan buffer asetat pH 4,7

kemudian larutan dipanaskan selama 15 menit. Perubahan warna diamati. Buffer

asetat pH 4.7 sebanyak 5mL ditambahkan kedalam tabung 1 dan 2, perubahan

yang terjadi diamati kembali.

Hasil dan Pembahasan

Tabel 1 Hasil uji pengendapan albumin oleh logam berat

Logam berat Hasil pengamatan (+/-) Perubahan warna larutan

HgCl2 + Larutan keruh, ada

endapan putih

Pb-asetat +++ Larutan keruh, ada

endapan putih

AgNO3 ++ Larutan keruh, ada

endapan putih

Keterangan (+) Logam berat mengendapkan protein

(-) Logam berat tidak mengendapkan protein

(a) (b) (c)

Gambar 1 Hasil uji pengendapan albumin oleh logam berat

HgCl2 (a), Pb-asetat (b), AgNO3

Tabel 2 Hasil uji pengendapan albumin oleh (NH4)2SO4

Uji Hasil pengamatan (+/-) Perubahan warna larutan

Uji kelarutan + Larut

Uji millon - Putih susu

Uji biuret - Biru

Keterangan (+) Garam mengendapkan protein

(-) Garam tidak mengendapkan protein

(a) (b) (c)

Gambar 2 Hasil uji pengendapan albumin oleh (NH4)2SO4

uji biuret (a), uji Millon (b), uji kelarutan (c)

Tabel 3 Hasil uji pengaruh pemanasan terhadap albumin

Uji Hasil pengamatan (+/-) Perubahan warna larutan

Uji kelarutan - Tidak larut

Uji Millon - Ada endapan putih

Uji biuret + Violet

Keterangan (+) Pemanasan mengendapkan protein

(-) Pemanasan tidak mengendapkan protein

(a) (b) (c)

Gambar 3 Hasil uji koagulasi uji biuret (a),

uji Millon (b), uji kelarutan (c)

Tabel 4 Hasil uji pengendapan albumin oleh alkohol

Larutan Hasil pengamatan (+/-) Perubahan warna

Albumin + HCl + Ada endapan putih

Albumin + NaOH - Tidak ada endapan

Albumin + buffer asetat pH 4.7 + Ada endapan putih

Albumin + etanol + Ada endapan putih

Keterangan (+) Alkohol mengendapkan protein

(-)Alkohol tidak mengendapkan protein

Gambar 4 Hasil uji pengendapan albumin oleh alkohol

Tabel 5 Hasil uji denaturasi albumin

Larutan

Hasil

Sebelum

pemanasan

Setelah

pemanasan

Setelah penambahan

buffer asetat 4.7

Albumin + HCl Ada gumpalan

putih

Gumpalan putih

bertambah

Gumpalan putih

semakin bertambah

Albumin + NaOH Tidak ada

gumpalan, larutan

kuning bening

seulas

Tidak ada

gumpalan,

larutan kuning

bening

Tidak ada

gumpalan, larutan

kuning keruh

Albumin + buffer Ada gumpalan Gumpalan

semakin

bertambah

-

(a) (b) (c)

Gambar 5 Hasil uji denaturasi albumin,

albumin + HCl (a), albumin + NaOH (b), albumin + Buffer (c)

Percobaan pengendapan oleh logam, dasar reaksi pengendapan protein

oleh logam berat adalah penetralan muatan. Pada pH alkalis dari titik isolistriknya

protein bermuatan negatif dengan adanya ion positif dari logam, akan terjadi

penetralan muatan dan protein mendekati titik isoelektris sehingga mengendap.

Endapan akan larut dengan penambahan alkali encer. Senyawa – senyawa logam

tersebut akan memutuskan jembatan garam dan berikatan dengan protein

membentuk endapan logam proteinat (Winarno 2002). Reaksi dapat dilihat pada

gambar 6.

Gambar 6 Reaksi pengendapan protein oleh logam (Poedjiadi 2009)

berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, diperoleh semua logam berat yang

ditambahkan pada larutan albumin menghasilkan endapan, hal ini terjadi karena

protein mengalami presipitasi bila bereaksi dengan ion logam. Pengendapan oleh

ion positif (logam) diperlukan pH larutan diatas pI karena protein bermuatan

negatif, pengendapan oleh ion negatif diperlukan pH larutan dibawah pI karena

protein bermuatan positif. Ion – ion positif yang dapat mengendapkan protein

ialah Ag+, Ca

+, Zn

+, Hg

+, Fe

+, Cu

+, dan pb

+, sedangkan ion – ion negatif yang

dapat mengendapkan protein ialah ion salisilat, trikloroasetat, tanat, dan

sulfosalisilat (Poedjiadi 2009)

