PROTEİNPROTEİNLERLERPROTEİNPROTEİNLERLER

“Protein” sözcüğünün kaynağı, Yunanca'nın "birincil öneme sahip" anlamını taşıyan (prota) sözcüğüdür. Bu isim, proteinleri 1838'de ilk tanımlayan Jöns Jakob Berzelius tarafından verilmiştir. 1926'da James B. Sumner'in üreaz enziminin bir protein olduğunu göstermesine kadar, proteinlerin canlılar için ne derece önemli olduğu tam anlaşılmamıştır. Yapısı çözülen ilk proteinler arasında insülin ve miyoglobin bulunur ki, insülin için Sir Frederick Sanger 1958'de, miyoglobin için de Max Perutz ve Sir John Cowdery Kendrew 1962'de Nobel Kimya Ödülü kazanmıştır. Her iki protein de kırınım analizi ile üç boyutlu yapıları çözümlenen ilk proteinlerdendir.

• Proteinler, amino asitlerin zincir halinde birbirlerine bağlanmasından oluşan büyük organik bileşiklerdir. Bu zincirde bir amino asitin karboksil grubunun bir diğerinin amino grubuna bağlanmasıyla oluşan bağ peptit bağı olarak adlandırılır. Proteinlerin primer yapısı genetik bilgiyi taşıyan DNA molekülleri tarafından denetlenmektedir.

Fonksiyonu ve biyolojik aktivitesi ne olursa olsun bütün proteinler 20 standart aa. den meydana gelmiştir.

Organizmada en yüksek oranda bulunan makromoleküller

% 70 su% 15 protein% 15 diğer

Total hücre ağırlığı

Amino asitlerin lineer polimerleri

Farklı Cins Sayı

sıralanma

(n tane) 20 St AA PROTEİN

Standart AAlerin peptid bağı aracılığıyla lineer dizilişi Birbirinden farklı cok

sayıda peptid zincirleri

Dipeptid: AA1 AA2

20 x 20400 farklı molekül

Tripeptid: AA1 AA2 AA3

20 x 20 x 20

Evrendeki total atom sayısı

8000 farklı molekül

.

Sınırsız sayıda farklı

protein yapılarıAA sekansı: 20n

AA sayısı: n

H2N ()nCOOH

Amino asitler

lineer polimerler:

PEPTİTLERİN KISA YAZILIŞI VE ADLANDIRILMASI:

• Üç harfli kısaltma ile (Glu-Gly-Ala-Lys)

• Tek harfli kısaltma ile (EGAK)

• Daima amino ucundan başlayarak yazılır ve okunur. Amino asit kalıntıları en sondaki hariç –il eki alır. (Glutamilglisilalanillizin)

3 boyutlu yapı, lineer polimerlerin çok farklı şekillerde katlanması ve kıvrılmasıyla oluşur

Her proteinin spesifik bir

fonksiyonu vardır

Biyolojik fonksiyonlar,3 boyutlu yapıya

bağlıdır

H2N ()nCOOH (lineer polimer)

(polipeptid zincir)

-Şekil -Yapı

-Çözünürlük

-Biyolojik fonksiyon

Sınıflandırmada kullanılan özellikler

ProteinProteinlerin Sınıflandırılmasılerin Sınıflandırılması ProteinProteinlerin Sınıflandırılmasılerin Sınıflandırılması

Proteinler Çeşitli Biyolojik Fonksiyonlara Sahiptirler…

Proteinlerin Çeşitli biyolojik fonksiyonlarını bilmek biyokimyanın çok önemli amaçlarından biridir. Proteinleri gördükleri biyolojik fonksiyonlarına göre bir sınıflandırmaya tabi tutabiliriz.

Proteinlerin biyolojik rollerine göre veya fonksiyonel olarak sınıflandırılmaları

• Enzimler: Amilaz, pepsin, lipaz • Taşıyıcı proteinler (transport proteinleri): Serum albümin,

hemoglobin, lipoproteinler, transferrin• Besin ve depo proteinler: Ovalbümin, kazein ferritin• Lipoproteinler: kolesterol trigliserid• Kontraktil proteinler: Miyozin, aktin• Yapısal proteinler: Kollajen, elastin • Savunma (defans) proteinleri: İmmünoglobülinler, kan

pıhtılaşma proteinleri• Düzenleyici proteinler: İnsülin, büyüme hormonu • Diğer proteinler: Fonksiyonları henüz daha fazla bilinmeyen ve

kolayca sınıflandırılmayan çok sayıda protein

Enzimler: Metabolizmayı düzenleyen ve etkileyen globuler proteinler( geniş bir protein sınıfı) Biyokimyasal reaksiyonları katalizlerler Substrat spesifiteleri vardır. .... az şeklinde adlandırılır Eksiklikleri pek çok metabolik hastalıkla sonuçlanır

Proteinlerin Biyolojik FonksiyonuProteinlerin Biyolojik Fonksiyonu

Proteinlerin Biyolojik FonksiyonuProteinlerin Biyolojik Fonksiyonu

Düzenleyici proteinler: Fizyolojik aktivitenin düzenlenmesinden sorumludurlar

Ör:Hormonlar (insülin eksiklliği diabet)

G-proteinler Hücre içi haberleşme

Yapısal proteinler: Kas, , bbağ dokusu proteinleri, membran proteinleri

Ör: Kollajen (tendon and ligamentlerde)

keratin (saç ve tırnakta)

Proteinlerin Biyolojik FonksiyonuProteinlerin Biyolojik FonksiyonuTransport proteinleri: Plazmada ve membranlarda spesifik maddelerin veya iyonların taşıyıcısıdırlar

Ör:Hb-O2, miyoglobin-O2

Lipoprotein-lipid, Transferrin-Fe Seruloplazmin-Cu, vbBesin ve Depo proteinler: Ovalbumin, laktalbumin, kazein, ferritin

Proteinlerin Biyolojik FonksiyonuProteinlerin Biyolojik Fonksiyonu

Kontraktil proteinler: Kasılmayı ve

hareketi sağlayan proteinler

Ör:Miyozin - kalın filament

Aktin - İnce filament

Tübilin - membran iskeleti

Reseptörler:Hücre içi haberleşmede rol oynarlar Ör:adrenalin için ß-adrenerjik reseptorSavunma proteinleri: Ör:İmmünoglobülinler: Patojenlere karşı organizmayı korurlar

Fibrinojen: (Pıhtılaşma mekanizması)

Proteinlerin Biyolojik FonksiyonuProteinlerin Biyolojik Fonksiyonu

Proteinlerin Saflaştırılması• Herbir hücrede binlerce farklı protein

bulunmaktadır. Herbir organizmadsaki proteinler birbirinden farklı olduğu gibi bu proteinler biyolojik aktivitelerini de dar bir pH ve sıcaklık sınırları içinde göstermektedir. Bir hücre ve dokudan istenilen bir proteinin saf halde izole edilmesi oldukça zordur. Proteinlerin saflaştırılmasında bugün kullanılan yöntemler oldukça gelişmiştir.

Bir proteinin aa kompozisyonunu ve aa dizisini tayin edebilmek için öncelikle bu proteinin saf halde elde edilmesi gerekir.

Ham bir tam hücre ekstraktından, biyolojik aktivite kaybı olmaksızın,

proteinin izolasyonu

PROTEİNİN SAFLAŞTIRILMASI

İzolasyon öncesi işlemler

- Hücre fraksiyonunun seçimi: sitoplazma, mitokondri, lizozomal, mikrozomal? - Organ tespiti: mitokondri kalp lizozomal /mikrozomal fraksiyonlar KC

Saflaştırma Şeması

Hücre ekstraktıenzimatikkimyasalFizikselmekanik

Hücre bütünlüğünün(membran yapısının)bozulması

Total hücre içeriğihücre lizatı

Biyolojik materyal (ör: doku)

ekstraksiyon

Hücre lizatı

Primer yapı tayini

Saflaştırma Şeması

diğer protein,iyon,su vb, ortamdan

uzaklaştırılması

Saf Protein

Ardışık Saflaştırma

işlemleri

SantrifüjFiltrasyon

Çözünmeyen hücre debrisi

(uzaklaştırılır)süpernatan hücresiz lizat

(nükleik asit, proteinler küçük moleküller)

•Primer yapı tayini

•Proteinin saflaştırılması

•Ekstraksiyon

Saflaştırma Basamakları

Suyun uzaklaştırılmasıTuz ve küçük iyonların uzaklaştırılmasıDiğer proteinlerden ayrılması

Amino asitlerin cins, sayı ve sırası

Ekstraksiyon

İstenilen proteinin yapısını ve biyolojik aktivitesini değiştirmemek için:- 0-4C ortam sıcaklığı(tüm işlemler için)- Blenderde parçalama(kıyılmış doku örneği)- Uygun tampon (pH, iyonik güç) seçimi ör: 0.05 M fosfat tamponu, PH 7.4

