research paper - soongene.netsoongene.net/nonmun/ksbb g-13.pdf · trations of nacl (1-10%) and...

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 34(3): 207-215 (2019)http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2019.34.3.207 ISSN 1225-7117 / eISSN 2288-8268

Research Paper

갓김치에서 분리한 NaCl 및 캡사이신 내성 세균인 Bacillus amyloliquefaciens

G-13의 혈전용해활성

이현호 · 석지원 · 오계헌*

Fibrinolytic Activities of NaCl- and Capsaicin-resistant Bacterium,

Bacillus amyloliquefaciens G-13 Isolated from Mustard leaf Kimchi

Hyun-Ho Lee, Ji-Won Seok, and Kye-Heon Oh*

Received: 21 August 2019 / Revised: 20 September 2019 / Accepted: 21 September 2019

© 2019 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract: The purpose of this work was to investigate the

fibrinolytic activities of NaCl- and capsaicin-resistant bacte-

rium, Bacillus amyloliquefaciens G-13 isolated from fully fer-

mented mustard leaf kimchi. Initially, the physiological and

biochemical characteristics of strain G-13 were examined. 16S

rRNA sequencing analysis was performed to identify the strain,

and the strain was designated as B. amyloliquefaciens G-13.

B. amyloliquefaciens G-13 grew well in the different concen-

trations of NaCl (1-10%) and capsaicin (0-300 µg/mL) at 37oC.

B. amyloliquefaciens G-13 showed the strongest fibrinolytic

activity (3.42 unit/mL) in the absence of NaCl and capsaicin.

When B. amyloliquefaciens G-13 was cultivated in harsh con-

ditions, such as in LB media containing 10% NaCl and 300 µg/mL

capsaicin, the culture showed 0.74 unit/mL of fibrinolytic

activity for 84 h. To our knowledge, this is the first report of

the fibrinolytic activities of NaCl- and capsaicin-resistant bac-

terium isolated from kimchi, including mustard leaf kimchi.

Considering its high fibrinolytic activity and significant NaCl-

and capsaicin-resistance, B. amyloliquefaciens G-13 can be

used as a starter culture for various food fermentations.

Key words: AITC, allyl isothiocyanate, Bacillus amyloliquefa-

ciens G-13, mustard leaf kimchi

1. INTRODUCTION

식생활이 서구화됨에 따라 오늘날 우리 사회에는 성인병이

많이 발병하고 있으며, 그 중에서도 혈관 내 장애에 의한 사

망요인이 증가하고 있다. 특히 뇌혈관 질환은 혈관이 손상됨

에 따라 생성되는 혈전이 뇌혈관에 축적됨에 따라 병이 발생

한다 [1]. 이러한 혈전은 혈관 상처에 의해 활성화되는 트롬

빈 (thrombin)이 피브리노겐 (fibrinogen)을 피브린 (fibrin)으

로 전환하여 생성된다 [2]. 일반적으로 혈전은 플라스민

(plasmin)과 같은 체내 혈전용해 효소에 의해 분해되지만, 혈

관 내의 과도한 혈전의 생성 또는 혈전 용해 기능이 비정상

적일 경우 혈전이 혈관에 축적될 수 있다. 이러한 혈전의 축

적은 심장이나 뇌와 같은 특정조직에 산소와 영양물질 공급

을 차단하여 혈전증 (thrombosis)을 유발하며 심각한 장애를

유발할 수 있다 [3].

오늘날 혈전증을 치료하기 위해서 사용되는 혈전용해제로

는 streptokinase, urokinase, tissue plasminogen activator (tPA)

등이 있다. 그러나 이러한 혈전용해제들은 가격이 높고 혈중

에서 반감기가 짧고 전신출혈 등의 부작용들이 있으며,

urokinase를 제외하면 경구용으로 사용하기에 부적합하다

[4,5].

따라서 최근에는 식품섭취를 통해 혈전용해제의 부작용

을 줄이고, 보다 경제적인 혈전용해제를 위한 연구가 진행

되고 있다. Sumi 등은 일본의 발효식품인 natto (nattokinase)

와 shiokara (katsuwokinase)로부터 혈전용해 활성을 가진 균

주를 분리하였고, 이 세균들이 만드는 효소들을 경구 투여

시 체내 혈전용해 활성을 높일 수 있다고 보고하였다 [6-8].

순천향대학교 자연과학대학 생명시스템학과Department of Life Science and Biotechnology, SoonchunhyangUniversity, Chung-Nam 31538, Republic of KoreaTel: +82-41-530-1353, Fax: +82-41-530-1350e-mail: [email protected]

208 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 34(3): 207-215 (2019)

혈전용해 활성이 뛰어난 세균들은 우리나라 전통 발효식품

들에서도 많이 발견되고 있으며, 그 중 청국장, 된장, 간장,

김치 등의 식품에서 혈전용해 활성이 있는 균주들이 분리되

었다 [9-12].

갓 (mustard leaf)은 십자화과에 속하는 일년생 경엽(莖葉)

채소류로서, 쏘는 듯한 매운맛을 갖고 있으며 우리나라에서

는 김치를 담그는데 많이 이용되고 있다. 이러한 갓은 배당

체인 sinigrin이 myrosinase의 작용에 의해 allyl isothiocyanate

(AITC)가 생성되며, 이 성분은 김치의 발효 시에 황을 포함

하는 성분을 생성한다. 이러한 함황(含黃) 물질들은 갓김치

의 발효 시에 항균작용을 나타내 발효를 지연시켜서 다른 김

치에 비해 저장성을 증가시킨다 [13,14]. 또한 갓에는 칼슘,

칼륨, 철 등의 무기질 성분이 풍부하게 포함되어있으며, 다

른 김치에 사용되는 경엽 채소류에 비해 항산화 효능을 가진

것으로 알려진 β-카로텐 (β-carotene), 아스코르브산 (ascorbic

acid), 엽록소 등이 많이 함유되어 있다 [15]. 그러나 갓김치

를 포함한 갓으로 만든 음식에서의 항산화능에 관한 연구는

일부 알려져 있으나 [16], 갓김치로부터 유래하는 혈전용해

활성에 대한 연구는 보고된 바 없다.

