recombinant dna technology

Recombinant DNA

Technology

Dr. Hui LIOffice : S408Tel: 26538722

Topic 5

Expression of recombinant gene(Prokaryotes)

遗传信息从 DNA 到蛋白质的传递过程——中心法则（ central dogma ）。

1. Gene expression

2. Expression of recombinant gene

A dividing E. coli

Prokaryotic promoter MCSSD sequence terminator

3. Expression of recombinant gene in prokaryote

识别原核细胞的启动子，催化所有的 RNA 合成。

数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。

2. 以操纵子 (operon) 为单位

1. 只有一种 RNA 多聚酶

3. 1 Remarks on prokaryotic expression system

有意义链5’

反意义链3’

转录

mRNA5’ 3’

翻译

蛋白质N C

5’

3’

3. 转录和翻译偶联、连续进行。

4. 不含内含子 (intron) ，缺乏转录后的加工系统。

5. 调控主要在转录水平上。

含有一个启始密码子和一段同核糖体 16SRNA3’ 末端碱基互补的序列，叫 Shine-Dalgarno （ S-D ）序列。

6. mRNA 的核糖体结合位点。

Shine-Dalgarno （ S-D ） sequence:

3.2 Attention when we express recombinant gene in prokaryotes

1. 外源基因不能带有内含子。

2. 必须用 cDNA

3. 不能直接用真核基因组 DNA 。

4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）

5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。

11

3.3 Principal factors in bacterial expression

是 DNA 上的能与 RNA 聚合酶结合并能起始 mRNA 合成的序列。

大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（ consensus sequence ）。

3.3 Regulation of prokaryotic gene expression

1. 启动子 (promoter)

-35 Box and -10 Box

（ 1 ）启动子序列

13

E. coli Promoter Sites

consensus sequences

5’-TTGACA-3’

5’-TATAAT-3’

② -10box （ Pribnow Box): The Pribnow box has a function similar to the TATA box that occurs in promoters in eukaryotes and archaea: it is recognized and bound by a subunit of RNA polymerase during initiation of transcription

TTGACA TATAAT 转录起始位点17bp

5’

核糖体结合位点

RNA 聚合酶亚基的识别位点。

① -35box

结合区

（ 2 ）翻译的起始位点① 核糖体结合位点（ RBS ）

i ） Shine-Dalgarno （ SD ） sequence ：

mRNA 上与核糖体 16sRNA 结合的序列。

ribosome binding site

SD

mRNA 5’—AGGAGGU——AUG——

16S rRNA3’

UCCUCCA

S-D序列距离 AUG的距离也影响翻译

AUG （ 91% ）GUG （ 8% ）UUG （ 1% ）

位于 SD 序列下游。

ii ）起始密码：

全酶是一个 5 聚体，含有两个 α 小亚基，和 2 两个大亚基（ β 和 β′ ），一个σ 亚基。

2. RNA polymerase大肠杆菌只有一种类型的 RNA 多聚酶转录 tRNA ， rRNA 和 mRNA 。

（ 1 ）结构

3. 转录终止子

内终止子 intrinsic terminator ：

E.coli 中促使转录终止的 DNA 位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串 A ，称为内终止子，形成终止信号。

在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。

启动子操纵子 S-D 序列目的基因终止子

由于茎环 3’ 段紧接一串 A/U 的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。

原因：

反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了 RNA 与 DNA 的互作用

① 茎环结构

② 多聚 A/U

5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5( 模板 )

转录↓

5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)

RNA 折叠↓

mRNA 折叠

U CC

U GG—CA—UC—GC—GG—CC—GC—GG—C

A ACCCAC UUUU—3

DNA

RNA 聚合酶

脱落

大肠杆菌偏爱 UAAU 。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（ skipping ）。

4. 翻译终止密码（ Stop codon ）

5. 翻译增强子（ Enhancer ）

能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。

① 必须是一种强启动子

能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的 10%-30% 以上。

② 应呈现低水平的基础转录

便于表达毒性蛋白等。

③ 应是可诱导型的

用温度或化学试剂诱导。

（ 1 ）最佳启动子必须具备的条件

6. 基因工程常用的原核启动子

26

Inducible bacterial promoters

Why not to use constitutive, always strong promoter?

Induction

Because recombinant (alien) protein is often toxic for bacterial cell.

Bacteria tend to expelharmful plasmids

Bacterial grow takes time….

