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壱o0 1e osstems
QuantStudioSノQuantStudio5
リアルタイムPCRシステム
簡易操作ガイド
QuantStudioDesign&AnalysisSoftwarevl.2
マニュアル番号A29331JPRev.B
ThermoFisherSCIENTIFIC研究用にのみ使用できます｡診断目的およびその手続上での使用はできません。
ForResearchUseOnly.Notintendedmranyanimalorhumantherapeuticordiagnosticuse.
InfOrmationinthisdocumentissubjecttochangewithoutnotice.
APPLIEDBIOSYSTEMSDISCLAIMSALLWARRANTIESWITHRESPECTTOTHISDOCUMENT,EXPRESSEDORIMPUED,
INCLUDINGBUTNOTUMITEDTOTHOSEOFMERCHANTABILITYORFITNESSFORAPARTICULARPURPOSE.TOTHE
FULLESTEXTENTALLOWEDBYLAW,INNOEVENTSHALLAPPUEDBIOSYSTEMSBEUABLE,WHETHERINCONTRACT,
TORT,WARRANTY,ORUNDERANYSTATUTEORONANYOTHERBASISFORSPECIAL,INCIDENTAL, INDIRECT,
PUNITIVE,MULTIPLEORCONSEQUENTIALDAMAGESINCONNECTIONMTHORARISINGFROMTHISDOCUMENT,
INCLUDINGBUTNOTUMITEDTOTHEUSETHEREOF,WHETHERORNOTFORESEEABLEANDWHETHERORNOT
APPUEDBIOSYSTEMSISADVISEDOFTHEPOSSIBILITYOFSUCHDAMAGES.
LimitedUseLabelLicenseNo.358:ResearchUseOnly
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TaqMan,Amperase,andAmpliTaqGoldareregisteredtrademarksofRocheMolecularSystems, Inc.
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'C2016ThermoFisherScientificinc.AII rightsreserved.All.
本ガイドはAppliedBiosystemsTMQuantStudioTM3とQuantStudioTM5リアルタイムPCRシステムの操作を行う際に必要となる部分のみを記載している簡易操作ガイドです。
詳細は装置付属の英文ユーザーガイドをご確認ください。また本ガイドには知的財産に関するいかなる情報も含んでおりません。知的財産に関するする情報は英文ユーザーガイドに記載されておりますのでご参照ください。
2
目次
QuantStudioDesign&Analysisソフトウエア簡易操作ガイド(I)StandardCurve～検景線存用いた壼量～･･･････-.......-.....‘･･･-......---....….．･･･一･････…･-......--........･･･････････．｡･･･-......-..．･･･････-..-....
StandardCurve使用フロー------------･･------------------------------------..-------------------... -
新規ドキュメントの作成-------------------------------------------..-----------------------･･----------------------‐
ランの開始---------........------------------------------･･････-----------..----..--------..--....--------------------------..--‐
反応プレートの準備-------------------------------------------------------..--------------------------------------‐
ランの終了--------------------------------------------------･･------------------------------------------------------‐
デー｡タ解析----....-----..-..-----------..-------....------------..----..-..---..--------..-..------------------------..-....-------‐
データ出力-----..--------------..-..--....----------．･･･-------..-----..------.｡･･-----------..--------------..----------..------‐
補足情報VeriFIexの設定方法-----------------------------------------------------------------..------------‐
QuantStudioDesign&Analysisソフトウエア簡易操作ガイド(II)RelativeStandardCurve～検景線寿用いた相対定量～･････-．･･･．．･･･-------..---…･･････-....-..．･･･------..-----…-..--....
ドキュメントの設岸----------------..-----．･･･------..--------..-..----．･･･--------..----------------..--------..-------------‐
RelativeStandardCurveデータ解析------････-....------------------------------------------..-----------------‐
QuantStudioDesign&Analysisソフトウエア簡易操作ガイド(III)
ComparativeCT(△ACT)～検量線を用いない相対定量～~.．~..…~~~~~~~~~~~~~~~…~~~~…~~~~~~~~~~~~~．~…
ドキュメントの詔穿---------------------------------------------..--------------------------------------------------
ComparativeCT(△△CT)データ解析~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~..~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~‐
QuantStudioDesign&AnalysiSソフトウエア簡易操作ガイド(IV)Genotyping～対立遺伝子識別アッセイ～-----..-..-…･･････---......-.....．…･･-..--..----....････････--..---…-----..--..-..-...･･･…‐
新規ドキュメントの作成------------------------------------------------------------------------------------------‐
ランの開始．.---------------------------------------------..-････-..--------------------------------..------..-----------‐
反応プレートの準備-----------..-..-..-..-----------..---..----------------..------..------------------------------------.・
ランの終了---..------..-------------------..----..-------..----------------------..-----------..-----------------------..--‐
タイピング結果の検証---------------------------------------..--..--------------------------..--..----------------．．-‐
データ出力.､---------..------..--------------..-----..--------------------------..------..--------..--..-....--------------..--‐
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3
QuantStudioDesign&Analysisソフトウエア簡易操作ガイF(I)
StandardCurve
～検量線を用いた定量～
概要
QuantStudio3/QuantStudio5リアルタイムPCRシステムでは､検量線を用いた絶対定量を行うことが
できます。
分子数が明確なサンプル(例:ブﾗｽﾐドや精製したPCR産物等)を用いて検量線を作成すると絶対定量を行うことができます｡主に以下のアプリケーションに利用されています。
‐ウィルスや微生物の定量
一遺伝子組み換え食品の検出･定量
また､同一のサンプル内で複数遺伝子のmRNAの量比を定量する場合にも､絶対定量を行うことが必要です。
なお､分子数が不明確なサンプルからでも､増幅することが確実なサンプルを希釈することにより､相対定量のための検量線を作成することができます｡各反応系毎に､相対的な定量値を算出することも可能です。
5
StandardCurve使用フロー
[I
リアルタイムPCRシステム本体を起動
lﾀﾂﾃバﾈﾙの画面が蹴れること書確．ソフトウェアの起動ならびにドキュメントの作成
･ランタイプとTarget､Sampleの入力
･RunMethodの確認(変更）
ドキュメントの保存
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･StanRunボタンをクリックしてランを開始
･ランの終了
データ解析
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6
栽規ドキュメントの惟成
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QuantStudi"
Design&
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1.デスクトップ上のショートカットをダブルクリックし､ソフトウエアを起動します。
2.Home画面が表示されます。
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ドキュメントについて
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A:メニュー
実験を行うときにはこのメニューを左から右へ順番に切り替えることで､ドキュメントの設定、ランおよび解析までを行うことができます。
Bメニューで選択した項目に対応する画面が表示されます。
C:タブ
ファイルを開くと自動的にソフトウェア下段にタブが表示されます｡タブをクリックすることで表示するファイルを切り替えたり、Home画面に戻ることができます。各ファイルを閉じる時にはタブ右側の×をクリックします。
8
NgXt
ドキュメントの設定Properties
新規ドキュメントを作成するとProperties画面が表示されます。この画面でファイル名や実験系の基本情報を入力します。
1.Name