갓김치는 일반적인 김치와 마찬가지로, 소금에 절인 갓에

고춧가루, 파, 마늘 등의 부재료가 첨가되어 만들어진다. 이

러한 부재료들은 김치의 발효에 영향을 끼치며, 특히 김치

발효에서 소금 절임은 염분 농도에 따라 숙성에 관여하는 젖

산균의 생장이 달라짐이 보고된 바 있다 [17]. 그 외에도 소

금 절임에서 소금의 농도와 종류에 따라 절임 채소의 염도를

좌우할 뿐만 아니라, 김치의 발효에 커다란 영향을 미치며,

김치의 저장성에 큰 영향을 끼친다 [18]. 김치의 제조에 사용

되는 고춧가루에는 무색의 지용성 알칼로이드인 캡사이시

노이드 (capsaicinoid)에 속하는 캡사이신이 많이 포함되어있

으며, 이 성분은 김치의 매운맛을 띠게 하고, 위벽을 자극하

여 소화액의 분비를 촉진시키며, 교감신경을 활성화하여 에

너지 대사를 증가시켜 비만을 억제하고, 항균활성이 있는 것

으로 보고되었다 [19,20].

본 연구에서는 갓김치에서 캡사이신과 염분에 내성이 있

으며 혈전용해 활성이 뛰어난 균주인 Bacillus amyloliquefaciens

G-13을 분리하였으며, 이 균주에서 캡사이신과 염분의 다양

한 농도와 노출시간에 따른 혈전용해 활성을 검증하여 비교

분석하였다.

2. MATERIAL AND METHOD

2.1. 균주분리 및 배양조건

가정에서 만든 갓김치 시료로부터 혈전용해 활성이 있는 균

주를 분리하였다. 갓김치를 잘게 잘라서 5% NaCl과 캡사이

신 100 μg/mL이 포함된 멸균된 증류수 100 mL가 들어있는

Erlenmeyer 플라스크에 넣고 진탕 배양기 (37oC, 160 rpm)에

3시간 동안 진탕하였다. 혈전용해효소를 생산하는 균주를

분리하기 위해 진탕 배양한 플라스크의 배양액 100 μL을 5%

NaCl과 1% skim milk가 포함된 Luria-Bertani (LB) 고체배지

에 도말하였고 37oC의 배양기에서 48시간 동안 배양하였다.

이 후, 고체 평판 상에서 투명대 (clear zone)를 형성하는 집락

을 선별하였다. 선별된 균주의 캡사이신 내성을 확인하기 위

해 Agarwal 등 [20]의 방법을 변형하여 well-diffusion assay를

실시하였다. 5% NaCl이 포함된 LB 고체배지에 1차 선별한

세균들을 도말하고 멸균한 cork borer를 이용해 6 mm의 well

을 만들었다. 캡사이신을 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 녹여

100, 150, 200, 250, 300 μg/mL의 농도의 캡사이신 용액을 제

조하였고, 각 well에 캡사이신 용액 100 μL를 주입했다. 24시

간 동안 배양기 (37oC)에서 LB 고체배지를 배양하여 투명대

를 측정하였다. 300 μg/mL의 캡사이신 농도에서 투명대가

형성되지 않은 세균을 확인한 후, fibrin plate assay를 통해 혈

전용해 활성이 우수한 세균을 최종 선별하였다. 분리세균은

LB 배지 (증류수 1 L당, 5 g tryptone, 10 g yeast extract, 10 g

NaCl)에 접종하였고 진탕배양기 (160 rpm, 37oC)에서 배양

을 유지하며 본 실험에 사용하였다.

2.2. 16S rRNA 염기서열 분석에 의한 동정 및 계통수 분석

분리 세균 G-13의 계통수 (phylogenetic tree)를 작성하기 위

하여 16S rRNA의 sequencing을 실시하였다. G-13 균주를 이

용해 genomic DNA를 G-spin Genomic DNA Extraction Kit

(Intron, Korea)을 사용하여 추출하였다. 추출한 DNA의 16S

rRNA 유전자를 중합효소연쇄반응 (PCR)로 증폭하기 위해

primer는 27F primer (5´-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´)

와 1492R primer (5´-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3´)

를 사용하였고, PCR은 추출한 DNA를 주형으로 하여 PCR

premix (GenDEPOT, Korea)를 사용하여 실시되었다. 수행조

건은 변성 (denaturation) (94oC, 1분), 냉각 (annealing) (60oC,

1분), 신장 (elongation) (72oC, 1분) 단계를 32회 반복한 후,

72oC에서 10분간 유지하였다. PCR 결과물을 agarose extraction

kit (Intron, Korea)를 이용하여 gel상에서 회수하였고, 염기서

열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 BLAST를 통해 상동성

을 비교하였고, 이를 통해 작성한 계통수는 Mega7 (The

Biodesign Institute, Arizona State University, AZ, USA)과 Bio

Edit (Ibis Biosciences, Carlsbad, CA, USA) 프로그램을 이용

하여 작성하였다.

