qpcr diagnostics assay development for infectious disease working with industry - an academics...

of 29 /29
qPCR Diagnos-cs Assay Development for Infec-ous Disease Working with Industry – an Academics Perspec-ve Dr Thomas Barry Nucleic Acid Diagnos-cs Research Laboratory (NADRL) Microbiology NUI, Galway Ireland NADRL

Upload: jonathan-clarke

Post on 22-Jan-2018

338 views

Category:

Science


1 download

TRANSCRIPT

Page 1: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

 qPCR Diagnos-cs Assay Development for Infec-ous Disease  Working with Industry – an Academics Perspec-ve 

Dr Thomas Barry Nucleic Acid Diagnos-cs Research Laboratory (NADRL) Microbiology  NUI, Galway  Ireland 

 

NADRL  

Page 2: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

Infec-ous Disease    Clinical (Respiratory, Sepsis, STI,GI)   Food Pathogen / Veterinary Environmental Monitoring    Environmental Reservoir Contaminants    Water contaminants   Bioprocess Monitoring 

 Future Diagnos-cs   CirculaEng RNA biomarkers / Small 

RNA Sequencing  

NADRL  

NADRL Core Research Areas 

Page 3: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

NADRL  

The NADRL has developed a range of diagnosEcs tests  for mulEnaEonal industrial and SME partners including: 

NADRL Commercial Partners/ Disclosures 

Page 4: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

 Infec-ous Disease NAD Product Development  Pipeline 

‘From the Bench to the Bedside’ 

NADRL  

Feasibility 

Page 5: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

NADRL Biological Resources

  In‐house stocks of nucleic acid material from >1800 organisms including bacteria, fungi, and viruses  

  In-house stocks of cryopreserved cultures from >2000 species/strains representing >500 species of bacteria and >50 species of fungi 

  NucleoEde sequence database with                 ~ 3500 target sequences generated 

NADRL  

Page 6: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

NADRL  

NADRL‐ Diagnos-cs Assay Development Strategy 

Target Biodiscovery

Identify novel nucleic acid

diagnostics targets

Bioinformatics In silico design / IP

landscape evaluation, filing

and prosecution

qPCR Assay Design

Species Specificity

Panel Assembly

Assay Performance Optimisation

Validation

Small scale Clinical / Application Trials

Technology Providers Licensing and R+D contracts with Industry

Translation

Page 7: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

NADRL ‐ NAD Assay  Development:

NADRL  

Minimum InformaEon for PublicaEon of QuanEtaEve Real‐Time PCR Experiments      (MIQE guidelines ‐hSp://miqe.info/ ) 

Page 8: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

NADRL Proprietary Technologies –  Intellectual Property 

The NADRL has developed a range of nucleic acid diagnosEcs target technologies 

  Spacer Probe (ITS) ‐ Bacterial / Fungal markers 

  RiboSEQ* ‐ Bacterial markers 

  MycoSEQ - Fungal / Yeast markers

  NucleoSEQ - Bacterial markers

11 Technologies Patented or Undergoing Office AcEons 

NADRL  

Page 9: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

 RioboSEQ IP –  Bacterial Target Diagnos-cs Technology   ssrA gene & tmRNA 

NADRL  

  DNA / RNA target found in all bacterial species 

  Structure conserved in all bacteria  

Nucleo-de sequence diversity allowing for assay specificity‐  Genus and species 

Useful for syndromic infec-ous disease  diagnos-cs applica-ons 

  Diagnos-cs patents granted worldwide 

Page 10: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

NADRL  

Highly experienced research team ‐ staff have many years combined experience in both 

academia and industry commercialisaEon 

 

The laboratory endeavours to work to industry standard and has rigorous on site training, record keeping and SOPs etc. 

in place. 

 

Focuses on all aspects of technology transfer from 

laboratory bench to industry se\ng 

 

Staff members have experience in and have spent Eme working on site with various industrial partners, specifically at the technology 

transfer stage 

 

NADRL Staff Exper-se 

Page 11: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

 

NADRL  

 

Water Monitoring for Pathogens –  A qPCR NAD Assay Design and Development  Case Study  

Building Water Reservoir Contaminants  / Water Contaminants /Bioprocess Monitoring   

Page 12: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

NADRL  

•  Water plays a crucial role in the industrial, manufacturing, 

residenEal and clinical sectors.  •  Pathogenic microorganisms in building water distribuEon and 

premise plumbing systems can pose a significant risk to human health parEcularly in hospital se\ngs.  