自動的にドキュメント作成日時が入力されます｡必要に応じて変更･追加します。BarcodeとUserNameは全て任意で入力してください。
2.lnstrumenttypeご利用の機器をプルダウンメニューから選択します。
3.BIocktypeご利用の機器のブロックタイプをプルダウンメニューから選択します。
4.Experimenttype検量線を用いた定量実験を行うときにはStandardCurveをプルダウンメニューから選択します。
注記:StandardCurve/RelativeStandardCurve/ComparativeCT(△△CT)の各ドｷｭﾒﾝﾄタイプはラン終了後に変更し､再解析することができます。
5.Chemistry検出に用いる蛍光ｹﾐｽﾄﾘを選択します。
TaqManプローブを用いるときにはTaqManReagentsを､SYBRGreenを用いるときにはSYBRGreenReagentsを､両者が混在しているケースかその他の蛍光色素を用いるときにはOtherを選択します。
6.Runmode
ご利用いただく試薬にあわせて選択します。
Standard用試薬をご利用の場合はStandardを､Fast用試薬をご利用の際はFastを選択します。
7.入力が完了したら､Nextをクリックします。
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Eキュメントの設定:Method
次にMethod画面が表示されます。
ExperimentPropertiesで選択した項目に合わせたサーマルサイクラー条件が自動的に表示されます。必要に応じて適宜変更します。
1.反応ボリュームを入力します｡ブロック毎の推奨ボリューム及び最大ボリュームは以下の通りです。
ブロックタイプ
384ウエル
Standard96ウェル
Fast96ウェル
推奨ボリューム
5-20ML
10-100ML
10-30UL
最大ボリューム
30PL
200ML
100UL
注記:推奨ボリューム以上の値に設定すると､Fastモードの時のランプスピードが遅くなります。
2.温度条件を確認します｡各ステップにポインターを重ねた時に表示される+一ボタンをクリックすることで､任意のプログラムを追加･削除することができます。
3．aのマークがアクティブになっているポイントで蛍光データを回収します。マークの上をクリックすることで､データ回収ポイントを設定することができます。注記データを取り込むために必要な時間は10秒以上です。
4. （オプション)Verinex機能により､ブロック間で異なる温度を設定することができます。詳細は39ページを参照してください。
5.入力が完了したら、Nextをクリックします。
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次にPlate画面が表示されます。
この画面では検出する遺伝子(Target)及び未知サンプル(Sample)の情報を入力します。
注記:Plate画面の設定はラン終了後にも入力･変更できます。
1.AdvancedSetupタブを選択します。
2.Targetの設定をします(詳細はpl2.参照)。
3.Sampleの設定をします(詳細はpl3.参照)。
4. （オプション)BiologicalReplicategroupの設定(詳細はp42参照)。注記:StandardCurveドキュメントではBiologicalReplicateを設定しても解析結果には反映されません。
RelativeStandardCurveドキュメント及びComparativeCT(△△CT)ドキュメントをStudyで解析したときにのみ､解析結果に反映されます。
5.プレートレイアウトの設定をします(詳細はpl4参照)。
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ドキュメントの設定:Plate(1) 1arqetsの設定
注記PIate画面の設定はラン終了後にも入力･変更できます。
1.Targetsには検出する遺伝子の情報を入力します。-Nameには遺伝子名等を入力します。
-Reporterの蛍光色素をプルダウンメニューから選択します。-Quencherの設定を確認します。
2.複数の遺伝子を検出するときにはAddをクリックしてリストに追加し､1の作業を繰り返します。
3.繰り返し使用するTargetはその情報をLibraryに保存することができます｡保存するTargetをクリックしてハイライトで選択したら､ActionメニューからSavetoLibraⅣをクリックします。
4以前Libraryに保存したTargetを呼び出して使用したいときには､ActionメニューからimportfromLibraryをクリックしてTargetLibraryを表示させ､使用するTargetを選択してからAddSelectedTarget(s)をクリックします。
5. （オプション)TaqManGeneExpressionAssayをご利用の場合、ActionメニューからImportfromLibraryをクリックしてTargetLibraryを表示させ､ライブラリー内のImportAIFをクリックし､添付のCD内のAssaylnfOrmationFile(AIF)を選択すると､各AssaylDがTargetNameに入ったTargetListが自動的にLibraryに登録されます。
6（オプション)以前Libraryに保存したTargetを削除したいときにはActionメニューからImportfromLibraryをクリックしてTargetLibraryを表示させ､Targetを選択してからDeleteをクリックします。
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7.Samplesに定量する未知サンプルを登録します。-SampleNameにはサンプル名を入力します。
8.複数の未知サンプルがある時には､Addをクリックしてリストに追加し､6の作業を繰り返します。
9.繰り返し使用するSampleをLibraⅣに保存することができます｡保存するSampleをクリックしてハイライトで選択し、ActionメニューからSavetoLibraryをクリックします。
10.以前LibraⅣに保存したSampleを呼び出して使用したいときには､ActionメニューからImportfromLibraryをクリックしてSampleLibraryを表示させ､使用するSampleをクリックしてからAddSelectedSample(s)をクリックします。
11． （オプション)以前LibraⅣに保存したSampleを削除したいときにはActionメニューからImportfromLibraryをクリックしてSampleLibraryを表示させ､Sampleを選択してからDeleteをクリックします。
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ドキュメントの設定Eatg_(alプレートレイアウトの設定
1.画面右側で､設定するウェルを選択します。‐マウスをドラッグさせると選択枠が広がります。‐列番号または行のアルファベットをクリックすると､列または行全体を一度に選択できます。‐ウエルの左上の小さな正方形のブロックをクリックすると､全ウェルを一度に選択できます。-Controlキーを押しながらクリックすると､任意のウェルの選択及び選択解除ができます。
2.Targetsﾌｨｰﾙド内のターゲットﾘｽﾄのチェックボックスにチェックを入れると､選択したウエルにTargetが設定されます。
3.Taskを選択します｡初期設定では全て''U''です｡アルファベットをクリックして設定を適宜変更します。-U:Unknown未知サンプル
-S:Standard検量線作成用標準サンプル
注記:Standardの設定はDefineandSetUpStandardsの機能(15ページ参照)を使用することができます。
-N:NoTemplateControlテンプレート無しのネガティブコントロール
4.QuantityにStandard(検量線作成用標準サンプル)の初期量を入力します。注記:Quantityの入力はDefineandSetUpStandardsの機能を使用することで自動化できます。
（詳細はpl6.参照）注記：希釈倍率が等間隔ではないときには､DefineandSetUpStandardsの機能を使用できないため､この項目で直接入力します。
5.Unknown(未知サンプル)にSampleを設定します｡設定するUnknownウエルを選択し､Samplesフィールド内のサンプルﾘｽﾄのチェックボックスにチェックを入れると､選択したウエルにSampleが設定されます。
6. （オプション)BiologicalReplicateを適宜設定します｡設定するUnknownウエルを選択し､BiologicalGroupsﾌｨｰﾙド内のサンプルﾘｽﾄのチエックボックスにチェックを入れると､選択したウエルにBiologicalReplicateが設定されます。注記:StandardCurveドキュメントではBiologicalReplicateを設定しても解析結果には反映されません｡RelativeStandardCuiveドキュメント及びComparativeCT(AACT)ドキュメントで解析したときにのみ､解析結果に反映されます。
7.Viewをクリックしてウエルの表示設定を変更することができます。
8. （オプション)PassivereferenceをROXから変更する必要がある場合､QuickSetupタブ内のPassivereferenceプルダウンメニューから変更します。
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DefineandSetUpStandardsを用いたStandardの設定方：
前項⑨のActionメニューからDefineandSetUpStandardを選択します。
1. 1wellあたり1色の反応(Singleplex)か､複数色の反応(Multiplex)かを選択します。
2. Standardを設定するTargetをプルダウンメニューから選択します。
3.Standardに設定する濃度の数値を入力します。
‐稀釈系列は5点以上設定することを推奨します｡最低でも3点はご用意ください。
4.各Standardの反復数を入力します。
5.Standardの濃度の､基点となる数値を入力します。
6.希釈倍率をプルダウンメニューから選択します。
－1:5を選択すると､基点の濃度に対して1/5の値が繰り返し自動的に算出されます。-10Xを選択すると､基点の濃度に対して10倍の値が繰り返し自動的に算出されます。
7.希釈系列の並び順の設定です｡Columnsを選択すると縦方向に､Rowsを選択すると横方向に、希釈系列がそれぞれ並びます。
8.ウエルの自動配置の設定を行います。
-AutomaticallySelectWellsbrMeを選択するとソフトウェアが自動的にウェルを決定します。-LetMeSelectWelIsを選択すると､任意の位置を使用者が選択して設定することができます。
9.Standardが設定されるウェルの範囲がハイライトで表示されます｡7でLetMeSelectWellsを選択した時には､この場所で設定するウェルを選択します。
10.Applyをクリックすると､上記設定に従ってウェルヘのStandardSampleの設定が適用されます。
11.複数のTargetがあるときには､1から9までの作業を繰り返します。
12.設定が終了したらCloseをクリックし､画面を閉じます。
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(オプション)雛型ファイルの保存同じ条件で何回も繰り返し実験を行う場合､雛型ファイルを作成しておくことができます。
1.SaveよりSaveAsを選択します。
2.保存先の指定の画面が表示されます。
3.保存先を指定し､FileNameを入力してSaveをクリックすると保存されます。注記:PCの動作安定の為､C:ドライブへの保存は避けD:ドライブに保存を行ってください。
4.入力が完了したら､Nextをクリックします。
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注記:雛型ファイルから新規実験系ファイルを作成するときは､HomeページCreateNewExperimentのプルダウンメニューからTemplateを選択し､雛型ファイルを選択してOpenをクリックします。