2.3. 분리세균의 형태학적 관찰 및 생리 화학적 특성조사

분리세균을 고체 영양배지에 도말하여 단일 집락 형태를 관

찰하였고, 그람염색 후 현미경을 사용해 세균의 형태학적 특

성을 조사하였다. Glucose 이용여부, indole 생성유무, methyl

red-voges proskauer (MR-VP) 시험, 녹말 이용여부, citrate 이

용여부 gelatin 분해유무, catalase 생성유무, oxidase 생성유

무, Kligler iron agar (KIA) 시험, litmus milk 시험 등을 실시

하여 분리 세균의 생리 화학적 특성을 조사하였다. Glucose 이

용 여부를 알아보기 위해, 탄소원으로 1% glucose와 지시약

인 phenol red를 포함하는 액체 배지에 분리 세균을 접종하여

색변화를 관찰하였다. indole 생성유무를 알아보기 위해 1%

https

https

갓김치에서 분리한 NaCl 및 캡사이신 내성 세균의 혈전용해 활성 209

tryptone이 포함된 액체배지가 들어있는 시험관에 균주를 접

종한 후 세균을 37oC에서 24시간 동안 배양하였다. 멸균한

MR-VP 배지 (Difco, Detroit, MI, USA)가 들어있는 시험관에

분리세균을 접종하였다. 24시간 동안, 37oC의 배양기에서 배

양한 MR-VP 배지를 두 개의 시험관에 각각 반씩 분주한 뒤,

MR-VP 시험을 실시하였다. MR 시험에서는 pH 지시약인

methyl red와 VP 시험에서는 α-naphthol와 40% KOH을 첨가

하였다. 이 후, 각 배지에서 색변화를 관찰하였다. 분리세균

의 녹말 분해여부를 알아보기 위해, 녹말이 포함된 고체 영

양배지 (nutrient agar)에 도말하였다. 집락이 형성되면 집락

주변에 그람 요오드 용액을 첨가하였고 투명대 형성 여부를

확인하였다. 분리세균의 citrate 이용여부를 파악하기 위해,

Simmon’s citrate 배지 (Difco, Detroit, MI, USA)에 분리세균

을 접종하였고, 이 후 배지의 색변화를 관찰하였다. Litmus

milk (Difco, Detroit, MI, USA)가 들어있는 시험관에 분리세

균을 접종하였고 48시간 동안 37oC의 환경에서 세균을 배양

하였다. 이 후, 배양의 펩톤화 (peptonization) 여부를 관찰하

였다.

2.4. NaCl 농도와 캡사이신 농도에 따른 분리세균의 생장

측정

분리세균의 생장을 측정하기 위하여 1%, 5%, 10% NaCl과 0

μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL 캡사이신이 포함

된 LB 배지를 준비하였다. 24시간 간격으로 세균배양액

1 mL를 채취하여, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리 한 뒤, 상

등액을 제거하여 분리세균의 팰릿으로부터 PRO-PREP protein

extraction solution (Intron, Korea)을 이용하여 단백질을 추출

하였다. 추출한 단백질은 Bradford assay [21]를 통해 정량하

였다.

2.5. NaCl 농도와 캡사이신 농도에 따른 혈전용해 활성의

측정

분리세균의 혈전용해 활성을 측정하기 위하여 1%, 5%, 10%

NaCl과 0 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL 캡사이

신이 포함된 LB 배지를 준비하였다. 각각 다른 농도의 NaCl

과 캡사이신이 포함된 LB 액체 배지 100 mL에 세균배양액

을 1% 접종하여, 37oC, 160 rpm에서 96시간 동안 배양하였

다. 배양 기간 중 12시간마다 배양액을 샘플링하고, 원심분리

하여 상등액을 준비하였다. 상등액은 0.45 μm syringe filter로

여과하였으며, 여과된 상등액의 혈전용해 활성은 Astrup 등

[22]의 fibrin plate 방법에 의해여 측정하였다. Fibrinogen은

0.1 M sodium phosphate buffer 5 mL에 0.6%의 농도가 되도

록 용해시키고, 동일한 완충용액에 녹인 1.5% agarose 용액

5 mL를 혼합시킨 후, thrombin (100 NIH units) 100 μL을 혼

합 용액에 첨가하였으며, 즉시 혼합 용액을 고체 평판에 붓

고 실온에서 30분 동안 방치하여 굳혔다. 준비된 fibrin plate

에 파스퇴르 피펫을 이용하여 지름 3 mm의 well을 만들었으

며, 그 후 fibrin plate의 각 well에는 각 시료 10 μL를 첨가한

뒤 37oC에서 18시간 동안 반응시켰다. 시료에 대한 대조구는

1 unit의 정제된 혈전용해효소인 plasmin을 이용하였다. 반응

이후 생성된 투명대는 ImageJ 프로그램을 이용해 면적을 측

정하였다. 혈전용해 활성은 다음과 같이 계산하였다.

혈전용해 활성 (unit/mL) =

3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. 세균의 분리 및 배양

본 연구에 사용된 분리세균은 가정에서 만든 갓김치에서 농

화배양기법으로 분리하였다. 염분과 캡사이신 내성 세균을

일차적으로 분리하기 위해 5% NaCl과 100 μg/mL의 캡사이

신이 포함된 멸균수 100 mL가 담긴 Erlenmeyer 플라스크에

갓김치 시료를 넣어 3시간 동안 진탕 배양하였다. 이 후, 배

양액 100 μL을 skim milk 1%와 NaCl 5%가 포함된 고체 LB

배지에 도말하였고, 48시간 동안 배양하였다. 배지 내 집락

주변 투명대의 존재를 통해 분리 세균이 단백질을 분해할 수

있는 능력이 있다고 판단하였다. 이를 통해, 고체 배지 내에

skim milk를 분해하여 투명대를 생성하는 5가지 균주를 1차

선별하였다. 선별한 5가지의 균주에서 캡사이신에 대한 내

성을 확인하기 위해 well-diffusion assay를 이용하였다. 이 후,

300 μg/mL의 캡사이신 농도에서 투명대를 형성하지 않은 2

가지 균주를 확인한 뒤, 이들 균주를 대상으로 fibrin plate를

통한 혈전분해능의 검증을 통하여 활성이 더 우수한 G-13 세

균을 최종 선별하였다.