Introduc-on 

Page 13: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

 

NADRL  

Acquired Infec-ons Due to Contaminated Water Systems 

Page 14: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

NADRL  

  RouEne microbiological tesEng of water and water distribuEon systems are performed using century old culture techniques     slow     labour intensive 

   Microbial numbers can be significantly underesEmated  

Limita-ons of Tradi-onal Culture Methodologies for Analysis of Water 

Page 15: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

NADRL  

Gram –ve 

• Legionella sp. •  Pseudomonas aeruginosa •  Burkholderia sp. •  Serra5a marcescens •  Stenotrophomonas maltophilia •  Ralstonia sp. •  Enterobacter aerogenes •  Klebsiella pneumoniae •  Proteus mirabilis •  Acinetobacter baumannii 

NAD Microbial Por_olio for Water Analysis 

Gram +ve  •  Staphylococcus aureus •  Bacillus sp. •  Non Tuberculosis Mycobacteria  

Fungal  •  Candida albicans 

Amoeba (‘Trojan Horses’) Development stage 

Page 16: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

 Amoeba ‘Trojan Horses’ – Indicators for Pathogens?    Legionella ‐ Prey becoming the Predator

NADRL  

Legionella are taken up into amoeba  without being digested and replicate there within vacuoles. When the Legionella have reached a certain density, the vacuoles release them into the water system  (hSp://www.pall.com/main/medical/medical‐cc5a1214.page) 

Page 17: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

NADRL  

The Need for a Different Diagnos-c Approach: Quan-ta-ve Mul-plex qPCR  ‐ a poten-al solu-on? 

•  Essen-al test criteria:   Rapid‐ Culture independent    QuanEtaEve    Specific  

•   Desirable test criteria:   MulEple microorganism idenEficaEon in a single test (mulEplexing)    High throughput and simultaneous analysis of mulEple samples   PotenEal for integrated  / automated tesEng  

Page 18: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

The example: Legionella 

 

NADRL  

qPCR NAD assay to quan-ta-vely detect human pathogens from water, water distribu-on and premise plumbing systems 

Page 19: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

Legionella qPCR diagnos-cs assay requirements 

NADRL  

•  Essen-al Assay Specificity Detec-on Requirements: •  Must detect all clinically relevant Legionella species (n >35) – genus specific •  Must specifically detect all L. pneumophila serogroups (n=15) – species specific  •  Must specifically detect L. pneumophila serogroup 1 – serogroup specific 

 •  Essen-al Assay Sensi-vity Detec-on Requirements: 

•  Limit of DetecEon: 1‐10 genome equivalents – wet lab diagnosEcs •  Limit of QuanEficaEon: 10 CFU / 100ml water – water sample diagnosEcs 

Page 20: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

Legionella genus assay: RiboSEQ* 

•  DetecEon of all clinically relevant Legionella species  and strains tested (n=35) 

•  *This target is currently endorsed by the CDC for use in NAD for the detecEon of the Legionella genus  (Current and Emerging Legionella DiagnosEcs for Laboratory         and Outbreak SituaEons (2015) Clin Micro Rev. (28) 1). 

Clinically relevant Tested Detected

Legionella anisa Legionella birminghamensis (n=2) Legionella bozemanii (n=2) Legionella cincinnatiensis Legionella dumoffii (n=2) Legionella erythra Legionella feeleii (n=2) Legionella gormanii (n=2) Legionella hackeliae (n=2) Legionella longbeachae Legionella micdadei  Legionella oakridgensis (n=2) Legionella parisiensis Legionella wadsworthii                                                       Legionella pneumophila subsp. pneumophila‐1      (n=12)   Legionella pneumophila subsp. pneumophila‐2‐16     

Page 21: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

Legionella pneumophila species (all serogroups): NucleoSEQ 

•  DetecEon of all clinically relevant Legionella pneumophila serogroups (n=15) 

Clinically relevant Tested Detected

Legionella anisa Legionella birminghamensis (n=2) Legionella bozemanii (n=2) Legionella cincinnatiensis Legionella dumoffii (n=2) Legionella erythra Legionella feeleii (n=2) Legionella gormanii (n=2) Legionella hackeliae (n=2) Legionella longbeachae Legionella micdadei  Legionella oakridgensis (n=2) Legionella parisiensis Legionella wadsworthii                                                       Legionella pneumophila subsp. pneumophila‐1      (n=12)   Legionella pneumophila subsp. pneumophila‐2‐16     