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17
ランの開始:Run
次にPIate画面が表示されます。
1本体ﾀｯﾁパネル右上の回を押してサンプルプﾛｯｸを出します。
2プレートをプﾛｯｸに載せ､回を押してサンプルブﾛｯｸを収納します。
3.ソフトウェア画面の右上STRTRUNをクリックし､プルダウンメニューでシリアルナンバーを選択
するとSave画面が表示されます。
4任意のファイル名を入力し､Saveをクリックするとランが開始します。
5ラン中に増幅曲線を確認することができます。
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注意： ランニング中に本体ﾀｯﾁパネルより残り時間､PCRサイクル詳細､増幅曲線を確認するができます。
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反応プレートの準備
推奨の消耗品とその組み合わせは下記の通りです。
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ブロックタイプ
MicroAmpOptical384-WelIReactionPlate
商品番号!4309849
MicroAmpOpticalAdhesiveFilm
商品番号:4311971
384ウェル
MicroAmpOptical96-WellReactionPlate
商品番号:N8010560
MicroAmpOpticaiAdhesiveFilm
商品番号:4311971
MicroAmpOptical96-WellReactionPlate
商品番号 N8010560Standard96
ウェル MicroAmpOptical
8-CapStrip商品番号:4323032(Flatタイプ）
MicroAmpOptical
8-TubeStrip(0.2mL)商品番号:4316567
MicroAmp96-Weli
Tray/Retainerset
(Blue)商品番号:4381850
MicroAmpOptical
TubewithoutCap(0.2mL)商品番号:N8010933 MicmAmp96-Well
SupportBase商品番号:4379590MicroAmpFast96-Well
ReactionPlate
商品番号:4346907
MicroAmpOpticalAdhesiveFiim
商品番号:4311971
MicroAmpFast96-WellReactionPlate
商品番号:4346907MicroAmpOptical
8-CapStrip商品番号:4323032(FIatタイプ）
Fast96ウェル
MicroAmpFast
8sTubeStrip(01mL)商品番号:4358293 MicroAmp96-Well
Tray(BIack)商品番号:4379983MicroAmpFastReaction
TubewithCap(01mL)商品番号:4358297
重要:反応系調製用の消耗品を取り扱う際には必ずパウダーフリーの手袋を装着してください。
警告！ ：チューブにセットするキャップは必ずフラットタイプのものをご利用ください｡ドーム型のキャップを用いるとヒートカバーが損傷します。△
重要:反応するプレートやチューブ等にマジックでラベルをしないでください｡マジックの中には蛍光物質が含まれているため､データに悪影響を及ぼします。
重要:プレートの底を汚さないように注意してください｡プレートの底に液体や他の汚染物がつくと、サンプルブロックを汚染し､異常に高いバックグウンド信号が検出されてしまう可能性があります。
19
プレートのシール方法
1.プレートに反応試薬を適宜分注します。注記:96ウエルプレート･Fast96ウエルプレートをご利用の場合､ベースの
上にプレートを乗せて作業を行ってください。
2.OpticalAdhesiveFilmを1枚取り出し､両端を上向きに折り曲げます｡フィルムの保護面を上側に向けます。
3.白色の保護フィルムをすばやくシール面から剥がします｡シール面には触れないでください。
4.フィルムの両端を持ち､フィルムを反応プレートの方に向けて降ろし
ます(接着面が反応プレートに面するように)。フィルムが反応プレート中の全ウェルを完全に覆っていることを確認します。
5.上から圧力をかけながらアプリケータを縦横にゆっくり動かして､反応プレート全体にフィルムとプレートが密着するようにします。
6.アプリケータを使ってフィルムの端を押さえながら､他方の端を持っ
てすばやく引っ張り､フイルムのタブを取り外します｡反対側についても同じようにします。フィルムのタブは綺麗に取り除いてください｡タブが残っているとプﾚｰﾄがヒーヒヵバーにくっついてしまう原因になります。
7.蒸発が生じないよう完全に密着させるために､ステップ5を繰り返します。
8.アプリケータの端をフィルムの外側の縁に沿ってしっかり圧力をか
けながらなぞってフィルムを密着させます。注記:OpticalAdhesiveFilmは､接触しただけで密着するものではありません｡蒸発が生じないよう完全に密着させるためには､圧力をかけることが必要です。
9.反応プレートを点検し､全てのウェルがシールされていることを確認します｡フィルム表面上に全ウェルの縁がはっきりと映っていなけ
ればなりません。 に装置にプレートが付着しないよう､フィルラン
ムのタブが完全に取り除かれていることを確認します。
重要;フィルムを適用する際､光学接着カバーの接着剤が､プレートの
縁に付着することがあります。OpticalAdhesiveFilmの外周から､余剰の接着剤をすべて拭き取ります｡余剰な接着剤を拭
き取らないと機器本体のサンプルブロックに付着することがあります。
10.プレートの底からみて､反応液がプレートの各ウェルの底に集まっ
ていることを確認してください｡ウェルの底に集まっていないものが1つでもあれば､プレートを遠心してください。
20
キャップを使用する方法
96ウェルプレートにキャップを使用する場合以下のように組み合わせて使用します。
MicroAmpOptical8-CapStrip(Flatタイプ）
MicroAmpOptical96-WellReactionPlate/
MicroAmpFast96-WellReactionPlate
MicroAmp96-WelISupportBase
重要:機器にセットする前にMicroAmp96-WellSupportBaseから取り外してください。
Standard96ウエルブロツクでチューブ及びキャップを使用する場合以下のように組み合わせて使用します。
MicroAmpOptical8-CapStrip(FIatタイプ）
MicroAmpOptical96-WellTraylRetainerSet :Retainer
MicroAmpOptical8-TubeStrip/MicroAmpOpticaITubewithoutCap
MicroAmpOptical96-WellTray/RetainerSet :Tray
MicroAmp96-WellSupportBase
重要:機器にセットする前にMicroAmp96-WellSupportBaseから取り外してください。
21
キャップを使用する方法
Fast96ウエルブロツクでチューブ及びキャップを使用する場合
以下のように組み合わせて使用します。
8連チューブとキャップ
MicroAmpOptical8-CapStrip(Flatタイプ）
MicroAmpFast8-TubeStrip
MicroAmp96-WellTray
MicroAmp96-WellSupportBase
キャップ付きチューブ
MicroAmpFastReactionTubewithCap
MicroAmp96-WelITray
MicroAmp96-Wel!SupportBase
重要:機器にセットする前にMicroAmp96-WellSupportBaseから取り外してください。
22
ランの終了:Results
ランが終了すると、自動的にResults画面のAmplificationPIotに切り替わり、自動解析が行われた結果が表示されます。
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プレートの取り出し
1本体タツチパネル右上の回をﾀｯﾁしてサンプルプﾛｯｸを出します。
2.プレート取り出します。
警告1怪我の危険:装置のラン中､プレートは105℃に加熱されています｡プレートは室温になるまで待ってから取り出してください。
3.再度本体ﾀｯﾁパネル右上の圖をﾀｯﾁしてサンプルブロックを収納します。
(オプション)機器本体のシャットダウン
連続して実験を行わない場合は､ラン終了時に機器本体の電源(本体背面)を切っていただくことができます｡データ解析はソフトウェア単独で行うことができます。
23
デ三ﾀ解析
ランの終了後､データ解析を行います｡解析する前に､遺伝子ごとに解析パラメータ値を指定します。
ソフトウェアにはすべての解析パラメータを自動で決定するAutoCT機能と､パラメーターをマニュアルで設定するManuaICT機能が搭載されています。
用語
ベースライン(Baseline)
指定したサイクル内の蛍光シグナルを使用して､反応液中のバックグラウンド蛍光強度を0に補正します。
ウエルごとに自動決定されます。
指定したサイクルが同-Targetで使用しているすべてのウェルに自動で決定する場合;AutomaticBaselineウエルごとに自動決定されます。
手動で決定する場合:ManualBaseline 指定したサイクルが同-Targetで使用しているすべて｛適用されます。
スレッショルドライン(Thresholdiine)あるPCR増幅産物量(蛍光シグナル量)に達するサイクルを求めるために設定する補助線になります。増幅曲線の画面上にラインとして表示されます。
設定に関する詳細
自動ベースライン/スレッシヨルド機能(AutomaticCT機能）ベースラインとスレッショルドラインを自動で決定する機能です｡ベースラインは各サンプルウェルそれぞれの増幅曲線立ち上がりサイクルから自動的に決定されます｡スレッショルドラインは指数関数的増幅領域内に自動設定されます。
手動ベースラインノスレッシヨルド機能(ManuaICT機能）ベースラインとスレッショルドラインを手動で決定する機能です｡指定したサイクルのシグナルをベースラインとしてすべてのウェルに適用するManualBaselineと､ウェルごとに自動で決定するAutomaticBaselineを選択できます｡スレッショルドラインは手動設定になります。
AmpI市cationPIot1口
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※左図のような増幅曲線の形
で､適切な位置にスレッショル
ドラインを設定するように機能を使い分けてください。Fｰ§。’
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24
AmplificationPlotの確認
ランが終了すると、自動的にResults画面のAmplificationPiotに切り替わり、自動解析が行われ、結果が表示されます。
ソフトウェアは典型的なAmplificationPlotのデータが得られていると想定し、自動的にBaselineとThresholdLineを設定･解析します。
重要:ブロックの汚染やコンタミ･ピペッティングエラーなどにより､AmplificationPIotの波形が変わると､QuantStudioソフトウェアは正確なBaselineとThresholdLineを設定することができなく
なることがあります。
解析後AmplificationPlot画面でBaselineとThresholdLineを確認することを推奨します。
もしイレギュラーな波形及びThresholdLineが表示された場合には､手動解析による解決を試みてく
ださい。
回 をクリックすると､詳細設定が可能になります(右図)。Showplotsettings
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ThresholdLineのManual設定
1.TargetのプルダウンメニューをThreshold設定するTargetにあわせます。
2.Autoチェックボックスをクリックしてチェックをはずします。
3.グラフ上のThresholdLineにマウスのポインタを合わせると上下に移動することができるので、ドラッグして任意の位置にあわせます。
4画面右上のI Ana'yz｡ をｸﾘｯｸすると新しく設定したThresholdを用いた解析が行われます。
5.テキストボックスにThresholdLineの数値を直接入力することもできます｡値を入力して画面右上のAnalyzeをクリックすると､新しく設定したThresholdを用いた解析が行われます。
Results
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[正しく設定されたスレッショル同
設定されたスレッショルドは、
増幅曲線の指数関数増幅領域内に
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スレッショルドが最適値を上回った
り下回って設定されると､複製グル
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Cycle
AmPlificationplot1ED1
[低すぎるスレッショルド］設定されたスレッショルドは､増幅曲線の
指数関数増幅領域より低い領域にあります。1EOO
この場合､スレッショルドが正しく設定
された場合のプロットよりも､はるかに
多くの標準偏差が発生します。
スレッショルドバーを指数関数増幅
領域内に引き上げてください。
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Amplificationplot1EO1
[高すぎるスレッショル門設定されたスレッショルドは､増幅曲線
の幾何学的相より高い領域にあります。この場合､スレッショルドが正しく設定
された場合のプロットよりも､はるか
に多くの標準偏差が発生します。
スレッショルドバーを指数関数増幅
領域内に下げてください。
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BaselineのManual設定:1arqet単位
AmplificationPlotのOptionsの項目でBaselineをManualで設定することができます。この方法は､Target毎にまとめて同一のBaselineを設定するときに用います。
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1.TargetのプルダウンメニューをBaseline設定するTargetにあわせます。
2.Autoチェックボックスをクリックしてチェックをはずします。続けてAutoBaselineチェックボックスをクリックしてチェックをはずします。
3.ShowのBaselineのチェックを入れると､BaselineのStart(緑)とEnd(赤)が表示されます。初期設定ではStartが3サイクル､Endが15サイクルになっています。
4サイクル数軸に表示されているSta前とEndの三角ボタンは､マウスのポインタを合わせると横方向にドラッグして移動することができます｡最も早く増幅開始しているプロットの増幅開始直前のポイントにBaselineのEndの位置を合わせます。
5移動したのち画面右上の Ana'yZ｡ |をｸﾘｯｸすると､新たに設定したBaselineでの解析が行われます。
28
一ベースラインの設定一
AmplificationPiot1EO1
[正しく設定されたベースライン］
増幅曲線がベースラインのEnd
cycleを越えてから始まっており、
調整の必要はありません。
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[短すぎるベースライン］
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[長すぎるベースライン］
増幅曲線がベースラインのEnd
cycle以前に始まっているので、
EndCycle値を減らす必要があります。
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29
Baselineの手動設定:WeⅡ単位
AnalysisSettingsのAdvancedSettingsタブでBaselineを手動で設定することができます。この方法は､Well単位でBaselineを設定するときに用います。
1.AmplincationPIotのグラフから､Baselineを変更するウェルと.Baselineを設定するサイクル
の数値を決定し､控えておきます。
2画面右上のAnalyzeの横のAnalysisSettings回をｸﾘｯｸ､またはAnalysisﾒﾆｭｰからAnalysisSettingsを選択すると､AnalysisSettings画面が表示されます。
3.AdvancedSettingsタブをクリックします。
4.各ウエルのBaselineの設定リストが表示されるので､手動でBaselineを設定する任意のウエルをクリックしてハイライトで選択します(同時に複数のウェルを選択することも可能です)。
5.画面右側の[AutomaticBaseline]および[UseCTSettingsDefinedfOrTargetlのチェックを外します。
6.BaselineStartCycle:とEndCycle:の項目が入力できるようになるので､適宜任意の値を入力します。
7.画面下のApplyをクリックすると､設定した手動のBaselineを反映した再解析が行われます。
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1.PlotType:AmplincationPlotのグラフ表示を切り替えることができます｡通常は△RnvsCycleを選択してください。
2.GraphType:グラフの縦軸をLog/Linearに切り替えることができます。
3.PIotColor:AmplificationPlotの表示色を､WELL/SAMPLE/TARGET/FLAG_STATUSのいずれかから選択することができます。
4グラフ左上のPIotPropertiesボタンをクリックすると､グラフの縦軸･横軸のスケールを変更することができます。
31
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StandardCurveの確語
StandardCurveを確認します。
1.Results画面で､プルダウンメニューからStandardCurveを選択します。
2.Showplotsettings回をｸﾘｯｸします。3.Showplotsettings内でTargetを適宜選択します。AIIはすべてのTargetを表示します。
4.Showplotsettings内でPlotColorを適宜選択します。
5.Target毎のSIopeとR2とEff%を確認します。-SIope:検量線の傾きです｡PCR効率(Eff%)を反映し､効率が100%の時には約-3.32になります。-R2:相関係数です｡CT値と初期量が完全に相関しているときには1.00になります｡一般的にR2値は0.990以上あることが望ましいです。
-Eff%:PCRの増幅効率をSIope値から算出した値です。
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32
Results
MeltCurveの確認
(SYBRGreenアッセイの場合のみ)MeltCurve画面で二次産物の有無を確認します。
1.Results画面で､プルダウンメニューからMeltCurveを選択します。
2.Showplotsettings回をｸﾘｯｸします。3.PlotがDerivativeReporterであることを確認します。
4.Targetを適宜選択します。
5.ピークが単独か複数か確認します｡下図の通り単独であれば問題ありません｡もし異なる温度を示す複数のピークがあった場合は､実験系の最適化を行っていただくことが必要です。
6.Targetが複数あるときには1つずつ切り替えて確認します。
Results
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tCurveplot
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認：
Analyzeを行った後に､プレートレイアウト画面のウェル上にフラグ(黄色の三角マーク)が表示されることがあります｡フラグは表示されたウェルに何かしらの問題がある可能性を示しています。
フラグ内の数字は確認された問題の数を示します。
QCSummaⅣ画面ではフラグの具体的な内容､及びその対策方法を確認することができます。
1.Results画面で､プルダウンメニューからQCSummaryを選択します。
2.テーブル内の｢Frequency｣および｢Wells｣カラムを調べ､問題の内容とウエル数､およびウエルの位置を確認します。
3.各フラグの行をクリックすると､下段にそのフラグの詳細が表示されます。
34
Results
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H噂hmndarddev箇廿onmrep"tegmup 0
Outhermrepmtegroup 1 C11
StandardCurveMethod実験では､実験データの状況により下記のフラグが表示されます。
フラグ
AMPNC
BADROX
OFFSCALE
HIGHSD
NOAMP
NOISE
SPIKE
NOSIGNAL
OUTLIERRG
EXPFAIL
BLFAIL
THOLDFAIL
CTFAIL
内容
ネガティブコントロールで増幅
パッシブリファレンス値に異常あり
蛍光値がオフスケール
リプリケートグループ内の標準偏差が高い
増幅なし
他のウェルと比較してノイズが高い
スパイクノイズ有り
蛍光値が検出されない
リプリケートグループ内に異常値がある
指数関数的増幅領域が確認されない
ベースライン自動設定時に問題確認
Threshold自動設定時に問題確認
CT値自動算出時に問題確認
Passivereferenceの値が低いPRFLOW
PassivereferenceがCT値近傍で変動しているPRFDROP
Unkl601
m■ロ
Copyサンプルの肖ﾘ除
Zoomll
ZoomOut
FitPIate
0（
ロ
FullScreen
1
Unkl601
任意のウエルを解析対象外に指定することができます。
1.プレートレイアウト面上で､解析対象から外すウェルを選択します。
2.そのまま右クリックするとメニューが表示されるので､Omitを選択します。
3.解析対象外に指定されたウェルの左上に赤い×マークが表示されます。
0（hclude
回■ SaveAs
PrintPreView
Print._
＝ーb 4 P 4 b 4
4Analyzeをクリックすると､削除指定したウェルのデータを除外した解析が行われます。注記:Omit作業を行った後は､必ずAnalyzeをクリックして再解析してください。
5.解析対象に戻すときは､ウェルを選択して右クリックメニューからIncludeを選択します。
35
へ ﾛ■
ViewWeIITableタブ画面
'全ての解析が終了したら､目 を押してResultstableを表示します。
…｡師pG側ね、 晦廿褐d P… nm R“u地 唾”、
ResmtS 画A“”vqsQvQ
”、 ． ， ‘ ， ､平,｡ | '!Rﾊ錨守r■胃bﾛ■ず田冒rザ
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各ウエルの詳細情報が横一列に表示されます。
a.VieWプルダウンメニューから､ResultsTableに表示する項目を設定することができます。
b.Groupbyプルダウンメニューから､ターゲット毎､サンプル毎等にグループ表示することができます。C.表の各タイトルカラムをクリックするとソートすることができます。
2.データを確認したら､Nextをクリックします
36
データ出力:数値データ
次にExport画面が表示されます。
1.FileTypeプルダウンメニューから､QuantStudio形式およびファイル形式､もしくはRDML形式を選択します。
2.出力するデータの種類を､Contentから選択します。
最終的な定量結果のみを出力したい場合は､Resultsにチェックが入った状態にしてください。
3.出力するデータを個別のファイルで出力するか､1つのファイルで出力するか選択できます。
4.Browseをクリックし､データの出力先を指定します。
5.Exportをクリックするとデータが出力されます。
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データ出力:画像データ
AmplincationPIotなどのグラフを画像ファイルとして出力することができます。
JPEG等の画像ファイルへの出力
,出力したいグﾗﾌ上で右ｸﾘｯｸ>SaveAsを選択､もしくは回ｱｲｺﾝをｸﾘｯｸします。
2．出力したファイルの保存先の指定画面が表示されるので､画像ファイルの保存形式を選択し､任意の場所を指定して保存します。
定量結果やグラフを印刷することができます。
グラフの印刷
,出力したいグﾗﾌ上で右ｸﾘｯｸ>Printを選択､もしくは圖ｱｲｺﾝをｸﾘｯｸします。
2．プリンター選択の画面が表示されますので､任意のプリンターを選択し､印刷します。
定量結果の印刷
1.FileメニューからPrintRepo枕を選択します。
2.出力するデータ及びグラフにチェックを入れます。
3.PrintReportをクリックすると､プリンター選択の画面が表示されますので､任意のプリンターを選択し､印刷します。
注記：プリンター選択画面でCutePDFWriterを選択すると､PDFファイルを作成することができます。この場合はPrintをクリックした後ファイルの保存先指定画面が表示されるので､任意の場所を選択して保存します。
38
報VeriFIexの設定方法
QuantStudio3/QuantStudio5リアルタイムPCRシステムは､独立したブロックゾーンで異なる温度を設
定･運転することができる｢VeriFlex｣ブロックを搭載しています。
1.Methodの画面で､異なる温度を設定するｽﾃｯプのAdvancedSettings蟻をｸﾘｯｸします。
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I2VeriFlexチェックボックスにチェックを入れ､各ゾーンに任意の温度を入力します。隣接するブロック間の温度差は､5．C以内まで入力可能です。
3.入力後､Saveをクリックして設定を保存します。
39
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QuantStudioDesign&Analysisソフトウエア簡易操作ガイド(II)
RelativeStandardCurve
～検量線を用いた相対定量～
概要
QuantStudio3/QuantStudio5リアルタイムPCRシステムでは､検量線を用いた相対定量を行うこと
ができます。
RelativeStandardCurveではターゲット遺伝子と内在性コントロール遺伝子の定量値をそれぞれの検
量線から求めたあと､内在性コントロール遺伝子の値で補正を行い､さらに基準にしたリファレンスサンプルとの相対値を算出します。
注記:ここではStandardCurveの設定と異なる項目のみご説明致します｡その他の項目の設定方法につきましては､StandardCurveでの該当項目をご参照ください。
ドキュメントの設定Properties
ExperimenttypeからRelativeStandardCurveを選択します。
注記:StandardCurve/RelativeStandardCurve/ComparativeCT(△ACT)の各ドキュメントタイプはラン終了後に変更し､再解析することができます。
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1.Plate画面内QuickSetupのPlateAttributesで､基準とするReferenceSampleと、内在性コントロール(EndogenousControl)とする遺伝子をそれぞれプルダウンメニューから選択します。
注記:ReferenceSample及びEndogenousControlはラン終了後に変更することができます。
注記:EndogenousControlとしてMultipleControlを選択すると､複数のTargetの平均値を内在性コントロール用補正値として用いることができます。
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(オプション)集団間での比較定量を行いたい場合は､集団ごとの名前(BiologicalReplicateGroups)の入力も行います｡BiologicalReplicateGroupとは､同一の生物学的な集団の指定に相当します。
BiologicalReplicateGroupの指定を行うと､Sample間の相対値の算出とは別に､BiologicalReplicateGroup間の相対値も求めることができます。
2.Plate画面内AdvancedSetupのBiologicalReplicateGroupsに任意のBiologicalReplicateを登録します。
a.Addをクリックするとリストに新規のBiologicalReplicateGroupが追加されます。b.該当ウエルを選択し､各BiologicalReplicateGroupsのチェックボックスにチェックを入れます。
注記:BiologicalReplicateGmupはラン終了後に変更することができます。
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注記:ここではStandardCul･veの設定と異なる項目のみご説明致します｡その他の項目の解析方法につきましては､StandardCuweでの該当項目をご参照ください。
RelativeStandardCurveを選択した場合､AnalysiS画面にGeneExpression画面及びQCPIot画面が追加されます。
GeneExpressionの確認
GeneExpressionには､内在性コントロールで補正後の、リファレンスサンプルとの相対値が表示されます。
1Results画面内でプルダウンメニューからGeneExpressionを選択します。
2.Showplotsettings回をｸﾘｯｸします。
3.PIotTypeでグラフ表示単位を変更できます。
4.GraphTypeで縦軸のスケールを変更できます。
50rientationでグラフの向きを変更できます。
6（オプション)棒グラフの順番､はポインターでドラッグすることで入れ替えることができます。
7.画面右側にサンプル毎の相対値等詳細データが表示されます。
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GeneExpressionの確認(続き）
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QCPiotの確認
QCPlotでは最大4種類のターゲット遺伝子のサンプル毎のCT値の変動を比較できます。最もCT値の変動が少ない内在性コントロールを設定するのに最適です。
1.Results画面内でプルダウンメニューからQCPlotを選択します。
2.内在性コントロール候補のTargetにチエックを入れます。3.EndogenousControIProfileでCt値の変動を確認します。
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内在性コントロールやリファレンスサンプルを変更する場合はAnalysisSettingsのRelativeQuantificationSettingsで行うことができます。
AnalysisﾒﾆｭｰからAnalysissettingを選択､もしくはAnalyzeポﾀﾝ横の同ｱｲｺﾝをｸﾘｯｸするとAnalysisSettingが表示されます。
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1.RelativeQuantitationSettingsを選択します。
2.SelectReferenceおよびSelectEndogenousControlを適宜変更します。
3.設定を変更したらApplyをクリックしてウインドウを閉じ､Analyzeをクリックして再解析を行ってください。
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QuantStudioDesign&Analysisソフトウエア簡易操作ガイド(III)
ComparativeCT(AACT)～検量線を用いない相対定量～
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QuantStudio3/QuantStudio5リアルタイムPCRシステムでは､検量線を用いない比較CT法(ComparativeCT法)による相対定量を行うことができます。
比較CT法(△△CT法)では､基準としたリファレンスサンプルとのCT値(ThresholdCycle値)の差から相対値を求める相対定量法です。
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注記:ここではStandardCuiveの設定と異なる項目のみご説明致します｡その他の項目の設定方法
につきましては､StandardCurveでの該当項目をご参照ください。
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ExperimenttypeからComparativeCt(AACt)を選択します。
注記:StandardCurve/RelativeStandardCurve/ComparativeCT(△△CT)の各ドキュメントタイプはラン終了後に変更し､再解析することができます。
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1.Plate画面内QuickSetupのPlateAttributesで､基準とするReferenceSampleと､内在性コントロール(EndogenousControl)とする遺伝子をそれぞれプルダウンメニューから選択します。
注記:ReferenceSample及びEndogenousControlはラン終了後に変更することができます。
注記:EndogenousControlとしてMultipleContmlを選択すると､複数のTargetの平均値を内在性コントロール用補正値として用いることができます。
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(オプション)集団間での比較定量を行いたい場合は､集団ごとの名前(BiologicalReplicateGroups)の入力も行います｡BiologicalReplicateGroupとは､同一の生物学的な集団の指定に相当します。
BiologicalReplicateGroupの指定を行うと､Sample間の相対値の算出とは別に､BiologicalReplicateGroup間の相対値も求めることができます。
2.Plate画面内AdvancedSetupのBiologicalReplicateGroupsに任意のBiologicalReplicateを登録します。
a.Addをクリックするとﾘｽﾄに新規のBiologicalReplicateGroupが追加されます。b.該当ウエルを選択し､各BiologicalReplicateGroupsのチェックボックスにチェックを入れます。
注記:BiologicalReplicateGmupはラン終了後に変更することができます。
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RelativeStandardCurveデータ解析
注記:ここではStandardCurveの設定と異なる項目のみご説明致します｡その他の項目の解析方法につきましては､StandardCul-veでの該当項目をご参照ください。