Larutan albumin dalam air dapat diendapkan dengan penambahan

ammoniumsulfat ((NH4)2SO4) hingga jenuh (Poedjiadi 2009). Berdasarkan

percobaan setelah larutan albumin dijenuhkan dengan ((NH4)2SO4), uji endapan

yang terbentuk dengan air menunjukkan hasil positif yang ditandai dengan

larutnya endapan protein dalam air, uji millon yang dilakukan pada endapan

menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan terbentuknya wearna putih susu

pada larutan karena hasil positif pada uji millon ditandai dengan terbentuknya

warna merah (Page 1997), uji biuret yang dilakukan pada filtrat juga

menunnjukkan hasil negatif yang ditandai dengan terbentuknya warna biru karena

hasil uji positif uji biuret adalah warna violet (Sukardjo 2009). Pengujian endapan

yang dihasilkan dengan pereaksi millon bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya

kandungan tirosin, sedangkan pengujian filtrat dengan pereaksi biuret bertujuan

untuk mengetahui ada tidaknya gugus amida pada filtrat yang dihasilkan. Hasil

negatif uji biuret pada filtrat menunjukkan bahwa sudah tidak ada gugus amida

pada filtrat, namun uji millon juga menunjukkan hasil negatif, seharusnya uji

millon menunjukkan hasil positif karena endapan yang terbentuk merupakan

albumin, albumin termasuk protein lengkap yang dibangun oleh sejumlah asam

amino esensial dan non esensial diantaranya adalah tirosin (Page 1997), hasil

negatif yang didapatkan mungkin disebabkan karena pereaksi yang digunakan

sudah tersimpan lama dan ada kemungkinan pereaksi telah terkontaminasi.

Percobaan menggunakan ((NH4)2SO4) karena ((NH4)2SO4) memiliki tingkat

kelarutan yang lebih tinggi dari pada protein. Sehingga pada saat penambahan

((NH4)2SO4) , amonium sulfat akan melarut dalam air dan mendesak protein

keluar, kembali dalam bentuk solidnya, sehingga terbentuk protein yang

terendapkan (Poedjiadi 2009). Proses ini terjadi karena adanya kompetisi antara

molekul protein dengan ion anorganik dalam mengikat air (hidrasi) (Sumarjo

1998). Salting out adalah pengendapan protein dari sampel sedangkan salting in

pengendapan protein dari sampel dan endapan tersebut dapat larut kembali jika

ditambahkan pelarut.

Percobaan uji koagulasi menggunakan prinsip denaturasi protein dan titik

isolistrik. denaturasi yaitu keadaan dimana protein terurai menjadi struktur

primernya, baik reversible maupun irreversible (Poedjiadi 2009). Sedangkan yang

dimaksut titik isolistrik adalah suatu keadaan dimana ion negatif dan ion positif

yang ada pada suatu molekul jumlahnya sama dan mengindikasikan kenetralan,

pH ketika terjadi isolistrik disebut pI (pH isolistrik). Besarnya pI untuk albumin

adalah sebesar 3.5 – 4.5 (vlasova 2003). Berdasarkan percobaan uji kelarutan

dalam air menunjukkan hasil negatif, uji millon juga menunjukkan hasil negatif,

uji millon betujuan untuk mengetahui adanya asam amino tirosin yang

menghasilkan warna merah (Page 1997). Seharusnya uji millon menunjukkan

hasil positif karena albumin yang terendapkan mengaandung tirosin hal ini sesuai

dengan pernyataan Page (1997) yang menyaatakan bahwa albumin termasuk

protein lengkap yang dibangun oleh sejumlah asam amino esensial dan non

esensial diantaranya adalah tirosin. Tidak terbentuknya warna merah pada larutan

mungkin disebabkan karena pereaksi millon yang digunakan tidak dalam keadaan

fress dan telah terkontaminasi. Uji biuret untuk filtratnya menunjukkan hasil

positif yang mengindikasikan bahwa masih ada ikatan peptida antar asam amino

yang terdapat dalam filtrat. Penambahan asam asetat 1 M ke dalam larutan protein

menyebabkan ion - ion H+

dari asam akan terikat pada gugus – gugus yang

bermuatan negatif sehingga terjadi perubahan pengutuban dari molekul protein.

Perubahan pengutuban ini menyebabkan perubahan konfirmasi dari protein atau

rusaknya struktur tersier atau struktur kuartener protein sehingga protein

mengalami koagulasi (Fessenden 1986).

Pengendapan oleh alkohol, Penambahan alkohol dapat menurunkan

konstanta dielektrik pada larutan sehingga gaya tarik menarik antar molekul

menjadi semakin kuat. Alkohol akan mengoksidasi gugus positif pada asam

amino untuk bereaksi dengan gugus negatif yang ada dalam larutan, yang

mengakibatkan pada suasana tertentu dapat membentuk endapan, dalam

percobaan albumin yang ditambahkan buffer pH 4,7 menghasilkan endapan paling

banyak. Hal ini disebabkan pada pH 4,7 terdapat titik isoelektrik protein sehingga

endapan yang terbentuk merupakan jumlah endapan yang maksimal. Albumin

sendiri memiliki titik isoelektrik pada pH 4,5 - 4,9 (Poedjiadi 2009). Berdasarkan

hasil percobaan, dapat dilihat pada Tabel 4, hanya albumin yang ditamnbahkan

NaOH yang memberikan hasil negatif, hal ini disebabkan karena titik isoelektrik

protein terlalu jauh dalam suasana basa. Albumin yang ditambahkan HCl akan

membentuk endapan namun dengan kuantitas yang lebih sedikit. Endapan yang

terbentuk sedikit karena gugus positif pada protein berikatan dengan gugus Cl-

dan gugus negatif yang ada pada larutan sehingga endapan yang terbentuk dalam

suasana asam lebih sedikit.

Denaturasi protein adalah berubahnya bentuk dan lipatan molekul protein

tetapi tidak sampai memutuskan ikatan antar asam amino dalam struktur protein.

Hal itu dikarenakan denaturasi tidak cukup kuat untuk memutuskan ikatan.

Denaturasi terjadi karena adanya gangguan pada struktur skunder dan tersier

protein . denaturasi yang umum ditemui adalah proses presipitasi dan koagulasi

protein (Ophart 2003). Denaturasi dapat terjadi karena beberapa hal yaitu karena

pengaruh pH, panas, pelarut, logam berat, garam, kekuatan ion terlarut, dan

radiasi. Denaturasi memiliki derajat yang bertingkat , dari yang ringan yaitu

bersifat reversible sampai yang berat yang bersifat irreversible (Hawab 2003).

Berdasarkan percobaan dapat dilihat pada Tabel 5 hanya albumin yang ditambah-

kan NaOH yang tidak menghasilkan endapan hal ini karena titik isoelektrik

protein terlalu jauh dalam suasana basa. Penambahan buffer pH 4.7 pada albumin

yang ditambahkan HCl menyebabkan endapan semakin bertambah, hal ini

dikarenakan albumin sendiri memiliki titik isoelektrik pada pH 4,5-4,9 (Poedjiadi

2009). Titik isolistrik pada protein mempunyai arti pentingkarena pada umumnya

sifat fisika dan kimia erat hubungannya dengan pH isolistrik., pada pH diatas titik

isolistrik protein bermuatan negatif, sedangkan dibawah titik isolistrik protein

bermuatan positif. Panas dapat digunakan untuk mengacaukan ikatan hidrogen

dan interaksi hidrofobik non polar. Hal ini terjadi karena suhu tinggi dapat

meningkatkan energi kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein

bergerak atau bergetar sangat cepat sehingga mengacaukan ikatan molekul

tersebut. Protein telur mengalami denaturasi dan terkoagulasi selama pemanasan

(Ophart 2003).

Panas dapat digunakan untuk mengacaukan ikatan hidrogen dan interaksi

hidrofobik non polar. Hal ini terjadi karena suhu tinggi dapat meningkatkan energi

kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein bergerak atau bergetar sangat

cepat sehingga mengacaukan ikatan molekul tersebut. Protein telur mengalami

denaturasi dan terkoagulasi selama pemanasan (Ophart 2003).

Simpulan

Berdasarkan hasil percobaan, logam berat (Ag, Hg dan Pb) akan

membentuk ikatan logam proteinat ketika direaksikan dengan larutan protein.

Kelarutan protein berkurang ketika ditambahkan garam-garam anorganik,

sehingga terbentuk endapan. Koagulasi dan denaturasi protein disebabkan akibat

pemanasan dan penambahan alkohol.

Daftar Pustaka

Fessenden. 1986. Kimia Organik jilid 1. Pudjaatmaka AH, penerjemah. Jakarta:

Erlangga.

Hawab, HM. 2004. Pengantar Biokimia. Jakarta: Bayu Media Publishing.

Ophart, C.E. 2003. Virtual Chembook. Elmhurst College.

Page, DS. 1997. Prinsip-prinsip Biokimia. Jakarta: Erlangga.

Poedjiadi, Anna dkk. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.

Sukardjo, Drs. Kimia Dasar Universitas. Jakarta : Erlangga.

Winarno, F. 2002. Kimia Pangan dan Gizi. Gramedia: Jakarta.