Page 22: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

Biomarker Discovery ‐ Legionella pneumophila sg1 specific assay 

•  Requirement for a novel target for sg1: 

         15 serogroups associated with L. pneumophila species 

•  ComparaEve whole genome analysis 

Comparison of L. pneumophila sg1 whole genome with L. pneumophila sg6 and sg12    

•  95 nucleoEde sequence regions of difference idenEfied 

•  BioinformaEc analysis of these 95 regions 

•  Yielded 3 potenEal NAD targets in silico 

Page 23: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

Legionella pneumophila sg 1 specific NAD assay 

AmplificaEon curves for Legionella pneumophila sg1 real‐Eme PCR diagnosEcs assay  

•  DetecEon of all L. pneumophila sg1 strains tested (n=12) 

•  Specific for L. pneumophila sg1 – no non sg 1 strains detected (n=23) 

Page 24: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

Legionella Mul-plex Assay: Current Status 

•  Incorporate all assays into mulEplex format in the presence of an Internal AmplificaEon Control‐ complete (4 –plex) 

•  Generate standard curves for quanEficaEon‐ complete 

•  OpEmise mulEplex assay – real water samples – Ongoing to improve LoQ (near compleEon) 

Page 25: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

  Analysis of isolates from biocontaminated hot and c  

•  Test water samples (without culture) with our NAD mulEplex assay from a biocontaminated hot and cold water system 

•  Currently also working on a novel microbial nucleic acid enrichment process from water 

•  UlEmate goal is to develop an accurate, sensiEve and validated NAD test for Legionella with a rapid turnaround Eme (TAT)  

     Water Sample In to Result Out in  <4 hours 

Future Work 

Page 26: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

NADRL  

Tips for Dealing with Industry 

In general:  •  License negoEaEons ‐ bring in the professionals (University TTO / Legal / IP Managers) R+D Contracts with Industry: •  MeeEng industry product specificaEons, milestones and deliverables deadlines – employ a 

programme manager •  “Moving goalposts” ‐ Chopping and changing of work programme / schedules  – usually 

influenced by markeEng component of industry partner (can be very frustraEng)  •  Physical separaEon of industry laboratory group from your day to day academic 

laboratory group 

Page 27: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

  Analysis of isolates from biocontaminated hot and c

•  Significant nega-ve impact on your ability to publish research in peer reviewed journals  

 •  ‘Le\ng your technology go’ – dependent on the nature of license structure  

 (exclusive / non‐ exclusive)  

Downsides from Working with Industry 

Page 28: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

  Analysis of isolates from biocontaminated hot and c qPCR NADRL Peer Reviewed Publica-ons 2015: 

Cross Pla_orm Standardisa-on of an Experimental Pipeline for Use in the Iden-fica-on of Dysregulated Human Circula-ng MiRNAs. Kelly, H et al. (2015) PLoS ONE 10(9): e0137389. doi:10.1371/journal.pone.0137389.  100% (License Royalty Stream) v 0%  A rapid culture independent methodology to quan-ta-vely detect and iden-fy common human bacterial pathogens associated with contaminated high purity water. Minogue, E et al (2015) BMC Biotechnol.  75% v 25% (SFI)  Compara-ve genome analysis iden-fies novel nucleic acid diagnos-cs targets for use in the specific detec-on of Haemophilus influenzae. Coughlan, H. Et al. (2015)  DiagnosJc Microbiology And InfecJous Disease. 50% v 50% (SFI)  A comparison of established diagnos-c methodologies and a novel bacterial smpB real‐-me PCR assay for the specific detec-on of Haemophilus influenzae associated with respiratory tract infec-ons. Reddington, K et al. (2015) Journal Of Clinical Microbiology. 0% v 100% (EU) 

 

Benefits from Working with Industry –  

Non‐Repor-ng (%) v Repor-ng (%) Research Funding Contribu-on 

Page 29: qPCR Diagnostics Assay Development for Infectious Disease Working with Industry - an Academics Perspective

Thank You     PI: Dr Thomas Barry ([email protected]) To my core research team: Postdocs –  Kate Reddington, Nina Tuite, Elizabeth Minogue Postgrads – Helena Coughlan, Helena Kelly, Shannon Fullbrook   

 CDC  University College London / Royal Free Hospital NHS Hospitals London Public Health England  UCHG  

Our academic collaborators: