¿que es espectrometría de masas
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INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA, UNAM
MÉTODOS EN BIOQUÍMICA
SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNASPOR ESPECTROMETRÍA DE
MASAS
Ayala Bretón Camilode Regil Hernández Rubén
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Cuernavaca, Morelos 8 de Junio del 2004
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ÍNDICESecuenciación de proteínas por Espectrometría de Masas.......................................................5I. Espectrometría de masas.......................................................................................................5
1. Fundamentos.....................................................................................................................51.1. Historia de la Espectrometría de Masas....................................................................5
1.1.1. Las raíces en la física..........................................................................................61.1.2. La ramificación hacia la Química.......................................................................71.1.3. Incursionando en la biología...............................................................................81.1.3. Antecedentes......................................................................................................9
1.2. Grupos Funcionales.................................................................................................121.3 Métodos de Ionización..............................................................................................14
1.3.1 Ionización electrónica (EI)................................................................................141.3.2 Bombardeo Rápido de Atomos (FAB) y Espectrometría de Masas de IonLíquido Secundario (LSI) ..........................................................................................161.3.3. Ionización por Electrospray..............................................................................17
1.4. Métodos de Análisis................................................................................................221.4.1. Análisis de Doble Sector..................................................................................221.4.2. Espectrometría de Masas de Tiempo de Vuelo (TOF) ....................................231.4.3. Analizador de Masas de Cuadrupolos .............................................................251.4.4. Transformada de Fourier de Resonancia Ion Ciclotrón (FTICR) ..................271.4.5. Análisis en Trampa Iónica ..............................................................................281.4.6. Espectrometria de Masas en Tándem...............................................................291.4.7. PSD MALDI..................................................................................................34
II. Secuenciación de proteínas por espectrometría de masas..................................................362. Determinación de la estructura y de la secuencia por espectrometría de masas............37
2.1. Fragmentación.........................................................................................................382.1.1. Influencia de la posición y deslocalización de la carga ...................................41
2.2. Identificación y secuenciación de péptidos ............................................................422.3. Correlacionando información MS/MS de la secuencia en la base de datos............472.4. Correlación de la información de m/z del péptido con secuencias conocidas.........492.5. Cuantificación de péptidos .....................................................................................49
2.5.1. Cálculo de Masa Molecular..............................................................................502.5.2. Bases de Datos de Secuencias..........................................................................512.5.3. Consideraciones sobre la Base de Datos..........................................................512.5.4.Esquemas de Puntaje.........................................................................................52
2.6 .Caracterización de proteínas con técnicas combinadas...........................................522.6.1. Identificación de proteínas en mezclas por “Shotgun”.....................................522.6.2. Interacciones proteína – proteína y complejos de proteína..............................53
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2.6.3. Detección de mutaciones..................................................................................542.6.4. Detección de variantes a través de la medición de la masa de la proteína intactacon ESIMS................................................................................................................552.6.5. Identificación de proteínas separadas electroforéticamente.............................562.6.6. Secuenciación de proteínas en geles de poliacrilamida teñidos por plata........592.6.7. Elucidación de estructura secundaria de proteínas por ionización enelectrospray.................................................................................................................592.6.8. Localización de puentes disulfuro en proteínas................................................612.6.9. Detección y verificación de la secuencia de péptidos con puentes disulfuro porFABMS y MS/MS......................................................................................................622.6.10. Localización de puentes disulfuro en pequeñas proteínas ricas en cisteína.. .632.6.11. Secuenciación en escalera de proteínas .........................................................642.6.12. Proteínas y péptidos hidrofóbicos analizados por MALDI............................662.6.13. Análisis de Glicoproteínas y Glicopéptidos utilizando Bombardeo Rápido deÁtomos (FAB)............................................................................................................66
Bibliografia.........................................................................................................................69
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Secuenciación de proteínas por Espectrometría de Masas
I. Espectrometría de masas
1. Fundamentos
¿Qué es la Espectrometría de Masas?
La espectrometría de masas (MS) es una herramienta espectroscópica analítica enfocadaprincipalmente a la separación de especies moleculares y atómicas de acuerdo a su masa. Laespectrometría de masas puede ser usada para el análisis de muchos tipos de muestras, desdeunidades elementales hasta grandes proteínas y polímeros.
¿Qué nos puede decir la Espectrometría de Masas?
• Una medición precisa de masa puede ser usada para comprobar/validar fórmulasempíricas.
• La fragmentación, que muchas veces resulta en sitios específicos o en gruposparticulares puede ser usada para identificar muestras por cotejo con bases de datosde fragmentos.
• La fragmentación controlada puede ser usada para la elucidación de compuestosnovedosos.
• La observación de picos comunes en un espectro puede proporcionar informaciónútil respecto a grupos funcionales.
• La abundancia relativa de isótopos es usada para obtener información de loselementos que forman un compuesto.
• Las mezclas complejas pueden ser analizadas mediante combinaciones de técnicascomo Cromatografía de GasesEspectrometría de Masas o HPLCEspectrometría deMasa y evitando, en consecuencia, las largas tareas de purificación de muestras.
1.1. Historia de la Espectrometría de Masas
La espectrometría de masas (MS) tiene una historia marcada con premios Nobel y unatecnología continuamente en avance que ha aportado importantes vías en el descubrimiento
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de drogas, caracterización de proteínas e incluso en diagnóstico de enfermedades. Lahistoria de la ciencia muestra claramente que la Espectrometría de Masas (MS) tiene susraíces en la física, ramificándose a la química y en las últimas dos décadas ha incursionadoen la biología.
1.1.1. Las raíces en la física
La historia de la MS comienza con Don Joseph John Thompson en los laboratoriosCavendish de la Universidad de Cambridge. El trabajo de Thompson “Estudios teóricos yexperimentales sobre la conducción de electricidad por gases” llevó al descubrimiento delelectrón en 1897, por el cual le fue otorgado el Premio Nobel en Física a Thompson en1906. En la primera década del siglo veinte, Thompson construyó el primer espectrómetrode masas (llamado entonces Espectrógrafo de parábola), en el cual los iones eran separadospor sus distintas trayectorias parabólicas en campos electromagnéticos y la detección eraregistrada por los choques de los iones en una pantalla fluorescente o en una placafotográfica.
Figura 1. J.J. Thomson y el tubo de rayos catódicos usado para realizar unas de las primeras mediciones de larelación carga/masa. La deflección del electrón se observaba una vez que se encendía el campo eléctrico.
En los años siguientes a la Primera Guerra Mundial, el asociado de Thompson en laUniversidad de Cambridge, Francis W. Aston (Premio Nobel en Química en 1922), diseñóun espectrómetro de masas que mejoró la resolución en un orden de magnitud, permitiendoa Aston estudiar isótopos. En ese mismo período, A. J. Dempster de la Universidad deChicago también mejoró la resolución con un analizador magnético y desarrolló la primerafuente de impacto electrónico, la cual ioniza moléculas volatilizadas con un rayo deelectrones. Las fuentes de impacto electrónico son todavía ampliamente usadas enespectrómetros de masas modernos para análisis de moléculas pequeñas.
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Thompson, Aston y Dempster sentaron una sólida base para la teoría de laEspectrometría de Masas y el diseño instrumental, haciendo posible, para aquellos quesiguieron, desarrollar instrumentos capaces de reunir las demandas de los químicos ybiólogos. La tarea de crear tales instrumentos, sin embargo, requirió de seis décadas deesfuerzo.
1.1.2. La ramificación hacia la Química
Uno de las áreas a la que se le ha dedicado esfuerzo, particularmente para los químicos,ha sido crear un instrumento con suficiente precisión para el análisis tanto de elementoscomo de pequeñas moléculas orgánicas. La respuesta a este problema vendría en cuatrodiferentes formas: Los Sectores magnéticos de doble enfoque, el análisis por Tiempo deVuelo (TOF), el filtro Cuadrupolo y los analizadores de masa por Transformada de Fourierde Resonancia IonCiclotrón (FTICR). Alfred O.C. Nier en la Universidad de Minnesotadesarrolló el equipo de alta resolución de masas de doble enfoque durante la SegundaGuerra Mundial para realizar análisis isotópicos y separar 235U de 238U. De hecho, la primerabomba atómica fue desarrollada completamente del Uranio separado por este tipo deespectrómetro de masas.
William E. Stephens de la Universidad de Pennsylvania propuso el concepto de TOF MSen 1946. En un analizador por TOF, los iones son separados en base a las diferencias en susvelocidades a medida que se mueven en una trayectoria recta hacia un colector. TOF MS esrápida, con una alta resolución y alta precisión, y aplicable para la detección cromatográfica.Es usada para la determinación de masa de grandes biomoléculas ya que virtualmente notiene límite en el rango de masa a analizar.
A mediados de la década de 1950 fue reportado por primera vez por Wolfgang Paul de laUniversidad de Bonn, que el filtro de masas Cuadrupolo era ideal para el acoplamiento conGC (Cromatografía de Gases) y, más recientemente, LC (Cromatografía de Líquidos). Eneste equipo, un campo eléctrico cuadrupolar (conformado por radiofrecuencias ycomponentes de corriente directa) fue usado para separar iones. Años mas tarde, Paul,recibió de manera compartida el Premio Nobel en Física por su trabajo en la trampa deiones.
Aunque los espectrómetros de masas de cuadrupolos no eran tan precisos como losequipos de doble sector magnético, ofrecían un rango dinámico excelente, eran muy estables
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y fueron rápidamente aplicados a los experimentos de Espectrometría de Masas en Tándem(MS/MS). Estas características hicieron de los Espectrómetros de Masas de cuadrupolosequipos muy populares para el análisis cuantitativo y para aplicación de descubrimiento defármacos.
Para el problema de la alta resolución y gran precisión, la espectrometría de masas deResonancia Ion Ciclotrón (ICR/MS) ha sido la técnica más exitosa para el análisis de masas.Descrita inicialmente por J.A. Hipple y colegas, el ICR opera mediante someter a los iones auna radiofrecuencia, un campo eléctrico y un campo magnético uniforme simultáneamente,lo que causa que los iones sigan una trayectoria espiral en una cámara. Haciendo un barridoen la radiofrecuencia o en el campo magnético, los investigadores pudieron detectar ionessecuencialmente. En 1974, Melvin B. Comisarow y Alan G. Marshall de la Universidad deBritish Columbia revolucionaron el ICR desarrollando la Transformada de Fourier ICR/MS(FTICR/MS). La mayor ventaja de la FTICR/MS fue que permitió medir muchos iones almismo tiempo, y ahora es común lograr una precisión de subppm (sub partes por millón)con los equipos comerciales.
Todos estos diseños de analizadores de masas, e inclusive combinaciones de diferentestécnicas para la MS en Tándem, son usados todavía y están desarrollándose para nuevasaplicaciones.
1.1.3. Incursionando en la biología
A pesar de los avances en la precisión en la medición de masas, el rango de masa quepodía ser analizado, el análisis cuantitativo y la habilidad de acoplar los equipos a lacromatografía, en la década de 1980, la MS todavía carecía de eficacia para el análisis debiomoléculas grandes y pequeñas. Una deficiente descomposición molecular ofragmentación durante la vaporización/ionización y una pobre sensibilidad eranproblemáticos. La aplicación de una “ionización suave” como la de Ionización porElectrospray (ESI) y la Desorción/Ionización por Láser Asistida en Matriz (MALDI)permitió a la MS evolucionar hacia las áreas de la biología.
En la ESI/MS, unas finas gotas eléctricamente cargadas son dispersadas a la salida de uncapilar por un campo eléctrico y después evaporadas. Los iones resultantes eran dirigidoshacia la entrada del espectrómetro. Aunque el profesor de química Malcolm Dole de laUniversidad de Northwestern concibió primero la técnica en los años 60s, no fue sino hasta
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principios de los años 80 que John B. Fenn de la Universidad de Yale lo puso en prácticapara el análisis de biomoléculas. Koichi Tanaka y colaboradores de la compañía Shimadxu,reportaron inicialmente la técnica MALDI/MS, la cual fue desarrollada también por FranzHillenkamp y Michael Karas en la Universidad de Frankfurt. En MALDI las moléculas delanalito son desorbidas por acción de un rayo láser, de una matriz sólida o líquida queabsorbe rayos UV.
Por su trabajo en el desarrollo de las técnicas de ionización suave las cuales sonadecuadas para el análisis de grandes biomoléculas, Fenn y Tanaka compartieron el PremioNobel en Química en 2002. ESI y MALDI han hecho que la MS sea cada vez más útil paraexperimentos biológicos sofisticados como el secuenciamiento y análisis de péptidos yproteínas utilizando las técnicas desarrolladas por Klaus Biemann del MassachussettsInstitute of Technology, estudios de complejos no covalentes y moléculas inmunológicas,secuenciación de DNA y el análisis de virus intactos.
1.1.3. AntecedentesEl espectrómetro de masas
Los elementos que componen un espectrómetro de masas son los siguientes:
Un sistema de inyecciónUna fuente de iones
Un analizador de masaUn detector
Las muestras pueden ser introducidas directamente a la fuente de iones del espectrómetro enuna sonda, o en el caso de mezclas, por un sistema intermediario (ej. Cromatógrafo deGases, Cromatógrafo de Líquidos, Electroforesis capilar, etc.). Una vez que la muestra seencuentra en la fuente de iones, las moléculas de la muestra se someten a ionización; paraello la sustancia es bombardeada con un rayo de electrones que tienen suficiente energíapara romper la molécula. Los fragmentos positivos que se producen (cationes y cationesradicales) se aceleran en vacío a través de un campo magnético y son distribuídos en base asu relación carga/masa (m/z). Dado que la mayor parte de los iones producidos en elespectrómetro de masas conllevan una carga positiva, el valor de la relación m/z esequivalente al peso molecular del fragmento. El análisis de la información del espectro demasas requiere reagrupar teóricamente los fragmentos para reconstruir la molécula original.Un esquema de un espectrómetro de masas se muestra a continuación:
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Figura 2. Esquema general del mecanismo de desviación de iones de fragmentos mediante un imán en unespectrómetro de masas.
Sólo una pequeña cantidad de moléculas de la muestra se hacen pasar a la cámara deionización (que se encuentra a alto vacío) las cuales son bombardeadas por un haz deelectrones de alta energía. Las moléculas se fragmentan y los cationes que se producen seaceleran y se dirigen hacia un analizador. La trayectoria de las moléculas cargadas esdesviada por un campo magnético aplicado. Los iones que tienen una menor masa (menormomentum) serán desviados más fácilmente provocando que choquen contra las paredes delanalizador. De la misma manera, los iones con alto momentum no serán desviadossuficientemente para seguir la trayectoria curva que el campo magnético genera y tambiénchocarán con la pared del analizador. Los iones con una relación m/z adecuada no serándesviados y seguirán la trayectoria del analizador, saldrán por la ranura de salida yfinalmente chocarán con el colector. Esto genera una corriente eléctrica, la cual esamplificada y detectada. Variando la fuerza del campo magnético, se puede controlar losiones que pasarán al colector.
La información que arroja el espectrómetro de masas es una gráfica de intensidad relativavs. la relación carga/masa. El pico más intenso en el espectro se llama “pico base” y todoslos demás se reportan en relación a la intensidad de este. Los picos son extremadamentedelgados y comúnmente aparecen como líneas verticales.
El proceso de fragmentación ocurre siguiendo principios químicos simples y predecibles.Los iones que se forman representan los cationes y cationesradicales más estables que lamolécula puede formar. El pico de mayor peso en el espectro representa generalmente lamolécula “padre” menos un electrón y se le llama “Ion molecular (M+)” Comúnmente, los
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picos pequeños aparecen por arriba de los pesos moleculares calculados debido a laabundancia natural de los isótopos 13C, 2H, etc. Muchas moléculas con protones muy lábilesno producen iones moleculares; un ejemplo de esto son los alcoholes, en los cuales el picode mayor peso molecular ocurre a una relación carga/masa uno menos el ion molecular (m1). Los fragmentos pueden ser identificados por su relación carga/masa, pero es más útilidentificarlos por su masa la cual ha disminuído por los grupos que se les han separado en lafragmentación. Es decir, la pérdida de un grupo metilo generará un pico de m15, la pérdidade un etilo, m29, etc.
El espectro del tolueno (metil benceno) se muestra a continuación.
Figura 3. El espectro presenta un ion molecular fuerte en m/z = 92, unos picos pequeños m+1 y m+2, unpico base en m/z = 91 y una serie de picos menores en m/z=65 y menores.
El ion molecular, nuevamente, representa la pérdida de un electrón y los picos por arriba delion molecular se deben a la abundancia de isótopos. El pico base en el tolueno es debido a lapérdida de un átomo de hidrógeno para formar el catión bencilo que es relativamenteestable. Se cree que después sufre un rearreglo para formar el catión tropilio que es muyestable, y este fuerte pico en m/z = 91 es una característica de los compuestos que contienenun grupo bencilo. El pico menor en m/z = 65 representa la pérdida de un acetileno neutro delion tropilio y los picos menores por debajo de m/z = 65 surgen como resultado de unafragmentación más compleja.
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1.2. Grupos Funcionales
Alcanos: Los alcanos suelen sufrir una fragmentación por la pérdida inicial de un grupometilo para formar especies (m15). Este carbocatión puede sufrir una fragmentaciónsubsecuente a lo largo de la cadena hidrocarbonada expulsando las unidades neutrales de doscarbonos (etilenos). Los hidrocarburos ramificados forman carbocationes secundarios yterciarios más estables, y estos picos suelen dominar el espectro de masas.
Hidrocarburos Aromáticos: La fragmentación del núcleo aromático es un tanto complejo,el cual genera una serie de picos que tienen una relación carga/masa de m/z= 77, 65, 63, etc.Aunque estos picos son difíciles de describir en términos simples, forman un perfil (el“agregado aromático”) que se aprende a reconocer con la experiencia. Si la moléculacontiene una unidad bencilo, la ruptura más importante generará el carbocatión bencilo, elcual sufre un rearreglo para formar el ion tropilio. La expulsión del acetileno (etino) generaun pico característico con una m/z = 65.
Aldehídos y Cetonas: La ruptura predominante en los aldehídos y cetonas es la pérdida deuna de las cadenas laterales para generar un ion oxonio sustituído. Esta es una rupturaextremadamente favorable y este ion generalmente representa el pico base en el espectro. Elderivado metilo (CH3C O+) comúnmente se le llama el “ion acilo”
Otro tipo de fragmentación común que se observa en los compuestos carbonilo (y ennitrilos, etc.) consiste en la expulsión del etileno neutral en un proceso llamado el RearregloMcLafferty, que sigue el mecanismo general mostrado a continuación:
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Esteres, Acidos y Amidas: De la misma manera que con los aldehídos y cetonas, la rupturaprincipal observada en estos compuestos es la expulsión del grupo “X”, como se muestraabajo, para formar el ion sustituído oxonio. Para ácidos carboxílicos y amidas no sustituídas,los picos característicos en m/z = 45 y 44 también se pueden apreciar en el espectro.
Alcoholes: Además de perder un protón y un radical hidroxilo, los alcoholes tienden aperder uno de los grupos (o hidrógenos) para formar iones oxonio. Para los alcoholesprimarios, esto genera un pico en m/z = 31; en alcoholes secundarios se generan los picos enm/z = 45, 59, 73, etc. de acuerdo a la sustitución.
Eteres: Siguiendo el comportamiento de los alcoholes, los éteres se fragmentangeneralmente por la pérdida de un radical alquilo para formar el ion oxonio sustituído, comose muestra para el dietil éter.
Haluros: Los haluros orgánicos se fragmentan con la simple expulsión del halógeno. Losiones moleculares de los compuestos que contienen cloro y bromo generan múltiples picosdebido al hecho que cada uno de ellos existe como dos isótopos relativamente abundantes.Así, para cloro, la relación 35Cl/37Cl es aproximadamente 3.08:1 y para el bromo la relación79Br/81Br es aproximadamente 1.02:1. El ion molecular de un compuesto que contiene clorotendrá dos picos con una diferencia de dos unidades de masa, en una proporción aproximada
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3:1, y un compuesto que contiene bromo tendrá dos picos igualmente con una diferencia enmasa de 2 unidades con intensidades muy similares.
Figura 4. Fragmentos comunes en los espectros de masa.
1.3 Métodos de Ionización
1.3.1 Ionización electrónica (EI)
Teoría
Los electrones son producidos por emisión termiónica desde un filamento de tungsteno orenio. Una corriente típica de un filamento es del orden de 1x104 amperios. Estos electronessalen desde la superficie del filamento y son acelerados hacia la cámara fuente de iones lacual es mantenida a una potencial positivo (igual al voltaje de aceleración) Los electronesadquieren una energía igual al voltaje entre el filamento y la cámara fuente (típicamente 70electrovoltios, eV). La trampa de electrones se mantiene a un potencial fijo positivo conrespecto a la cámara fuente. Una porción del haz de electrones golpeará la trampa deelectrones produciendo la corriente de la trampa. Esta es usada como un circuito deretroalimentación para estabilizar el haz de electrones.
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Figura 5. Esquema de una fuente de Ionización Electrónica.
Un imán permanente se coloca a lo largo de la cámara fuente para producir un flujomagnético paralelo al haz de electrones. Esto causa que el haz de electrones tome unadirección de espiral desde el filamento hasta la trampa, aumentando la probabilidad y laeficiencia para ionizar el analito. Las moléculas de analitos gaseosos son introducidas en lavía del haz de electrones en donde son ionizados por interacciones electrónicas con el haz deelectrones. La ionización puede realizarse también por impacto directo de un electrón conuna molécula de analito.
El repulsor de iones con carga positiva y la excitación negativa del voltaje actúanconjuntamente para producir un campo eléctrico en la cámara fuente tal que los ionessaldrán de la cámara a través de la ranura de salida de iones. Los iones son dirigidos pormedio de varios lentes de enfoque y centrados y son enfocados hacia la ranura de salida dela cámara. Es entonces cuando los iones pueden ser analizados por su masa.
Mecanismos de formación de iones.
Considérese la ionización del analito AB:
1. AB + e* > A+ + B + e 2. AB + e* > A+ + B° + 2e 3. AB + e* > [AB+°*] + 2e
seguido por [AB+°*] > AB+° 4. AB + e* > [AB2+*]" + 3e
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seguido por [AB2+*]" > A+ + B+ baja abundancia 5. AH + e* > AH* + e
seguido por AH* + AH > [AH+H]+ + A 'autoionización química' Notas:
Especies con un superíndice * se encuentran en estados de alta energía. Especies con un superíndice son radicales. Especies con un superíndice " son intermediarios de vida corta que no pueden servistos en el espectro.1 y 2 son procesos con alta probabilidad de ocurrencia debido a la alta abundancia delas especies y se denominan fragmentación instantánea. Esta es la razón por la que laIonización Electrónica es considerada un proceso de ionización dura.3 tiene una probabilidad moderada de ocurrir debido a la relativa abundancia de susespecies y es el proceso responsable de la formación molecular del ion.Desafortunadamente el radical intermediario de alta energía [AB+°*] tiende afragmentarse (o rearreglarse) como un proceso de estabilización, esto da lugar a losfragmentos ionizados de bajo peso presentes en el espectro.4 es un proceso con baja probabilidad de ocurrir por la escasez de sus especies peroteóricamente si puede ocurrir.5 es un proceso que puede ocurrir a altas presiones (Autoionización Química), estoes especialmente problemático en la ionización de alcoholes y aminas en donde sepuede encontrar que el proceso dominante de ionización es el intercambio deprotones entre dos moléculas de analito, dando lugar a la formación del ion pseudomolecular [M+H]+.
1.3.2 Bombardeo Rápido de Atomos (FAB) y Espectrometría de Masas de IonLíquido Secundario (LSI)
Teoría
Las técnicas de FAB y LSI consisten en el bombardeo de una mezcla sólida de analito +matriz por un rápido haz de partículas. La matriz esta formada por especies pequeñasorgánicas (glicerol o alcohol 3nitrobencílico) las cuales son usadas para mantener unasuperficie homogénea “fresca” para el bombardeo, y por lo tanto, extendiendo el tiempo devida espectral y acentuando la sensibilidad. En FAB, el haz de partículas es un gas inerteneutral, comúnmente Ar o Xe, con energías de bombardeo de 4 10keV, mientras que enLSI, el haz de partículas es un ion, típicamente CS+, con energías de bombardeo de 2 – 30KeV.
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El haz de partículas incide en la superficie del analito en donde transfiere mucha de suenergía a los alrededores, generando colisiones e interferencias momentáneamente. Algunoscompuestos son expulsados fuera de la superficie en forma de cationes y aniones en esteproceso, y estos iones secundarios liberados son luego extraídos de la fuente y analizadospor un espectrómetro de masas. La polaridad de la fuente de extracción puede ser cambiadadependiendo que compuesto se esta analizando.
Figura 6. Esquema de una fuente Rápida de Bombardeo Atómico (FAB).
La figura 6 muestra un esquema que representa una fuente Rápida de Bombardeo Atómicooperando en modo de ion positivo. El rápido haz atómico incide en la superficie del analito+ matriz en donde produce una liberación de iones secundarios. Los iones positivos sonextraídos de la fuente hacia el espectrómetro de masas.
Las técnicas FAB y LSI son comparativamente técnicas de ionización suave, y por lo tantoson adecuadas para compuestos da baja volatilidad, que producen típicamente grandes picospara las especias iónicas pseudo moleculares [M+H]+ and [MH], conjuntamente confragmentos iónicos estructuralmente significativos y algunos agregados iónicos de mayorpeso molecular y dímeros.
1.3.3. Ionización por Electrospray
Teoría
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La producción de iones por evaporación de gotas cargadas eléctricamente obtenida medianteasperjado o burbujeo se conoce desde hace siglos, pero solo recientemente se descubrió queestos iones pueden contener más de una carga. Un modelo de la formación de iones en ESI,que contiene los temas comúnmente aceptados se describe a continuación:
Grandes gotas cargadas se producen por “nebulización neumática”; por ejemplo cuando seforza a pasar la solución del analito a través de una aguja, donde al final de ésta se aplica unpotencial; el potencial usado es suficientemente alto para dispersar la solución que sale enpequeñas finas gotas cargadas todas a la misma polaridad. El solvente se evapora,disminuyendo el volumen de la gota y aumentando la concentración de la carga en lasuperficie de la gota. Eventualmente, en el límite de Rayleigh, la repulsión culómbica superala tensión superficial de la gota y ésta explota. Esta explosión culómbica forma una serie degotas más pequeñas y menos cargadas. El proceso de disminución de volumen seguido de laexplosión se repite hasta que se logran formar iones individuales cargados del analito“puro”. Las cargas están estadísticamente distribuidas en todos los sitios de cargadisponibles del analito, dando lugar a la posible formación de múltiples iones cargados enlas condiciones correctas. Aumentar la velocidad de evaporación del analito introduciendoun flujo de gas desecante a contra corriente a los iones asperjados aumenta el grado decargado múltiple. Si se disminuye el diámetro capilar y se disminuye el flujo de la solucióndel analito, como en ionización nanospray, se producirán iones con una proporción más altade m/z (es una técnica de ionización mas suave) que los producidos por un ESI convencionaly son de mayor utilidad en el campo de bioanálisis.
Figura 7. Esquema de la distribución típica de una fuente de electrospray.
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1.3.4. Desorción/Ionización láser asistida en Matriz (MALDI)
Desorción láser
El estudio de los compuestos polares siempre ha sido un problema para laespectrometría de masas. Se demostró a principios de la década de 1960 que la radiación demuestras orgánicas de bajo peso molecular con un pulso láser de alta intensidad, produceiones que pueden ser analizados por su masa.
Desde estos primeros experimentos, la desorción láser (LD) ha sido ejecutada con un ampliorango de condiciones instrumentales y una gran variación en la calidad de los resultados. Laaplicación de LD al análisis de macromoléculas biológicas polares no volátiles,macromoléculas orgánicas y polímeros fue un paso importante en el desarrollo de LD. Sinembargo, estos experimentos revelaron tener un límite máximo para el peso molecular de 510 kDa.
El requisito primario para una Desorción Láser exitosa es que la transferencia de energía delrayo láser hacia el analito debe ocurrir en el menor tiempo posible para prevenir ladescomposición de las moléculas térmicamente lábiles del analito. El límite del pesomolecular es probablemente debido a que la energía necesaria para provocar la excitaciónresonante y la transferencia exitosa de energía es más grande que la energía de disociacióndel analito. Por lo tanto, el analito no se desorbe quedando intacto en una cantidadsignificativa dando como resultado un espectro de fragmentos de bajo peso molecularsolamente.
Otra restricción importante de la ionización LD es la corta duración del destello iónico quese produce después del pulso láser. Una consecuencia de esto es que la técnica no esadecuada para instrumentos de análisis de barrido en sector o en cuadrupolos. Esto indicaque LD es particularmente adecuada para espectrometría de masas de Tiempo de Vuelo(MS/TOF).
Desarrollo de la Desorción/Ionización asistida en Matriz (MALDI)
En 1987, se descubrió que el uso de una matriz en Desorción Láser (LD) podría liberar lalimitación restrictiva del peso molecular de la técnica. Los requisitos de la matriz son quetenga una fuerte absorbancia en la longitud de onda láser y que tenga un peso molecular
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suficientemente bajo para poder sublimarse. El analito, a baja concentración, se dispersauniforme y completamente en la matriz sólida o líquida, depositada al final de una sonda oen una placa metálica e introducida al pulso del rayo láser.
Una analito a baja concentración tiene ventajas importantes:
• La eficiencia de la transferencia de energía del láser al analito (a través de la matriz)aumenta, mientras que los problemas asociados con la disociación del analito sereducen significativamente.
• La asociación de las moléculas de analito para formar agregados de alto pesomolecular también se reduce y se cree que ciertas matrices específicas puedeninclusive acentuar la formación de iones.
Mecanismo de la Desorción Iónica
El mecanismo de la técnica MALDI no se ha comprendido totalmente, pero se cree quefunciona de la siguiente manera:
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Figura 8. Esquema de desorción por MALDI.
(i) La formación de una “Solución Sólida”. Las moléculas de analito están completamente distribuidas en toda la matriz de manera quese encuentran aisladas unas de otras. Esto es necesario para que la matriz forme una“solución sólida” homogénea (cualquier solvente líquido usado en la preparación de lasolución se retira cuando la mezcla se seca antes del análisis)(ii) Excitación de la Matriz. Algo de la energía láser incidente en la solución sólida es absorbida por la matriz,produciendo rápidas vibraciones y causando una desintegración local de la solución sólidaformando agregados compuestos de moléculas individuales de analito rodeadas demoléculas de matriz neutras y excitadas. Las moléculas de la matriz se evaporan de estosagregados dejando atrás la molécula excitada del analito.(iii) Ionización del Analito.Las moléculas de analito pueden ionizarse por simple protonación por la matriz excitadafotónicamente, dando lugar a la formación del compuesto típico de tipo [M+X]+ (dondeX=H, Li, Na, K, etc.). Algunos compuestos con carga múltiple, dímeros o trímeros sepueden formar también. Se producen aniones por las reacciones con desprotonación delanalito por la matriz para formar [MH] y por las interacciones con los fotoelectrones paraformar iones moleculares radicales [M] .
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Estas reacciones de ionización ocurren en las primeras decenas de nanosegundos después dela radiación, y dentro de la nube de desorción inicial de matriz/analito. Es en esta forma enque se produce el espectro característico MALDI, dando lugar típicamente a grandes señalespara compuestos del tipo [NM+X]n+ (N * n).
1.4. Métodos de Análisis
1.4.1. Análisis de Doble Sector
Teoría
Los iones se aceleran desde la fuente, bajo la acción de un voltaje, Va, y entran al analizadorelectrostático el cual funciona como un instrumento de direccionamiento de energía. Debidoa la naturaleza física de muchos tipos de ionización, los iones con una misma masa y cargase producen con una energía de distribución, la cual, si no se corrige, disminuirádrásticamente la resolución observada y la precisión en la medición de la masa. Elanalizador electrostático dirige los iones con una misma relación cargamasa, m/z, hacia unatrayectoria más coherente a través del sector magnético.
El sector magnético consiste en un tubo amplio colocado entre un imán variable de fuerza decampo B y radio r (comúnmente 60 O 120O). Al cambiar el campo magnético la fuerzadirigirá a los iones de diferente relación masacarga hacia el punto de “dobledireccionamiento” (figura 9) y en consecuencia hacia el detector de iones (usualmente unmultiplicador electrónico).
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Figura 9. Esquema de un espectrómetro de masas de dos sectores. Componentes básicos de un espectrómetrode masas de dos sectores (electrostático/magnético).
Iones de masa m, carga z y velocidad v, entran al campo magnético con una energía cinéticadefinida por la ecuación 1, la cual la adquirieron al salir de la ranura de la fuente.
Ecuación 1:
La fuerza centrífuga experimentada por los iones debe balancear la fuerza de Lorentzejercida por el campo magnético (fuerza B, radio r) para que sea dirigido hacia el punto dedoble direccionamiento.
1.4.2. Espectrometría de Masas de Tiempo de Vuelo (TOF)
Teoría
El espectrómetro de masas TOF es el más simple de los analizadores de masas y tiene unamuy alta sensibilidad en virtualmente un rango ilimitado de masas. Los iones de la muestrase generan en una zona fuente, s, en el equipo, por cualquiera de los métodos de ionización.Un potencial Vs (la fuente de extracción) se aplica a lo largo de toda la fuente para extraer yacelerar los iones de la fuente hacia la zona libre de campo d, del equipo.
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Figura 10. Desorción laser de un espectrómetro de masas con tiempo de vuelo. (A) Un sistema lineal detiempo de vuelo en el cual los iones generados por la desorción laser se aceleran a través de la región de lafuente de iones hacia el tubo de campo libre que va al detector. (B) Un sistema de tiempo de vuelo con unespejo reflectrón de iones que invierte la trayectoria de vuelo de los iones de manera que corrige lasdiferencias en la energía cinética de los iones con la misma m/z.
En un caso ideal, todos los iones producidos saldrán de la fuente al mismo tiempo con lamisma energía cinética, debido a que fueron acelerados por la misma diferencia depotencial. En este caso, los iones producidos por la técnica Tiempo de Vuelo, dependeránsolamente de la masa y de la carga producida en el ion. Descartando el tiempo de extracciónde la fuente, la fórmula básica para el análisis de masas por TOF está dada por la siguienteecuación:
Donde:
mi = masa del ion de analito
zi = carga en el ion de analito
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E = campo de extracción
ti = tiempo de vuelo del ion
ls = longitud de la fuente
ld = longitud de la región libre de campo magnético
e = carga electrónica (1.6022x1019 C)
Para obtener un espectro de masas confiable, el tiempo de extracción del ion debe ser de unaalta precisión. Este problema se aborda generalmente usando una técnica de ionización depulsos como la desorción láser o MALDI. Hay ciertos problemas con las técnicas quecausan una distribución en el tiempo de vuelo para cada masa, y por lo tanto disminuyen laresolución. Estos factores deben ser corregidos si se desea un espectro de alta resolución.Para obtener una alta resolución se requiere usar los equipos más complejos reflectrón, tubosmás largos y/o extracción iónica retrasada.
1.4.3. Analizador de Masas de Cuadrupolos
Teoría
En un analizador de masas de Cuadrupolos, se usan campos eléctricos solamente paraseparar los iones de acuerdo a su relación cargamasa. Un cuadrupolo consiste en cuatrovarillas paralelas o polos a través de los cuales se hacen pasar los iones a separar. Los polosreciben una corriente directa fija y voltajes de radio frecuencia (RF) alternantes.Dependiendo del campo eléctrico producido, solamente iones con cierta relación de cargamasa serán dirigidos hacia el detector; todos los demás iones serán desviados hacia lospolos. Al variar la fuerza y la frecuencia de los campos eléctricos, diferentes iones puedenser detectados y formar el espectro de masas. La trayectoria de un ion a través delcuadrupolo es muy compleja.
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Figura 11. Esquema de un analizador de masas de Cuadrupolos. Las cuatro varillas muestran un áreatransversal circular pero en la práctica son de área transversal hiperbólica.
Dos polos opuestos tendrán un potencial de +(U+Vcos(t)) y los otros dos (U+Vcos(t))donde U es un potencial fijo y Vcos(t) representa un campo de frecuencia de radio (RF)de amplitud V y frecuencia cos(t). Cuando cos(t) se encuentra en fase con el tiempo, t,los voltajes aplicados en pares de polos opuestos variarán de manera sinusoidal pero enpolaridad opuesta (debido a que están en fase opuesta). A lo largo del eje central delcuadrupolo y también en el eje entre cada polo adyacente el campo eléctrico resultante escero. En dirección transversal de los cuadrupolos, un ion oscilará entre los polos con unatrayectoria compleja, dependiendo de su relación cargamasa, los voltajes U, V y lafrecuencia del potencial alternante RF. Mediante una selección adecuada de U, V y wc
solamente iones con una relación cargamasa oscilarán de manera estable a través delanalizador de masas de cuadrupolo hacia el detector. Todos los demás iones tendrán unamayor amplitud de oscilación haciendo que se estrellen en uno de los polos. En la práctica,la frecuencia se mantiene fija con valores típicos entre 12 MHz. La longitud y diámetro de los cuadrupolos determinará el rango de masas y la resoluciónfinal que puede conseguirse por el conjunto de cuadrupolos. Sin embargo, el rango máximoque puede lograrse es alrededor de 4000 kDa con una resolución de aproximadamente 2000.
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1.4.4. Transformada de Fourier de Resonancia Ion Ciclotrón (FTICR)
Teoría
La espectrometría de masas por resonancia ion ciclotrón transformada de Fourier (FTICR)es probablemente el método más complejo de análisis de masas. La técnica ha pasado por uncomplejo desarrollo desde su concepción a mediados de los años 50´s. Es la más sensible delas técnicas de uso común hoy en día, y tiene casi una resolución de masas ilimitada, >106
puede observarse con la mayoría de los instrumentos y tiene resoluciones en el rango de 104
a 105.
El espectrómetro de masas FTICR consiste de tres secciones principales. La primera es lafuente de la muestra, la cual puede ser prácticamente cualquiera de las técnicas, aunque ESIy MALDI son las más comunes. La segunda sección es la región de transferencia iónica,donde los iones generados en la fuente son dirigidos, agrupados y transferidos hacia unaregión de alto vacío antes de entrar a la celda de analizador. La región final es la celdamisma. Es posible, en algunos casos (especialmente con MALDI) generar ionesdirectamente en la celda; esto evita la necesidad de las regiones complejas dedireccionamiento iónico y bombeo.
El arreglo estándar para la región del analizador del equipo de FTICR, es una trampa iónicacolocada dentro un campo magnético estático B0 espacialmente uniforme. El efecto delcampo magnético es restringir la trayectoria de los iones incidentes a una órbita circular,cuya frecuencia es determinada por la masa m, la carga z, y la velocidad v, del ion, poracción de la fuerza de Lorentz, definida en la ecuación 1. El ion del analito es desviado haciauna trayectoria circular en un plano perpendicular al campo magnético.
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Figura 12. Esquema de la trampa de iones, la excitación y la detección de iones para producir un espectro demasas en espectrometría de masas FTICR.
La presencia de iones entre un par de electrodos del detector (en la celda de la trampa)realmente no producirá ninguna señal medible. Es necesario excitar los iones con unarelación cargamasa específica como un paquete coherente para un radio orbital más largoaplicando un barrido de radiofrecuencia de pocos milisegundos a través de la celda. Unafrecuencia dada excitará a un ion con una relación cargamasa particular (La transformadade Fourier permite medir todas las frecuencias simultáneamente). La medición de lafrecuencia angular (ecuación 2) lleva a valores de relación cargamasa (ecuación 3) y por lotanto al espectro de masas. Debido a que la frecuencia puede ser medida de manera másprecisa que cualquier otra propiedad, la técnica tiene una muy alta resolución de masas.Después de la excitación, a los iones se les deja relajarse y regresar a su estado natural demovimiento para ser medidos nuevamente si es necesario.
1.4.5. Análisis en Trampa Iónica
Teoría
El analizador de masas con cuadrupolo y trampa iónica consiste de tres electrodoshiperbólicos: el electrodo circular, el electrodo de tapa de entrada y el electrodo de tapa desalida. Estos electrodos forman una cavidad en la que es posible atrapar y analizar iones. Losdos electrodos de tapa tienen un pequeño orificio en su centro a través de los cuales los ionespueden pasar. El electrodo circular se encuentra a la mitad entre los dos electrodos de tapa.
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Figura 13. Componentes básicos de un espectrómetro de masas de trampa iónica
Los iones generados desde la fuente entran a la trampa a través del sistema dedireccionamiento de entrada y el electrodo de tapa de entrada. Se aplican varios voltajes alos electrodos para atrapar y expulsar a los iones de acuerdo con su relación cargamasa. Seaplica un potencial a.c. de frecuencia constante y amplitud variable al electrodo circular paraproducir un campo potencial cuadrupolar 3D dentro de la cavidad de la trampa. Estoatrapará a los iones en una trayectoria oscilante estable confinada en la celda de la trampa.La naturaleza de la trayectoria depende del potencial de la trampa o de la relación cargamasa de los iones. Durante la detección los potenciales del sistema de electrodos se alteranpara producir inestabilidades en las trayectorias de los iones y en consecuencia expulsan alos iones en una dirección axial. Los iones son expulsados en orden creciente de acuerdo asu relación cargamasa, dirigidos por el lente de salida y detectados por el sistema detectorde iones.
1.4.6. Espectrometria de Masas en TándemEl término “tándem” indica el uso de una segunda etapa de análisis de masas en el
mismo experimento. Esto da lugar a la capacidad de estudiar selectivamente ionesespecíficos en una mezcla compleja para obtener información estructural sobre ese ion.Acoplando dos analizadores, separados por una cámara de colisiones se puede obtener másinformación de la molécula. El primer analizador se usa para seleccionar el ion de interés.Este ion se hace pasar luego hacia la cámara de colisiones, la cual, usualmente se encuentra
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presurisada con un gas inerte. La colisión del ion con los átomos en la cámara puedeninducir la disociación del ion. A este proceso se le conoce como Disociación Inducida porColision (CID). El ion original se le llama “ion precursor” y a los iones disociados se lesconoce como “iones producidos”. Estos iones producidos luego se analizan en el segundoespectrómetro de masas dando lugar a un espectro de masas de iones producidos del ionoriginal.Estos análisis se conocen como MSn en donde “n” significa el número de etapas de análisisde masas. Un espectro MS2 o MS/MS de iones producidos contiene dos etapas de análisis.
Figura 14. Caracterización estructural de un ion seleccionado en base a su masa por espectrometría de masasen tándem. El análisis de masa del ion precursor determina la m/z del péptido ionizado de interés. Ese ion seselecciona en base a su masa en la primera etapa del análisis y se activa por colisión con una molécula de gasneutral para inducir la reacción de fragmentación. Los iones producidos de la reacción de fragmentación seanalizan en la segunda etapa del análisis de masa para producir un espectro de iones producidos.
La MS/MS proporciona información estructural mediante el establecimiento de relacionesentre los iones precursores y sus fragmentos producidos por las colisiones.
La espectrometría de masas en tándem puede clasificarse en dos tipos:
Tándem en espacio:
• Cuadrupolos en tándem• Reflectrón Tiempo de Vuelo• Sector en tándem
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• Sector – Cuadrupolo
Tándem en tiempo:
• Trampa iónica• Transformada de Fourier
Figura 15. Una representación de cuatro modos de barrido de espectrometría de masas en tándem (A). Modoestándar de análisis, el primer analizador y la cámara de colisiones transmiten todos los iones para que elsegundo analizador realice el análisis de masas. (B) Barrido de iones producidos, el ion en estudio seselecciona de acuerdo a su masa en el primer analizador y se fragmenta en la cámara de colisiones. En elsegundo analizador de masas se analiza la masa de los iones producidos. La señal es el resultado de los ionesproducidos derivados del ion precursor que fue seleccionado en base a su masa. (C) Barrido de ion precursor,en el primer analizador se realiza un barrido secuencial para transmitir los iones hacia la cámara de colisionespara su fragmentación, el segundo analizador selecciona el ion producido de interés de acuerdo a su masa. Laseñal que llega al detector es el resultado de todos los iones precursores que se pudieron fragmentar en un ionproducido común. (D) El barrido de pérdida neutral, el análisis de masas se realiza en ambos analizadoresenlazándolos con una diferencia constante en masa. La señal que llega al detector es el resultado de lafragmentación de los iones precursores al perder una especie neutral específica, formando un ion con unadiferencia de masa característica.
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Equipos de Tándem en espacio.
Los equipos en la categoría de tándem en tiempo utilizan más de un analizador de masas quefuncionan independientemente durante el experimento. El ejemplo clásico de este tipo deequipos es el de Cuadrupolos en Tándem, al cual se le conoce como “espectrómetro de triplecuadrupolo”. Se emplea un analizador cuadrupolo en ambas etapas de análisis de masas conuna cámara de colisiones entre los dos analizadores. Las primeras versiones delespectrométro de triple cuadrupolo usaban otro cuadrupolo para la cámara de colisiones, ypor eso el nombre de triple cuadrupolo. El propósito de este sistema, es que en la cámara decolisiones se lleven a cabo las colisiones que producirán la activación y fragmentación a lavez de retener los iones de todos los tamaños y liberarlos hacia la segunda etapa de análisisde masas.
Otro equipo de tándem en tiempo utilizado para la secuenciación de proteínas tiene uncuadrupolo para el primer analizador de masas y un analizador TiempodeVuelo (TOF)para el segundo analizador. Además utiliza un sistema de lentes octapolo alrededor de lacámara de colisiones. La diferencia principal en este tipo de equipo es que el espectro demasas y el espectro de de iones producidos se registran en un analizador TOF con todas susventajas características.
Un tercer tipo de equipos de tándem en espacio es el analizador de masas configurado paraestudiar reaciones de Post Source Decay (PSD). La característica particular de estos equiposy el equipo estándar Reflectron Tiempo de Vuelo, es la compuerta electrostática utilizadapara la selección de iones precursores. Estas compuertas utilizan pulsos de voltaje paradesviar los iones de m/z no deseados de la entrada al tubo de vuelo. Debido a que laresolución m/z de estas compuertas es relativamente baja (ej, 100) la selección de un ion aun m/z de 1000 Th permite transmitir o liberar en una ventana de m/z cerca de 20 Th.
Figura 16. Diagrama de un espectrómetro de masas con cuadrupolos en tándem. En un experimento deespectrometría en tándem, ambas etapas del análisis de masas se realizan con un filtro de masas cuadrupolo.La cámara de colisión es un sistema de lentes octapolo que contiene y transmite iones de cualquier m/z. Para
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mediciones de peso molecular, el primer cuadrupolo se utiliza en un modo de radio frecuencia para transmitirtodos los iones y el segundo cuadrupolo realiza el análisis de masas.
Equipos de Tándem en tiempo.
Los equipos que realizan espectrometría de masas en tándem en el tiempo constan de soloun analizador, que por nececidad, este analizador debe ser capaz de atrapar iones. Unejemplo de estos equipos es el espectrómetro con trampa iónica. Otros equipos en estacategoría son los de Resonancia Ion Ciclotrón (ICR). En un espectrómetro con trampa iónica, el análisis en tándem comienza atrapando iones detodas las m/z. Se aplican una serie de funciones de barrido de radiofrecuencia (rf), lo cuallibera de la trampa a todos los iones excepto a los que tienen la m/z de interés. En estascolisiones, la energía cinética de las colisiones se convierte en energía interna en el ion parainducir la fragmentación. Finalmente se efectúa un análisis de masas en secuencia paramedir la relación m/z de todos los iones producidos.
La espectrometría de masas en tándem también puede ser empleada para cuantificación.Esto se logra mediante el registro en dos etapas del ion seleccionado. El primerespectrómetro se configura para transmitir el ion de interés hacia la cámara de colisiones yposteriormente uno de sus iones producidos se monitorea en el segundo espectrómetro demasas.
La espectrometría de masas puede utilizarse también para efectos de selección y existen dostécnicas principales. El segundo espectrómetro se configura estadísticamente para transmitiriones producidos seleccionados con una relación m/z específica. Esta masa se monitoreaconstantemente mientras que el primer espectrómetro se realiza un barrido. Se detecta unaseñal solamente cuando un ion precursor se fragmente en el ion que se esta monitoreando.Esta técnica se conoce como “Barrido de Ion precursor” y se usa generalmente para filtraruna matriz compleja (ej. orina o fluídos corporales) con el fin de localizar compuestos conestructura relacionada, como metabolitos de una droga conocida.
La otra técnica es el “Barrido de Pérdida Neutral Constante”. En esta técnica, ambosespectrómetros realizan barridos simultáneamente pero se encuentran desfasados por unacantidad fija que corresponde a la diferencia de masa entre el ion precursor y el ionproducido. La señal aparece solo cuando el ion precursor genera un ion producido con la
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diferencia de masa seleccionada. Esta técnica puede ser utilizada para seleccionarcompuestos que contengan una caractarística estructural específica que genere un proceso defragmentación común.
1.4.7. PSD MALDI
El método esta basado en el análisis de los iones producidos (iones PSD) en la primeraregión libre de campo magnético de un reflectrón en un espectrómetro con Tiempo de Vuelo(TOF).
Al contrario del análisis de peso molecular por MALDI/MS tradicional, la producción deiones es mejorada cambiando a un diseño apropiado de la fuente de iones mientras que elanálisis de los iones producidos se procesa mediante una evaluación de los tiemposcaracterísticos de vuelo de los iones PSD en el reflectron.
Cristalización de la Muestra/Matriz
La matriz tiene tres principales funciones:• La separación y solvatación de moléculas de analito en la fase sólida,
evitando su aglomeración.• Absorber la energía del rayo laser utilizada para la desorción e ionización
de la matriz y el analito.• La ionización de analito (protonación) mediante reacciones ácido/base en
la fase gaseosa.
La matriz tiene generalmente un alto espectro de absorción en la longitud de onda del láserusado, mientras que generalmente el analito, aunque no necesariamente, tiene bajaabsorción. La solvatación del analito y la desorción de moléculas de analito entre ellas,requieren de la formación, durante la preparación, de cristales de la matriz, los cualesincorporan el analito a la red de la matriz.
Desorción e Ionización
Las moléculas de la matriz se calientan y se excitan rápidamente por la absorción de fotones,dando lugar a una rápida expulsión de material. Las moléculas protonadas de la matriz(iones de la matriz) se forman después de una serie de reacciones fotoquímicas que sesuceden rápidamente en una fase densa justo encima de la superficie. Poco después, en unafase menos densa (aun dentro de una distancia de 1mm de la superficie) se lleva a cabo la
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ionización de las moléculas de analito por la transferencia de un protón de los iones de lamatriz a las moléculas neutrales del analito; esto es debido a una mayor afinidad del analitopor protones.
Activación dentro de la fuente
Dado que en la pluma de desorción predominan moléculas neutras de la matriz, se producenfrecuentes colisiones de baja energía de los iones con estas moléculas neutrales durante laaceleración en los primeros microsegundos después del pulso láser. La densidad de la nubede moléculas neutrales y la energía cinética de los iones de analito que colisionan son losdos factores clave para fragmentaciones subsecuentes. Una mayor densidad y una mayorenergía de colisión resultan en una activación más eficiente y en fragmentacionessubsecuentes (más señales de fragmentos iónicos). La densidad neutral se controlaprincipalmente por la radiación del láser, la temperatura de sublimación de la matriz y eldiámetro de enfoque. La energía de colisión, por otro lado, se controla básicamente por lafuerza de campo inicial de aceleración.
Desactivación iónica
Los iones activados por colisión pasan a un estado de desactivación en la región libre decampo magnético del espectrómetro. Esta desactivación tiene velociadades k típicamente enel rángo de 2,000 – 30,000 seg1. Las velociadades de desactivación disminuyen al aumentarla masa del ion. La larga región libre de campo de un espectrómetro de masas TOF es por lotanto una buena opción para obtener una alta eficiencia de fragmentación.
Análisis de masa
Los fragmentos iónicos (iones PSD) formados en la región libre de campo magnético tienenuna velocidad igual a la de los iones precursores y, en un equipo lineal TOF, seríandetectados en el mismo tiempo. La energía cinética de los iones en una medida directa de lafracción de la masa del ion precursor. Los fragmentos pequeños (con menos energíacinética) son reflejados primero y por lo tanto toman trayectorias más largas a través delreflector que los fragmentos más grandes. Para conocer el espectro completo de los ionesPSD desde los fragmentos con menor masa, es necesario obtener varios espectros adiferentes potenciales en el reflector para direfentes energías cinéticas. Después de pasar lasegunda región libre de campo magnético del equipo TOF, los iones PSD se detectan en undetector de iones común como una placa de microcanales o un multiplicador electrónico.
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Figura 17. Un equipo reflectrón con tiempo de vuelo y una compuerta iónica. La compuerta iónica semantiene a un voltaje positivo excepto durante un pequeño intervalo, específico para transmitir selectivamenteiones a una cierta m/z. La fragmentación debe ocurrir antes de entrar al reflectrón, el cual separa los ionesproducidos de acuerdo a la cantidad de energía cinética que llevan.
II. Secuenciación de proteínas por espectrometría demasas
Los péptidos y proteínas son polímeros constituídos por combinaciones de los 20aminoácidos más comunes unidos por puentes peptídicos. Además, las proteínas producidaspor los ribosomas pueden sufrir modificaciones covalentes, llamadas modificaciones posttraduccionales. Más de 200 modificaciones han sido detectadas, las más importantes son:glicosilación, formación de puentes disulfuro, fosforilación, hidroxilación, carboxilación y
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acetilación del ácido Nterminal. La espectrometría de masas no sólo permite ladeterminación precisa del peso molecular sino también la determinación de sus secuencias.
Tabla 1. Modificaciones posttraduccionales y variaciones en la masa de la proteína
Modificación posttraduccional Diferencia de masa (Da)Metilación 14.03Propilación 42.08Sulfación 80.06Fosforilación 79.98Glicosilaciones por: Desoxihexosas (Fuc) 146.14 Hexosaminas (GlcN, GalN) 161.16 Hexosas (Glc, Gal, Man) 162.14 N Acetilhexosaminas (GlcNAc, GalNAc) 203.19 Pentosas (Xyl, Ara) 132.12 Ácido siálico (NeuNAc) 291.26Reducción de un puente disulfuro 2.02Carbamidometilación 57.03Carboximetilación 58.04Cisteinilación 119.14Etilpiridilación 105.12Acetilación 42.04Formilación 28.01Biotinilación 226.29Farnesilación 204.36Miristoilación 210.36Condensación Shiff del piridoxal fosfato 231.14Estearoilación 266.47Palmitoilación 238.41Lipoilación 188.30Carboxilación de Asp o Glu 44.01Deamidación de Asn o Gln 0.98Hidroxilación 16.00Oxidación de Metionina 16.00Proteólisis de un puente peptídico 18.02Desaminación de Gln a piroglutámico 17.03
2. Determinación de la estructura y de la secuencia porespectrometría de masas
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El análisis de proteínas puede dividirse en dos categorías básicas: análisis de masas ysecuenciación de aminoácidos. La habilidad para medir de manera precisa la masa de laproteína intacta sirvió como un método para revisar rápidamente si la secuencia de laproteína era correcta o para determinar la presencia de modificaciones posttraduccionales.
Se ha mejorado con gran éxito las técnicas para medir las masas moleculares de lasproteínas separadas por electroforesis en gel utilizando MALDI/TOF directamente, paralograr esto, las proteínas son transferidas a una membrana adecuada o cortadas directamentedel gel. El corte del gel deshidratado o la membrana, es colocado en el lugar de la muestra,tratado con una solución matriz e irradiada con láser. La proteína se libera del gel o lamembrana y se determina la masa molecular.
2.1. Fragmentación
Si se quiere obtener información estructural por medio de espectrometría de masas, lamolécula que se estudia debe de cortarse en uno o varios enlaces del esqueleto peptídicopara después corresponder el valor de m/z de los fragmentos resultantes con su estructuraquímica. Las técnicas más comunes implican la formación de iones estables que noproducen fragmentos. Esta característica se usa para determinar el peso molecular de lospéptidos o proteínas aun cuando se encuentren en una mezcla compleja. Sin embargo, estamisma característica conlleva una falta de información respecto a su estructura. Esteinconveniente se puede superar transfiriendo por lo menos la energía extra requerida para lafragmentación a los iones estables producidos durante la ionización. Aunque varias técnicaspermiten una transferencia de energía, tales como la fotodisociación y la disociacióninducida en superficie, el método más común es la Disociación Inducida por Colisión (CID).Los fragmentos que resultan son analizados utilizando MSn
Los espectros de masa en tándem pueden ser obtenidos utilizando los instrumentos yamencionados como analizadores magnéticos, trampas de iones, cuadrupolos, etc. Ladiferencia básica entre todos estos métodos radica en la cantidad de energía cinética de losiones. En instrumentos magnéticos la energía del ion precursor es de varios kiloelectrovoltios (keV) mientras que en los otros, como los cuadrupolos o trampas iónicas, laenergía cinética nunca excede los 100 eV. Esta diferencia en energía influye, obviamente, enel proceso de fragmentación. Los espectros de alta energía en tándem presentan un ampliorango de rutas de fragmentación, algunas de las cuales no se observan a baja energía. Unnúmero mayor de iones de fragmentos frecuentemente tienen más información pero tambiénincrementan la dificultad para interpretar el espectro.
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El análisis MS/MS de muchos péptidos con secuencias conocidas y desconocidas permiteidentificar los distintos procesos de fragmentación existentes. Hay rutas de fragmentaciónraras y otras más comunes que ocurren dependiendo de las condiciones en las que se realicela fragmentación. Como ejemplo se muestran los espectros de fragmentación de alta y bajaenergía de un péptido (metioninaencefalina) en la figura 18.
Figura 18. Espectros de fragmentación de alta y baja energía de la metioninaencefalina (secuenciaYGGFM).
Los fragmentos pueden clasificarse en dos categorías:1) Aquellos derivados del corte de uno o dos enlaces peptídicos en la cadena
peptídica.2) Aquellos que además sufren un corte en una cadena lateral de aminoácidos.
Los iones de péptidos se fragmentan comenzando por los puentes amida a lo largo delesqueleto peptídico. El corte de un enlace en la cadena peptídica puede ocurrir en tres tiposde enlaces a) Cα – C, b) CN o c) N – Cα, que forma seis tipos de fragmentos que senombran an, bn y cn cuando se queda una carga positiva en el extremo Nterminal y senombran xn, yn y zn cuando la carga positiva se mantiene en el extremo Cterminal. Elsubíndice n indica el número de aminoácidos contenidos en el fragmento. La figura 19muestra los distintos tipos de fragmentos producidos a través del corte de un enlace en lacadena peptídica.
Figura 19. Principales vías de fragmentación de los péptidos en CID/MS/MS.
La diferencia de masa entre iones consecutivos (entre dos picos) dentro de una serie permitedeterminar la identidad de aminoácidos consecutivos y por lo tanto deducir la secuenciapeptídica. Hay dos excepciones: Leu – Ile, que son isómeros y por lo tanto tienenexactamente la misma masa; y Gln – Lys, que son isobares, es decir, que son diferentes encomposición pero tienen la misma masa nominal. Normalmente el espectro muestra variasseries incompletas de iones que producen información redundante y hacen al espectro muycomplejo y difícil de interpretar.
Hay una marcada diferencia entre la fragmentación observada a alta y baja energía. A altaenergía se generan todas las fragmentaciones descritas en la figura 19. Sin embargo, notodos los fragmentos son observados en el espectro debido a que la fragmentación puede serinfluenciada por la naturaleza de los aminoácidos en la secuencia. A baja energía, los
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fragmentos observados son principalmente bn y yn. Estos fragmentos pierden pequeñasmoléculas como agua y amonio de los grupos funcionales de las cadenas laterales de losaminoácidos.
Los iones de las series dn y vn se producen por la escición de la cadena aminoacídica lateral yse observan solamente en espectros CID de alta energía.
Los mejores espectros son aquellos con una o dos series de iones, de manera que cada enlacepeptídico en la molécula esta representado en el espectro. De esta manera, la secuencia sedetermina por la diferencia de masas entre iones sucesivos. La producción de más de dosseries de iones ocurre en espectros de alta energía y generalmente con un espectroincompleto de cualquiera de las series, y por lo tanto haciendo la interpretación más difícil.
Las masas monoisotópicas y químicas de los aminoácidos se muestran en la tabla 2. La masamonoisotópica es la masa del isótopo con menor m/z en un espectro donde se muestran lospicos de todos los isótopos (espectro de alta resolucion). La masa química es la masapromedio de todos los isótopos (espectro de baja resolución).
Tabla 2. Masa de varios aminoácidos
Aminoácido Código (3)
Código (1)
Masamonoisotópica
Masaquímica
Glicina Gly G 57.02147 57.052Alanina Ala A 71.03712 71.079Serina Ser S 87.03203 87.078Prolina Pro P 97.05277 97.117Valina Val V 99.06842 99.133Treonina Thr T 101.04768 101.105Cisteína Cys C 103.00919 103.144Isoleucina Ile I 113.08407 113.160Leucina Leu L 113.08407 113.160Asparagina Asn N 114.04293 114.104Aspartato Asp D 115.02695 115.089Glutamina Gln Q 128.05858 128.131Lisina Lys K 128.09497 128.174Glutamato Glu E 129.04260 129.116Metionina Met M 131.04049 131.198Histidina His H 137.05891 137.142Fenilalanina Phe F 147.06842 147.177Arginina Arg R 156.10112 156.188Tirosina Tyr Y 163.06333 163.17Triptofano Try W 186.07932 186.213
Generalmente, en la fragmentación se producen en cada corte dos fragmentos, uno con unN terminal y otro con un Cterminal. Se pueden encontrar otros tipos de fragmentos en la
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mayoría de los espectros que resultan del corte de al menos dos puentes internos en lacadena peptídica. El primer tipo se llama fragmento interno debido a que no contieneextremos N y C terminal, esta formado por tres a cuatro aminoácidos y es muy pocoabundante. Se representa por una serie de simples letras correspondientes a la secuencia delfragmento. Los péptidos que contienen prolina son más abundantes debido a que el grupoimino de la prolina esta incluido en un anillo de cinco átomos y por lo tanto tiene una mayorafinidad por el protón que otros enlaces peptídicos en la cadena. Por lo tanto la protonacióny corte del enlace amida de la prolina está favorecido para formar un fragmento interno.
El segundo tipo de fragmento que resulta de un corte múltiple de la cadena peptídica es elion imonio que, al igual que el ion anterior, muestra una baja masa en el espectro. Estosiones se marcan por la letra correspondiente al aminoácido padre.
Además de estos fragmentos, en un espectro de alta energía se pueden encontrar otros trestipos que resultan del corte de la cadena peptídica y de la cadena lateral del aminoácido loscuales se muestran en la figura 20. En la figura 21 se muestra las vías para su formación.
Figura 20. Fragmentos derivados de un corte doble de la cadena principal del péptido
Figura 21. Vías de fragmentación que producen los iones característicos de las cadenas laterales de losaminoácidos
Dos de estos tipos de fragmentos resultan del corte de un puente entre los carbonos β y γ dela cadena lateral de los aminoácidos, se simbolizan como dn o wn, respectivamente, deacuerdo a si contienen la carga positiva en el N terminal o en el Cterminal. Estosfragmentos son útiles para distinguir los isómeros Leu e Ile.
2.1.1. Influencia de la posición y deslocalización de la carga
La protonación ocurre principalmente en sitios más básicos. Si se añaden más protonesestos se dirigirán primero hacia los otros aminoácidos básicos, si se encuentran presentes, ydespués a los grupos amida.
La presencia y la posición de un aminoácido básico dentro del péptido influencia el procesode fragmentación. La presencia de aminoácidos básicos tales como Arg, Lys, His o Procerca del Cterminal induce principalmente la formación de iones conteniendo el extremo Cterminal (yn, vn y wn) como se muestra en la figura 22, mientras que la presencia de estos
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aminoácidos cerca del Nterminal favorece la formación de iones conteniendo el extremoNterminal (an y dn). Sin embargo, la ausencia de un aminoácido básico dentro del péptido secaracteriza por una distribución más marcada de iones que contienen ya sea el C o el Nterminal por lo que la complejidad del espectro se incrementa..
Figura 22 Influencia de la presencia y posición de la carga en los fragmentos resultantes.
2.2. Identificación y secuenciación de péptidos
La Disociación Inducida por Colisión (CID) produce una escalera de secuencia de ionesdonde la diferencia en el valor m/z entre iones consecutivos (picos en el espectro) indica lamasa del aminoácido en esa posición de la secuencia. La interpretación exitosa requieredeterminar cuales iones se originaron del N o Cterminal de forma que las diferencias en lasmasas entre iones consecutivos del mismo tipo de fragmento (ej. yn) puedan ser calculadas.Por lo tanto, una serie de iones secuenciales con valor m/z en orden ascendente definirá lasecuencia de aminoácidos. El espectro que contenga una serie completa de iones tipo bn nospermite deducir la secuencia del péptido desde el Nterminal al Cterminal, mientras que laserie de iones tipo yn permite la identificación de la secuencia en la dirección inversa.
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La distinción entre fragmentos que contengan el C o N terminal se puede lograr alintroducir un átomo 18O en el Cterminal de los péptidos obtenidos por digestión tríptica. Laidentificación se consigue al identificar el aumento de masa producido por la adición del18O.
La diferenciación entre Leu e Ile se logra favoreciendo la fragmentación de la serie dn o wn.Otra forma, es fragmentar los iones imonio de estos aminoácidos a baja energía en m/z = 86que corresponde a la masa característica de este par de aminoácidos. La diferenciación entreLys y Gln se logra por la acetilación del grupo amino utilizando anhídrido acético.
Para generar dos series distintas del péptido, la proteína se digiere con tripsina o por otrasproteasas. El sitio específico de corte para estas y otras proteínas utilizadas se muestra en latabla 3.
Tabla 3. Corte específico o enzimático de polipéptidos (el corte está entre el extremo carboxilo del residuo Xy el extremo amino del residuo Y)
Reactivo Sitio de CorteCorte químico Bromuro de cianógeno MetY Ácido Fórmico AspPro Hidroxilamina AsnGly 2–Nitro–5–tiocianobenzoato XCys Fenil isotiocianato (Edman) Grupo amino terminal del péptidoCorte enzimático Tripsina ArgY, LysY Quimiotripsina TyrY, PheY, TrpY Endoproteasa V8 GluY (AspY) Endoproteasa Asp N XAsp (XCys)
Cerca de 0.1 – 2 nmol por digestión son suficientes para un análisis CIDMS/MS. El pesomolecular de cada péptido se determina después de una separación por HPLC de fasereversa,
El espectro de masas en tándem, adquirido en un Espectrómetro de masas de trampa deiones Finnigan MAT LCQ, se muestra en la figura 23. El análisis MS/MS de los péptidosderivados a partir de una digestión de proteínas por tripsina generalmente presenta una serieprominente de iones tipoy en el lado de alta masa del espectro y un residuo de lisina yarginina como el aminoácido Cterminal. Estos aminoácidos pueden ser reconocidos comodel tipoy1 en el m/z 147 o 175, pero cuando se producen iones de péptidos grandes porMS/MS el espectro de la trampa de iones de los péptidos no muestra los valores bajos de
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m/z. La masa que se obtiene por la diferencia entre picos es el valor calculado delaminoácido y la masa química conocida de un aminoácido es el valor predicho.
Figura 23. Espectro de masas de disociación inducida por colisión (CID) grabado en los iones [M + 2H]2+ am/z de 786 de [Glu]1fibrinopéptido B. Los valores de m/z debajo de la secuencia son aquellos predichos apartir de la secuencia. Debajo de ellos están los valores de m/z medidos y la diferencia entre los dos valores.
La interpretación puede iniciarse con el ion más abundante y de más alto m/z, en este casom/z 1285. Se puede crear una tabla de diferencias de masa restando los valores de losaminoácidos probables para buscar el siguiente ion (del mismo tipo, ej. yn) de la secuencia,la diferencia de masa corresponde a la masa del aminoácido siguiente. En este caso el ion am/z 1171 muestra una diferencia de 114.04 que corresponde al aminoácido Asn. Si secontinúa con este proceso a lo largo del espectro de masas en tándem se puede determinar laserie de ocho aminoácidos. Debido a que el péptido fue producido por cortes por tripsina sepuede limitar el residuo Cterminal a Lisina o Arginina. El ion presente a 246.1 es el ion y2
asi que probablemente las combinaciones de aminoácidos son ValLys y AlaArg. Unarevisión al espectro muestra una baja abundancia a m/z 1396. La diferencia entre [M + H]+
(m/z 1221) y este ion es 175. La masa del residuo de Arg [156 + 18 (H2O) = 175] sugiereque la secuencia Cterminal del péptido es AlaArg.
