UNIVERSITATEA  POLITEHNICA  DIN  BUCUREȘTI  FACULTATEA  DE  CHIMIE  APLICATĂ  ȘI  ȘTIINȚA  MATERIALELOR  

SINTEZA  VITAMINEI  B12  

  Student:  Romuald  Győrgy     Grupa:  1131  IIPCB    

Cuprins  

 

INTRODUCERE  ...........................................................................................................................................  1  STRUCTURA  CHIMICĂ  .............................................................................................................................  2  SINTEZA  .......................................................................................................................................................  3  METODE  INDUSTRIALE  DE  OBȚINERE  A  VITAMINEI  B12  .............................................................  4  EXTRACȚIE  DIN  MICROORGANISME  ...........................................................................................................................  4  FERMENTAȚIA  AEROBĂ  A  UNEI  CULTURI  DE  MICROORGANISME  .........................................................................  5  

BIBLIOGRAFIE  ...........................................................................................................................................  7      

  1  

Introducere  Una  din  cele  mai  fascinante  molecule  din  lumea  științei  și  a  medicinii,  vitamina  B12,  a  

fost   folosită   la   început   pentru   tratarea   anemiei.   Structura   ei   complexă   a   fost   descoperită  ulterior;  vitamina  B12  se  află  printre  substanțele  cele  mai  intens  studiate.  

Anual  producția  de  vitamina  B12  depășește  10  tone  și  se  realizează  prin  extracția  din  diferite  specii  de  bacterii.  

Vitamina  B12  există   în   lumea  științifică  de   la   începutul  anilor  1920,   când  doi  medici  americani  –  Minot    și  Murphy  –  au  reușit  să  vindece  anemia  pernicioasă  cu  o  dietă  bazată  pe  carne  de  ficat.  Descoperirea  a  dus  la  numeroase  cercetări  pentru  descoperirea  așa  numitului  “factor  extrinsec”.  Abia  la  20  de  ani  mai  târziu  două  companii  farmaceutice  –  Merck  (SUA,  Karl  Folkers)  și  Glaxo  (UK,  Alexander  Todd)  –  au  reușit  să  izoleze  din  ficat  un  compus  cristalin  de  culoare  roșie  care  vindecă  anemia  pernicioasă,  compus  care  a  fost  numit  ulterior  vitamina  B12.  Structura   tridimensională   a   vitaminei   a   fost   determinată   abia   în   1964   de   către   Hodgkin,  folosind  tehnica  de  difracție  de  raze  X.    

Vitamina  B12   face  parte  din  grupul  de  vitamine  B,   vitamine   solubile   în  apă   și   cu   rol  major   în  metabolismul   celular.   B12   este   una   dintre   vitaminele   cu   rol   esențial   pentru   corpul  uman,   ea   fiind   implicată   în   funcționarea   creierului   și   a   sistemului   nervos,   a   producerii  sângelui,  în  metabolismul  celular  (afectează  sinteza  ADN-­‐ului),  dar  este  implicată  și  în  sinteza  acizilor  grași  și  producerea  energiei.  Aceasta  este  metabolizată  în  corp  sub  o  formă  activă  de  coenzimă.  Vitamina  B12  se  găsește  în  mod  natural  în  lactate,  carne  de  vită  și  de  pui,  ouă,  fructe  de  mare  și  culturi  ale  diferitelor  bacterii,  aceste  culturi  reprezentând  principala  sursă  pentru  producerea  industrială  a  acesteia.  

     

  2  

Structura  chimică  Termenul  de  vitamina  B12  este  utilizat  pentru  a  descrie  în  general  compușii  care  fac  

parte   din   grupul   cobalaminelor,   însă   compusul   numit   propriu-­‐zis   vitamina   B12   este  cianocobalamina   (Fig.   1).   Această   formă  nu   se   găsește   în   natură,   dar   este   cea  majoritară   în  sinteza  industrială.  Gruparea  cian  (CN-­‐)  este  rezultatul  extracției  compusului  din  culturile  de  bacterii.   În   cazul   în   care   în   locul   grupării   cian   se   găsește   un   rest   de   adeozină   (5’-­‐deoxiadenosil)   vitamina   B12   este   sub   formă   de   coenzimă,   și   participă   la   numeroase   reacții,  spre  exemplu  la  sinteza  metioninei.  