来自大肠杆菌的乳糖操纵子。

用乳糖或其类似物 IPTG 充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。

Plac O 目的基因

（ 2 ）乳糖启动子 lac

阻遏物与操纵基因结合阻遏物与操纵基因结合

四聚体的阻遏物

阻遏物与 DNA 的结合

① 乳糖操纵子控制区的结构

阻遏物作用区CAP 作用区RNA 聚合酶作用区

组成：

长度：

203bp 的 HaeIII片断（包括 β-半乳糖苷酶的前 8 个密码）。

“可移动的 lac启动子小片断”

IPTG 有毒、昂贵，不理想。

IPTG =异丙基硫代 -β-D半乳糖

36

BL(DE3) inducible system and pET vectors (invented in 1984 by Bill Studier,

on sale by Novagen)

1) T7 RNA polymerase gene is integrated in chromosome

under the control of a lac promoter and operator

2) lactose analogue, IPTG, causes the host to produce T7 RNA polymerase

3) The E. coli host genome also carries the lacI (repressor) gene

pET23

Gene of interest is expressed from strong T7 promoter

37

Why repressor gene and gene of interest are expressed from different

DNA molecules? Repressor gene expressed from chromosome;

Gene of Interest expressed from plasmid

If too high repressor no transcription (you need to increase expensive IPTG)

If too low repressor promoter is leaky (active without IPTG)

Repressor is in chromosome, because there it is best kept controlled there

(no plasmid loss, not too high expression)

（ 3 ）色氨酸启动子 trp

trpR P1 O trpE trpD P2 trpC trpB trpA

trpR 阻遏蛋白基因；P1

P2

启动子；

O 操纵基因；衰减子

来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。

色氨酸操纵子


邻氨基苯甲酸合成酶

吲哚甘油硼酸合成酶

色氨酸合成酶

链链

分支酸邻氨基苯甲酸

磷酸核糖基邻氨基苯甲酸 CDRP 吲哚甘

油 -磷酸色氨酸

阻遏物

转录

（ P1是主要启动子， P2的作用只有 3%。）

没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。


阻遏物色氨酸

结合不转录

用于表达载体的 trp 启动子一般只包含启动基因、操纵基因、和部分 trpE 基因。

P1 O trpE 目的基因

有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转录（称为 corepressor ）。

（ 4 ） PL 和 PR 启动子

是从噬菌体中得到的一类启动子，比 lac 启动子的活性高 8-10倍，比 trp 启动子活性高。

cIII N PL/OL cI PM OR/PR Cro PE cII

N:抗终止蛋白；Cro: 抗阻遏蛋白 (裂解必需的）；

cI, cII, cIII: 阻遏蛋白；P: 启动子； O: 操纵子。

R:右； L:左

cIII N PL/OL cI PM OR/PR Cro PE cII

阻遏物

转录

转录

转录

当 cI 合成后，与 OL 和 OR 结合阻止 RNA 聚合酶，则左右基因都受到抑制。但促进 PM 使 cI 进一步转录。进入溶原期。

早期左边

早期右边

cI857:

表达载体常用的噬菌体启动子是 PL 。

调节基因 cI 则是选择了一个温度敏感性的突变基因 cI857 。

整合在宿主基因组里，或克隆到载体上。

42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录

cI857cI857 PL 外源基因

28oC时阻遏 PL ，外源基因不转录。

47

3.4 Where your expressed protein will be located?

Inclusion bodies(insoluble)

Cytoplasm (soluble)

Periplasmatic space(soluble or insoluble)

Secreted (!!)E.Coli

can not do that

48

Inclusion bodies (most common case)

-- Inclusion bodies are formed through the accumulation of folding intermediates

rather than from the native or unfolded proteins.

-- It is not possible to predict which proteins will be produced as inclusion bodies.

-- Production of inclusion bodies not dependent on the origin of protein,

the used promoters, the hydrophobicity of target proteins...

49Electron micrograph of an inclusion body of the protein prochymosin in an E. coli cell

Pag

e 11

6

Protein Folding

50

Good side of inclusion bodies

1) inclusion bodies can be accumulated in the cytoplasm to much higher level (greater than 25%)

than production as soluble form;

2) inclusion bodies is initially isolated in a highly purified, solid, and concentrated state

by simple physical operation (centrifugation).

3) inclusion bodies have no biological activity. For toxic proteins it may be the only one available;

4) inclusion bodies are resistant to proteolysis That results in the high yield of protein production.