3.2. 16S rRNA 염기서열에 의한 동정 및 계통수 분석

갓김치에서 분리한 세균 G-13은 universal primer를 이용해

16S rRNA를 증폭하였다. 이렇게 해서 얻은 염기서열 분석은

NCBI의 BLAST를 이용해 상동성을 비교하였다. 그 결과, G-13

은 Bacillus amyloliquefaciens (99%)로 동정되었으며, GenBank에

[MN249498]로 등록하였다. G-13과 여러 Bacillus 종에 속하

는 다른 균주들과의 유사관계는 16S rRNA 염기서열 분석 결

과에 기초하여 유전적 계통수 (phylogenetic tree)를 통해 나

타내었다 (Fig. 1).

3.3. 분리세균의 형태학적, 생리 화학적 특성조사

분리세균인 G-13은 그람염색을 하고 현미경을 통해 형태학

적 관찰을 실시하였다. 그 결과로 이 세균은 그람양성의 간

균으로 관찰되었다. 또한 G-13에 대한 여러 생리 화학적 특

성조사를 실시하였다. Glucose 액체배지에 G-13을 접종한

결과로 배지의 색이 붉은색에서 노란색으로 변하였다. 인돌

생성실험에서는 음성결과가 나타났으며, MR-VP 시험에서

는 methyl red와 α-naphthol을 각각 첨가한 결과, 모두 음성으

로 나타났다. 녹말배지와 젤라틴 배지에서 모두 투명대를 확

인할 수 있었으며, Simmon’s citrate 배지에서는 배지의 색깔

이 파란색으로 변하여 양성으로 나타났다. Kligler iron agar

배지에서 disulfhydrase에 의한 어떠한 변화도 관찰되지 않았

시료의 용해면적 mm2

( )

plasmin의 용해면적 mm2

( )-----------------------------------------------------------------------


으며, litmus milk 배지에서는 펩톤화(peptonization)가 확인

되었다. Catalase 실험에서는 기포를 확인할 수 없었으며,

oxidase 실험에서는 Kovac 시약에 의한 색 변화를 관찰할 수

없었다 (Table 1).

3.4. NaCl 농도에 따른 분리세균의 생장

다양한 농도 (1%, 2.5%, 5%, 7.5% 10%)의 NaCl이 포함된 액

체배지 (w/v)를 제조하여, 각 배지에 G-13을 접종하여, 120

시간 동안 24시간 간격으로 Bradford assay [21]와 흡광도 측

정을 통해 G-13의 생장을 조사하였다. 접종 후 분리세균 G-

13은 모든 NaCl 농도에서 72시간까지 흡광도 값과 단백질량

이 상승하였으며 72시간에서 최대의 생장을 보여주었다. 이

후 단백질 농도와 흡광도 값은 점차 감소하는 양상을 보였다

(Fig. 2). 최대 생장 기준인 72 시간의 배양을 기준으로 하여,

분리세균의 단백질량 (흡광도 값)은 1% NaCl의 농도에서

4.72 μg/mL (3.24), 2.5% NaCl의 농도에서 4.51 μg/mL (2.85),

5% NaCl의 농도에서 4.2 μg/mL (2.47), 7.5% NaCl의 농도에

서 3.88 μg/mL (2.08), 10% NaCl의 농도에서 3.41 μg/mL (1.85)

로 나타났다. NaCl의 농도가 높아짐에 따라 분리세균의 생

장은 점차 저해되었다. Lee 등 [23]은 전통 대두발효 식품에

서 분리한 B. amyloliquefaciens의 염분 9%에서의 최대 흡광

도 값을 약 0.61로 보고하였는데, 이 결과와 비교해 볼 때, 본

실험에 사용한 G-13 균주의 흡광도는 10%의 염분에서 1.85

로서 상당히 높은 생장을 보여주었다.

3.5. NaCl 농도에 따른 혈전용해효소의 활성

분리세균 B. amyloliquefaciens G-13을 1%, 5%, 10%의 NaCl

이 포함된 LB 액체배지에 분리세균을 각각 접종한 뒤 96시

간동안 매 12시간 마다 배양액을 채취하여, 피브린 평판에서

투명대의 크기를 통해 혈전용해 활성을 측정하였다 (Fig. 3).

대조군인 plasmin (1 unit/mL)의 투명대 크기를 대조군으로

설정하였고, 그 결과 모든 NaCl 농도에서 혈전용해 활성은

84시간 까지 지속적으로 증가하였으며, 96시간에서 활성이

줄어드는 것으로 나타났다. 최대 혈전용해 활성을 보인 84시

간 기준으로 염분 1%에서 3.42 unit/mL, 5%에서 2.65 unit/mL,

10%에서 1.93 unit/mL의 혈전용해 활성을 각각 확인하였다.

이를 통해 NaCl의 농도가 높을수록 G-13의 혈전용해 활성이

떨어지는 것을 알 수 있었으며, 혈전용해 활성 감소율은 1%

의 NaCl의 혈전용해 활성을 기준으로 5%에서는 26%, 그리고

10%에서는 44%의 감소를 보여주었다. Noh 등 [16]은 김치로

Fig. 1. Phylogenetic trees of the strain, B. amyloliquefaciens G-13 (●) based on 16S rRNA gene sequences. The trees were constructedby the neighbor-joining method. Number at nodes are bootstrap percentage based on 1000 resampled data sets. GenBank accession

numbers are given in parentheses. Bar, 0.0050 changes per nucleotide.

Table 1. Morphological and physiological characteristics of the

isolate, B. amyloliquefaciens G-13 isolated from mustard leaf kimchi

Morphological characteristics

Cell shape Rod

Gram staining positive

Physiological characteristics

Glucose +

Indole production −

Methyl red −

Voges-proskauer −

Starch hydrolysis +

Gelatin hydrolysis +

Catalse −

Oxidase −

Simmon’s citrate +

H2S (KIA) −

Litmus milk +

+: Positive reaction, -: Negative reaction.