Vitamina  B12  este  solubilă  în  apă  și  prezintă  una  din  structurile  cele  mai  mari  și  mai  complicate:  în  molecula  sa  are  9  centri  chirali,  6  dintre  aceștia  fiind  legați  intr-­‐un  singur  lanț.  Vitamina  B12  este  alcătuită  din  trei  părți:  un  ciclu  central  (corin)  cu  patru  liganzi  pentru  ionul  central  de  cobalt,  un  ligand  inferior  (alfa)  și  un  ligand  superior  (beta).  

Structura  centrală  este  dată  de  ciclul  corin  care  este  plan;  acest  ciclu  este  format  din  patru  unități  de  pirol.  Geometria  de  coordinare  a  ionului  de  cobalt  (III)  este  octaedrică.  Acesta  este   legat  coordinativ  de  cei  patru  atomi  de  azot  de   la  ciclurile  derivate  de  pirol.  Al  cincilea  ligand  al   ionului  de  cobalt  (ligandul  alfa)   îl  reprezintă  atomul  de  azot  din  molecula  de  DMBI  (dimetilbenzimidazol).   A   șasea   legătură   coordinativă   (ligandul   beta)   conferă   reactivitate  moleculei     și   se   poate   realiza   cu   o   grupare   cian   (CN-­‐),   hidroxil   (OH-­‐),   metil   (CH3·)   sau   cu    atomul  de  carbon  C5’   al  5’-­‐deoxiadenosil.   Legătura  C-­‐Co  a   fost  prima   legătură  metal-­‐carbon  

descoperită   într-­‐o   moleculă   cu  activitate   biologică.   Această   legătură  este  slabă,  având  o  energie  de  disociere  de  aproximativ  130  kJ/mol,   iar  ruperea  legăturii  este  homolitică,  ceea  ce  explică  proprietatea  de  catalizatori  a  diferiților  derivați  ai  vitaminei  B12.  

     

Fig.1.  Structura  vitaminei  B12.  

(azenozil-­‐cobalamină)  

  3  

Sinteza  După  10  ani  de  muncă  în  care  au  fost  implicați  mai  mult  de  100  de  cercetători,  sinteza  

chimică   a   vitaminei  B12   a   fost   realizată   de   către  Woodwart   și   Eschenmoser   în   anul   1973   și  prezentată  la  un  simpozion  în  Riga.    

Abia  în  1993  s-­‐a  putut  elucida  și  calea  de  sinteză  biochimică  a  cobalaminei  în  mediu  aerob  pentru  microorganismul  Pseudomonas  denitrificants.   În  urma  cercetărilor  s-­‐a  dedus  că  există  și  o  cale  anaerobă  de  sinteză,  însă,  aceasta  este  mult  mai  puțin  înțeleasă.  

Obținerea  vitaminei  pe  cale  chimică  presupune  70  de  pași  de  sinteză,  ceea  ce  pentru  obținerea  industrială  este  mult  prea  complicat  din  punct  de  vedere  tehnic  și  mult  prea  scump  din  punct  de  vedere  economic.  

Sinteza   vitaminei   B12   la   nivel   industrial   se   realizează   exclusiv   prin   procese  biosintetice   de   fermentație   în   care   se   folosesc   microorganisme   optimizate   genetic.   Printre  acestea  se  numără  următoarele:  Aerobacter,  Agrobacterium,  Alcaligenes,  Azotobacter,  Bacillus,  Clostridium,   Corynebacterium,   Flavobacterium,   Micromonospora,   Mycobacterium,   Norcardia,  Propionibacterium,  Protaminobacter,  Proteus,  Pseudomonas,  Rhizobium,   Salmonella,   Serratia,  Streptomyces,  Streptococcus  și  Xanthomonas.  