RelativeStandardCurveを選択した場合､Analysis画面にGeneExpression画面及びQCPIot画面が追加されます。
GeneExpressionの確認
GeneExpressionには､内在性コントロールで補正後の､リファレンスサンプルとの相対値が表示されます。
1.Results画面内でプルダウンメニューからGeneExpressionを選択します。
2.Sh･wplotsettings回をｸﾘｯｸします。
3.PlotTypeでグラフ表示単位を変更できます。
4.GraphTypeで縦軸のスケールを変更できます。
5.Orientationでグラフの向きを変更できます。
6. （オプション)棒グラフの順番､はポインターでドラッグすることで入れ替えることができます。
7画面右側にサンプル毎の相対値等詳細データが表示されます。
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GeneExpressionの確認（続き）
8. （オプション:BiologicalReplicateGroupを設定した場合のみ）
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QCPlot①確認
QCPIotでは最大4種類のターゲット遺伝子のサンプル毎のCT値の変動を比較できます。最もCT値の変動が少ない内在性コントロールを設定するのに最適です。
1.Results画面内でプルダウンメニューからQCPlotを選択します。
2.内在性コントロール候補のTargetにチエックを入れます。3.EndogenousControlProfileでCt値の変動を確認します。
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内在性コントロールやリファレンスサンプルを変更する場合はAnalysisSettingsのRelativeQuantificationSettingsで行うことができます｡また､PCR効率の補正も行うことができます。
AnalysisﾒﾆｭｰからAnalysissettingを選択､もしくはAnalyzeボﾀﾝ横の回ｱｲｺﾝをｸﾘｯｸするとAnalysisSettingが表示されます。
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a.Emciencyでは､Target毎のPCR効率を入力することで､PCR効率を考慮した解析が可能です｡過去に検量線を作成し明確なPCR効率がわかっている場合､入力して解析を行う
ことで､より正確な相対値を算出することができます。
1.RelativeQuantitationSettingsを選択します。
2.SelectReferenceおよびSelectEndogenousControlを適宜変更します。
3.Efficiencyでは､Target毎のPCR効率を入力することで､PCR効率を考慮した解析が可能です。過去に検量線を作成し､PCR効率がわかっている場合､Efficiencyに入力します。
4.設定を変更したらApplyをクリックしてウインドウを閉じ､Analyzeをクリックして再解析を行ってください。
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QuantStudioDesign&Analysisソフトウエア簡易操作ガイド(Ⅳ）
Genotyping～対立遺伝子識別アッセイ～
概要
QuantStudio3/QuantStudio5リアルタイムPCRシステムでは､5'-nucleaseアッセイに
よるAllelicDiscriminationアッセイ(対立遺伝子識別アッセイ)を行うことができます。
原理
既知のSNPsに対応する2つの異なる蛍光色素でラベルした2プローブを加えてPCR反
応を行います｡プローブと標的配列の間にミスマッチがあるとプローブのTm値が下がり､競
合反応により100％マッチのプローブが優先的にハイブリダイズしてプローブの分解によ
るリポーター蛍光色素を検出します｡一方ミスマッチのプローブの分解及び蛍光強度の上
昇が最小限に抑えられるので､PCR終了後のエンドポイントで蛍光量をプロットすることで
両ホモ及びヘテロのタイピングを行うことができます。
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1.デスクトップ上のショートカットをダブルクリックし､ソフトウエアを起動します。
2.Home画面が表示されます。
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3.Selectanoption内のCreateNewExperimentをクリックすると､新規ドキュメントが開きます。
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A:メニュー
実験を行うときにはこのメニューを左から右へ順番に切り替えることで､ドキュメントの設定、ランおよび解析までを行うことができます。
B:メニューで選択した項目に対応する画面が表示されます。
C:タブ
ファイルを開くと自動的にソフトウエア下段にタブが表示されます｡タブをクリックすることで
表示するファイルを切り替えたり、Home画面に戻ることができます。各ファイルを閉じる時にはタブ右側の×をクリックします。
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ドキュメントの設定:Properties
新規ドキュメントを作成するとPmperties画面が表示されます。この画面でファイル名や実験系の基本情報を入力します。
1.Name
自動的にドキュメント作成日時が入力されます｡必要に応じて変更･追加します。BarcordとUserNameは全て任意で入力してください。
2.lnstrumenttypeご利用の機器をプルダウンメニューから選択します｡
3.BIocktype
ご利用の機器のブロックタイプをプルダウンメニューから選択します。
4.Experimenttype対立遺伝子識別アッセイを行うときにはGenotypingをプルダウンメニューから選択します。
5Chemistry
検出に用いる蛍光ｹﾐｽﾄﾘを選択します。
TaqManReagentsが選択されていることを確認してください。
6.Runmode
ご利用いただく試薬にあわせて選択します。
Standard用試薬をご利用の場合はStandardを､Fast用試薬をご利用の際はFastを選択します。
7.入力が完了したら､Nextをクリックします。
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ExperimentProperties
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ドキュメントの設定:Method
次にMethod画面が表示されます。
ExperimentPropertiesで選択した項目に合わせたサーマルサイクラー条件が自動的に表示されます。必要に応じて適宜変更します。
1.反応ボリュームを入力します｡ブロック毎の推奨ボリューム及び最大ボリュームは以下の通りです。
推奨ボリューム 最大ボリュームブロックタイプ
384ウエル
Standard96ウエル
Fast96ウェル
20ML5uL
25uL
10UL
50PL-
30pL
注記:推奨ボリューム以上の値に設定すると､Fastモードの時のランプスピードが遅くなります。
2.温度条件を確認します｡各ステップにポインターを重ねた時に表示される+一ボタンをクリックすることで､任意のプログラムを追加･削除することができます。
重要:Pre-ReadとPostReadをそれぞれ25･Cに設定していただくことをお勧めします。
3○のマークがアクティブになっているポイントで蛍光データを回収します。マークの上をクリックすることで､データ回収ポイントを設定することができます。
4. （オプション)別のサーマルサイクラーで増幅させたプレートのリードだけ行いたい場合には､Pre-
PCRReadとAmplificationチェックボックスを外します。
重要:必ずQuantStudioのそれぞれの機器に対応したプレートを使用してください｡プレートの種類を間違えますと故障の原因となります。
5.入力が完了したら､Nextをクリックします。
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ドキュメントの設定:Plate仙SNPsの設定
次にPlate画面が表示されます。
この画面では検出するSNP(SNPAssay)及び未知サンプル(Sample)の情報を入力します。
注記;Define画面の設定はラン終了後でも入力･変更できます。
SNPsに検出する遺伝子の情報を入力します。
1初期設定では''SNPAssayl"が表示されます。詳細情報を入力する場合は1度クリックしてハイライト表示してからActionからEditを選択します。aSNPAssayNameにSNP名を入力します。
b各アレルの名称または塩基を入力します。c.Reporterの蛍光色素をプルダウンメニューから選択します。d.Quencherの設定を確認します。
e.Colorはソフトウェアが自動的に振り分けますが､もしカスタマイズしたいときにはプルダウンメニューから選択します。
2.設定が完了したら､OKをクリックします。
3.複数のSNPを検出するときにはAddをクリックしてリストに追加し､1の作業を繰り返します。
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ドキュメントの設定:PIate(2)SNPsの設定
4.繰り返し使用するSNPはその情報をLibraryに保存することができます｡保存するSNPAssayをクリックしてハイライトで選択したら､ActionからSavetoLibraryで保存されます。
5.以前Libraryに保存したSNPを呼び出して使用したいときには､ActionからImportfromLibraryをクリックしてSNPLibraryを表示します｡使用するSNPAssayをクリックし､AddSeiectedSNP(s)をクリックします。
6.弊社で設計･合成のAssayで納品時にCDが添付されている製品の場合､SNPLibraryのImportAIFをクリックし､添付のCD内のAssaylnfOrmationFile(AIF)を選択すると､SNPAssayListが自動的に保存されます。
7以前Libraryに保存したSNPを削除したいときには､ActionからImportfromLibraryをクリックしてSNPLibraryを表示します｡削除するSNPAssayをクリックして選択したら､Deleteをクリックします。
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ドキュメントの設定:Plate(3)Samplesの設定
8.SamplesにSNPのタイピングをする未知サンプルを登録します。-SampleNameにはサンプル名を入力します。-CoIorはソフトウエアが自動で振り分けますが､カスタマイズしたいときにはプルダウンメニューから選択します。
9.複数の未知サンプルがある時には､Addをクリックしてリストに追加し､8の作業を繰り返します。
10.繰り返し使用するSampleをLibraⅣに保存することができます｡保存するSampleをクリックしてハイライトで選択し､ActionからSavetoLibraryボタンをクリックすると､確認画面が表示されて保存されます。
11.以前Libraryに保存したSampleを呼び出して使用したいときには､ActionからImportfromLibraⅣをクリックしてSampleLibraryを表示します｡使用するSampleをクリックし､AddSelectedSample(s)をクリックすると､選択したSampleがﾘｽﾄに追加されます。
12.以前Libraryに保存したSampleを削除したいときには､ActionからImportfromLibraryをクリックしてSampleLibraryを表示します｡削除するSampleをクリックし､Deleteをクリックすると､選択したSampleがﾘｽﾄから削除されます。