부터 Bacillus amyloliquefaciens, Micrococcus luteus, Bacillus

brevis를 분리하였고, NaCl이 없을 때 혈전용해 활성을 언급

한 순서대로 2.58 unit/mL, 2.03 unit/mL, 1.48 unit/mL로 각각

보고하였는데, 이와 비교하여 볼 때, 본 실험에서 사용된 균

주인 B. amyloliquefaciens G-13은 훨씬 높은 혈전용해 활성

인 3.42 unit/mL를 보여주었다. Back 등 [24]은 간장에서 분

Fig. 2. Growth of B. amyloliquefaciens G-13, measured as protein amount based on Bradford assay (a) and absorbance (A600) by

spectrophotometer (b), at the concentrations of 1% (○), 2.5% (●), 5% (▲), 7.5% (■), and 10% (◆) NaCl. These data represent themean±SD based on triplicate studies.

Fig. 3. (A). Time course of fibrinolytic activity from B. amyloliquefaciens G-13 at the concentrations of 1% (○), 5% (●), and 10% (▲)NaCl, respectively. These data represent the mean±SD based on triplicate studies (A); Clear zones were measured during the incubation

period – 1. 12 h, 2. 24 h, 3. 36 h, 4. 48 h, 5. 60 h, 6. 72 h, 7. 84 h, 8. 96 h (B).


리한 B. licheniformis가 10% NaCl 농도에서 약 0.98 unit/mL

의 혈전용해 활성을 나타내는 것으로 보고하였다. 또한 Choi

등 [25]은 된장에서 분리한 B. amyloliquefaciens DJ-4의 배양

액에 10% NaCl을 첨가하여 12시간 배양하였을 때의 혈전용

해 활성을 0.14 unit/mL으로 보고하였다. 이들 결과와 비교하

였을 때, 본 연구에서 사용된 G-13은 10% NaCl의 농도에서

혈전용해 활성이 1.93 unit/mL으로 측정되어, 고농도의 NaCl

농도에서도 탁월한 활성이 있는 것으로 밝혀졌다.

3.6. 캡사이신 농도에 따른 분리세균의 생장

캡사이신 농도에 따른 분리세균의 생장을 알아보기 위해 분

리세균 G-13을 0 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL

농도의 캡사이신을 포함하는 LB 배지에 각각 접종한 뒤, 총

120시간 동안 24시간 간격으로 배양액을 채취하여 Bradford

assay [22]를 이용한 단백질 정량을 통한 생장을 측정하였다.

분리세균 G-13은 모든 캡사이신 농도에서 72시간까지 단백

질량이 상승하여 최대 생장을 보였으며, 그 후 단백질량은 점

차 감소하였다 (Fig. 4). 캡사이신 농도(0 ug/ml, 100 μg/mL,

200 μg/mL, 300 μg/mL)에 따른 최대 단백질량은 언급한 순

서대로 4.72 μg/mL 4.18 μg/mL 3.42 μg/mL 2.84 μg/mL로 나

타났다. 캡사이신 농도에 따른 단백질량은 캡사이신이 미첨

가된 배양액의 단백질량을 기준으로 하여, 100 μg/mL에서

12%, 200 μg/mL에서 28%, 300 μg/mL에서 40% 감소율을 보

였다. 이런 결과를 바탕으로 캡사이신의 농도가 높을수록 분

리세균의 생장이 저해되는 것으로 나타났다. Nascimento 등

[26]은 캡사이신에 대한 Bacillus subtilis의 최소저해농도(MIC)

를 25 μg/mL로 보고하였다. 또한 Jones [27]은 식품 매개 병

원체인 Helicobacter pylori의 50 μg/mL의 캡사이신 농도에

서 생장이 억제됨을 보고하였다. 이들 보고를 바탕으로 캡사

이신이 여러 세균에서 생장을 억제하였으나, 본 실험에서 사

용된 G-13 균주는 고농도의 캡사이신 농도에서도 생장하는

것으로 관찰되었다. 따라서 본 실험에 사용된 균주인 B.

amyloliquefaciens G-13은 캡사이신에 대한 내성이 매우 뛰어

난 것으로 사료된다.

3.7. 캡사이신 농도에 따른 혈전용해효소의 활성

캡사이신 농도에 따른 분리세균의 혈전용해 활성을 알아보

기 위해, 캡사이신 0 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL

농도의 LB 배지에 분리세균을 각각 접종하고, 96시간 동안

12시간 간격으로 배양액을 채취하여 fibrin plate assay를 이

용해 혈전용해 활성을 측정하였다. 그 결과, 모든 캡사이신

농도에서 84시간 까지 혈전용해 활성이 증가하여 최대 활성

을 보였으며, 이후 혈전용해 활성이 감소하였다 (Fig. 5). 캡

사이신 농도에 따른 혈전용해 최대 활성은 각각 0 μg/mL에

서 3.42 unit/mL, 100 μg/mL에서 3.1 unit/mL, 200 μg/mL에서

2.79 unit/mL, 300 μg/mL에서 2.2 unit/mL로 각각 나타났다.

캡사이신 농도에 따른 혈전용해 감소율은 캡사이신 0 μg/mL

를 기준으로 하여 100 μg/mL에서 7%, 200 μg/mL에서 16%,

300 μg/mL에서 34%를 보여주었다. 이를 통해 캡사이신의

농도가 높을수록 혈전용해 활성이 떨어지는 것으로 나타났

다. 캡사이신에 의한 혈전용해 활성의 영향에 대한 연구는

보고된 바 없다.

3.8. NaCl 및 캡사이신 농도에 따른 분리균주의 생장

B. amyloliquefaciens G-13의 NaCl과 캡사이신의 존재 하에서

내성을 확인하기 위해, 다양한 농도의 캡사이신 (0 μg/mL,

Fig. 4. Growth of B. amyloliquefaciens G-13, measured as protein

amount based on Bradford assay, at the concentrations of 0 µg/mL

(○), 100 µg/mL (●), 200 µg/mL (▲), 300 µg/mL (■) capsaicin.These data represent the mean±SD based on triplicate studies.

Fig. 5. Time course of fibrinolytic activity from B. amyloliquefaciens

G-13 at the concentrations of 0 µg/mL (○), 100 µg/mL (●), 200

µg/mL (▲) and 300 µg/mL (■) capsaicin, respectively. Thesedata represent the mean±SD based on triplicate studies.


100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL)과 NaCl (5%, 10%)을 각

각 첨가한 LB 배지에 접종한 뒤, 120시간 동안 24시간 간격

으로 Bradford assay [22]를 통해 생장을 측정하였다 (Fig. 6).

그 결과, 이전에 기술된 단일 NaCl (Fig. 2)이나 캡사이신

(Fig. 4)에서의 얻어진 결과와 마찬가지로, 병용 첨가된 NaCl

과 캡사이신의 농도가 증가할수록 G-13 균주의 생장이 크게

저해되는 것으로 나타났다. 모든 NaCl과 캡사이신 농도에서

G-13의 단백질량은 접종 후 72시간까지 증가하였으며, 그 이

후로 점차 감소하였다. 최대 생장 시간인 72시간을 기준으로

하여, 5% NaCl에 캡사이신 (0 μg/ml, 100 μg/mL, 200 μg/mL,

300 μg/mL)이 병용 첨가된 배양액에서 단백질량은 4.2 μg/mL,

3.72 μg/mL, 3.12 μg/mL, 2.62 μg/mL였으며 (Fig. 6(a)), 동일

한 방법으로 10% NaCl에 캡사이신이 병용 첨가된 경우에 단

백질량은 각각 3.32 μg/mL, 3.01 μg/mL, 2.68 μg/mL, 2.2 μg/

mL로 나타났다 (Fig. 6(b)). 이 결과를 통해 이전에 기술된

NaCl (Fig. 2) 또는 캡사이신 (Fig. 4)이 첨가된 배양에서의 생

장보다 NaCl과 캡사이신을 병용하여 분리세균을 배양했을

때 생장은 크게 저해되었으나, B. amyloliquefaciens G-13은

높은 농도의 NaCl과 캡사이신이 첨가된 배양에서 생장하여

이들 성분에 대하여 강한 내성이 있는 균주로 생각된다.

3.9. NaCl 및 캡사이신 농도에 따른 혈전용해 활성

B. amyloliquefaciens G-13의 NaCl과 캡사이신의 존재 하에

서 혈전용해 활성을 확인하기 위해, NaCl과 캡사이신을 첨

가한 LB 배지에 접종하여 96시간 동안 12시간 간격으로 배

양액을 채취하여 피브린 평판법으로 혈전용해 활성을 측정

하였다 (Fig. 7). 그 결과, NaCl과 캡사이신의 농도가 높을수

록 분리 세균의 혈전용해 활성이 감소하는 것으로 나타났다.

모든 NaCl과 캡사이신 농도에서 혈전용해 활성은 배양 후

지속적으로 증가하여 84시간에서 최대 활성을 보였으며, 시

간이 경과함에 따라 점차 감소하였다.

NaCl이나 캡사이신이 들어있지 않은 상태에서 최대 혈전

용해 활성은 3.42 unit/mL이었으며, 이들 성분의 농도가 증가

함 함에 따라 혈전용해 활성은 감소되는 것으로 나타났다.

병용된 NaCl (5%, 10%)과 캡사이신 (0 μg/mL, 100 μg/mL,

200 μg/mL, 300 μg/mL) 농도에 따른 최대 혈전용해 활성은 5%

NaCl에서 낮은 캡사이신 농도부터 2.65 unit/mL, 2.35 unit/mL,

1.81 unit/mL, 1.34 unit/mL를 보였으며, 10% NaCl에서 낮은 캡

사이신 농도부터 각각 1.93 unit/mL, 1.56 unit/mL, 1.19 unit/mL,

0.74 unit/mL로 나타났다.

본 연구에서 얻어진 다양한 농도의 NaCl과 캡사이신이 첨

가된 G-13 배양에서의 최대 혈전용해 활성의 결과를 비교하

여 요약하였다 (Table 2). NaCl과 캡사이신이 미첨가된 혈전

용해 활성인 3.42 unit/mL를 기준으로 하여 NaCl (5%, 10%)

을 단일로 처리하여 배양했을 때의 혈전용해 감소율은 5%

NaCl에서 23%, 10% NaCl에서 44%로 나타났으며, 캡사이신

을 단일로 처리하여 배양했을 때의 혈전용해 감소율은

100 μg/mL에서 7%, 200 μg/mL에서 16%, 300 μg/mL에서

34%로 관찰되었다. NaCl (5%, 10%)과 최고 농도인 캡사이

신 (300 μg/mL)을 병용했을 때 혈전용해 활성 감소율은

61%, 79%로 나타났다. 이런 결과를 통해 NaCl과 캡사이신

을 병용하여 분리세균을 배양하였을 때, 혈전용해 활성은 단

일로 NaCl이나 캡사이신을 첨가해 배양하였을 때 보다 혈전

용해 활성은 더욱 감소하였다. 김치류의 KS 규격에서 김치

의 매운 정도는 함유된 캡사이시노이드(Capsaicinoid)의 농

도에 따라, 순한 맛 (4 μg/mL 미만), 보통 매운맛 (4-12 μg/

mL), 그리고 매운맛 (12 μg/mL 이상)으로 구분하였다 [28].