La presencia de arginina en zonas terminales facilita la secuenciación óptima de un péptidoporque solo dos series de iones se producen y se ha visto que siempre son series completas.
Valores predichosValores calculados
Diferencia
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Una arginina situada a mitad del péptido resulta en la producción de iones Nterminales y Cterminales dependiendo del lugar de escición respecto a la arginina. El espectro resultante esmás difícil de interpretar y pueden aparacer zonas en blanco.
Figura 24. Espectro de disociación inducida por colisión de (A) Un péptido (SYSMEHFRWGKPVG) [M + H]+ = 1680.3 y (B) el mismo péptido derivatizado con TMMA (trimetilamonioacetilo) [M]+ = 1780.0
Los péptidos sin arginina generalmente producen tanto iones Nterminales como Cterminales. También presentan zonas en blanco. El perfil del espectro y la presencia dezonas en blanco en los patrones de fragmentación varían de péptido a péptido.
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Figura 25. Espectro de disociación inducida por colisión de (A) El péptido αendorfina(YGGFMTSEKSQTPLVT) [M + H]+ = 1745.5 (B) Derivatizado con TMMA (trimetilamonioacetilo) [M]+ =1844.4
Derivados con carga fija.
Una manera efectiva de dirigir la producción de series completas de iones an y dn es el uso dederivados con carga fija en el Nterminal. La derivación se realiza en el Nterminal porqueexisten métodos para la modificación selectiva del extremo N en presencia de lisina,mientras que la modificación selectiva al extremo Cterminal no es tan simple. Hasta ahorael amonio cuaternario (dimetilalquilamonio), trifenilfosfoniometil (TPPE), trihidrotiofeno(THTA) han sido utilizados para realizar las derivatizaciones en el Nterminal.
El ion precursor con carga fija lleva una carga inmóvil en vez de una carga móvil de protón.En teoría todos los iones son producidos por una fragmentación de carga remota dirigida porla carga fija. En la práctica se observa la fragmentación esperada, aunque pueden ocurrirrearreglos en los que la carga se transfiere a otros sitios en el péptido. Estos procesos detransferencia de carga ocurren más a menudo cuando una arginina esta presente en elpéptido y se encuentra cerca del Nterminal.
Tres factores deben considerarse al escoger derivados cargados y son: el efecto en laproducción de iones, el efecto en la eficiencia de la ionización y la facilidad de síntesis.
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Los derivados que se ha observado que tienden menos a provocar rearreglos en la carga yproducir iones problematicos, y que tienen un efecto neutral o positivo en la eficiencia deionización y que son fácilmente sintetizados son los derivados de dimetilaquilamonio.
Ejemplos del uso de Derivados Cargados
Las figuras 24A y 25A muestran el espectro CID de dos péptidos que se fragmentanpobremente. El primer péptido tiene una arginina a mitad del péptido y el segundo no tieneargininas. La derivatización con TMMA (trimetilamonioacetilo ) se muestra en las figuras24B y 25B respectivamente. El efecto de la derivatización con TMMA es producir seriescompletas de iones an y dn.
Para resolver la identidad de los aminoácidos Nterminales se requiere de un experimentoMS3 para confirmar cualquier interpretación. Basándose en la información de la secuenciaya disponible, la información puede ser usada para buscar en la base de datos utilizandoprogramas de similitud en secuencia.
2.3. Correlacionando información MS/MS de la secuencia en labase de datos.
Utilizando algoritmos computacionales la información creada por la ionización inducidapor colisión (CID) de los péptidos puede ser usada para buscar en bases de datos denucleótidos y proteínas.
Los iones de fragmentos contenidos en el espectro proveen un grado de especificidad a lamasa del péptido y permite la identificación de las proteínas basado en sólo un espectro demasas en tándem. La mayoría de los algoritmos usan cada espectro de masas en tándem enuna búsqueda independiente en la base de datos. Es muy baja la probabilidad de que dos omas espectros de masas, de calidad razonable (buena proporción señalruido), coincidanincorrectamente con la misma secuencia de proteína.
Los espectros de masas en tándem de péptidos contienen tres niveles de información. Elprimero es la masa del péptido. La pura masa exacta del péptido puede reducir el número deposibilidades de secuencia a un pequeño número (miles a decenas) cuando se compara conlas secuencias obtenidas y se corta la proteína con cierta enzima.
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Figura 26. Secuenciación espectrométrica de masas en tándem. Los iones de fragmentos representan lasecuencia de aminoácidos del péptido. Al restar los valores m/z de iones adyacentes del mismo tipo, lasecuencia puede ser elucidada. El patrón de fragmentación puede ser utilizado para buscar en la base de datosde proteínas para encontrar la secuencia de aminoácidos que corresponda mejor con el espectro de masas entándem.
Al conocer la especificidad de la enzima y con una amplia tolerancia de masa (comomargen de error), se pueden identificar un gran número de péptidos basándose simplementeen la masa. Para identificar únicamente la secuencia de aminoácidos representada por unamedición de la masa, se necesita un segundo nivel de información. Un espectro de masas entándem provee un patrón de los fragmentos o secuencia de iones que son únicos para unasecuencia dada. Al comparar la masa predicha del péptido a partir de la secuencia deaminoácidos con aquella observada en el espectro de masas en tándem, se puede determinarla cercanía de la correspondencia. El tercer nivel de información presente en un espectro demasas en tándem es la secuencia real. Al correlacionar una secuencia corta de aminoácidos(3 – 4 residuos de aminoácidos) que pueden no ser únicos para un proteína específica con lamasa del péptido completo se crea un nivel más alto de especificidad.
Un inconveniente potencial, cuando se utiliza información de espectrometría de masas entándem para buscar en grandes bases de datos, es la existencia de proteínas similares consecuencias conservadas.
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2.4. Correlación de la información de m/z del péptido consecuencias conocidas
Con las estrategias de análisis de proteínas se busca obtener suficiente información paraidentificar a la proteína. El primer paso después de obtener la secuencia, es buscar en basesde datos para determinar si la secuencia es conocida. Los valores observados de m/z soncomparados en la base de datos con los valores predichos de cada proteína. Si la proteína nose encuentra muy modificada y no hay mas de dos proteínas presentes en el análisis demasas se puede encontrar una correspondencia exacta. Este método es útil en laidentificación rápida de las proteínas, en particular, en la identificación de las proteínas engeles de dos dimensiones.
Las mejoras recientes en la exactitud de la masa (10 – 50 ppm) y la resolución (10,000 –15,000) en espectrómetros de masas TOF, creados por la combinaciones de extracciónretardada y reflectores, han mejorado la precisión en la medición de la masa, lo queminimiza la ambigüedad en la identificación. El mapeo de masas también se ha propuestocomo un método para la identificación de especies relacionadas. Este proceso involucra eluso de información en la base de datos de un organismo para identificar proteínas similaresu homólogas de otro organismo para el cual no hay muchas secuencias de proteínas.
2.5. Cuantificación de péptidos
La cuantificación es un proceso que requiere de especificidad. Algunos métodos analíticoscomunes como los radioinmunoensayos, proporcionan alta sensibilidad en la detección perouna pobre especificidad. La espectrometría de masas en tándem (MS/MS) es un método queayuda a incrementar la especificidad en el análisis cualitativo y cuantitativo deneuropéptidos endógenos de extractos de tejidos.
En MS/MS el alto nivel de especificidad se logra después de la desorción e ionización delpéptido para producir la moléculaion protonada (M+H)+ del péptido por el primerespectrómetro; el segundo espectrómetro colecta solamente los fragmentos de ionesproducidos a partir de esa moléculaion que fue seleccionada por el primer espectrómetro.Para mejorar la especificidad molecular se usa un estándar interno, un isótopo estableincorporado a la secuencia de aminoácidos del péptido.
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El espectro de masas del péptido endógeno y del estándar interno se registra usando laprimera etapa (MS1) del espectrómetro en tándem. Muchos de los fragmentos de iones quedeterminan la secuencia de aminoácidos que se observan en el espectro no pueden serdiferenciados entre los fragmentos del péptido endógeno del estándar interno.
Los parámetros de operación de la cámara de colisiones inducidas (CID) para el ion (M+H)+
pueden ser optimizadas de manera que el ion (M+H)+ produzca o aumente la intensidad delos fragmentos de iones producidos. Por esta razón, el gas de colisión, la presión del gas y laenergía de colisión se optimizan para producir la mayor cantidad de fragmentos de iones quedeterminan la secuencia de aminoácidos. Específicamente la presión del gas en la cámara decolisiones inducidas (CID) se ajusta para reducir la cantidad de la ion (M+H)+ al 50% de suvalor original y producir una corriente apreciable de fragmentos de iones.
El espectro de los fragmentos del ion (M+H)+ del péptido endógeno se registra en la segundaetapa (MS2) del espectrómetro en tándem.
Antes de la cuantificación se realiza un análisis cualitativo del péptido para verificar lapresencia de los fragmentos de iones que determinan la secuencia. El espectro de losfragmentos de iones del ion (M+H)+ del péptido nativo se compara con un ion (M+H)+
sintético. Si los fragmentos de iones son equivalentes en estos dos espectros, entonces lasecuencia del péptido nativo queda establecida.
La cuantificación del péptido se obtiene registrando la corriente iónica producida por el ionprecursor seleccionado al pasar a ion producto (fragmentos).
La especificidad molecular de los métodos MS/MS para una cuantificación precisa depéptidos endógenos supera a otras técnicas debido a:
1. El análisis cuantitativo en MS/MS establece primero la secuencia de aminoácidos del péptido endógeno.
2. MS/MS establece y mantiene el enlace estructural entre el ion (M+H)+ y losiones correspondientes que determinan la secuencia de aminoácidos.
3. Se emplea un isótopo estable incorporado a un péptido sintético comoestándar interno.
2.5.1. Cálculo de Masa MolecularPara el cálculo de pesos moleculares de péptidos proteolizados, es esencial que los valoresde masa de los residuos amino ácidos correspondan a aquellos que se encuentran en la
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mezcla. La confusión más común es el estado de los residuos de cisteína. Generalmente esdeseable cortar los puentes de disulfuro antes de la digestión para hacer la proteína másaccesible a la proteasa. En este caso solo se requiere añadir un agente reductor para lo cualse deberá considerar el peso de la cisteína en su estado reducido. Por otro lado, si elprotocolo implica cisteínas en estado corboximetilado o piridietilado, entonces el pesomolecular de la cisteína debe modificarse para cada caso.
Las modificaciones posttraduccionales presentan mayores dificultades. Una gran parte delos registros de las bases de datos son derivaciones de traducciones conceptuales desecuencias de ácidos nucléicos, y por lo tanto no contienen información de modificacionesposttraduccionales.Los pesos moleculares se calculan generalmente de los pesos atómicos, los cuales son losvalores promediados isotópicamente de los materiales en estado natural.
2.5.2. Bases de Datos de Secuencias
Las más grandes bases de datos son mantenidas por varias instituciones independientesalrededor del mundo. Aunque hay un intenso intercambio de información entre estos gruposy una base de datos incorpore actualizaciones de varias otras, no existe un sistema rigurosopara asegurar que alguna base de datos contenga todas las secuencias conocidas.
Esto presenta una dificultad para elegir la base de datos: elegir solo una y reconocer quefalta una fracción de una secuencia conocida, o formar una base de datos compuesta demúltiples bases de datos y aceptar la redundancia que se encontrará. La solución ideal esconstruir una base de datos concisa de la que se eliminen registros duplicados. El mejorejemplo de una base de datos no redundante es la base de datos compuesta OWL, disponiblepor medio del protocolo de intercambio de archivos FTP de la página en internet http://sind2.dl.ac.uk o http://ncbi.nlm.nih.gov que contiene registros de SwissProt, PIR, PDB(Brookhaven) y otras.
2.5.3. Consideraciones sobre la Base de Datos
Reglas de proteólisis enzimática
Una base de datos de referencia de valores de masa de péptidos proteolizados se crearelacionando el comportamiento observado de una enzima en los registros de una colección
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de secuencias como el SwissProt o PIR. En la práctica, a concentraciones de orden depicomolar, es difícil asegurar que la digestión se lleve a cabo completamente, así que muchodel arte de la creación de bases de datos radica en la simulación adecuada de digestionesincompletas.
2.5.4.Esquemas de PuntajeLas estrategias de búsqueda y puntaje más simples, consisten en calcular la masa del péptidode cada registro en la base de datos de la secuencia y se compara contra los valoresexperimentales. Cada valor calculado que cae dentro de un cierto rango de tolerancia conrespecto al valor experimental cuenta como un punto. El puntaje final es el número depéptidos encontrados por registro.
2.6 .Caracterización de proteínas con técnicas combinadas
2.6.1. Identificación de proteínas en mezclas por “Shotgun”El análisis por shotgun consiste en acoplar la Ionización por electrospray (ESI) con
cromatografía líquida (LC) para resolver los componentes de mezclas complejas antes deintroducirlas al espectrómetro de masas en tándem. Grandes cantidades de espectros demasas en tándem (cientos a miles) pueden ser automáticamente generados, lo cual seríaimposible de adquirir a través de la operación manual del instrumento. El análisis directo yautomatizado de los espectros de masas en tándem del péptido es posible con el uso dealgoritmos y bases de datos.
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Figura 27. Identificación por shotgun de mezclas de proteínas. Una mezcla de proteínas se digiere con unaproteasa para producir una mezcla compleja de péptidos. Los péptidos son analizados en serie utilizandoHPLC acoplado a un espectrómetro de masas. Los espectros de masas en tándem se utilizan para buscar enuna base de datos utilizando el software de búsqueda en base de datos SEQUEST y algoritmos de revisión deinformación para identificar las proteínas presentes en la mezcla.