13.(オプション)PassivereferenceをROXから変更する必要がある場合､QuickSetupタブ内のPassivereferenceプルダウンメニューから変更します。
14.入力が完了したら、Nextをクリックします。
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Properties Method : Plate :■ ■
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E壬1塁些上Q設定:Plate凹一ゴﾚｰ上し王Z立上Q設定
1.プレートレイアウト内で､設定するウェルを選択します。‐マウスをドラッグさせると選択枠が広がります。‐列番号または行のアルファベットをクリックすると､列または行全体を一度に選択できます。‐ウエルの左上の小さな正方形のブロックをクリックすると､全ウェルを一度に選択できます。-Controlキーを押しながらクリックすると､任意のウェルの選択及び選択解除ができます。
2.SNPsﾌｨｰﾙド内のSNPﾘｽﾄのチェックボックスにチェックを入れると､選択したウエルにSNPが設定されます。
3.Taskを選択します｡初期設定では全て''U''です｡アルファベットをクリックして設定を適宜変更します。-m:Unknown未知ｻﾝプﾙ-m:NoTemplateControlテンプレート無しのネガティブコントロール-":Allelelホモコントロール-":Allele2ホモコントロールー図:ヘテロコントロール注記:Nは1SNPあたり必ず1ウェル以上設定してください｡3ウェル以上設定していただくことを推奨しています。注記:各アレルコントロールの設定は必須ではありません｡全て未知サンプルでもクラスタが分離すればタイピングすることができます。
4.Unknown(未知サンプル)にSampleを設定します｡設定するUnknownウエルを選択し､Samplesフィールド内のサンプルﾘｽﾄのチェックボックスにチェックを入れると､選択したウェルにSampleが設定されます。
5.Viewをクリックしてウエルの表示設定を変更することができます。
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企l幽 囮
60
ドキュメントの設定:Plate(5)プレートレイアウトの設定
(オプション)雛型ファイルの保存
同じ条件で何回も繰り返し実験を行う場合､雛型ファイルを作成しておくことができます。
1.SaveよりSaveAsを選択します。
2.保存先の指定の画面が表示されます。
3.保存先を指定し､FileNameを入力して､Saveをクリックすると保存されます。注記:C:ドライブへの保存は避け､D:ドライブに保存を行ってください。
4.入力が完了したら､Nextをクリックします。
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注意:雛型ファイルから新規実験系ファイルを作成するときは､HomeページCreateNewExperimentのプルダウンメニューからTemplateを選択し､雛型ファイルを選択してOpenをクリックします。
準｡■劫■函画産椥●紋閥”●又酎肺…
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ランの開始:Run
次にPIate画面が表示されます。
,本体ﾀｯﾁパﾈﾙ右上の画を押してｻﾝプﾙブﾛｯｸを出します。
2プﾚｰﾄをブﾛｯｸに載せ回を押してｻﾝプﾙブﾛｯｸを収納します。
3.ソフトウェア画面の右上STRTRUNをクリックし､プルダウンメニューでシリアルナンバーを選択すると
Save画面が表示されます。
4任意のファイル名を入力し､Saveをクリックするとランが開始します。
5.ラン中に増幅曲線を確認することができます。
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重要： ランニング中のデータをソフトウエアから確認することはできませんが､本体タッチパネル上で残り時間、PCRサイクル詳細､増幅曲線を確認することができます。
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反応プレートの準備
推奨の消耗品とその組み合わせは下記の通りです。
ベース(サンプル調整時のみ使用）
ブロックタイプ プレート･チューブ シール･キャップ トレー･リテーナー
MicroAmpOptical384-WellReactionPlate
商品番号:4309849
MicroAmpOpticalAdhesiveFilm
商品番号:4311971
384ウェル
MicroAmpOptical96-WelIReactionPlate
商品番号:N8010560
MicroAmpOpticalAdhesiveFilm
商品番号:4311971
MicroAmpOptical96-WellReactionPIate
商品番号:N8010560Standard96
ウェル MicroAmpOptical
8-CapStrip商品番号:4323032(FIatタイプ）
MicroAmpOptical
8-TubeStrip(02mL)商品番号:4316567
MicroAmp96-Well
Tray/Retainerset
(BIue)商品番号:4381850
MicroAmpOptical
TubewithoutCap(0.2mL)商品番号:N8010933 MicroAmp96-Well
SupportBase商品番号:4379590MicroAmpFast96-Well
ReactionPlate
商品番号:4346907
MicroAmpOpticaiAdhesiveFilm
商品番号:4311971
MicroAmpFast96-WellReactionPIate
商品番号14346907MicroAmpOptical
8-CapStrip
商品番号:4323032(Flatタイプ）
Fast96ウエル
MicroAmpFast
8-TubeStrip(01mL)商品番号:4358293 MicroAmp96-Well
Tray(Black)商品番号:4379983MicroAmpFastReaction
TubewithCap(0.1mL)商品番号:4358297
重要:反応系調製用の消耗品を取り扱う際には必ずパウダーフリーの手袋を装着してください。
警告！ ：チューブにセットするキャップは必ずフラットタイプのものをご利用ください｡ドーム型のキャップを用いるとヒートカバーが損傷します。△
重要:反応するプレートやチューブ等にマジックでラベルをしないでください｡マジックの中には蛍光物質が含まれているため､データに悪影響を及ぼします。
重要:プレートの底を汚さないように注意してください｡プレートの底に液体や他の汚染物がつくと、サンプルブロックを汚染し､異常に高いバックグウンド信号が検出されてしまう可能性があります。
63
プレートのシール方法
1.プレートに反応試薬を適宜分注します。注記:96ウエルプレート･Fast96ウエルプレートをご利用の場合､ベースの上にプレートを乗せて作業を行ってください。
2.OpticaIAdhesiveFilmを1枚取り出し､両端を上向きに折り曲げます｡フィルムの保護面を上側に向けます。
3.白色の保護フィルムをすばやくシール面から剥がします｡シール面には触れないでください。
4.フイルムの両端を持ち､フィルムを反応プレートの方に向けて降ろし
ます(接着面が反応プレートに面するように)。フィルムが反応プレート中の全ウェルを完全に覆っていることを確認します。
5.上から圧力をかけながらアプリケータを縦横にゆっくり動かして､反応プレート全体にフィルムとプレートが密着するようにします。
6.アプリケータを使ってフィルムの端を押さえながら､他方の端を持っ
てすばやく引っ張り､フィルムのタブを取り外します｡反対側についても同じようにします。
フイルムのタブは綺麗に取り除いてください｡タブが残っているとプレートがヒートカバーにくっついてしまう原因になります。
7.蒸発が生じないよう完全に密着させるために､ステップ5を繰り返します。
8.アプリケータの端をフィルムの外側の縁に沿ってしっかり圧力をか
けながらなぞってフィルムを密着させます。注記:OpticaIAdhesiveFilmは､接触しただけで密着するものではありません｡蒸発が生じないよう完全に密着させるためには､圧力をかけることが必要です。
9反応プレートを点検し､全てのウェルがシールされていることを確認
します｡フィルム表面上に全ウェルの縁がはっきりと映っていなけ
ればなりません。 ラン後に装置にプレートが付着しないよう皇フィル
いることを確認します。
重要:フィルムを適用する際､光学接着カバーの接着剤が､プレートの
縁に付着することがあります。OpticaIAdhesiveFilmの外周から､余剰の接着剤をすべて拭き取ります｡余剰な接着剤を拭
き取らないと機器本体のサンプルブロックに付着することがあります。
10.プレートの底からみて､反応液がプレートの各ウェルの底に集まっ
ていることを確認してください｡ウェルの底に集まっていないものが1つでもあれば､プレートを遠心してください。
64
プキャッ る
96ウエルプレートにキャップを使用する場合以下のように組み合わせて使用します。
MicroAmpOptical8-CapStrip(Flatタイプ）
MicroAmpOptical96-WeIIReactionPlate/
MicroAmpFast96-WellReactionPIate
Mic1℃Amp96-WellSupportBase
重要:機器にセットする前にMicroAmp96-WellSupportBaseから取り外してください。
Standard96ウエルブロツクでチューブ及びキャップを使用する場合以下のように組み合わせて使用します。
電瞬 全篁MicroAmpOptical8-CapStrip(Flatタイプ）
MicroAmpOpticai96-WellTraylRetainerSet:Retainer
MicroAmpOptical8=TubeStrip/
MicroAmpOpticalTubewithoutCap
MicroAmpOptical96-WellTray/RetainerSet :Tray
MicroAmp96-WelISupportBase
重要:機器にセットする前にMicroAmp96-WellSupportBaseから取り外してください。
65
キャップを使用する方法
Fast96ウエルブロツクでチューブ及びキャップを使用する場合
以下のように組み合わせて使用します。
8連チューブとキャップ
MicroAmpOptical8-CapStrip(FIatタイプ）
MicroAmpFast8-TubeStrip
MicroAmp96-WeiITray
MicroAmp96-WeIISupportBase
キャップ付きチューブ
MicroAmpFastReactionTubewithCap
MicroAmp96-WellTray
MicroAmp96-WellSupportBase
重要:機器にセットする前にMicroAmp96-WellSupportBaseから取り外してください。
66
ランの終了
ランが終了すると、自動解析が行われ､Results画面のAmplificationPlotsが表示されます。
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1回
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･猫樋･画･薗猶緯鞘撹･艀筆職些馬醤．
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プレートの取り出し
1本体ﾀｯﾁパネル右上の回をﾀｯﾁしてサンプルプﾛｯｸを出します。
2.プレートを取り出します。
警告1怪我の危険:装置のラン中､プレートは105･Cまで加熱されています｡プレートは室温になるまで待ってから取り出してください。
3再度本体ﾀｯﾁパﾈﾙ右上の画をﾀｯﾁしてｻﾝプﾙブﾛｯｸを収納します。
(オプション)機器本体のシャットダウン
連続して実験を行わない場合は､ラン終了時に機器本体の電源を切っていただくことができます。
データ解析はソフトウェア単独で行うことができます。