使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞

回收的蛋白生物活性差。

② 缺点

① 优点

2. 周质中表达

（ 1 ）周质（ periplasm ）

革兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。

蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚

优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。

phoA 、 OmpA 、 OmpT 、 OmpF 、 LamB 、 β-内酰胺酶（ lactamase）、肠毒素（ enterotoxin ） ST-II 、 LT-B等

（ 3 ）常用的原核信号肽① 大肠杆菌的信号肽：

能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。

（ 2 ）信号肽（ signal peptide ）

一般位于 N 端。

鼠源 RNase 、人生长激素信号肽。

也能在细菌中起作用。

（ 2 ）真核信号肽

④胡萝卜欧氏杆菌的 PelB 蛋白。

②金黄色葡萄球菌的蛋白 A 。

③枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶（ endoglucanase ）。

由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。

用溶血素（ hemolysin ）基因构建分泌性融合蛋白；

使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。

3. 胞外表达

或与细菌素释放蛋白（ bacteriocin release protein)共表达。

载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。

S-D 序列 ATG- 外源基因 -TAG

优点

3.5 Several examples on expression vector

1. 非融合型表达载体

产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。

缺点：

容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。

哈佛大学的 Gilbert实验室建立的。表达能力强。

（ 1 ） pKK223-3 载体

组成结构：

① 强启动子 : tac （ trp-lac ） :

trp 的 -35 区 lacUV5 的 -10 区

lac 操纵基因

②操纵基因：

乳糖操纵子系统。

④终止子：

③ 调节基因：

Lac I

宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。如 JM105 菌。

rrnB 的强终止子 rrnB 强终止子

S-D 插入位点区

⑤S-D 序列和插入位点区：

tac P Lac O S-D 插入位点区 rrnB T

宿主 lac I

⑥载体的其余部分：

来自 pBR322 质粒。

⑦表达诱导物： IPTG （乳糖的类似物，不会被降解）

阻遏物 IPTG

必须选择一个有 lacI 的宿主菌。

条件：

载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。

如： pIN III 系列：

2. 分泌型表达载体

pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,

（ 1 ）组成结构

Ipp lac P lac O S-D/ATG ompa 插入位点

Ipp （脂蛋白基因启动子）和 lacUV5 启动子。

②调节基因： lac I③S-D 序列和起始密码 ATG 。④分泌信号肽：

大肠杆菌外膜蛋白基因 ompa 。

⑤插入位点区（多克隆位点）。

① 强启动子：

pIN III-comA1

以 pBR322 为基础构建的。

调节基因不必借助于宿主的 lacI.

表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。

① 启动子： tac②操纵基因： lacP③ 调节基因： lacI④S-D 序列

3. 融合蛋白表达载体系统 ----pGEX 系列

（ 1 ）优点

（ 2 ）组成结构

便于融合蛋白的分离和纯化。

22

lacI

tac lac O S-D/ATG GST 插入位点 TGAlacP

⑤ori ： pBR322 ori⑥融合肽： GST(谷胱甘肽巯基转移酶）

GST融合蛋白用 Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。

（ 3 ）产物提纯

（ 4 ）产物分离用凝血酶或 Xa 因子可以把外源蛋白从 GST 上切下来。

柱（ column ） GST 外源蛋白

凝血酶

外源蛋白柱（ column ） GST

GST

洗脱

柱（ column ）

可再利用

pGEX

插入区：pGEX-1T

CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGA

Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr Asp

EcoR I

BamH I

凝血酶

CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGACG

Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg Asp

EcoR I

BamH I

凝血酶

ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTGACTGAC

Ile Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser Ser

EcoR I

BamH I

Xa 因子

pGEX-2X 的插入区：

pGEX-3X 的插入区：

Sma I

Sma I

（ 5 ）其他融合蛋白系统His-tag （组氨酸标签）：

在外源多肽的 N 端或 C 端接上 6 个组氨酸（ His ）。

His-tag 能与 Ni2+ 柱结合，但很容易被 EDTA （或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。

人胰岛素在大肠杆菌中的表达

溴化氰

Cyanogen bromide ：

5’-TTGACA-3’

5’-TATAAT-3’