Existen varias razones para extender la capacidad de la identificación por shotgun para elanálisis de proteínas. Primero, el producto final de muchos experimentos biológicos, comola inmunoprecipitación, son mezclas pequeñas de proteínas. Segundo, los procedimientos depreparación y digestión de la muestra pueden ser más agresivos con calor o agentescaotrópicos lo que ayuda a una proteólisis más completa. Finalmente, esta técnica tiene unalto potencial para experimentar en un amplio rango de condiciones fisiológicas.
Varias aplicaciones del método de identificación por shotgun han sido demostradas. Laprimera y más importante, este método es más poderoso en organismos con su genomacompleto secuenciado. Cuando un genoma está completo, la secuencia debería estardisponible para cada proteína expresada.
2.6.2. Interacciones proteína – proteína y complejos de proteínaLas proteínas involucradas en procesos enzimáticos o rutas bioquímicas pueden ser
identificadas por la asociación bajo condiciones que indiquen una interacción específica. Lastécnicas bioquímicas como la coinmunoprecipitación son ampliamente utilizadas paraidentificar la interacción de proteínas. La determinación de interacciones proteína – proteínase ha vuelto un componente importante para elucidar la función de la proteína o paraidentificar proteínas en procesos y rutas metabólicas. Varias estrategias bioquímicas para la
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determinación de interacciones proteína – proteína se han adaptado a la identificación porshotgun utilizando LC/MS/MS y una búsqueda posterior en la base de datos (Figura 28).
Figura 28. Tres métodos bioquímicos para determinar las interacciones proteína – proteína. El primero es lacoinmunoprecipitación. Se utiliza un anticuerpo para precipitar la proteína junto con las proteínas unidas. Elsegundo método, cromatografía de afinidad por interacción de proteínas, utiliza una proteína “anzuelo” paraunirse a las proteínas que interactúan. El último método es la purificación del complejo protéico intacto.
2.6.3. Detección de mutacionesUna mutación puntual dentro de una proteína produce una variación en su peso
molecular. La espectrometría de masas es un método rápido para el análisis de mutacionesespecialmente cuando se pueden obtener cantidades suficientes de proteínas, además es útilpara verificar la estructura de proteínas recombinantes. Estas variantes protéicas pueden seranalizadas al compararlas con las proteínas de referencia.
Para la caracterización de mutaciones de proteínas, se realiza un experimento químico queconsiste en dos pasos: mapeo del péptido y secuenciación del péptido. Estos pasos puedenser reemplazados por análisis espectrométrico de masas de una mezcla compleja depéptidos, seguido por MS en tándem (MS/MS) de las especies de interés. El análisisestructural de variantes de proteínas por espectrometría de masa puede ser resumido de lasiguiente manera:
La variación de masas entre las especies silvestre y la mutante es igual a la diferencia en lamasa entre el residuo mutado y el residuo de la proteína silvestre, asumiendo sólo unamutación. La región de una proteína que contiene la mutación puede ser determinada por uncorte químico o por digestión proteolítica de esta proteína seguido de una espectrometría de
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masa del los péptidos resultantes. Los péptidos que contienen la mutación presentan lamisma variación del peso molecular con la proteína intacta. Por el otro lado, los péptidoslibres de mutación tienen pesos moleculares calculados idénticos a aquellos calculados paralas proteínas silvestres.
Tabla 4 Diferencias en la masa (Da) observada entre varios aminoácidos; el residuo en la columnacorresponde al aminoácido esperado mientras que el residuo en la fila corresponde al aminoácido mutante
Gly Ala
Ser
Pro
Val
Thr
Cys
Leu
/Ile
Asn
Asp
Gln/
Lys
Glu
Met
His
Phe
Arg
Tyr
Trp
Gly 14 30 40 42 44 46 56 57 58 71 72 74 80 90 99 106 129Ala 16 26 28 30 32 42 43 44 57 58 60 76 76 85 92 115Ser 10 12 14 16 26 27 28 41 42 44 60 60 69 76 99Pro 2 4 6 16 17 18 31 32 34 50 50 59 66 89Val 2 4 14 15 16 29 30 32 38 48 57 64 87Thr 2 12 13 14 27 28 30 36 46 55 62 85Cys 10 11 12 25 26 28 34 44 53 60 83Leu/Ile 1 2 15 16 18 24 34 43 50 73Asn 1 14 15 17 23 33 42 49 72Asp 13 14 16 22 32 41 48 71Gln/Lys 1 3 9 19 28 35 58Glu 2 8 18 27 34 57Met 6 16 25 32 55His 10 19 26 49Phe 9 16 39Arg 7 30Tyr 23Trp
La diferencia entre el peso molecular del péptido nativo y el del péptido mutante permite ladeterminación del aminoácido natural que ha sido mutado, siempre y cuando sólo existauno, de otra forma se necesita de MS/MS.
2.6.4. Detección de variantes a través de la medición de la masa de laproteína intacta con ESIMS
La figura 29 muestra el espectro de masas transformado ESI de una mezcla de cadenasβglobina. Dos diferentes especies de βglobina son claramente diferenciadas en el espectrode masas a una resolución de 3000 y la separación de masas, para este análisis, es de 14 u.
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Figura 29 Espectro de masas transformado ESI de una mezcla de cadenas βglobina que difieren en 14 u
Las variantes que tienen sustituciones de aminoácidos (exceptuando Leu e Ile, Lys y Gln)son, teóricamente, detectables al medir la masa molecular de la proteína intacta. La pequeñadiferencia en las masas moleculares detectables por MS incrementa con el aumento detamaño de las proteínas.
La identificación de variantes de especies difiriendo en 14 u en un análisis real, correspondeal patrón teórico en la figura 30, como se presenta en la figura 29. La diferencia mínima enla masa molecular detectable como el patrón D en la figura 29, para una mezcla equimolarcon proteínas normales de Mr (masa de una molécula calculada utilizando los pesosatómicos de cada elemento) mayor a 100 000, es cerca de 20 u. Esto significa que la mitadde todas las posibles sustituciones de aminoácidos en una proteína de este tamaño podrándetectarse.
Figura 30. βglobinas normales y variantes: (A). Proteína normal pura; (B) Normal y mutante con +4unidades de masa; (C) Normal y mutante +9; (D) Normal y mutante +14
2.6.5. Identificación de proteínas separadas electroforéticamente
Dos diferentes estrategias espectrométricas de masa han sido utilizadas para identificara las proteínas separadas por electroforesis en gel. Todos los intentos publicados usanmétodos de digestión in situ después de la electroforesis en gel para obtener péptidos de laproteína a analizar. Las colecciones de péptidos obtenidas son adecuadas para el análisis porespectrometría de masas para obtener mapas de masa del péptido y, por lo tanto, identificarla proteína después de una búsqueda en la base de datos.
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El espectro generado por la digestión de una proteína por una enzima es único y específicode dicha proteína y puede ser suficiente para cuantificarla.
La manera común de realizarlo es tomando una pequeña muestra de la proteína de interés ydigerirla con una enzima proteolítica; la mezcla de fragmentos es analizada por MSempleando ya sea MALDI o ESI. Las lecturas experimentales son luego comparadas en unabase de datos de masas de péptidos. Si el espectro de la proteína de interés que se deseaidentificar se encuentra en la base de datos, entonces la proteína ha sido identificada. Si elespectro no se encuentra en la base de datos, se escoge el espectro que tenga el mayorporcentaje de identidad con el espectro de la proteína de interés.
Este método de identificación es más rápido y sensible que el método de secuenciación deEdman y mucho más sensible que la detección de firmas por los perfiles de migración conelectroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) o por los tiempos de retención en HPLC.
Selección de instrumentación
Se utilizan dos tipos de espectrómetros de masas: MALDI acoplado a un analizador TOF oun ESI acoplado a un analizador de cuadrupolos.
El método MALDI tiene dos características que lo hacen especialmente adecuado para elanálisis de mezclas de digestión intactas comparado con otros métodos de ionización:
1) Es relativamente tolerante a bajos niveles de contaminantes como sales debuffer y,
2) La discriminación entre componentes en las mezclas es relativamente baja.
Aunque al tolerancia de MALDI a bajos niveles de contaminantes es mayor que en otrosmétodos de ionización, muchos métodos cromatográficos y electroforéticos son mástolerantes a contaminantes que el MALDI y más precisos en la cuantificación. Es decir,MALDI es la mejor elección cuando lo que se quiere es la firma de los fragmentos de ladigestión en órdenes de picomoles o menores y no se busca una cuantificación . El error enla medición de masa es significativo y es generalmente menor al 0.1% llegando hasta 0.01%si el espectro contiene un pico de masa conocida que sirve como calibrador interno lo queequivaldría a 1 o 2 Daltones para un péptido tríptico común.
Aislamiento y Purificación de Proteína
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El análisis mediante firmas de fragmentos de proteínas no funciona bien en mezclas deproteínas. En estos casos la electroforesis en gel es la opción indicada para el aislamiento dela muestra. Las dificultades al analizar proteínas de geles con MS son que los reactivospueden suprimir la señal, modificar covalentemente la muestra o alterar el peso molecular.Algunos de los reactivos que mayores problemas causan son el SDS, monómero deacrilamida y muchos marcadores comunes.
Algunos métodos prácticos para la producción de péptidos proteolíticos a partir de unamezcla son:
1) La proteína intacta se eluye del gel para una digestión subsecuente2) La proteína es digerida en el mismo gel3) La proteína se transfiere por blotting a una membrana y luego digerida in
situ, en condiciones que se favorezca la liberación de péptidos a la solución
La transferencia hacia una membrana tiene la gran ventaja de que la mayor parte del SDSpuede ser lavado antes de la digestión. De otra manera, sería necesario hacer la remoción delSDS por precipitación de la proteína o por purificación de los péptidos por HPLC. Lasmembranas de fluoruro de Polivinilideno (PVDF) funcionan mejor que las de nitrocelulosapara digestiones in situ que se van a analizar por MALDI debido a que tienen un fondoquímico más limpio.
Algunos marcadores como la sulforodamina B para PVDF o el imidazol de zinc suprimenmenos la señal en MALDI que el azul de Coomasie y en consecuencia no es forzosa suremoción. Los buffers volátiles se remueven por liofilización. El glucósido de octilo esmejor tolerado que el SDS tanto en MALDI y ESI.
Elección de la enzima
Enzimas de poca selectividad que digieren proteínas produciendo mezclas de amino ácidos ypéptidos muy cortos no son una buena opción. En un sentido práctico, un mezcla quecontiene un gran número de fragmentos de masas similares resulta en un espectro quecontiene muchos picos coincidentes que se sobrelapan. De la misma manera, péptidos demayor tamaño tienen mayor discriminación que los pequeños porque son hay menorcantidad y porque el número de posibles permutaciones de amino ácidos aumentageométricamente con el tamaño del péptido.
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Una versión altamente resolutiva de la electroforesis en gel es la electroforesis de dosdimensiones en gel (2DGE), la cual combina una separación por punto isoeléctrico en laprimera dimensión con la separación por tamaño en la segunda dimensión. Este método escapaz de separar miles de proteínas en un solo análisis.
2.6.6. Secuenciación de proteínas en geles de poliacrilamida teñidos porplata
La detección y secuenciación subpicomolar de proteínas a partir de poliacrilamida esuna proposición realista. Después de una electroforesis las proteínas son visualizadas poruna tinción con azul de coomassie si la proteína es lo suficientemente abundante (más de100 ng), aunque la tinción por plata es un método mucho más sensible con un límite dedetección entre 1 y 10 ng. La proteína es digerida, después, para producir péptidos los cualesson extraídos para posteriormente ser analizados. Este método es compatible con lacaracterización microanalítica de proteínas debido a que no introduce modificacionesquímicas, incluso en las cadenas laterales altamente inestables como los grupos –SH de lacisteína.
2.6.7. Elucidación de estructura secundaria de proteínas por ionización enelectrospray
Para este estudio, la espectrometría de masas requiere un método en el cual lasdiferencias de la conformación de la proteína puedan ser monitoreadas.
Los cambios en la distribución del estado de carga de los iones de los fragmentos en unespectro son interpretados como el resultado de las diferencias en el plegamiento de laproteína. Por ejemplo, la figura 31 muestra los espectros obtenidos para la lisozima bajo lasmismas condiciones de calibración en el espectrómetro de masas, pero en diferentescondiciones de solvente. Ambos muestran el peso molecular de la proteína como 14,305 Dpero claramente muestran diferentes distribuciones en el estado de carga.
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Figura 31 Espectro de masas ESI de lisozima de huevo que muestra la distribución del estado de cargaobtenido utilizando diferentes solventes. El espectro superior fue obtenido de una solución 100% acuosa a pHde 5.0 y el espectro inferior se obtuvo bajo condiciones estándar de solvente para electrospray con unasolución acetonitriloagua ácido fórmico 50:49:1
El espectro superior fue obtenido de una solución acuosa 100% a pH de 5.0 y muestra unaproporción del estado de carga de 9+, mientras que el espectro inferior, obtenido de unasolución conteniendo acetonitrilo al 50% y ácido fórmico al 1% exhibe un máximo de 12+.Estas diferencias del estado de carga pueden ser interpretadas en término del grado deplegamiento de la molécula de proteína. El bajo pH (antes de la ionización) del solventealtamente orgánico despliega la proteína de una forma mayor que la solución acuosa en lacual la proteína se encuentra en su conformación nativa. Por lo tanto, el desplegamiento dela proteína desorganiza los puentes salinos y expone los sitios que son propensos a laprotonación pero que están enterrados en la estructura nativa.
Aunque estas diferencias en el estado de carga son un reflejo del plegamiento de lamolécula, también son muy sensibles a las condiciones de calibración del espectrómetro, aligeras variaciones en el pH y a efectos de contraión.