67
イヒング結果の検冒
1.Results画面のプルダウンメニューからAllelicDiscriminationPlotsを選択します。
2.ShowPlots｡剛ngs回をｸﾘｯｸし震す。3.SNPAssayを適宜選択します｡選択されたSNPのプロットが表示されます。
4.各クラスターの分離を確認します。
●（赤) :アレル1(VICプローブ）●（青):アレル2(FAMプローブ）鰯(緑):ヘテロ× ：ﾀｲピﾝゲ不可■ :NegativeContml
G):…壁
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PrcpertiGB Me山@d PIatE Run : ReBults ・唾port知■■■■■■■■■■
タイピング結果の検証：
任意のウエルのコール結果を手動で変更することができます。
5.Al lelicDiscriminationPIot画面上で､変更したいプロットをマウスのポインタで囲うようにドラッグして
選択します｡選択されるとプロットがハイライト表示されます。
6.ShowPIotSetings回をｸﾘｯｸします。7.ApplyCallのプルダウンメニューから､該当する遺伝子型を選択します。選択したコールタイプの色に切り替わります。
h q■■■■】■■’■■＝＝－
Pmpenies MethOd PIate Run 5 Results ・apo（軸■■■■■■■■口■
Results
A陛陸Discrm壷塁t…V
画鋤PAIieIicDiscriminationpIot
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鯉柾設定変更上Ana…皇画面由I■■■■ 直乎 84 ｿ
回ｱｲｺﾝをｸﾘｯｸすAnalysisメニューからAnalysissettingを選択､もしくはAnalyzeボタン横のるとAnalysisSettingが表示されます。
1.AnalysisSettings画面でCalISettingsタブを選択します。
2.DataAnalysisSettingsでは､コールに用いるデータを設定することができます。-AnalyzeDatafromPost-PCRReadOnlyPCR増幅反応後に回収した蛍光データのみを用いてデータ解析を行います。
-AnalyzeDatafromPre-PCRReadandPost-PCRRead(初期設定）PCR増幅反応前のデータを差し引いたデータを用いてデータ解析を行います。
-AnalyzeReal-TimeRnData
AmplincationPlotの各サイクル毎のRn値を用いてデータ解析を行います｡データ解析に用いるサイクル数は任意で設定できます。
-AnalyzeReal-TimeRn-Median(RnatoRnb)AmplincationPlotの各サイクル毎のRn値の､設定したサイクル数の範囲内の平均値を用いてデータ解析を行います｡データ解析に用いるサイクル数は任意で設定できます。
-AnalyzeReal-TimedRnData
AmplincationPlotの各サイクル毎のdRn値を用いてデータ解析を行います｡データ解析に用いるサイクル数は任意で設定できます。
3.DefaultCallSettingsでは初期解析設定を任意の条件に設定することができます。
4.SelectaSNPAssayでは､各SNPAssay毎に解析設定をAutoまたはManualに変更することができます。
a.設定変更するSNPAssayをクリックしてハイライト表示します。b.画面右側CallSettingsfOr[SNPAssayName]で､チェックボックスを適宜設定します｡全てのチェックをはずすと､Manual解析設定になります。
5.画面下のApplyをクリックし､Analyzeをクリックすると設定に基づく再解析が行われます。
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AnalysisSettingsでAnalyzeReal-TimeRnもしくはdRnを選択すると､各サンプルのサイクル毎の軌跡を表示することが可能になります。
同をｸﾘｯｸします。6.AllelicDiscriminationPlot画面で､showplotsettings
7.RevealTracesにチェックを入れると､軌跡が表示されます。
8.ShowCycleのバーをマウスで横方向にドラッグすることで､各サイクル毎のプロットが表示されるので､各クラスターが最も分離しているポイントを選択することができます。
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71
Results
Analyzeを行った後に､プレートレイアウト画面のウェル上にフラグ(黄色の三角マーク)が表示されることがあります｡フラグは表示されたウェルに何かしらの問題がある可能性を示しています。フラグ内の数字は確認された問題の数を示します。
QCSummary画面ではフラグの具体的な内容､及びその対策方法を確認することができます。
1.Results画面で､プルダウンメニューからQCSummaryを選択します。
2.テーブル内の｢Frequency｣および｢Wells｣カラムを調べ､問題の内容とウエル数､およびウエルの位置を確認します。
3.各フラグの行をクリックすると､下段にそのフラグの詳細が表示されます。
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Results
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Genotyping実験では､実験データの状況により下記のフラグが表示されます。
フラグ
BADROX
OFFSCALE
NOSIGNAL
PCFAIL
SMCLUSTER
AMPNC
DRNMIN
NOAMP
NOISE
SPIKE
EXPFAIL
BLFAIL
THOLDFAIL
CTFAIL
内容
パッシブリファレンス値に異常あり
蛍光値がオフスケール
蛍光値が検出されない
ポジティブコントロール不良
クラスタにタイピングされたサンプル数が少ない
ネガティブコントロールで増幅
ARn値が低い（増幅が弱い）
増幅なし
他のウェルと比較してノイズが高い
スパイクノイズ有り
指数関数的増幅領域が確認されない
ベースライン自動設定時に問題確認
Threshold自動設定時に問題確認
CT値自動算出時に問題確認
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サンプルの削除
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任意のウェルを解析対象外に指定することができます。
1プレートレイアウト面上で､解析対象から外すウェルを選択します。
2.そのまま右クリックするとメニューが表示されるので､Omitを選択します。
3解析対象外に指定されたウェルの左上に赤い×マークが表示されます。
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SaveAs
PrintPreview
Print...
4.Analyzeをクリックすると､削除指定したウエルのデータを除外した解析が行われます。注記:Omit作業を行った後は､必ずAnalyzeをクリックして再解析してください。
5.解析対象に戻すときは、ウェルを選択して右クリックメニューからincludeを選択します。
73
Omit
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,全ての解析が終了したら､目 を押してResultsTableを表示します。
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各ウエルの詳細の情報が横一列に表示されます。
aViewプルダウンメニューから､ResultsTableに表示する項目を設定することができます。
b.Groupbyプルダウンメニューから､ターゲット毎､サンプル毎等にグループ表示することができます。C.表の各タイトルカラムをクリックするとソートすることができます。
2.データを確認したらNextをクリックします
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データ出力:数値データ
次にExport画面が表示されます。
1.FileTypeプルダウンメニューから、QuantStudio形式およびファイル形式､もしくはRDML形式を選択します。
2.出力するデータの種類を､Contentから選択します。
最終的な定量結果のみを出力したい場合は､Resultsタブにチェックが入った状態にしてください。
3.出力するデータを個別のファイルで出力するか､1つのファイルで出力するか選択できます。
4Browseをクリックし､データの出力先を指定します。
5.Exportをクリックするとデータが出力されます。
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AmplincationPIotなどのグラフを画像ファイルとして出力することができます。
JPEG等の画像ファイルへの出力
,出力したいグﾗﾌ上で右ｸﾘｯｸ>SaveAsを選択､もしくは同ｱｲｺﾝをｸﾘｯｸし議す。2．出力したファイルの保存先の指定画面が表示されるので､画像ファイルの保存形式を選択し､任意の場所を指定して保存します。
データト
定量結果やグラフを印刷することができます。
グラフの印刷
咄力したいグﾗﾌ上で右ｸﾘｯｸ>Printを選択もしくは圓ｱｲｺﾝをｸﾘｯｸします。2．プリンター選択の画面が表示されますので､任意のプリンターを選択し､印刷します。
定量結果の印刷
1.FileメニューからPrintRepo代を選択します。
2.出力するデータ及びグラフにチェックを入れます。
3.PrintReportをクリックすると､プリンター選択の画面が表示されますので､任意のプリンターを選択し､印刷します。
注記：プリンター選択画面でCutePDFWriterを選択すると､PDFファイルを作成することができます。この場合はPrintをクリックした後ファイルの保存先指定画面が表示されるので､任意の場所を選択して
保存します。
76
■アプリケーションサポートについて
テクニカルサポート
TEL:0120-477-392
(受付時間：月曜日～金曜日9:00～18:00祝日除く）
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■修理・メンテナンスなどのアフターサービスについて
修理、点検整備、キヤリブレーションサービス、バリデーション、移設などについてはこちらまでお問い合わせください。
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(受付時間：月曜日～金曜日9:00～12:00, 13:00～17:30祝日除く）
研究用にのみ使用できます｡診断目的およびその手続上での使用はできません。
肥戦の社名および製品名は､弊社または各社の商概または登録商標です。
欄準販売条件はこちらをご覧ください．www､thermofisheKcom/｢C
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AIItrademarksarethepmpeftyofThermoFishe｢壁ientificandhssu酷jdiariesun胞霊◎the『wisespecm函．
TaqManisarEgistef色dtrademarkofRocheMolecularSystems, Inc.
MicrDsoftandWindowsarerBgisteedtrademarksofMicIDsoftCorporation、Pnnt“inJapan,01/2016.PartNumberA29331JPRev,B
サーモフィッシャーサイエンティフィック
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テクニカルサポート函｡0120-477-392"jptech@thermofisheKcom
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