Kıyılmış doku örneği, 1/10 oranında tamponla karıştırılır

Hücre organellerinin elde edilme safhası

Kimyasal: Organik solventler, deterjanlar

Enzimatik: Lizozim, glukanaz

Fiziksel: Osmotik şok, dondurma / çözdürme

Mekanik: Sonikasyon, homojenizasyon

Fransız presi

Hücre bütünlüğünün bozulması

Kimyasal Yöntemler

Deterjanlar: Triton X-100, vb

Membran yapısını bozarak

hüce içeriğinin ortama

geçmesini sağlarlar

- Pahalı- Proteinleri denatüre edebilir - Ortamdan hemen uzaklaştırılmalıdır

Fransız PresiÇelik bir kaba yerleştirilen

hücre süspansiyonu üzerine uygulanan yüksek basınçla, hücreler küçük

bir delikten geçirilir

Mekanik yöntemler

Cam homojenizatör kabında

pistonun düzenli dönüşü ya da vuruşu ile sağlanan mekanik güçle, hücreler piston ve cam çeper arasında sıkıştırılır hücre zarı parçalanır,hücre içeriği tampona geçer, elde edilen süspansiyon,

bütünlüğü bozulmamış bir çok organeli içerir: HOMOJENAT olarak adlandırılır

HomojenizasyonMekanik yöntemler

Hücre süspansiyonuna daldırılan sonikatör, titreşim yaparak ve

yüksek ses dalgalarıyla hücre bütünlüğünü

bozar

Mekanik yöntemler

Sonikasyon

büyüklük/kütle şekil

çözünürlükpolarite

affinite, vb

fiziksel özelliklerProteinler saflaştırma

Saflaştırmada Kullanılan Prensipler

Saflaştırmada Kullanılan Yöntemler

• Diyaliz• Ultrafiltrasyon• Jel filtrasyonu• Elektroforez• İzoelektrik fokuslama• İyon değiştirme kromotogrefisi• Affinite kromotografisi• Densiti gradient (zonal) santrifugasyon

Fraksiyonel presipitasyon

Saflaştırmada Kullanılan YöntemPrensip

Büyüklükkütle

çözünürlük

diyaliz

jel elektroforezi (SDS-PAGE)

ultrafiltrasyon jel filtrasyonu kromatografisi

santrifüj

Saflaştırmada Kullanılan YöntemPrensip

yük

polarite

affinite kromatografisi

iyon exchange kromatografisiElektroforez ?

izoelektrik fokusing

adsorbsiyon kromatografirevers faz kromatografi (HPLC)hidrofobik etkileşim kromatografi

Biyolojik aktivite Bağlanma

Sulu karışımlar(süspansiyon/homejenat)’a

santrifüj kuvveti uygulandığında, daha büyük ve yoğun komponentler,daha hızlı

çökerler

Düşük hızlı santrifüj:Tam hücreleri, deney ortamından ayırır

Yüksek hızlı santrifüj: Farklı büyüklük ve yoğunluktaki subselüler organelleri ayırır

SANTRİFÜJ

• Kütle büyüdükçe, çökmesini sağlayan santrifüj gücü azalır

differensiyel santrifüjBüyüklükkütle

homojenat nükleushücre debrisi

mitokondriperoksizom

lizozom

mikrozomsitozol

• Homojenat, gittikçe artan santrifüj kuvvetine maruz bırakılarak fraksiyonlarına ayrılır

Zonal Ultrasantrifügasyon Yoğunluk esasına dayanır (daha hassas) Yoğunluk ve büyüklük olarak birbirine çok yakın olan organeller, Differansiyel santrifüjle ayrılamaz Bu amaçla zonal santrifügasyon kullanılır Çeşitli tipleri vardır:

Plastik bir tüpte % 5-20 konsantrasyonda sukroz gradienti oluşturulur En üste homojenat uyglanır Bir gün 100,000 x g’de santrifüj yapılır Homejanat, yoğunluğuna uyan tabakalara dağılır

Kademeli gradient santrifüj

Kademeli Gradient Santrifüj

sukroz gradienti (% 5-20)

numune

ultrasantrifüj

100,000 x g24 h

Tüpün dibi delinirfraksiyonlar toplanır

en yoğun en hafif

Büyüklük/kütle diyaliz

tampon

homojenat

Semipermiablmembran

Diyaliz başı Diyaliz sonu

Proteinler, tuz, iyon ve küçük moleküllerden ayrılır

Diyaliz:molekül büyüklüğüne bağlı diffüzyon Semi-permeabl (ultramikroskobik porları bulunan) selefon membran aracılığla filtrasyon

• Prensip olarak diyalize benzer (büyüklük/kütle)

• Ultrafiltrasyon tüpünün alt kısmında yarı geçirgen bir membran bulunur

• Üstten uygulanan basınçlı azot gazı ile, çözücü ve küçük moleküller membran dışına çıkar

ULTRAFİLTRASYON

homojenat

hücreler/proteinler

membran

Kromatografik Yöntemler

depo(tampon)

sabit faz(katı porlu matriks)

mobil faz(tampon)

elüent

Protein karışımı

Kromatografi:madde karışımlarının, sabit ile mobil faz arasında, büyüklük, şekil, taşıdıkları yük, çözünürlük, vb. özelliklerine göre,dağılmaları,ayrılmaları

•Kolon kromatografisi:proteinlerin saflaştırılmasında sıklıkla kullanılır •Kolon, proteinleri seçici adsorblayan bir maddeyle (katı porlu matriks) doldurulur SABİT FAZ •Protein karışımı kolona tatbik edilir •Tampon çözelti (MOBİL FAZ) ile yıkanan kolon tarafından, adsorbe edilmeyenler önce adsorbe edilenler daha geç kolondan çıkarlar

Kolon Kromatografisi

Kolon Kromatografi Tipleri

•Jel filtrasyonu büyüklük •İyon exchange yük •Affinite (bağlanma) • Adsorbsiyon (HPLC) fazlar arasındaki çözünürlük farkı

Kolondaki dolgu maddesi ve seçilen elüsyon metoduna göre gruplandırılır:

Jel Filtrasyon KromatografiProteinler, molekül büyüklüğüne göre ayrılırlar

•Kolon, jel boncuklar [sephadeks (çapraz bağlanmış dekstran)vb polisakkarid veya poliakrilamid polimer] ile doldurulur katı matriks•Protein karışımını içeren tampon, kolondan geçirilir

Küçük proteinler,jel boncuklar arasındaki boşluklara girer, kolondan geç çıkarlar

Büyük proteinler, jel boncuklar arasındaki boşluklara takılmaz,kolondan önce çıkarlar

jel boncuklar

cam kolon

akış

Proteinlerin elüsyonu: en büyük en küçük

Jel Filtrasyon Kromatografi

Jel Filtrasyon Kromatografijel boncuk

en büyük protein

Proteinlerin, matriksteki porlara takılma yüzdesi, büyüklüğü ile ters orantılıdır

•Avantaj: Büyük miktarda protein karışımı saflaştırılabilir

•Dezavantaj: Yavaş ayırım

Porlara takılan proteinler daha yavaş sürüklenirler

İyon exchange(değiş-tokuş) KromatografiProteinleri, üzerlerinde taşıdıkları net yüke göre ayırır

pH pI net yük pozitif pH pI net yük negatif

• Protein karışımındaki iyonlar, sabit fazdaki aynı yüklü iyonlarla[ (+)(+) veya (-) (-) ile] yer değiştirerek, kolona bağlanırlar

•Bağlanmayan proteinler, kolondan en önce çıkarlar

• Daha sonra, iyonik gücü/pH’sı farklı bir tampon kolondan geçirilir bağlı proteinlerin yükü değiştirilerek elüsyonu sağlanır

İyon-Exchange Kromatografi

Katı destek olarak Reçine Seçimi.

Katı destek exchangegrup

+ NaCl içeren elüsyon tamponu selüloz

dekstranagaroz

DEAE CMsülfonat

Anyon değiştirici reçine:Dietilaminoetil(DEAE)-SelülozKatyon değiştirici reçine: Karboksi metil(CM)- Selüloz Sülfoksi-selüloz

Reçine seçimi, saflaştırılacak proteinin yüküne ve ortam pH’sına bağlıdırKolonun dolgu maddesine, exchange yapacak yüklügruplar bağlanır karışımdaki proteinleri bağlar

(R+A-) + B- (R+B-) + A-

Katı matriks: DEAE-SelülozBirim moleküllerinde çok sayıdakuarterner amonyum hidroksit taşırlar

selüloz

DEAE-Selüloz

Anyon Exchange Kromatografi

(R+A-):kuarterner amonyum hidroksit (B-):negatif yüklü protein

R+, farklı anyonları farklı afinite ile bağlar

pozitif yüklü protein

R+

R+

R+

Tampon akışı

Anyon exchange Kromatografi

++++++

H

+

+

++ +

++

tuz gradienti

Üzerinde en çok negatif yük taşıyan proteinler, kolondan en geç çıkarlar

DEAEkolon

NaCleluent

Anyon değiştirici reçine: Dietilaminoetil (DEAE)- Selüloz

CH2-CH2-NCH2-CH3

CH2-CH3

Katı matriks: CM-Selüloz sülfoksi-selülozBirim moleküllerinde çok sayıda karboksilat/sülfonat taşırlar

selülozCM-Selüloz

(iyonize form)

Katyon Exchange Kromatografi

(R-A+): karboksil grubu (-COO-H+) sodyum sülfit (-SO3Na+)

B+: pozitif yüklü protein

R-, farklı katyonları farklı afinite ile bağlar

(R-A+) + B+ (R-B+) + A+

negatif yüklü protein

R-

Katyon exchange Kromatografi

Katyon değiştirici reçine: sülfoksi-selüloz(-SO3Na+)

Tuz çözeltileri ile Elüsyon•Reçineye bağlanan proteinler ortamın tuz konsatrasyonunu giderek artırmak suretiyle kolondan elüe edilirler•Tuzu oluşturan iyonlar, reçineye bağlanmak için proteinle yarışırlar