Există  două  tipuri  de  biosinteză  a  vitaminei  B12:  sinteza  în  condiții  aerobe  și  sinteza  în  condiții  anaerobe.  Sinteza  în  condiții  aerobe  este  întâlnită  la  organisme  de  tipul  Pseudomonas  denitrificants,   iar  genele  care    codifică  enzimele  sunt  recunoscute  prin  prefixul  cob-­‐.  În  cazul  sintezei   anaerobe,   la   care   participă   organisme     ca   Bacillus   megaterium,     Pseudomonas  Shermani   și   Salmonella   Typhimurium,   genele   codificatoare   sunt   numite   cbi.   În   Fig.   2   este  prezentată  biosinteza  cobalaminei  în  cele  două  forme:  aerobă  și  anaerobă.  

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fig.  2.  Biosinteza  vitaminei  B12  în  condiții  aerobe  și  anaerobe  

  4  

Biosinteza   în   plante   și   microorganisme   a   derivaților   de   tetrapirol   începe   cu   C-­‐5  glutamatul.   În   prima   etapă   legătura   t-­‐ARN   a   glutamatului   este   redusă   de   glutamil-­‐t-­‐ARN-­‐reductază   la   glutamate-­‐1-­‐semialdehyde.   Apoi,   în   a   doua   etapă,   are   loc   o   transpoziție  intramoleculară  a  grupării  amino-­‐  de  la  atomul  de  carbon  C-­‐2  la  atomul  C-­‐1,  obținându-­‐se  acid  5-­‐amino-­‐levulinic,   precursor   pentru   obținerea   tetrapirolilor.   În   urma   condensării   a   două  molecule  de  acid  5-­‐aminolevulinic  se  obține  porfobilinogen,  un  prim  derivat  al  pirolului,  care  la  rândul  său  e  polimerizat,   iar   în  urma  rearanjării  și  ciclizării  se  obține  uroporfirinogen  III,  primul   intermediar   macrociclic.   Metilarea   acestuia   la   C-­‐2   și   C-­‐7   prin   intermediul  metiltransferazei  duce  la  obținerea  ciclului  percorin-­‐2.  În  cazul  sintezei  aerobe  acest  ciclu  este  metilat   la   C-­‐20   obținându-­‐se   percorin-­‐3A.   În   sinteza   anaerobă,   la     ciclul   percorin-­‐2   are   loc  inserția  unui  ion  de  Co3+,  în  timp  ce  la  sinteza  aerobă,  inserția  ionului  de  Co  are  loc  abia  după  alte  nouă  reacții,  în  final  obținându-­‐se  doi  compuși  chelați  diferiți.  Deși  sinteza  vitaminei  B12  prin   cele   două  modalități   –   aerobă   și   anaerobă   –   diverge   după   obținerea   compusului   ciclic  percorin-­‐2,   aceasta   ajunge   să   conveargă   după   obținerea   acidului   adenosil-­‐cobiric,   care   este  transformat  în  cobinamidă  în  urma  adiționării  unei  molecule  de  aminopropanol  la  catena  de  acid  propionic  a  ciclului  D.  Ultimul  ciclu  de  nucleotide  se  atașează  în  urma  transferului  unui  rest   de   fosforiboză   la   DMBI.   Molecula   de   α-­‐ribazol   obținută   reacționează   cu   GDP-­‐adenozilcobinamida  care  duce  la  obținerea  adenozilcobalaminei.  

Metode  industriale  de  obținere  a  vitaminei  B12  

Extracție  din  microorganisme  Una  din  metodele  industriale  de  obținere  a  vitaminei  B12  se  realizează  prin  extracția  

acesteia  din  celulele  unor  microorganisme  care  produc  în  mod  natural  această  substanță.    În  acest  proces  celulele  care  conțin  vitamina  B12  sunt   tratate  astfel   încât  membrana  