본 실험에서는 김치의 매운 맛의 범위를 훨씬 능가하는

Fig. 6. Growth of B. amyloliquefaciens G-13 following the different concentrations of NaCl and capsaicin; (a) at 5% NaCl and different

concentrations of capsaicin [0 µg/mL (○), 100 µg/mL (●), 200 µg/mL (▲), 300 µg/mL (■)], and (b) at 10% NaCl and different

concentrations of capsaicin [0 µg/mL (○), 100 µg/mL (●), 200 µg/mL (▲), 300 µg/mL (■)], respectively. These data represent themean±SD based on triplicate studies.


300 μg/mL 캡사이신과 높은 10% NaCl에서 균주를 배양하였

을 때, 여전히 높은 혈전용해 활성을 보이는 것으로 나타났

다.

오늘날 청국장이나 된장과 같은 장류(醬類), 새우젓, 버섯

등의 발효식품에서 분리된 미생물들에서 혈전용해 활성이

보고되어 많은 관심의 대상이 되고 있다. 김치에서 분리된

균주에 의한 혈전용해 활성도 알려져 있으나, 제한된 농도의

NaCl에 노출된데 비하여, 본 연구를 통해서 갓김치에서 분리

한 B. amyloliquefaciens G-13이 NaCl 뿐만 아니라 고농도의

캡사이신 존재 하에서 생장이 뛰어나며 혈전용해 활성이 우

수한 것으로 확인되었다. 우리가 아는 한, 분리세균 B.

amyloliquefaciens G-13은 캡사이신 뿐만 아니라, NaCl과 캡

사이신 병용 시에 혈전용해 활성을 보고한 최초의 논문이다.

따라서 이 분리균주는 매운맛과 짠맛의 발효식품에서 접종

물(starter)로 사용될 수 있으며, 혈전용해 활성이라는 기능성

을 통해 국민건강에 기여할 수 있을 것으로 보인다. 향후 연

구는 이 분리세균이 고농도의 NaCl과 캡사이신에서 어떻게

생존이 가능한지와 고균(Archaea)과의 차이에 대해서도 병

행 연구가 진행되어야 할 필요가 있다고 사료된다.

4. CONCLUSIONS

본 연구는 발효된 갓김치로부터 NaCl과 캡사이신에 내성이

있는 균주인 Bacillus amyloliquefaciens G-13을 분리하여 고

농도의 NaCl과 캡사이신 하에서 혈전용해 활성을 알아보기

위하여 수행되었다. 먼저 균주 G-13의 생리생화학적 특성조

사를 실시하였다. 16S rRNA 분석을 통하여 이 균주를 동정

하였으며, 이 균주는 B. amyloliquefaciens G-13로 명명하였

다. 분리 세균의 생장과 혈전용해 활성의 변화를 배양기간에

따라 모니터링 하였다. B. amyloliquefaciens G-13은 다양한

NaCl (1-10%)과 캡사이신 (0-300 μg/mL) 농도에서 잘 생장

하였다. NaCl과 캡사이신이 없는 상태에서 혈전용해 활성은

3.42 unit/mL의 높은 활성을 보여주었으며, 본 연구에서 수행

된 고농도의 NaCl (10%)와 캡사이신 (300 μg/mL)이 동시에

포함된 배지에서도 최대 0.74 unit/mL의 활성을 보여주었다.

우리가 아는 한, 김치에서 분리된 NaCl과 캡사이신 내성 세

균의 혈전용해 활성을 보고한 것은 이번이 처음이다. 이같이

높은 혈전용해 활성, 상당한 염분과 캡사이신에 대한 내성,

생장력 등을 고려해볼 때, B. amyloliquefaciens G-13은 매운

맛의 발효식품을 위한 접종물로 사용될 수 있다.

REFERENCES

1. Harlan, J. M. and L. A. Harker (1981) Hemostasis, thrombosis,

Fig. 7. Time course of fibrinolytic activity from B. amyloliquefaciens G-13 following the different concentrations of NaCl and capsaicin;

(a) at 5% NaCl, and different concentrations of capsaicin [ 0 µg/mL (○), 100 µg/mL (●), 200 µg/mL (▲), 300 µg/mL (■)], and (b) at

10% NaCl and different concentrations of capsaicin [0 µg/mL (○), 100 µg/mL (●), 200 µg/mL (▲), 300 µg/mL (■)], respectively.These data represent the mean±SD based on triplicate studies.

Table 2. Comparison of maximum fibrinolytic activities of G-13

cultured in LB broth in the different concentrations of NaCl and

capsaicin (unit/mL)

NaCld

Capsaicin1% 5% 10%

0 µg/mL 3.42 (100%) 2.65 (77%) 1.93 (56%)

100 µg/mL 3.11 (93%) 2.32 (67%) 1.56 (45%)

200 µg/mL 2.79 (84%) 1.81 (52%) 1.19 (34%)

300 µg/mL 2.23 (66%) 1.34 (39%) 0.74 (21%)

*1% NaCl - LB medium (per liter) contains tryptone (5 g), yeast extract

(10 g) and NaCl (10 g).


and thromboembolic disorders. Med. Clin. North. Am. 65: 855-857.

2. Mullertz, S. (1987) Fibrinolysis, general aspects, characteristic fea-

tures and perspectives: International committee for fibrinolysis-

kabi prize lecture. Fibrinolysis 1: 3-12.

3. Gomez, C. C., R. Simoncarballo, A. C. Coma, T. Sanchez de

Leon, D. E. Montero, and P. R. Rodriguez (1991) The relationship

between lipid peroxidation and platelets aggregation in atheroscle-

rotic patients. Angiologica 43: 241-246.

4. Nakajuma N., N. Taya, and H. Sumi (1993) Characterization of

potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus.