Düşükyüksek oranda tuz içeren tamponlarla Elüsyon

Affinite KromatografisiEnzim, hormon,vb spesifik proteinlerin saflaştırılmasında kullanılır.Kolonun dolgu maddesine, (dekstran, poliakrilamid, selüloz vb) spesifik protein ile kompleks yapabilen bir ligand bağlanır:

Ligand bağlı boncuk

spesifikprotein

diğerproteinler

Tampon akışı

Serbest proteinler

ligand-proteinkompleksi

Affinite Kromatografisi

katı destek ligandspesifik protein

selülozsepharozdekstran

DNAIgG

histon protein A

antibody antijen antijen antibodysubstrat enzimkosubstrat enzimKonkavalin A glikoprotein reseptor hormon

+

Affinite Kromatografisi

glukoz-proteinkompleksi

boncuk serbest protein

boncukİlave

glukoz(G)

Ligand ile kompleks yapan spesifik protein,katı desteğe bağlanarak kolonda tutulurken; serbest proteinler kolonu terkederler

Bağlı protein, daha sonra, pH değişikliği / tuz çözeltileri veya ligand ilavesiyle kolondan elüe edilir

Örnek:

ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER

Ortam pH’sına göre, (+) ya da (-) olarak yüklenen kolloid taneciklerin, bir elektrik

alanında, kendi net yüklerine zıt yük taşıyan anot veya katoda doğru farklı hızlarda

sürüklenmeleri

Proteinler, elektrik yükü, büyüklük (yük/kütle oranı), şekil gibi özelliklerine göre ayrılırlar

ELEKTROFOREZ

Elektroforez, genellikle poliakrilamid jel üzerinde yapılır

Elektroforetik Yöntemler • Karışım içinde bulunan protein sayısını tespit etmek( kağıt ve jel elektroforezi) • Saflaştırılmış proteinin saflık derecesini belirlemek( SDS-PAGE) • Saflaştırılmış proteinin molekül ağırlığını tayin etmek (SDS-PAGE) amacıyla kullanılır

ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER

Proteinlerin saflaştırılmasında kullanılmaz !

POLİAKRİLAMİD JELPoliakrilamid Jel:Çapraz bağlı akrilamid polimeri

plastik kasa

anot

katot

tampon

tampon

jel

protein karışımı

Poliakrilamid Jel Elektroforezi(PAGE)

SDS - PAGESDS:Sodyum Dodesil Sülfat-anyonik deterjan

(-) yüklü SDS, proteinlerin kuarterner, tersiyer ve sekonder yapılarını bozar, katları açılan peptid zincir, SDS ile sarılarak misel görünümü kazanır

Zincirde yer alan her 2 AA artığına 1 molekül SDS bağlanır proteinlerin hepsi (-) yüklenir

SDS’in bağlanmasıyla , doğal yapısını kaybedenproteinler, aynı şekil ve yük/kütle oranına sahip olurlar elektriksel alan içinde proteinlerin hareketi sadece molekil ağırlıklarına bağlıdır Daha küçük olanlar, daha hızlı sürüklenir ve proteinlerin alt üniteleri birbirinden ayrılır

SDS - PAGE

SDS-PAGE ile proteinler, net yük ve şekillerine göre değil, sadece molekül büyüklüklerine göre,

birbirinden ayrılırlar

SDS-PAGE ÖRNEKLERİ

Molekül Ağırlığı TayiniStandart nümune

Sürüklenme hızı

Molekül ağ.(log)

nümuneprotein

İzoelektrik Fokusing• İzozimleri ya da özellikleri çok benzeyen proteinleri ayırmak için kullanılır

• pH gradienti oluşturulan jel üzerinde elektroforez yapılarak, proteinlerin pI değerleri tayin edilir • pH gradienti:Küçük molekül ağırlıklı organik asit ve bazları içeren bir amfolitya da amfolin (katyonik/anyonik polistren elektrolitler) çözeltisi inkorpore edilen jele elektrik alanı uygulanır

izoelektrik fokusing jel

10

pH

4

pH 10 pH 4

+-

İzoelektrik Fokusing• Amfolit çözeltisindeki H+ve OH- iyonları, biri diğerini nötralizeederek sürüklenirken, jelüzerinde pH gradienti oluşur

• protein karışımı İzoelektrik jele uygulanıp elektroforez yapıldığında, karışımdaki her protein kendi izoelektrik noktasına kadar jel üzerinde sürüklenir ve durur

pI:6.5

pH gradient

İzoelektrik FokusingProtein bandları

pH

Proteinlerin elektroforetik titrasyon eğrileri

Relatif yük

Protein saflaştırmasında kullanılan yöntemlerden bir veya birkaçı arka arkaya kullanılarak protein saf halde veya safa yakın bir şekilde elde edilmektedir.

Proteinlerin ÇözünürlüğüEtkileyen faktörler • Sıcaklık • pH • Ortamdaki nötral tuzun iyonik gücü

Presipitasyon: Çözünürlüğün kaybı Çözelti içinde (presipitat) çökelek oluşumu

Salting-out:Yüksek tuz konsantrasyonlarındahidratasyonu azalan proteinlerin presipitasyonuYüksek kons.lu tuz, kendi hidratasyonu için ortamdaki suyu tutar proteinin çözüneceği ortam azalır

İyonik güçTuzu oluşturan katyon ve anyonların yük sayısı ile tuz konsantrasyonu

Salting in / Salting outSalting IN

• Düşük konsantrasyonlarda (küçük iyonik güç) eklenen

tuz, yüklü proteinlerin çözünürlüğünü artırır

• Protein üzerindeki yük etkileşimleri korunur

• [Düşük tuz], proteinlerin

presipitasyonunu önler

Salting OUT• Yüksek konsantrasyonlarda

eklenen tuz, proteinlerin çözünürlüğünü azaltır

• Çünkü, proteinlerin çözünmesi için gerekli çözücü(su) için yarışır

• [yüksek tuz] tarafından hidrasyon kabuğu uzaklaştırılan protein, çöker

FRAKSİYONEL PRESİPİTASYONİyonik gücü gittikçe artacak şekilde farklı

konsantrasyonlarda tuz çözeltileri kullanarak, karışım içerisinde bulunan çeşitli proteinlerin

birbirinden ayrılmasıPolivalan anyon

sülfat fosfat sitrat

monovalan katyon Na+

NH4+

amonyum sülfat (NH4)2SO4

Salting out ile presipite edilen proteinler, doğal yapılarını koruduklarından, denatüre olmaksızın,

yeniden çözünür hale getirilirler

Amonyum sülfat ile Fraksiyonel Presipitasyon

santrifüj

% 20 (NH4)2SO4

Amonyum sülfat, Proteinleri - Presipite eder (salting-out) - Stabilitesini artırır(Kosmotropik iyon )

hedefprotein

% 40 (NH4)2SO4

presipitat

protein çözeltisi

Proteinlerin Canlı Yapısındaki Önemi1- Membranların, kas dokusunun, bağ dokusunun yapısal

elementidirler

2- Transport mekanizmasında görev yaparlar. Örn. Hemoglobin molekülü oksijeni, sitokrom molekülü ise elektronu taşımaktadır.

3- Proteinler kan dolaşımında serum albuminleri halinde vücut sıvısının dengeli bir şekilde kalmasını sağlarlar

4- Enzimler ve hormonlar halinde metabolik olayların düzenlenmesini sağlarlar

5- Nükleoproteinler halinde genetik yapıda yer almaktadırlar

6- vücut savunma mekanizmasında gama globulinler halinde antikorların yapısında yer alırlar.

Primer protein yapısı; aminoasit dizisi

Sekonder protein yapısı; amino asit dizileri hidojen bağlarıyla bağlanırsa

Tersiyer protein yapısı; sekonder yapının katlanmasıyla oluşur

Kuarterner protein yapısı; bir amino asit zincirinden fazlasını içerir

Proteinlerin yapı taşları aa. lerdir.Proteinlerin fiziksel, kimyasal ve biyolojik özelliklerini, bu yapıda yer alan aminoasitlerin sıralanışı, özellikleri ve bu aa.lerin yan zincirlerindeki moleküler düzenlemeler belirlemektedir. aa.lerin protein yapısında birbirini takip eden dizilişleri primer yapı olarak bilinmektedir.

a) Primer Yapı: Bir proteindeki amino asit dizisine denir. Amino asitler birbirlerine kovalent peptid bağlarıyla bağlanmışlardır. Bu bağ, bir amino asitin α-karboksil grubu ilediğerinin α-amino grubu arasında bir molekül su çıkışıyla kurulur. Peptid bağları, proteinleri denatüre eden sıcaklık ve yüksek üre konsantrasyonu gibi durumlarda kırılmaz. Ancak çok yüksek sıcaklıkta, uzun süre güçlü asit ve bazlarla muamele edildiğinde kırılabilir.Amino asitlerin peptid bağlarıyla bağlanmaları, dallanmayan zincir ţeklindeki polipeptidleri oluţturur. Bir polipeptidin her bir amino asidine bakiye (rezidü) denir.Peptid bağı, parsiyel çift bağ karakterindedir, rijid ve planardır ve bağ etrafında serbest rotasyon olmaz. Genellikle trans şeklindedir, yüksüz ama polardır.

Proteinler bellibelli bir amino asit dizisine sahip polipeptitlerdir. Bu dizilime

PRİMER (BİRİNCİL) YAPIPRİMER (BİRİNCİL) YAPI denir.

Proteinlerin fonksiyonlarını eksiksiz olarak yerine getirebilmeleri için sekonder, tersiyer, kuaterner yapı şekilleri de önemli bir yer tutmaktadır.

Peptid Bağı

PEPTİDLER

• Amino asitlerin -amino ve -karboksil gruplarının peptid bağları ile

birbirlerine bağlanmasıyla oluşurlar

Peptid Bağı

O ‖- C – N - H

Amid Bağı(kovalent bağ)

• Lineer amino asit polimerleri

R1

R2

R1

R2Karboksil

grup

Amino grup

Peptid Bağı

Peptid Bağı Oluşumu

H3N+ – CH – COO-

H

GLİSİN (Gly) ALANİN (Ala)H3N+ – CH – COO-

CH3

H3N+ – CH –

H

– CH – COO-

CH3 O ‖ C _ N H

H2Okondenzasyon reaksiyonu

Peptid Bağı

Peptid Bağı Oluşumu

Glisilalanin (Gly-Ala)

DİPEPTİD: GLİSİLALANİN

Glisin Alanin

N-terminal

C-terminal

Peptid bağı

su

Amid grubu düzlemi

Glisilalanin

PEPTİDLER, peptid bağı sayısına göre değil, AA sayısına göre sınıflandırılırlar

polipeptid n-1n

pentapeptid 45tetrapeptid 34tripeptid 23dipeptid 12PeptidBağ sayısıAA sayısı

Peptidlerin Sınıflandırılması

OLİGOPEPTİD: Birkaç AA(AA sayısı 10) 

POLİPEPTİD:Birçok AA(AA sayısı 10 - 12)  

PROTEİN: AA sayısı 40 (mol.Ağ: ~5000)

  Proteinler bir ya da daha çok polipeptid zincirinden oluşabilirler

Peptidlerin Sınıflandırılması

Peptidlerin ÖzellikleriAmino-terminalN-terminal (sol)

O

C – NH - CH -COO-

CH3

HCOH CH2 O

H3N+CH – C – NH – CH -

(CH3)2

CH

CH2

Karboksi-terminal C-terminal (sağ)

Tripeptid: Fenilalanil – lösil - treonin (Phe-Leu-Thr)

Rezidü (amino asit artığı): Peptid/protein yapısına katılan amino asit

Adlandırma: N-terminal(1) C-terminal(n)

Tetrapeptid: Alanil-tirozil-Aspartil-Glisin (Ala-Tyr-Asp-Gly)

Peptidlerin Özellikleri

Amino-terminal N-terminal

Karboksi-terminal C-terminal

Fizyolojik pH’da, • Peptid (amid) bağı: yüksüz • Peptidler: yüklü

Peptidlerin İyonizasyon Davranışları

Peptid bağını oluşturan amino ve karboksil grupları, peptidlerin asit-baz özelliklerine

katkıda bulunamazlar 

Peptidlerin asit-baz özelliği: -Amino ve karboksi terminaller -İyonize yan zincirlerin sayısı ve cinsi

• N-terminal +NH3 grupları, türedikleri amino asidin amino grubuna göre, daha güçlü asittir (pK )

Peptidlerde N- ve C-terminal gruplar, aynı -karbon atomu üzerinde bulunmadıkları için:

• C-terminal COO- grupları, türedikleri amino asidin karboksil grubuna göre, daha zayıf asittir (pK )

Anyonik form (-1)

10

İzoelektrik form ( 0 )

pI

Katyonik form (+1) 3

İyonizasyonAlanilalanin pH

H3N+ – CH –

CH3

- CH –COOH

CH3 O ‖ C _ N H

H3N+ – CH –

CH3

- CH – COO-

CH3 O ‖ C _ N H

HN2 – CH –

CH3

- CH – COO-

CH3 O ‖ C _ N H

Noniyonize yan zincir taşıyan peptidlerinİyonizasyon şekilleri

İyonize yan zincir taşıyan peptidlerin İyonizasyonu

CH – COOH

CH2SH O – C – N – H

CH3 O H3N+CH – C – N – CH H

COOH

(CH2)2

+NH3

(CH2)4

O – C – N – CH H

Alanil - glutamil - lizil - sistein

0 7.4

- 3 10

+2 3Net yük pH

O

C

H

N

O

C

H

N

-

+Rezonans yapıları

Peptid bağının çift bağ karakteri

Kısmi çift bağ karakterine sahip olan peptid bağı düzlemseldir

CC

NC

O

H

CC

NC

OH

H

Peptid bağı ve -C atomları aynı düzlemde bulunur

CC

NC

O

H

Peptid bağının düzlemsel karakteri

Peptid bağları nedeniyle, polipeptid

zincirin 2/3’ ü sabit bir düzlem içinde

tutulur Yarı-katı (sert) yapı

Protein yapısının düzenlenmesi

Peptid bağının düzlemsel karakteri

Peptid bağının kısmi çift bağ karakteri Bağ açıları ve uzunluklar

CC N

CO

H C

C N C

O H

Düzlemsel (hareketsiz) peptid bağının etrafındaki atom grupları cis/trans izomerizm gösterirler,

Trans (Tercih edilen konfigürasyon)

Cis(x-pro sıralanışı)

Komşu -C atomları arasındaki uzaklık: 0.3 nm

Peptid bağı düzlemi hareketsiz olmasına rağmen, - karbon etrafındaki rotasyon polipeptid

zincirine esneklik kazandırır

-karbon Amid düzlemi

Amid düzlemi

Alfa - Karbon Etrafında Rotasyon

Protein iskeleti boyunca rotastonu sağlayan bağlar

Peptid/Protein Serbest Amino Asitler6 M HCl

110°C, 24 h

Peptidlerin Kimyasal Reaksiyonları

• Asit / Baz Hidrolizi

AA1 AA2

Peptid bağı hidrolizi, proteinlerin AA dizisinin belirlenmesi için gerekli bir

basamaktır

• Enzim Hidrolizi: Proteazlar

-Endoproteazlar

Tripsin, Kimotripsin, pepsin

-Ekzoproteazlar

Aminopeptidaz, Karboksipeptidaz

-Papain (in vitro şartlar)

Peptidlerin Kimyasal Reaksiyonları

Fizyolojik Olarak Aktif Peptidler

Peptid AA sayısı AA DizisiKarnozin dipeptid Histidil-ß-alaninAnserin dipeptid Metilhistidil-ß-alanin

Glutatyon (GSH)

tripeptid -Glutamil-sisteinil-glisin

Bradikinin nanopeptid

Kallidin(Lizil-bradikinin)

dekapeptid

Kas yapısı

Plazma proteinlerinin hidrolizi ile açığa çıkarlar

-Düz kasları gevşetir -Antienflamatuvar

Proteinlerin Primer Yapısının TayiniProteinlerin Primer Yapısının Tayini

1-Bireysel polipeptid zincirlerinin elde edilmesi 2-Bireysel polipeptid zincirlerinde - Amino asit bileşiminin tayini - N - ve C- terminal AAlerin tayini 3-Bireysel polipeptid zincirlerinin daha küçük zincirlere parçalanması 4- Küçük zincirlerde sekans analizi

Bireysel polipeptid zincirlerinin elde edilmesi

Bireysel polipeptid zincirlerinin elde edilmesi

OLİGOMERİK proteinler, non-kovalent bağlar ve disülfid köprüleriyle birleşmiş, birden fazla alt üniteden oluşurlar

Analizi yapılacak protein, OLİGOMER olduğu takdirde, primer yapının tayininde ilk adım; bireysel polipeptid zincirlerin elde edilmesidir

Proteinler,üre,guanidin HCl, vb ajanlar ile denature edilir

Bu işlemlerin sonucunda, primer yapı bozulmaksızın, polipeptid zincirleri birbirinden ayrılmış olur

Bireysel polipeptid zincirlerinin elde edilmesi

Bireysel polipeptid zincirlerinin elde edilmesi

• SDS-PAGE • Kromatografik yöntemler

Oksidan/ redüktanlar ile sistin yapısındaki S-S bağı kırılır

1- Hidrojen bağlarının koparılması

2- Disülfid köprülerinin yıkılması

3- Subüniteler birbirinden ayrılır

Disülfid köprülerinin yıkılması

Oksidasyon (ör: Performik asit ile sisteik asit yan zincirleri oluşur.)

Sülfidril bileşikleri ile Redüksiyon(ör: 2-merkaptoetanol, Ditiyoeritritol(DTT)

S S SH HS

zincir A zincir B zincir A zincir B

zincir A zincir B zincir A zincir B

S SHCOOH

O

SO3H HO3S

NH

CH C

CH2

O

O

S

HN CH C

CH2

O

O

S

2HSCH2CH2OH

NH

CH C

CH2

O

O

SH

HN CH C

CH2

O

O

SH

2SCH2CH2OH++

NH

CH C

CH2

O

O

S

HN CH C

CH2

O

O

S

NH

CH C

CH2

O

O

SO3

HN CH C

CH2

O

O

SO3

C O

O

H O H

performic Acid

NH

CH C

CH2

O

O

S

HN CH C

CH2

O

O

S

NH

CH C

CH2

O

O

SO3

HN CH C

CH2

O

O

SO3

C O

O

H O H

performic Acid

performik asit

Disülfid köprülerinin yıkılması

Oksidasyon (ör: Performik asit)

Disülfid köprülerinin yıkılması

Redüksiyon (ör: 2-merkaptoetanol)

NH

CH C

CH2

O

O

S

HN CH C

CH2

O

O

S

2HSCH2CH2OH

NH

CH C

CH2

O

O

SH

HN CH C

CH2

O

O

SH

2SCH2CH2OH++NH

CH C

CH2

O

O

S

HN CH C

CH2

O

O

S

2HSCH2CH2OH

NH

CH C

CH2

O

O

SH

HN CH C

CH2

O

O

SH

2SCH2CH2OH++

NH

CH C

CH2

O

O

S

HN CH C

CH2

O

O

S

2HSCH2CH2OH

NH

CH C

CH2

O

O

SH

HN CH C

CH2

O

O

SH

2SCH2CH2OH++

NH

CH C

CH2

O

O

S

HN CH C

CH2

O

O

S

2HSCH2CH2OH

NH

CH C

CH2

O

O

SH

HN CH C

CH2

O

O

SH

2SCH2CH2OH++

Amino Grubunun Teşhis Reaksiyonları

FNO2

NO2

NHCH2CONHNO2

NO2

• Sanger Reaksiyonu

Fluoro-dinitrobenzen(FDNB)

N-terminal AA

+ H2NCH2CONH

HF

Dinitrofenil AA kompleksi

(Sarı renkli)

• Asit Hidrolizi (6 N HCl, 110 oC, 24 h)

Bireysel polipeptid zincirlerinde Amino asit bileşiminin tayiniBireysel polipeptid zincirlerinde Amino asit bileşiminin tayini

Tüm peptid bağları kırılır

Polipeptid zincir hidroliz edilir:

•Hidrolizatın Amino asit bileşimi (sayı ve tip),otomatize katyon-exchange kromatografi(amino asit analizör) veya HPLC ile tayin edilir

•Kolondan elüe edilen amino asitler,ninhidrin ile reakiyona sokularak, amino asit tiplerininkantitif tayini yapılır•Amino asitlerin ninhidrin ile verdikleri mavi mor rengin şiddeti, miktarlarıyla orantıdır

•Amino asit analizörler ile amino asitlerin zincirdeki sırası ve her bir amino asitin

absolu miktarı belirlenemez

Otomatize amino asit analizörden elde edilen Kromatogram

absorbans

Elüat volümü

Bireysel polipeptid zincirlerindeN- ve C- terminal AAlerin tayiniBireysel polipeptid zincirlerindeN- ve C- terminal AAlerin tayini

N-terminal amino asit tayini

-Sanger reaksiyonu (FDNB)

-Edman reaksiyonu (fenilizotiyosiyanat)

Bu reaksiyonların ürünleri, otomatize yöntemlerveya HPLC ile tayin edilerek, her seferinde

N-terminal sırada bulunan amino asitin kimliği belirlenebilir

C-terminal amino asit tayini

Karboksipeptidazlar, polipeptid zincirinde C-terminal amino asidin yapmış olduğu peptid bağını koparan ekzopeptidazlardır

Polipeptid zincir, karboksipeptidaz enzimleriyle inkübe edilir ve otomatize yöntemlerle serbetleşen amino asidin kimliği belirlenir

Karboksipeptidazlar

• Karboksipeptidaz A: Arg, Lys, Pro dışındaki diğer AAlerin yaptığı C –terminal peptid bağını koparır

• Karboksipeptidaz B: Sadece C-terminal Arg ve Lys amino asitlerini ayırır

• Karboksipeptidaz C • Karboksipeptidaz Y

Tüm C-terminal bağları koparır

Primer yapının otomatize analizi için, polipeptid zincir üzerinde sınırlı sayıda, spesifik hidrolizler(peptid bağı koparılır) yapılır. Böylece, 20-60 AAiçeren daha küçük zincirler elde edilir

3-Bireysel polipeptid zincirlerinin parçalanması

3-Bireysel polipeptid zincirlerinin parçalanması

Kimyasal ve Enzimatik Hidroliz

Polipeptid zincirinde R2 Amino Asitin yaptığı peptid bağının karbonil tarafı (CO) amin tarafı (NH)

CR

HCO

NH

CR

HCO

N CH

R

H

1 2 3

Kimyasal HidrolizReaktif Hidroliz noktası

Siyanojen bromür Met (CO) tarafı

O-İyodobenzen Trp (CO) tarafı

Hidroksilamin Asn - Gly• Metiyonin, polipeptid zincirlerinde nispeten seyrek bulunduğundan, CNBr ile hidroliz sonucunda, istenilen büyüklüklerde peptidler oluşur• Zincirdeki sistein artıklarının CNBr ile reaksiyon vermemesi için, iyodoasetat ile bloke edilir

İyodoasetat ile Asetilasyon

iyodoasetat ile asetilasyon

Reversibl

Asetillendikten sonra, irreversibl

asetillenmiş

sistein artıkları

redüksiyon

CNBr ile hidroliz

Enzim (endopeptidaz) Hidroliz noktası

Tripsin Lys, Arg (CO) tarafı

Kimotripsin Phe,Trp, Tyr (CO)

Pepsin Phe, Trp, Tyr (NH) Asp, Glu, Leu (NH)

Termolizin Leu, İle, Val (NH)

Enzimatik Hidroliz

Tripsin ile Hidroliz

Sekans AnaliziSekans Analizi

Polipeptidin Met, Trp, Arg, Asn noktalarında

hidrolizi, primer yapının tayini için, yeterli

uzunlukları sağlar

Bu parçacıklar, KROMATOGRAFİK

YÖNTEMLERLE birbirinden ayrılarak, AA.

dizilerinin tek tek tayinine geçilir

En az 2 farklı yöntemle kırılan peptid parçalarının birleştirilmesi:

overlapping

Tripsin ile hidroliz

CNBr ile hidroliz

++

+

+

++

+

Asidik ve bazik AAler nedeniyle, AMFOTERİK

PROTEİNLERİN FİZİKSEL VE KİMYASAL ÖZELLİKLERİ   

Proteinlerin İyonizasyonu

++

+

++

+

+

+

+

++

OH-OH-

Asidik pH Net yük +

Bazik pH Net yük -

pH = pINet yük 0

Tüm özellikler minimal seviyede Proteinler presipite edilebilir

Proteinlerin Titrasyon EğrileriProteinlerin Titrasyon Eğrileri

3 pH bölgesinde incelenebilir • pH 1.5-6.0 : Karboksil (-COOH, R- COOH)

• pH 6.0-8.5 : Histidin ve -NH3 grubu • pH 8.5 : Lys’de -NH3 grubu Tyr’de fenolik OH grubu Cys’de SH grubu Arg’de guanido grubu

Proteinler fizyolojik şartlarda tamponlayıcı

özelliğini His (imidazol) ile gösterir

Proteinlerin Titre edilebilen GruplarıProteinlerin Titre edilebilen Grupları

grup pK pH 7’de yük - COOH 3.5 - 4.0 -R - COOH 4.0 - 4.8 -

- +NH3 8.0 - 9.0 +İmidazol 6.5 - 7.4 0Guanido 12 + Tiyol 8.5 - 9.0 0 Fenol 9.5 - 10.5 0

PROTEİNPROTEİNLERİN 3 BOYUTLU LERİN 3 BOYUTLU YAPISIYAPISI PROTEİNPROTEİNLERİN 3 BOYUTLU LERİN 3 BOYUTLU YAPISIYAPISI

PROTEİNPROTEİNLERİN 3 BOYUTLU LERİN 3 BOYUTLU YAPISIYAPISI PROTEİNPROTEİNLERİN 3 BOYUTLU LERİN 3 BOYUTLU YAPISIYAPISI 1-Primer Yapı (1o)

2-Sekonder Yapı (2o)

3-Tersiyer Yapı (3o) 4-Kuarterner Yapı (4o)

-Alfa–heliks -Beta–kırmalı tabaka -Beta–bendler (kıvrım, dirsek) -Tesadüfi kıvrılmalar(Random coil)

1-Primer Yapı (1o)H2N (

)nCOOHAmino asitler

Protein yapısında yer alan AA lerin, bir düzen içerisinde

peptid bağları ile bağlanması

Protein sekansı

cins

sayı

sıra

AMİNO ASİT SIRALAMASI

Primer Yapı = Protein Sekansı

AA dizileri N-terminal C-terminal yönünde okunur

b) Sekonder Yapı:

Lineer dizide, komşu amino asitlerin birbirleriyle olan ilişkileri ve düzenlenmeleri sekonder yapıyı oluşturur. En önemli özelliklerinden birisi, bir peptid bağının -CO grubuyla, diğerinin -NH grubu arasında kurulan hidrojen bağlarıdır.Hidrojen bağları eğer, aynı zincir içindeki peptid bağları arasında kurulmuşsa, α-heliks yapı denilen yapılar oluşur. Bu spiral şeklinde, sıkı paketlenmiş bir yapıdır. Eğer hidrojen bağları farklı zincirlerdeki peptid bağları arasında ise, β-tabakalı yapımeydana gelir. Bu yapı, hem globüler hem de fibröz proteinlerde bulunabilir.

Paulling ve Corey 1951 de polipeptitlerin sekonder yapısınıbelirtmek üzere 3 yapı şekli önermiştir.

1) alfa- heliks yapı

2) beta- plakalı tabakalı yapı

3) Tesadüfi kıvrılmalar

• alfa -Helikste zayıf hidrojen bagı , bir peptit peptit bagındaki elektronegatif azot atomuna bağlı H atomu ile bu atomu ile bu peptit peptit bağından sonraki dördüncü amino asidin karbonil grubunun oksijen atomu arasında olusmaktadır.

• Bir peptit peptit zincirinin alfa -heliks olusturabilmesi için ya sadece L veya sadece D formunda a.asitleri içermesi gerekir

• Saç, kıl, tüy, yün, boynuz, tırnak, deri ve kus tüyü

gibi keratinlere dahil proteinler genellikle soldan saga dönüslü alfa-heliks düzenlemesi gösterirler.

• Beta-tabakalı konfigürasyonu ise ipek

lifi gibi gerilmis protein moleküllerinde görülmektedir.

• alfa– heliks ısı ve nemin etkisiyle beta-plakalı tabakaya dönüsebilir.

Miyoglobinin üç boyutlu yapısına katlanmış biçimi. Zincirde yer yer

sarmal katlanmalar gözleniyor. İşte bu

tip kurallı katlanmalar

SEKONDER YAPIYI oluşturur.

SEKONDER (İKİNCİL) YAPISEKONDER (İKİNCİL) YAPI

-sarmal-sarmal-tabaka-tabaka

2- Sekonder Yapı (2o) (PAULING ve COREY, 1951)

Primer yapıda birbirine yakın

olan AAlerin, molekül içindeki

düzenli ya da düzensiz

ilişkileri sonucunda oluşur

Düzenli ilişkiler: periyodik olarak tekrarlanan yapılar

Düzensiz ilişkiler: random coil (tesadüfi kıvrılmalar)

-heliks

-kırmalı tabaka

Sekonder Yapıyı Oluşturan Bağlar

R – CH2– S – S – CH2 – R

Cys Cys

Disülfid Bağı: Sistein rezidüleri arasında kovalent bağ

- Disülfid Bağları- Hidrojen Bağları

Hidrojen Bağları

Polipeptid zincirleri içinde veya arasında, polar ve yüksüz, -OH, -NH, -NH2 grupları

ile -C=O arasında medana gelir

(+) H atomları ile (-) O atomları arasındaki elektrostatik çekim gücü

-Heliks Yapısı• Çubuğa benzer bir yapı• Polipeptid zinciri bir ana eksen etrafında kıvrılarak devam eder

yan zincir

•Peptid bağları ve -Catomu (eksene paralel) polipeptid zincirin iskeletini oluşturur •-C üzerindeki R grupları, heliksin merkezinden dışına doğru yer alır

3.6 AA rezidü 5.4 Ao

H bağı

-Heliks’in Özellikleri • AA Rezidü = 1.5 AHer AA,heliks ekseni boyunca birbirinden 1.5 A uzaklıkta

bulunur

• Heliks Yüksekliği = 5.4 A Heliksin bir tam dönüş yapmasıyla gidilen uzaklık 1.5 A x 3.6 AA = 5.4 A

• 3.6 AA Rezidü / Dönüş Her AA, 100 açı yapar Heliksin her dönüşünde (360), 3.6 AA bulunur

• Primer yapıda aralarında 3- 4 AA’lik uzaklık bulunan AAler, -heliks ekseninde birbirine en yakındır

-Heliks Eksenine Üst Bakış

5.4 A

1.5 A

H bağı

H bağıH bağı

-Heliks Yapısında Hidrojen Bağları

Hidrojen bağları, zincir içinde oluşur

Heliks zincirindeki tüm peptid bağları hidrojen bağı oluşumuna katılır

1.AA rezidü-NH4.AA rezidü-C=O

Ardışık olarak H bağları oluşur

O

(- N -C-) H

Heliks zincirinin iç kısmında su molekülü yoktur

-Heliks Yapısında Stabilite Bir polipeptid zinciri için: - en düşük enerjili - en kararlı - en dayanıklı yapı

H bağları, sayılarının çokluğu nedeniyle, heliksin dayanıklılığını artırır

G = negatif

-Heliks(spontan oluşur)

İki ya da daha çok -helikszincirinin birbirlerine

sarılması

Süper-sekonder YapıSarılmış Sarmal(Coiled Coil)Protein

- Stabil, - Enerjetik olarak protein yapısına uygun

Beta–kırmalı tabaka

Buna Beta plakalı tabakalı yapı da denir.• 2 – 5 polipeptid zincirinin paralel ya da antiparalel birleşmesiyle oluşur

• Zincirler, tabaka/levha halindedir

• R grupları tabaka düzleminin altında ya da üstünde yer alırlar

(–konfigürasyon)

Beta–kırmalı tabaka

7.0 A

• AA Rezidü = 3.5 A

Her AA, -kırmalı tabaka boyunca birbirinden 3.5 A

uzaklıkta bulunur

• Polipeptid zinciri, gergin-gerilmiş

durumdadır.

Beta–kırmalı tabaka

Stabilite, sayılarının çokluğu nedeniyle, H bağları ile sağlanır

HİDROJEN BAĞLARI zincirler arasında oluşur

Beta–bendler (kıvrım, dirsek)• Proteinlerdeki -heliks ve -kırmalı tabaka yapıları, -bendler ile birbirine bağlanırlar

• -bendler, zincirin yönünü değiştirir( menteşe bölgeleri)

• -bendlerin varlığı, polipeptidlerin globüler kütleler oluşturmasını sağlar.

• -bend bölgelerindeki 1- 4 AA artıkları arasında H bağları oluşur.• Pro ve Gly sıklıkla bulunur

Diğer olası Diğer olası sekonder yapılarsekonder yapılar

Tesadüfi kıvrılmalar ((Random coil)

• Düzlemler arasında belirli bir ilişki ve H bağları yoktur

• Biyolojik fonksiyon bakımından, diğer sekonder yapılarla aynı

öneme sahiptir

•Proteinlerin, heliks, kırmalı tabaka veya -bend yapmayan bölgeleri, gelişi güzel helezonlar, kıvrılmalar şeklindedir.

Sekonder yapısını kazanmış protein daha Sekonder yapısını kazanmış protein daha da kıvrılıp katlanırsada kıvrılıp katlanırsa

TERSİYER (ÜÇÜNCÜL) YAPITERSİYER (ÜÇÜNCÜL) YAPISINI SINI kazanır. kazanır.

c) Tersiyer Yapı: Daha uzak amino asit bakiyeleri

arasındaki ilişkiyi yansıtır. Bir polipeptid zincirinin primer yapısı tersiyer yapıyı da belirler. Nonkovalan bağ olarak, hidrojen bağları dışında, yapıda stabilizasyonu sağlayan, hidrofobik interaksiyonlar ve yan zincirlerdeki negatif ve pozitif yüklü gruplar arasında iyonik etkileşimler de vardır. Kovalan bağ olarak disülfid köprüleri bulunur. Tersiyer yapı, polipeptid zincirlerinin uzaydaki 3 boyutlu düzenlenişini, dolayısıyla da proteinin şeklini belirler.

• ikinci yapıyı olusturan alfa ve beta konfigürasyonlar üst üste katlanır ve yumak seklinde sarılırlarsa elipsoid bir yapı gösterirler ki bu proteinlerin tersiyer yapılarıdır.

• Bu durum ise ancak yan zincirlerin reaksiyona girmesi ile mümkündür. Bu etkilesimler zayıf hidrojen bağları, kovalent bağlar, tuz bağları, iyonik bağlar ları, Van der Walls Walls çekim ve itim gücü ile sağlanmaktadır.

3 -Tersiyer Yapı

-Heliks / -kırmalı tabaka

yapıları, üstüste katlanarak,

sarılarak veya kendi etrafında kıvrılarak

şekillerde

Tersiyer Yapıyıoluşturur

• yuvarlak

• elipsoid

• Hidrojen bağları • Disülfid bağları • İyonik (tuz) bağlar (elektrostatik etkileşimler) • nonpolar etkileşimler • van der Waals bağları

Tersiyer yapıyı oluşturan bağlar

Polipeptid zincirin hücre içinde (sulu ortamda ) katlanması çok hızlıdır

100 nm x 0.5 nm, ~ 200 nm2

Su molekülleri

primer

3.45 nm ~ 37 nm2

tersiyer

?

minutesdakikalar

Çok sayıda hidrojen bağı

Elektrostatik Etkileşimler (İyonik Bağlar)

Yan zincirde

bulunan ve zıt

elektrik yükü taşıyan gruplar (asidik

ve bazik amino asitler ) arasında

oluşan tuz bağları

+

+

+

++

G = negatif

+

+

+

+

++

+

Elektrostatik Etkileşimler (İyonik Bağlar)

Nonpolar yan zincirli AA ler, tersiyer yapınıniç kısmında bulunurlar ve su ile temas etmezler

AlaVal

AlaAla

CH

HH

H

H

C

C

Asp

CO O

H H

HH

HC

H

H

H

C

HH

HC

van der Waals ve nonpolar etkileşimler

van der Waals bağları:Birbirine yakın iki atom arasında

Nonpolar etkileşimler:

Nonpolar yan zincirler arasında

van der Waals etkileşimi:

Zıt dipollerin birbirini çekerek nükleusları yaklaştırması

-

Tersiyer yapıyı oluşturan bağlar

Birden fazla polipeptit zincirinden oluşan Birden fazla polipeptit zincirinden oluşan proteinlerde daha da ileri bir yapısal oluşum proteinlerde daha da ileri bir yapısal oluşum vardır: vardır: KUATERNER (DÖRDÜNCÜL) YAPIKUATERNER (DÖRDÜNCÜL) YAPI

d) Kuarterner Yapı:

İki veya daha fazla polipeptid zincirinden oluşan proteinlerin, bu polipeptid alt ünitelerinin düzenlenmesiyle oluşan yapıdır. Alt üniteler arasında nonkovalent bağlar vardır. Herbir alt üniteye protomer veya monomer denir.

• Benzer özelliklere sahip alt üniteler salkım benzeri, topluluklar olusturarak dördüncü yapıya neden olurlar. Bu yapı proteinin polierizasyonunu yansıtan bir olaydır.

• Molekül ağırlrıgı 50.000 50.000 Da’dan dan büyük proteinler kuaterner yapıya sahiptirler.

• Fosforilaz-A dört alt üniteye sahip, dördüncül yapıyı sergileyen bir proteindir. Bu tür yapılarda alt üniteler kovalent olmayan güçler ile birlesmislerdir.

• Hemoglobin, serüloplazmin trozinaz trozinaz gibi globüler proteinler bu sınıfa

dahil olurlar.

4 - Kuarterner YapıPrimer, sekonder ve tersiyer yapıları bulunan polipeptid zincirlerinin non-kovalent bağlarla bir arada tutulması

Proteinlerin polimerizasyonu

Protein-protein kompleksi: OLİGOMER

Ör: Hemoglobin

Kuarterner Yapıda Protein

dış görünüş modeli

protein-protein bağlanma bölgesi

zincir modeli

4 Globin Zinciri (tetramer)

Hem

aynı 2 alfa globin zinciri

aynı 2 beta globinzinciri

Hb’ i oluşturmak üzere globin kompleksi

bağlanır

Tetramer

Kuarterner Yapıyı Oluşturan Bağlar

4 monomer Protein-Protein kompleksi

Non-kovalent bağlar

Hidrofobik etkileşimler

hidrojen bağlarıiyonik bağlar

Konformasyonlarına göre proteinler 2 ye ayrılır: Fibriler, globüler

• Globüler proteinler: Albüminler,Globülinler, Globinler, Glutelinler, Prolaminler, Protaminler, Histonlar.

• Fibriler proteinler: Keratin, elastin, fibrinojen, miyozin.

Sıkıca katlanmış helezon şeklinde polipeptid zincirlerden oluşur

Proteinler sekonder yapıyı aldıktan sonra kendi içinde katlanmalar yaparak küresel yapı alıyor. Örnek: Albumin, Miyoglobin

(Proteinlerin büyük kısmı, bu gruptadır)

Globüler proteinler:

•Spiral veya heliks şeklinde kıvrılmış,(kovalent ve H bağlarıyla çapraz bağlanmış)

zincirlerden oluşurlar Proteinler sekonder yapıyı aldıktan sonra bir araya gelerek çubuksu yapıyı oluştururlar.

• Bitkilerde bulunmazlar.Örnek: Bağ dokusu proteinleri: Kollajen, Elastin, Keratin Miyozin: Kas proteini Fibrinojen:pıhtılaşma proteini

Fibröz Proteinler:

Fibriler proteinler 1- keratinler

2- kollagenler3- elastin

α keratinler α heliks yapısı gösterirler,sistin bakımından zengindirler. Tırnak, boynuz gibi kırılgan dokularda bulunur. β keratinler β plakalı yapı gösterirler. Sistin içermezler. Örümcek ağlarında, ipek kozalarında bulunurlar.

Proteolitik

enzimlere

karşı dirençlidir

Kollajen:Birbirine sarılmış 3 polipeptid zinciri (üçlü heliks)’nden oluşur

Memelilerde total proteinin %30’unu teşkil eder deri kıkırdak tendon ve liflerde bulunurlar.

Gly,Ala,Pro,Lys’den zengindir

A

B

C

Elastin

• Bağ dokularının çoğunda,eklemlerde ana yapısal element olarak bulunur. Prolin aa açısından zengindir. Kan damarları duvarlarında bulunur. Kan damarlarına elastiklik kazandırır.

HemoglobinHemoglobin, kanda eritrositlerde bulunan, kana kırmızı rengini veren, demir-porfirinli bir bileşik proteindir

%g olarak kandaki hemoglobin konsantrasyonunun normal değeri

yetişkin erkek için %14-18 g

yetişkin kadın için %12-15 g

çocuk için %12-13 g

yeni doğan için % 21 g kadardır

Porfirin halka sisteminin en basit temel maddesi pirol halkasıdır.

Porfin halka sistemindeki pirol halkalarına çeşitli yan zincirlerin eklenmesiyle porfirin halka sistemi oluşur.

Asetil (A) ve metil (M) küçük takılardır; propiyonil (P), vinil (V), etil (E) ve oksietil (EOH) büyük takılardır.

Dört pirol halkası metenil (=CH-, metin) köprüleri ile birbirine bağlanırsa porfin halka sistemi oluşur

Porfirin halka sistemindeki pirol halkalarının N atomlarına Fe, Mg, Co, Zn, Ni, Cu gibi metallerin iyonlarının bağlanmasıyla metalloporfirinler diye tanımlanan çeşitli porfirin bileşikleri oluşur

Yapısı:Hemoglobin yapı olarak birbirinden farklı olan iki çift globin

zinciri içerir. Tetramerdir. 4Hem+ 4globin

Hb molekülünün 3 ve 4 boyutlu yapısı

Hem molekülü; porfirin halkası ve Demir (Fe)

Eritrositlerde bulunan ve kana kırmızı rengini veren hemoglobinin yapısında bulunan hem, önemli bir demir-porfirin bileşiğidir

Hemoglobindeki 4 hemin her biri bir protoporfirin III ve bir Fe2+ içerir

Hemoglobin, molekülünde içerdiği toplam 4 adet Fe2+ sayesinde akciğerlerden dokulara O2 molekülü taşıyabilmektedir. 1 hemoglobin molekülü toplam 4 adet O2 molekülü bağlayarak taşıyabilir

Hemoglobin Bir demir porfirin veya heme grubu içermektedir.4 peptid zincirinden oluşmuştur, 2 2 şeklinde. -zincirleri 141 aa lik zincirlerdir, -zincirleri 146 aa lik zincirlerdir. Reversible olarak oksijeni yüzeyine bağlamakta ve tekrar serbest bırakabilmektedir. Molekülde 4 hem grubu vardır. Hemoglobinin görevi , akciğerin oksijence zengin fazından oksijeni yüzeyine bağlayarak oksijence fakir periferal dokulara taşımaktır. Hemoglobine oksijen bağlama dengesi pH ile değişmektedir.

HHb +O2 ↔HbO2 + H

Proton ortamda arttığı zaman denge sola kaymaktadır. Proton ortamdan alınacak olursa bu kez denge sağa kayacaktır. Bu etkiye “Bohr etkisi” veya “Bohr Effect” denir

Bir hemoglobin molekülüne 4 oksijen bağlanabilmektedir.

Hb +O2 ↔HbO2

HbO2 +O2 ↔Hb(O2)2

Hb(O2)2 +O2 ↔Hb(O2)3

Hb(O2)3 +O2 ↔Hb(O2)4

Hemoglobini oksijen bağlamasında 2 model öne sürülmüştür.

1) Kademeli Model

2) Simetri Modeli

Koshland tarafından öne sürülen kademeli modele göre; oksijenlerden biri bir subüniteye bağlandığında subünitelerde bir konformasyon değişikliği olmakta ve diğer subünitelerin oksijene karşı affinitesi ( ilgisi) artmaktadır.

Mnod Wyman ve Changeux tarafından öne sürülen simetri modelinde ise Bütün subüniteler aynı anda oksijene karşı ya düşük ilgi ya da yüksek ilgi göstermektedir.

X ışını analizlerinden elde edilen veriler simetri modelini desteklemektedir.

Çeşitli hemoglobin tiplerinde bulunabilen polipeptit zincirleri -zincir, -zincir, -zincir, -zincir olmak

üzere dört tiptir. Bir hemoglobin molekülünde bu zincirlerden iki tür bulunur

Anormal hemoglobinler• Hb S: HbA1’in -zincirlerindeki 6. amino asit glutamik

asit yerine mutasyon sonucu valin bulunan hemoglobindir

Hb S: Oksijensiz ortamda solubulitesi azalır; çubuk benzeri lifler ve fibröz agregatlar oluşturur. Hb S içeren eritrositler orak şeklinde görüntü oluştururlar ve kolayca parçalanırlar oraklaşmış eritrositlerin ince kapillerlerde dolaşımı yavaşlatmasıyla tromboz ve emboliler gelişebilir

Hb S, orak hücreli anemi ( Hb S hastalığı) olarak tanımlanan hemoglobinopatinin ortaya çıkmasına neden olur. Eritrosit hücreleri orak şeklini almaktadır.

Oksihemoglobin (HbO2)Oksihemoglobin, hemoglobin molekülündeki 4 Fe2+’e akciğerlerde birer O2 molekülü bağlanması sonucu oluşan hemoglobin bileşiğidir

Hemoglobin molekülüne akciğerlerde O2 moleküllerinin bağlanması olayı, hemoglobinin oksijenasyonu olarak tanımlanır

Bir hemoglobin molekülü, oksijenasyon olayı sonucunda 4 O2 molekülü bağlayabilmektedir

Hemoglobinin oksijene affinitesi, oksijenin kısmi basıncına bağlıdır

pO2 değişimine karşı hemoglobinin oksijenle % satürasyonunu gösteren grafiklere hemoglobinin satürasyon

eğrisi veya oksihemoglobinin dissosiasyon eğrisi denir

pH ve oksijen kısmi basıncı hemoglobinin oksijen taşıma dengesi kontrol eden 2 temel unsurdur. Eğer akciğerde oksijen kısmi basıncı 100mmHg basınca eşit ve pH derecesi çok yüksek ise hemoglobin ancak % 96 oranında oksijen bağlayabilmektedir. Eğer çevre dokularda oksijen kısmi basıncı 45 mm Hg basıncına eşit,pH düşük ve CO2 seviyesi yüksekse oksijen bağlanması zayıflar ve % 65 doygunluk derecesine gelinceye kadar yüzeyine bağlı oksijeni dokulara bırakmaktadır. Böylece % 96 ve %65 oranlarında oksijene doygunluk göstermektedir.

Akciğerlerde oksijenasyon olayı sonucunda hemoglobine bağlanan oksijen, diğer dokularda deoksijenasyon olayı sonucunda hemoglobinden ayrılır

Oksijenin taşınmasında ve depolanmasında globinlerin rolüHemoHemoglobinglobin ve MiyoMiyoglobinglobin hayvanlarda sırasıyla, oksijen taşınması ve depolanmasında görev alan proteinlerdir. Hayvanlar yaşamak için hücrelerine oksijen pompalamak ve metabolizma sonucu oluşan artık ürünleri de (ör. CO2) dışarı atmak zorundadırlar. Dokular arasında difüzyon ile taşınma hızı yeterince yüksek değildir. Böcekler hariç tüm hayvanlar kan (atardamarlar) yoluyla dokulara oksijen taşır ve CO2’yi yine aynı yolla (toplardamarlarla) dışarı atar. Kanda oksijen taşıma görevi, değişik canlılarda farklı tipleri bulunan oksijen taşıyıcı proteinler tarafından sağlanır. Bu proteinler ya bazı omurgasızlarda olduğu gibi kanda çözünmüş olarak bulunur, ya da insan eritrositlerinde olduğu gibi belli hücrelerde yoğunlaşır.

Hemoglobine CO bağlanmasıHemoglobindeki Fe atomuna karbon monoksit (CO)

bağlanırsa:

Karbonmonooksihemoglobin (HbCO) oluşur.

Dokulara O2 taşıma yeteneği azalır.

(CO zehirlenmesinin temeli !)

Hemoglobinin CO’ne olan ilgisi O2’ne olan ilgisinden 220 kat fazla! Onun için ortamdaki çok küçük

miktardaki CO bile kanda toksik konsantrasyonda HbCO oluşmasına neden olur.

%60’ın üzerinde HbCO ÖLDÜRÜCÜDÜR !!!

CO zehirlenmelerinde O2 tedavisi uygulanır.

Miyoglobin

Miyoglobin, prostetik grubu hem olan bir kromoproteindir Başlıca kırmızı kaslarda özellikle kalp kasında yüksek konsantrasyonda bulunur.153 amino asitten oluşan bir polipeptit zinciri ve bir hem grubu içerir. Miyoglobin gayet sıkı yapılıdır. Molekül içine 4 molekül suyun girebileceği kadar boşluk vardır.Moleküliçinde nanpolar aa. ler bulunmakta, aa.lerin polar R grupları ise dışa bakan yüzeyde,trozin, triptofan, threonin gibi aa lerin polar olmayan uçları molekül içine uzanmıştır. Prolin aa.bükülme yapan bölgelerde bulunmuştur.

İncelenen bütün hayvan türlerinde miyoglobin polipeptit zincirinin kaba konformasyonu aynı bulunmuş fakat aa kapsamında farklılıklar vardır.

Miyoglobinin hem grubundaki Fe2+, O2 ile reversibl olarak bağlanabilir

Miyoglobinin oksijene affinitesi, hemoglobinin oksijene affinitesinden fazladır

Ancak ağır egzersizden sonra oksijenin azaldığı durumlarda kas dokusunun pO2’si 5 mmHg’ya kadar düşebilir ve miyoglobin kas mitokondrisinde ATP’nin oksidatif sentezi için kendisine bağlı oksijeni derhal serbest bırakır

miyoglobin, kasta bir çeşit oksijen deposu olarak işlev görür

Kaslarda bol miktarda bulunan miyoglobin, kas yaralanmalarında kana geçer ve idrarla atılır

İdrarla miyoglobin atılması miyoglobinüri olarak tanımlanır; klinik tanı açısından önemlidir

Yapılarına göre proteinler

Proteinler yapılarına göre, 3 grupta toplanırlar

• Basit proteinler

• Konjuge proteinler

• Türev proteinler

Proteinlerin YapısıProteinlerin Yapısı

Basit proteinler Hidroliz edildiklerinde sadece L--

amino asitleri veren,saf proteinler

Ör: AlbüminTürev proteinler Isıtma, hidroliz, asidifikasyon, vb işlemlerle modifiye olan proteinler Ör: bazı pepton ve peptidler

Konjuge proteinler L--amino asitlerin yanı sıra,başka kimyasal grupları (prostetik grup)da içerirler

•Glikoproteinler: protein + COH grup

Karbohidrat(oligosakkarit) ünitelerini içerirler Örnek: membran proteinleri plazma proteinleri(globulinler),

•Nükleoproteinler:: protein+nükleik asit (histonlar) (DNA,RNA)

•Lipoproteinler: protein + lipidProtein:Apo(lipo)protein (Apo A,B,C...)Lipid:Kolesterol,fosfolipid, gliseridÖrnek:Plazma Lp.leri ( HDL,LDL,VLDL)

•Fosfoproteinler: Fosfatlarla ester yapmış AAleri içeren proteinler

örnek: Kazein-süt Vitellin-yumurta sarısı)

Konjuge proteinler

• Glikoproteinler: Kollajen • Proteoglikanlar • Lipoproteinler • Fosfoproteinler: Kazein• Nükleoproteinler • Metalloproteinler: Ferritin, transferrin,

seruloplazmin• Kromoproteinler: Hemoglobin, miyoglobin,

sitokromlar, peroksidaz

•Hemoproteinler:protein+hem (ferroporfirin)

Ör:hemoglobin,miyoglobin,katalaz

•Metalloproteinler: protein + metal Cu- seruloplazmin Fe-transferrin, ferritin Ca-kalmodulin Zn-karbonik anhidraz

Konjuge proteinler

N-terminal C- terminal aa. tayini

Proteinleri saflaştırdıktan sonra bunların N- teminal, C-terminal aa. Lerini tayin etmek için öncelikle düz zincirli hale getirilmeleri gerekmektedir. Eğer iki zincirli protein var ise öncelikle zincirlerin birbirinden ayrılması gerekir. Zincirleri birbirinden ayırmak için performik asit ve β-merkapto etenol kullanılır. Böylece disülfit bağları birbirinden ayrılır.

Polipeptid zincirlerinin ayrılması

N-terminal aa. tayini

C Terminal amino asit tayini

aa. dizisinin tayini

POLİPEPTİDLERİN LABORATUVARDA SENTEZİ

DENATURASYON

• Proteinlerin primer yapısı değişmez (peptid bağları mevcut) • Diğer yapılar bozulur(nonkovalent bağlar kopar) • Biyolojik aktivite kaybolur

Kuarterner Yapıda denaturasyon:• Subüniteler birbirinden ayrılır• Subünitelerin tersiyer yapıları bozulur, tesadüfü kıvrılmalar, bükülmeler meydana gelir

Peptid bağları koparılmadan bir proteinin 3 boyutlu yapısının bozulmasına ve aktivitenin kaybolmasına

DENATÜRASYON denir.

Denatürasyona sebep olan faktörler

• 50-60 derecenin üstündeki sıcaklıklar

• pH<4 ve pH>10; asitler, bazlar

• Alkol,eter,aseton gibi organik çözücüler

• Ağır metaller

• U.v. Fiziksel etkiler

• İyonik deterjanlar

Eğer protein kuarterner yapıya sahipse denatürasyon koşulları altında 2 türlü değişme ortaya çıkar.1- Proteinin subüniteleri birbirinden ayrılmaktadır.2-Üç boyutlu yapı bozularak tesadüfi kıvrılmalar ve bükülmeler meydana gelmektedir.

Eğer denatürasyon ılımlı koşullarda gerçekleşmiş ise bazan kuaterner yapıya sahip proteinlerin sadece subüniteleri birbirinden ayrılmakta fakat tersiyer yapı bozulmamaktadır. Örneğin hemoglobin (α2ß2) tuz çözeltisinde αß, αß olmak üzere subünitelerine ayrılır. Diyaliz ile tuz ortamdan uzaklaştırılınca tekrar bu iki yapı biraraya gelerek α2ß2 yapısına kavuşur.

Ancak denatürasyon daha keskin şartlarda gerçekleştirilince denatürasyon geri dönüşümsüzdür. Örneğin : yumurtanın pişirilmesi ile yumurta akı proteini geri dönüşümsüz denatürasyona (irreversible) uğramıştır.

Proteinler bozulmuş durumda iken tekrar 3 boyutlu yapılarını kazanmaları ve yeniden biyolojik aktivite göstermeleri olayına ise RENATÜRASYON denir.

Tersiyer yapıdaki doğal proteinler üre, ß merkaptoetanol ve guanidin HCl ile muamele edilecek olursa polipeptid zinciri açılır ve denatüre olur. Fakat ılımlı koşullar hazırlanınca tekrar renatüre olarak 3 boyutlu yapılarını kazanırlar.

RENATURASYON: Reversibl Denaturasyon Biyolojik aktivitenin yeniden

kazanılması

 KOAGÜLASYON: İrreversibl Denaturasyon