Otra forma para observar la estructura secundaria es el marcaje por intercambio dehidrógeno – deuterio. El método de marcado de intercambio de hidrógeno – deuterio explotael hecho de que los elementos de la estructura secundaria que involucran la unión dehidrógeno entre las cadenas laterales del aminoácido y amidas del esqueleto protéico en elnúcleo de la proteína ofrecen protección contra el intercambio de hidrógeno, mientras que
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las regiones que no están involucradas en la estructura secundaria (que se exponen alsolvente en la superficie de la proteína) intercambiarán más rápido el hidrógeno. Por estarazón, la medición en el cambio en la masa de una proteína con el tiempo puede ser utilizadapara obtener información acerca de la estructura secundaria de una proteína, debido a que lasproteínas plegadas más fuertemente conservarán el marcado en el núcleo de la proteínadurante más tiempo que los estados parcialmente menos estables.
2.6.8. Localización de puentes disulfuro en proteínas
Los grupos sulfihidrilos de los residuos de cisteínas, además de ser altamentereactivos, están involucrados en los sitios activos para catálisis enzimáticas, como en lasproteasas de cisteína. Las reacciones de los grupos sulfihidrilos libres incluyen la oxidaciónpara formar puentes disulfuro, los cuales participan en procesos de plegamiento. Laestrategia general para localizar puentes disulfuro en las proteínas por métodosconvencionales involucra varios pasos:
1. Determinar el número de grupos sulfihidrilos libres y los puentes disulfuro.Esto se logra de la siguiente manera:
• Reducir todos los puentes disulfuro y alquilar los grupos sulfihidrilolibres.
• Alquilar sólo los grupos sulfihidrilos originales sin reducción de lospuentes disulfuro
• Determinar el peso molecular de la proteína nativa y de las proteínasmodificadas
Para calcular el número de cisteínas, grupos sulfihidrilos libres y puentesdisulfuro se determina la masa molecular de la proteína nativa (Mnat),proteínas reducidas y alquiladas (Mr + a), proteínas alquiladas (Ma) y la masaconocida del agente alquilante, que en este caso es 59 para el –CH2COOH.
Tabla 5. Determinación del número de cisteínas, grupos sulfihidrilos libres y puentes disulfuro enproteínas por ISMS
βLactoglobulinaMnat 18,276.7Mr+a 18,572.8Ma 18,333.8Ncys 5
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NsH 1Nss 2
Nota: Ncys = (Mr+a – Mnat)/59; NSH = (Ma – Mnat) (59 – 1); NSS = (Ncys – NSH)/2
2. La proteína es cortada con reactivos químicos y/o enzimas entre los residuoscisteinil.
3. Los péptidos que contienen cisteínas se separan utilizando técnicascromatográficas.
4. Los péptidos unidos por puentes disulfuro son identificados por análisis de lasecuencia de aminoácidos y se relacionan con segmentos específicos de laproteína.
2.6.9. Detección y verificación de la secuencia de péptidos con puentesdisulfuro por FABMS y MS/MS
Después de la separación, los péptidos purificados pueden ser analizados directamentepor FAB/MS. Se puede emplear la reducción y oxidación en sonda de los péptidos paradetectar rápidamente las fracciones que tienen péptidos con puentes disulfuro. Si un péptidocontiene un puente disulfuro intramolecular un nuevo pico aparecerá 2 Da más alto una vezque es reducido en la matriz de glicerol/tioglicerol. Si un péptido contiene un puentedisulfuro intermolecular, nuevos picos correspondientes a los dos péptidos constituyentesdel puente disulfuro, pueden aparecer en el rango de más baja masa molecular ydesaparecerá el pico correspondiente al péptido intacto conteniendo el disulfuro.
Aunque esta reducción en sonda es simple y útil, no puede ser utilizada para identificarpéptidos que contengan tiol. Esto requiere de de una buena resolución del instrumento paraidentificar péptidos conteniendo disulfuros intramoleculares con masas molecularesrelativamente altas.
La oxidación en sonda es otra técnica para identificar péptidos que contienen tiol ydisulfuros, rápidamente. El ácido perfórmico puede convertir un residuo de cisteína a ácidocistéico, lo que incrementa la masa molecular por 48 Da. Los péptidos unidos por disulfurosintramoleculares incrementarán el peso molecular en 98 Da, mientras que los péptidosunidos por disulfuros intermoleculares desaparecerán y formarán dos péptidos conteniendoresiduos de ácido cistéico.
Esquema 1. Estrategia general para la localización de puentes disulfuro en proteínas por MS.
Proteína purificada
Determinar el número de puentes disulfuro en la proteína por MS
Cortar la proteína entre la mitad de los residuos cisteinil por cortes químicos o enzimáticos
Separar los péptidos por HPLC
Identificar los péptidos que contienen disulfuro por MS
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La figura 32 muestra el espectro de masas FAB de una fracción HPLC de un digeridopéptico de papaína antes (a) y después (B) de la oxidación con ácido perfórmico. El pico enla figura 32A en m/z 1875 corresponde a dos péptidos, en los segmentos Val150 – Ala162 yGly198 – Tyr 203, unidos por un puente disulfuro, y los picos en m/z 11 y 1267corresponden a los péptidos formados por el corte del puente disulfuro. Una serie similar deiones (m/z 1946, 1338 y 611) está formada por el corte antes de Ala163. Una vez oxidados(figura 32B) los picos para los péptidos con puentes disulfuro (m/z 1875 y 1946) no estánpresentes y las masas moleculares para los péptidos constituyentes se incrementan en 48 Da.Estos resultados demuestran que Cys153 y Cys 200 en la papaína estaban unidos por unpuente difsulfuro.
Figura 32 Espectro de masa FAB de una fracción HPLC de un digerido peptídico de papaína antes (A) ydespués (B) de la oxidación con ácido perfórmico.
2.6.10. Localización de puentes disulfuro en pequeñas proteínas ricas encisteína.
Los puentes disulfuro en moléculas como toxinas, juegan un papel clave paramantener la estructura tridimensional. Para la localización exitosa de puentes disulfuro, lasproteínas tienen que ser cortadas entre los residuos cisteinil por métodos químicos oenzimáticos, sin intercambio de disulfuros. Varios intentos, que combinan corte por CNBr ydigestión Enzimática fallaron en su intento de producir péptidos con puentes disulfuro queno tuvieran cambios en éstos.
La hidrólisis ácida parcial es una forma alternativa de producir péptidos diagnóstico para lalocalización de los puentes. Un método consiste en la hidrólisis parcial seguida por análisisFAB/MS y otra consiste en hidrólisis suave y análisis con ionspray MS/MS (Figura 33)
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Figura 33. El espectro de masas de una fracción de una digestión de papaína tiene los picos mayores en m/z611 1657 y 2265 (A). Se utilizó oxidación y reducción en sonda para identificar estos picos. El pico delpuente disulfuro fue localizado en el m/z 2265 que equivale a los aminoácidos 150 – 166/ 198 – 203. Esto secomprobó posteriormente por FAB/MS con una subdigestión con carboxipeptidasa B que cortó las dostirosinas del Cterminal para generar, al mismo tiempo, los picos en m/z 448, 1494 y 1939 (B).
2.6.11. Secuenciación en escalera de proteínas Este ensayo, llamado “secuenciación en escalera de proteínas”, no utiliza MS/MS y
consiste en dos pasos. Primero, se genera una serie de fragmentos de péptidos, que difierendel siguiente por un aminoácido; estos se generan a partir de la cadena polipeptídica que sequiere secuenciar. Segundo, se utiliza espectrometría de masas MALDI para leer la seriecompleta de fragmentos en una sola operación. El espectro de masas contiene los ionescorrespondientes a cada especie polipeptídica presente. La diferencia de masas entre picosconsecutivos corresponde a los residuos de aminoácidos y su orden de aparición en la serie
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de datos define la secuencia de aminoácidos en la cadena peptídica original. La sensibilidadde esta secuenciación (en picomoles) es comparable a la existente en el método de Edman.
Un método se basa en la degradación por pasos utilizando el reactivo de Edman (fenilisotiocianato, PITC) en presencia de pequeñas cantidades del agente terminador (fenilisocianato). Una pequeña porción de péptido Nterminal es bloqueada durante cada pasopara evitar mayor degradación. Después de un suficiente número de ciclos, se toma unapequeña alícuota del análisis de masa. Al sustraer la diferencia de valores adyacentes de m/zse obtiene la información de la secuencia (figura 34). Las estrategias de secuenciación enescalera requieren de un péptido puro para ser exitosas.
Figura 34. (Arriba) Principio de secuenciación en escalera de proteínas. El fenil isotiocianato (PITC) producefeniltiohidantoina (PTH) del aminoácido terminal y un nuevo péptido con un aminoácido menos. El fenilisocianato (PIC), en baja cantidad, produce fenilcarbamato Nterminal de una pequeña fracción de cadapéptido. (Abajo) Ejemplo de secuenciación de [Glu1] fibrinopéptido B.
En otro método, se utiliza un reactivo volátil para degradación, el trifluoroetilisotiocianato,para evitar la necesidad de un método complejo de limpieza. La producción de la seriecompleta de péptidos fragmentados se logra añadiendo, a cada ciclo, la misma cantidad de laproteína original. No hay necesidad de añadir un agente terminador.
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Estos métodos permiten secuenciar a partir del Nterminal. Para secuenciar a partir del Cterminal se utiliza el corte enzimático, en el cual la muestra del péptido se divide en variaspartes, cada una se trata con una cantidad creciente de carboxipeptidasa. El primer intento, ainicios de 1980, utilizaba FAB para crear iones de péptidos secuencialmente cortados através del uso de la carboxipeptidasa Y para dejar un Cterminal desigual. Este intento hasido renovado y usado en conjunción con MALDI/TOF, que es altamente sensible.Ajustando la concentración de la enzima utilizada para crear la escalera, se puede disminuirla velocidad del proceso de corte enzimático y además pueden observarse los ionesformados por el corte de cada enlace amida.
2.6.12. Proteínas y péptidos hidrofóbicos analizados por MALDILa versatilidad de MALDI/MS nos brinda una alternativa viable para el análisis de
proteínas insolubles en agua. Específicamente, las características atractivas de MALDI parael análisis de especies incluyen su insensibilidad a contaminantes como lípidos y algunosdetergentes. Aunque el mecanismo de selectividad de la proteína en MALDI permaneceoscuro, la cocristalización de la matriz y la proteína (y por lo tanto la preparación de lamuestra) claramente juega un papel importante en los análisis exitosos.Los protocolos de preparación de la muestra involucran estrategias que emplean lasolubilización del analito y la matriz en un solvente apropiado, ya sea en solventes orgánicosfuertes o solubilización en una solución de detergente.
Una vez que se ha solubilizado la matriz y la proteína se pueden emplear métodos MALDIestándar. El desarrollo de MS para el análisis de péptidos hidrofóbicos y proteínas es unaherramienta altamente valiosa para estudios estructurales para esta clase tan importante deproteínas.
2.6.13. Análisis de Glicoproteínas y Glicopéptidos utilizando BombardeoRápido de Átomos (FAB)
El enfoque para analizar las muestras de glicoproteínas, utilizando este tipo deespectrometría (FAB/MS), depende de la información requerida. Si sólo se requiere laporción del carbohidrato de la molécula de interés, entonces los glicanos unidos al N puedenser liberados directamente de la glicoproteína intacta utilizando peptideN4(Nacetylβglucosaminyl) asparagine amidase F (PNGase F), mientras que los glicanos unidos al Opueden ser cortados por eliminación β reductiva.
Si se requiere de la información de los glicanos y los péptidos, entonces la proteína primerodebe ser reducida y someterse a un proceso de eliminación de puentes disulfuro y unasubsecuente digestión con tripsina u otra proteasas específicas. Una indicación rápida del
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sitio o sitios de la glicosilación unida al N puede ser obtenida del espectro de FAB antes ydespués de la liberación de los glicanos unidos al N con PNGase F. Debido a que lospéptidos forman iones pero no los glicopéptidos, cualquier nueva señal que aparezcadespués del tratamiento con PNGase F corresponde al péptido que contenía el sitio deglicosilación N.
Si se requiere un análisis detallado de los sitios de glicosilación N y O, la mezcla depéptidos trípticos y glicopéptidos puede ser fraccionada usando una cromatografía en fasereversa (HPLC) para aislar los glicopéptidos individuales.
Para identificar el sitio de unión del glicano al péptido Nglicosilado casi siempre esnecesario quitar el carbohidrato utilizando la PNGase F y luego analizar el péptidoutilizando FAB/MS (este análisis se puede realizar directamente en una alícuota de unamezcla de digestión con PNGase F, ya que contiene un buffer volátil que se evapora en lacámara de vacío del espectrómetro de masas). Los iones de los fragmentos generados, tantodel amino terminal como del carboxilo terminal del péptido, permiten su secuenciación ypor lo tanto deducir el sitio de glicosilación.
PNGase FC18
Reducción yCarboximetilación
Reducción y carboximetilaciónProteólisis HPLC
Fracción que no retiene Nglicanos
Fracción retenida con Oglicoproteína
βeliminación
Fracción que no contiene Oglicanos
Paracetilación
FABMS
Reducción y carboximetilación
Proteólisis FABMS
Glicopéptidos aislados PNGase F Beliminación Péptido modificado Péptido modificado
aislado aislado
FAB MS FAB MS
Glicoproteína
Análisis de N y O glicanos Mapeo por FAB Análisis del sitio
Esquema 2. Estrategia general para el análisis espectrométrico FAB de glicoproteínas
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Los sitios de Oglicosilación tienden a encontrarse cerca de residuos de serina y de treoninay pueden ser determinados con una eliminación β reductiva de un glicopéptido unido al O,para liberar la cadena de carbohidratos y generar un residuo de aminoácido no saturado adiferencia del aminoácido en el péptido no degradado.
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