celulară   să   fie   degradată   parțial   și   să   permită   amestecului   solubil   din   celulă   care   conține  substanța   de   interes   să   se   elibereze   in   lichidul   în   care   se   află   celulele.   Metodele   utilizate  pentru   degradarea   membranei   celulare   sunt:   tratamentele   termice   (pasteurizarea   sau  încălzirea   amestecului     într-­‐o   autoclavă),   utilizarea   unei   enzime   (enzimă   bactericide),  tratamente  mecanice  de  mărunțire,   utilizarea  unor   substanțe   cu   acțiune   asupra  membranei  (surfactanți  sau  solvenți  organici).  Metodele  pot  fi  folosite  singular  sau  combinate.  În  procesul  prezentat   se   preferă   ca   o   parte   din   faza   solidă   să   fie   adăugată   în   cea   lichidă   care   conține  vitamina  B12,  a  cărei  compoziție  masică  este  raportată  la  cantitatea  de  substanță  uscată.  Este  de  preferat  ca  variația  concentrației  de  vitamina  B12  să  se  încadreze  între  1  și  5  %.  Ca  metodă  de  separare  a  amestecului    solid-­‐lichid  se  folosește  ultrafiltrarea.  

În  proces   se  preferă   ca   soluția   care   conține   celulele  degradate   să   fie   spălată   cu  apă  distilată.   Soluția   rezultată   în   urma   spălării   se   adaugă   în   final   la   lichidul   obținut   în   urma  separării   soluției   inițiale.   Este   de   preferat   ca   spălarea   soluției   să   se   realizeze   tot   prin  diafiltrare.  Ulterior,  filtratul  este  amestecat  cu  soluția  de  B12  rezultată  în  urma  separării.  Noua  soluție  se  supune  unui  tratament  de  uscare,  care  se  poate  realiza  prin  mai  multe  metode:   la  vid,   prin   pulverizare,     uscare   în   pat   fluidizat,   etc.   O   altă   variantă   de  mărire   a   concentrației  vitaminei   B12   în   faza   uscată   este   spălarea   soluției   înainte   de   procesul   de   degradare   a  membranei  celulelor.    

Soluția  de  B12  obținută  conține  și  biomasă,  formată  din  celule  și  resturi  ale  acestora.  Sursa  de  la  care  se  pleacă  pentru  obținerea  vitaminei  B12  este  un  microorganism  capabil  să  o  producă.  Speciile  de  microorganisme  care  pot  produce  B12  sunt:    Acetobacterium,  Aerobacter,  Agrobacterium,   Alcaligenes,   Arthrobacter,   Azotobacter,   Bacillus,   Esterichia,   Eubacterium,  Flavobacterium,   Methanobacillus,   Methanosarcina,   Mychobacterium,   Propionibacterium,  

  5  

Proteus,   Pseudomonas,   Rhizobium,   Rhodopseudomonas,   Salmonella,   Seratia,   Streptococcus,  Streptomyces  și  Xanthomonas.  În  cazul  de  față  s-­‐a  preferat  folosirea  Propionibacterium.  

Pentru  amestecul  obținut   în  urma  uscării   (a  cărui  umiditate  e  de  preferat  să   fie  sub  5%),  distribuția  vitaminei  B12  este  omogenă,  ceea  ce  înseamnă  că  aceasta  nu  este  afectată  de  forțele  gravitaționale,    electrostatice  sau  de  operațiile  mecanice  pe  care  compoziția  le  suferă.  Acest  rezultat  a  fost  obținut  în  urma  unui  test  de  separare  (Fig.3)  care  a  urmărit  dacă  a  avut  sau  nu  loc  segregarea  vitaminei  B12.  

 

Produsul  obținut  poate  avea  diferite  arii  de  aplicație.  Acesta  poate  fi  utilizat  ca  aditiv  în   alimentele   animalelor   având   rol   în   creșterea   acestora,   dar   și   în   alimentele  umane.  O   altă  arie  de  utilizare  este  cea  a  cosmeticelor  care  se  aplică  pe  păr,  piele  sau  unghii,  spre  exemplu:  șampoane,  loțiuni  de  corp,  fond  de  ten,  farduri,  mascara,  rujuri,  pudră,  creme,  balsam  de  păr,  oje  etc.  

Fie   că   este   folosit   ca   supliment   alimentar   sau   ca   aditiv   în   produsele   cosmetice,  avantajul   folosirii  vitaminei  B12  este  că  nu   interferează  cu  alți  aditivi  din  compoziția  acestor  produse.  

Fermentația  aerobă  a  unei  culturi  de  microorganisme  O   altă   metoda   are   la   bază   fermentația   în   condiții   aerobe   a   unei   culturi   de  

microorganisme   nou-­‐descoperite:   Rhizobium   cobalaminogenum   27B74,   care   produce   toate  tipurile  de  vitamina  B12.  În  final  se  recuperează  vitamina  B12  produsă  prin  diferite  metode.  

Cultivarea   Rhizobium   cobalaminogenum   27B74   se   realizează   similar   cu   cea   a   altor  microorganisme,   nume   într-­‐un   mediu   care   conține   surse   de   carbon,   azot,   săruri,   acid  ribonucleic,   aminoacizi   și   vitamine.   Ca   surse   de   carbon   se   pot   folosi   carbohidrați   (glucoza,  maltoza,  sorbitolul,  amidon),  diferiți  acizi  organici  (acid  piruvic,  acid  fumaric,  acid  maleic,  acid  succinic),  alcooli  (metanol,  etanol),  amine.  Sursele    de  azot  pot   fi  organice  (peptide,   făină  de  soia)   sau   anorganice   (săruri   de   amoniu   ale   acidului   sulfuric,   azotic   sau   carbonic,   amoniac).    Alte  surse  nutritive  le  constituie  drojdiile  și  diferitele  săruri  de  calciu,  magneziu  sau  potasiu.  Acestea   pot   fi   folosite   singure   sau   în   amestec.   Este   de   preferat   ca   mediul   de   cultivare   a  microorganismelor  să  conțină  un  compus  al  cobaltului  (diferite  săruri  ale  cobaltului:  cloruri,  bromuri,   nitrați,   sulfați,   fosfați,   oxid   de   cobalt,   hidroxid   de   cobalt,   tiocianat   de   cobalt),   de  preferat   este   5,6-­‐dimetil-­‐benzimidazol,   care   duce   la   creșterea   randamentului   de   obținere   a  vitaminei  B12.  

Cultivarea   are   loc   în   condiții   aerobe.   Variația   pH-­‐ului   mediului   trebuie   să   fie   în  intervalul  4-­‐9.  Când  mediul  devine  prea  acid  sau  prea  bazic  se  poate  adăuga  o  bază  (carbonat  de   calciu,   hidroxid  de   sodiu,   amoniac,   etc.)   sau  un   acid   (   acid   sulfuric,   acid   hipocloros,   acid  

Fig.  3.  Testul  de  separare  care  a  confirmat  distribuția  omogenă  a  vitaminei  B12  în  produsul  obținut  

  6  

acetic,   etc.)   astfel   încât   valoarea   pH-­‐ului   să   fie   menținută   în   intervalul   4-­‐9.   Temperatura  mediului   în   care   se   cultivă   microorganismele   astfel   încât   să   aibă   loc   producerea   vitaminei    B12  trebuie  să  se  afle  în  intervalul  20-­‐45°C.  Timpul  de  cultivare  optim,  în  care  se  acumulează  cantitatea  maximă  de  vitamina  B12,  variază  între  2  și  10  zile.  

Extracția  vitaminei  B12  din  cultură  se  poate  realiza  prin  diferite  metode  de  separare  și  purificare  (extracție  cu  solvent,  precipitare,  cromatografie,  etc).  Un  exemplu  de  extracție  este  prezentat  în  continuare.    

Cultura   obținută   este   centrifugă   pentru   a   separa   celulele   bacteriene,   iar   pH-­‐ul   este  adus  la  valoarea  5.  Ulterior  se  adaugă  o  substanță  care  conține  ioni  de  cianură  și  se  încălzește  amestecul   obținut   pentru   a   se   forma   cianocobalamina,   care   este   extrasă   într-­‐o   fază   apoasă.  Pentru  a  obține  vitamina  B12  sub  formă  de  metil  derivat  sau  sub  formă  de  coenzimă  extracția  acesteia  se  realizează  cu  alcooli   (etanol,  propanol)  sau  cetone  (acetonă,  metil  etil  cetona).  O  altă   metodă   de   extracție   o   reprezintă   degradarea   membranei   celulare,   așa   cum   s-­‐a   a   fost  prezentată  la  metoda  anterioară.  

O  altă  variantă  de  obținere  a  vitaminei  B12  este  printr-­‐un  proces   în  șarje  care  are   la  bază  fermentația  unei  culturi  de  Propionibacterium.  

Prima   etapă   a   procesului   este   obținerea   unei   culturi   a   Propionibacterium   într-­‐un  fermentator.  Tulpina  de  Propionibacterium  utilizată  este  modificată  genetic  prin  mutageneză  clasică   sau   prin   tehnologia   de   recombinare   a   ADN-­‐ului.   Apoi   70-­‐90%   din   volumul   culturii  obținute   este   transferat   într-­‐un   al   doilea   fermentator,   unde   fermentația   are   loc   în   condiții  aerobe.  Cantitatea  de  oxigen  dizolvat  în  primul  fermentator  nu  trebuie  să  depășească  5%  din  saturația   aerului.  Este  de  preferat   ca   acest  procent   să   fie   sub  1%.  Etapa   fermentării   aerobe  este  de  preferat  să  aibă  loc  într-­‐o  serie  de  fermentatoare.  

Mediul  de  cultură  adecvat  trebuie  să  conțină  1-­‐50  mM  de    diferiți  nutrienți  (betaină,  metionină   sau   glutamină).   De   asemenea   se   poate   adăuga   și   un   alt   supliment   5,6-­‐dimetilbenzimidazol   (DBI)   a   cărui   cantitate   să   varieze   între   1-­‐40  mg/L.  De  preferat   este   ca  DBI  să  fie  adăugat  la  începutul  fazei  de  fermentare  aerobă.  Ca  soluție  în  care  are  loc  procesul  de  fermentație  poate  fi  folosită  melasa,  care  este  un  produs  secundar  la  obținerea  zahărului.  

Temperatura   pentru   cele   două   faze   de   fermentare   este   diferită.   Pentru   fermentația  anaerobă  temperatura  este  mai  mare  față  de  cea  în  condiții  anaerobe.  Timpul  necesar  pentru  fermentația  anaerobă  este  de  72  de  ore.  

Instalația  de  obținere  a  vitaminei  B12  (Fig.  4)  poate  produce  o  cantitate  de  360-­‐500  kg  de   B12   pură   pe   an.   Aceasta   este   formată   din   3   fermentatoare   a   căror   volum   este   de   25m3.  Cantitatea  de  melasă  necesară  anual  este  de  200-­‐250  tone.  Pe  lună  se  pot  realiza  10  cicluri  de  producție,  dacă  se  consideră  că  o  zi  este  destinată  preparării  și  curățării  instalației.      

Fig.  4.  Instalația  de  obținere  a  vitaminei  B12  

  7  

Bibliografie  1. J.   H.   Martens   et   al.,  Microbial   production   of   vitamin   B12,Appl.   Microbio.   Biotechnol.,  

2002,  58,  275-­‐285  2. Y.   Piao   et   al.,   Production   of   Vitamin   B12   in   Genetically   Engineered   Propoinibacterium  

freudenreichii,  J.  Biosci  Bioeng.,  2004,  98,  167-­‐173  3. H.  L.  Bijl,  Production  and  use  of  compositions  comprising  high  concentrations  of  vitami  

B12  activity,  U.S.  Pat.  No.  5955321,  Sept.  21,  1999  4. Jan  Hendik  Hunik,  Process  for  the  production  of  vitamin  B12,  U.S.  Pat.  No.  6492141  B1,  

Dec.  10,  2002  5. http://www.scribd.com/doc/8544035/Vitamin-­‐b12-­‐Production-­‐Parul?picrid=i&df=1