Biosci. Biotechnol. Biochem. 57: 1726-1730.

5. Nakashima, A., T. Okada, and I. Sµgie (1990) Fibrin-dependent

activation of plasminogen by a proteolytic digest of streptokinase.

Blood Coagul. Fibrinolysis 1: 279-284.

6. Sumi, H., H. Hamada, H. Tsushima, H. Mihara, and H. Muraki

(1987) A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable

cheese natto, a typical and popular soybean food in the Japanese

diet. Experientia 43: 1110-1111.

7. Sumi, H., N. Nakajima, and C. Yatagai (1995) A unique strong

fibrinolytic enyme (katsuwokinase) in skipjack “shiokara” a Japa-

nese traditional fermented food. Comp. Biochem. Physiol. 112:

543-547.

8. Nakajima N., N. Taya, and H. Sumi (1993) Potent fibrinolytic

enzyme from the lysate of Katsuwonus pelamis digestive tract

(Shiokara): purification and characterization. Biosci. Biotechnol.

Biochem. 57: 1604-1605.

9. Sohn, B. H. and K. H. Oh (2006) Isolation and characterization of

the fibrinolytic enyme producing bacterium isolated from natu-

rally fermented chungkookjang. J. Kor. Acad. Industr. coop. Soc.

7: 476-482.

10. Kim, S. H., N. S. Choi, W. Y. Lee, J. W. Lee, and D. H. Kim

(1998) Isolation of Bacillus strains secreting fibrinolytic enzymes

from Doenjang. Kor. J. Microbiol. 34: 87-90.

11. Yun, G. H., E. T. Lee, and S. D. Kim (2003) Purification and char-

acterization of a fibrionlytic enzyme produced from Bacillus amy-

loliquefaciens K42 isolated from Korean soy sauce. Kor. J.

Microbiol. Biotechnol. 284-291.

12. Noh, K. A., D. H. Kim, N. S. Choi, and S. H. Kim (1999) Isola-

tion of fibrinolytic enzyme producing strains from kimchi. Kor. J.

Food Sci. Technol. 31: 219-223.

13. Kang, S. K. (1995) Isolation and antimicrobial activity of antimi-

crobial substance obtained from leaf mustard (Brassica juncea). J.

Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 24: 695-701.

14. Pyo Y. H., J. S. Kim, and Y. S. Hahn (2000) Volatile compounds of

mustard leaf kimchi and their changes during fermentation. Kor. J.

Food Sci. Technol. 32: 56-61.

15. Cho, Y. S., B. S. Ha, S. G. Park, and S. S. Jun (1993) Contents of

carotenoids and chlorophylls in dolsan mustard leak. Kor. J.

Dietary Culture 8: 153-157.

16. Song, E. S., Y. S. Jeon, and H. S. Choi (2001) Antioxidative effect

of chlorophylls and carotenoids in mustard leaf kimchi activity. J.

Kor. Soc. Food ScI. Nutr. 30: 421- 425.

17. So, M. H., Y. S. Lee, H. S. Kim, E. J. Cho, and M. J. Yea (1996)

An influence of salt concentration on growth rates of lactic acid

bacteria isolated from kimchi. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 9: 341-

347.

18. Yoo, M. S., J. B. Kim, and Y. R. Pyun (1991) Changes in tissue

structure and pectins of chinese cabbage during salting and heat-

ing. Kor. J. Food Sci. Technol. 4: 420-427.

19. Leung, F. W (2014) Capsaicin as an anti-obesity drµg. capsaicin as

a therapeutic molecule. Progress in Drµg 1: 171-179.

20. Agarwal, P., C. Dias, O. Dias, and T. Shanbhag (2017) Antimicro-

bial property of capsaicin. Inter. Res. J. Biol. Sci. 6: 7-11.

21. Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the

quantitation of microgram quantities of protein utilizing the princi-

ple of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.

22. Astrup, T. and S. Mullertz (1952) The fibrin plate method for esti-

mating fibrinolytic activity. Arch. Biochem. Biophys. 40: 346-351.

23. Lee, J. Y., S. J. Jeong, M. J. Cho, K. M. Cho, G. M. Kim, et al.

(2014) Fibrinolytic activities of Bacillus species isolated from tra-

ditional fermented soy foods. J. Agric. Life Sci. 48: 163-173.

24. Back, S. Y., H. J. Yun, H. D. Park, and S. H. Yeo (2011) Isolation

and optimized culture conditions of fibrinolytic enzyme producing

strain isolated from Korean traditional soybean sauce. Kor. J.

Microbiol. Biotechnol. 39: 330-336.

25. Choi, N. S. and S. H. Kim (2000) The effect of sodium chloride on

the serine-type fibrinolytic enzymes and the thermostability of

extracellular protease from Bacillus amyloliquefaciens DJ-4. J.

Biochem. Mole. Biol. 34: 134-138.

26. Nascimento P. L., T. C. Nascimento, N. S. Ramos, G. R. Silva, J.

E. Gomes, R. E. Falcao, K. A. Moreira, A. L. Porto, and T. M.

Silva (2014) Quantification, antioxidant and antimicrobial activity

of phenolics isolated from different extracts of Capsicum frute-

scens (Pimenta Malagueta). Molecules 19: 5434-5447.

27. Jones, N. L., S. Shabib, P. M. Sherman (1997) Capsaicin as an in

inhibitor of the growth of the gastric pathogen Helicobacter pylori.

FEMS. Microbiol. Lett. 146: 223-227.

28. Korean Industrial Standard for Kimchi, Food Industry Policy Divi-

sion. https://standard.go.kr/KSCI/standardIntro/getStandardSearch-

View.do.(2018).

research paper - soongene.netsoongene.net/nonmun/ksbb g-13.pdf · trations of nacl (1-10%) and...

Documents