① -35box

② -10box （ Pribnow Box ）

3.6 Factors influencing the efficiency of expression

1. 启动子的结构对表达效率的影响

RNA 聚合酶 σ 亚基的识别位点

（ 1 ）一致顺序

（ 2 ） -35 区与 -10 区之间的距离间隔为 17bp时，启动子最强。

（ 3 ） -35 区和 -10 区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。

5’-TTGACA TATAAT一致顺序lac

trp

PL

recA

tac I

tac II

5’-TTTACA TATGTT5’-TTGACA TTAACT5’-TTGACA GATACT

5’-TTGATA TATAAT

5’-TTGACA TATAAT5’-TTGACA TTTAAT

-35box -10box

5’-AGGAGGU-3’

S-D 序列后面的 4 个碱基：

如果是 A （ T ） , 翻译效率最高；

如果是 G （ C ） , 效率只有 50% 或 25% 。

2. 转译起始序列对表达效率的影响

（ 1 ） S-D 序列

？？？？

AUG左侧的三个碱基也有影响。

（ 2 ）起始密码 AUG

-半乳糖苷酶的 mRNA 中：

AUG左侧如果是 UAU 或 CUU时，最为有效；

如果是 UUC 、 UCA 或 AGG时下降 20倍。

多顺反子的 mRNA 与核糖体的结合位点有一个或几个终止密码。

噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白 mRNA 的核糖体结合位点有多个 U 。

（ 3 ）其它

lac P S-D lac ATG croATG cro

ATG croATG cro

ATG croATG cro

ATG croATG cro

ATG cro

pTR213pTR199

pTR214

pTR188

pTR194pTR210

pTR182

pTR190

BamH I

Cro的表达水平

S-D距ATG的距离

1.630.085

1.00

0.65

0.54

0.85

0.00120.0006

载体

3. 启动子与外源基因之间的距离

转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。

增加载体的拷贝数会增加转录出的 mRNA 数目。增加表达效率。

4. 转录终止区对表达效率的影响

5. 载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响

6. 外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响

但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。

1. 选择强启动子序列，如 tac 等

2. 调整 S-D 序列与 AUG 碱的距离

距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。

3. 改变起始密码下面的几组密码子

一般为 5-9bp 。

能提高翻译的起始效率。

3.7 How to improve the expression level?

4. 增加 mRNA 的拷贝数和稳定性

在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列”能防止 mRNA受到 3’5’ 外切酶的攻击。

5. 减轻宿主细胞的代谢负荷合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。

将宿主生长代谢与外源基因表达分开。

（ 1 ）诱导表达

一般采用温度诱导或药物诱导。

（ 2 ）表达载体诱导复制

将宿主的生长与载体的复制分开。

当宿主大量生长后，再诱导载体制粒的复制，增加拷贝数。

当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。

N 末端：由原核基因编码一段多肽，C 末端：是完整的真核外源基因。

（ 1 ）设计成融合蛋白这是避免被降解的最好措施。

质粒基因产物目的基因产物N C

切割

6. 提高表达产物的稳定性

防止被宿主的酶降解。

① 使用次黄嘌呤核苷（ lon ）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。

②大肠杆菌的 htp R 基因突变也减少蛋白酶的降解作用。

③T4噬菌体的 pin 基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把 pin 增加到载体上。

（ 2 ）使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解

减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。

（ 3 ）表达分泌蛋白

细胞质

外膜内膜

周间质

质粒染色体

“外排”：蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。

“分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。

细菌蛋白分泌的条件：

位于 N 端，一般为 15-30aa 。真核与原核的结构相似 , 功能相似，可以互换。

碱性氨基酸N 疏水氨基酸核心区切割位点Arg 、 Lys Leu 、 Ile Ala

GlySer

信号肽酶

外源蛋白

① 有信号肽。

③ 细胞内的转运机制。

真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达；但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。

信号肽酶 I 、信号肽酶 II 等近 20 多种蛋白质的参与。

② 蛋白质内有与分泌相关的 aa 序列。

为蛋白指明目的地。

缺乏蛋白质的加工。

（如糖基化、氨基酸修饰等）。

3.8 Problems with prokaryotic expression system

分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。

1. 形成正确的二硫键 (Disulfide bond )

人胰岛素分子

抗体分子人血红蛋白分子

如信号肽、内含肽（ intein ）等序列的切割。

2. 前体切割

（ 1 ） O- 糖基化（ Ser, Thr ）

增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。

3. 蛋白质糖基化 (Glycosylation)

糖基

（ 2 ） N- 糖基化（ Asn ）

Dol ：长醇 Mannose ：甘露糖

Glucose ：葡萄糖 N-AcGlc ： N乙酰氨基葡萄糖

磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、软脂化

4. 氨基酸残基的修饰

羟脯氨酸

甲基组氨酸

羟赖氨酸

羧基谷氨酸

95

Bacillus• Antibiotic Producers: B. brevis (e.g. gramicidin, tyrothricin), B. cereus

(e.g. cerexin, zwittermicin), B. circulans (e.g. circulin), B. laterosporus (e.g. laterosporin), B. licheniformis (e.g. bacitracin), B. polymyxa (e.g. polymyxin, colistin), B. pumilus (e.g. pumulin) B. subtilis (e.g. polymyxin, difficidin, subtilin, mycobacillin).

• Pathogens of Insects: B. larvae, B. lentimorbis, and B. popilliae are invasive pathogens. B. thuringiensis forms a parasporal crystal that is toxic to beetles.

• Pathogens of Animals: B. anthracis, and B. cereus. B. alvei, B. megaterium, B. coagulans, B. laterosporus, B. subtilis, B. sphaericus, B. circulans, B. brevis, B. licheniformis, B. macerans, B. pumilus, and B. thuringiensis have been isolated from human infections.

• The Genus Bacillus includes two bacteria of significant medical importance, B. anthracis, the causative agent of anthrax, and B. cereus, which causes food poisoning. Nonanthrax Bacillus species can also cause a wide variety of other infections, and they are being recognized with increasing frequency as pathogens in humans.

3.9 Other bacteria

96

Bacillus Endospores

Bacillus thuringiensis phase micrograph

Bacillus anthracis Crystal violet stain viewed by light microscopy

Spore stain of a Bacillus species. CDC. Mature spores stain green, whether free or still in the vegetative sporangium; vegetative cells and sporangia stain red.

97

Bacillus

• Bacillus strains used as production organisms: - B. subtilis - B. brevis - B. licheniformis

• Transformation systems: - via competent cells (during transition from vegetative cells ->

sporulation, cell can take up DNA (ss) when population reaches a metabolic state called competence)

- protoplast - plasmid rescue - bacteriophage-mediated transduction

• Vectors: - replicating plasmids (pUB110, pE194, pC194, pHP13, shuttle vectors) -> replicating plasmids with temperature-sensitive origin of replication (replication stops above certain temp. -> pE194 stops above 45ºC) - integrative vectors (normally shuttle vectors)

Transformation Systems

Integrative Plasmid

No replicon for Bacillus-> selection in Bacillus driggers integration-> useful if construct should carry one copy of foreign gene

-> integration of circular plasmid

-> shuttle vectors

Integrative Plasmid

No replicon for Bacillus-> selection in Bacillus driggers integration-> useful if construct should carry one copy of foreign gene

-> integration of linear plasmid-> generate deletions

-> shuttle vectors

101

Bacillus

• Promoters: - aprE promoter -> induction with onset of sporulation - amylase promoter -> growth-phase and nutrition regulated promoter (induction at end of exponential growth + repression

by glucose) - sacB promoter (levansurase) -> not regulated - spac promoter -> hybrid promoter (subtilis phage + lac

operator) -> induction with IPTG - T7 system -> hybrid system -> E. coli T7 system (IPTG

induction) + T7 polymerase (on chromosome) under control of a xylose- inducible promoter - xylose-inducible promoter -> induction with xylose, strong promoter (200 times), repressed by glucose

-> Bacillus is good secreter -> Signal sequence longer and N-terminus more pos. charged

-> low GC-content bacteria

102

Bacillus as expression host

103

Bacillus as expression host

Other Bacteria for Gene expression:

Gram positive: Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Streptomyces,...Gram negative: Pseudomonas, Agrobacterium, Xanthomonas,...

105

Products produced in Prokaryotic

Systems • Restriction Endonucleases -> produced in E. coli• L- Ascorbic Acid (Vitamin C) -> recombinant Erwinia

herbicola (gram-negative bacterium)• Synthesis of Indigo (blue pigment -> dye cotton /jeans) ->

produced in E. coli• Amino Acids -> produced in Corynebacterium glutamicum

(gram-positive bacterium)• Lipases (laundry industry) -> from Pseudomonas

alcaligenes produced in Pseudomonas alcaligenes • Antibiotica (most of them from Streptomyces, other gram-

positive bacteria, fungi) -> produced in recombinant Streptomyces and fungi (Penicillium)

• Biopolymers (PHB -> biodegradable plastics) -> produced in E. coli (stabilized with parB)

recombinant dna technology

Documents