resultados y discusiÓn cuantificación de proteínas totales...
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cuantificación de Proteínas Totales Séricas
La edad media de los pacientes, que fue de 67 años (± 8.8 años) no fue
significativamente diferente (p = 0.5) con relación a la edad media de los controles que
fue de 64 años (± 9.7). La cantidad promedio de proteínas totales en las muestras séricas
de los pacientes, estimada espectrofotométricamente a 280 nm, fue de 68.04 ± 8.5
mg/mL, mientras que la de los controles fue de 61.44 ± 5.62 mg/mL. Las diferencias de
concentración proteica influyeron en la cantidad de inmunoglobulina G purificada,
siendo ésta mayor en el caso de los pacientes.
Purificación de la IgG Sérica por Cromatografía
La purificación de la IgG sérica se realizó en tres etapas cromatográficas en
secuencia. El objetivo de la primera etapa, fue separar a las inmunoglobulinas del suero,
utilizando cromatografía de interacción hidrofóbica. Gracias al carácter hidrofóbico de
las inmunoglobulinas fue posible removerlas del resto de las proteínas séricas; su
separación se basó en las interacciones hidrofóbicas entre las regiones no-polares de las
proteínas y los grupos hidrofóbicos inmovilizados en la fase estacionaria (Ramos-
Clamont y col., 2006). Para ello se utilizó una matriz de Sefarosa 6B altamente acetilada
(Vázquez-Moreno y col., 1992), con un volumen de cama de 12 cm3
, a la cual se aplicó
1 mL de suero (de paciente con DM2 o control) obteniéndose en promedio 5.53 mg de
inmunoglobulinas totales en un volumen de elución de 24 mL. En el cromatograma
típico (Figura 11), se observa el pico “a” (fracción de lavado) que corresponde a las
proteínas no afines a la fase estacionaria con una concentración de 48.5 mg/52 mL. El
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Figura 11. Cromatograma del aislamiento de inmunoglobulinas séricas en Sefarosa-6B
altamente acetilada.
La muestra sérica con una concentración proteica de 61-68mg fue aplicada a la matriz
(a) y lavada con Na2SO4 0.5 M / PB 20 mM, pH 7.2. Las inmunoglobulinas afines a la
fase estacionaria (b) fueron eluidas con PB 20 mM, pH 7.2. Las proteínas remanentes
fueron removidas de la matriz con una solución de guanidina-HCl 6 M, pH 7.0 (c).
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 20 40 60 80 100 120
DO
(2
80 n
m)
Fracciones de 1 mL
34
pico b (fracción de elución) contiene a las inmunoglobulinas que se adsorbieron
específicamente a la matriz cromatográfica, mientras que el pico c corresponde a la
fracción de regeneración de aproximadamente 1.24 mg de proteína en 10 mL de
hidrocloruro de guanidina.
Los métodos más comúnmente utilizados en las primeras etapas para aislar a las
inmunoglobulinas, involucran procesos de precipitación proteica con etanol, sulfato de
amonio o propilenglicol, seguidos de métodos cromatográficos basados en intercambio
iónico o cromatografía de exclusión de tamaño (Schneider y col., 1976). Sin embargo,
los métodos de precipitación no son adecuados para mantener íntegra la estructura
nativa de la proteína, por lo tanto la cromatografía de interacción hidrofóbica fue ideal
para la separación de inmunoglobulinas del resto de las proteínas del suero humano
debido a que no se alteró su conformación proteica (Jennissen, 2005).
En la etapa dos, se llevó a cabo el aislamiento de la IgA total del resto de las
inmunoglobulinas séricas, para evitar su interferencia con la purificación de la IgG en la
tercera etapa cromatográfica en la que se utilizó la matriz Sefarosa-Proteína A, que es
relativamente afín a la IgA. Algunas de las técnicas comúnmente utilizadas en la
purificación de la IgA, incluyen a la matriz agarosa-jacalina, muy útil para la separación
de las subclases de IgA por su alta afinidad hacia la IgA1 (Álvarez y col., 2010). Sin
embargo, en lugar de esta última matriz, en el presente trabajo se eligió la agarosa-anti
IgA porque la finalidad de la etapa fue remover a la IgA total del resto de las
inmunoglobulinas. El volumen de cama de la matriz agarosa-anti IgA fue de 7.91cm3, a
la cual se le aplicaron las inmunoglobulinas aisladas de la primera etapa cromatográfica
(aproximadamente 5.5 mg/24 mL) a una velocidad de flujo de 0.25 mL/min. En la figura
12 se observa el cromatograma característico del aislamiento de la IgA total; el pico a
contiene las inmunoglobulinas que no se adsorbieron a la matriz (fracción de lavado) en
una concentración aproximada de 4.8 mg/31mL, esta fracción fue almacenada para su
posterior utilización en la etapa tres. El pico b contiene a la IgA total (fracción de
elución) con una concentración promedio de a 0.36 mg/ 16 mL.
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Figura 12. Cromatograma del aislamiento de IgA total en agarosa anti-IgA.
La muestra (5.5 mg en 24 ml) proveniente de la fracción de elución de la primera etapa
cromatográfica, fue aplicada a la fase estacionaria (a) y lavada con PB 20 mM, pH 7.2 y
la IgA total que se adsorbió a la matriz fue eluida con glicina-HCl 0.05 M, pH 2.6 (b)
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 10 20 30 40
DO
(280 n
m)
Fracciones de 1 mL
36
Tal como se señaló antes, el objetivo de la remoción de la IgA total fue evitar la
competencia de la IgA con la IgG en la siguiente etapa de purificación, debido a que la
IgA presenta cierta afinidad hacia la proteína A (Hage, 2006). La remoción de la IgA era
fundamental en este trabajo, debido a que es una glicoproteína con abundantes sitios
glicosilados (Mattu y col., 1998).
En la tercera etapa cromatográfica se logró la purificación de la IgG sérica
utilizando una matriz de afinidad Sefarosa CL-6B-Proteína A (Sigma-aldrich., USA).
La afinidad de la IgG por la proteína A, una proteína que se obtiene de la pared celular
de Staphilococcus aureus, es ampliamente reconocida por lo que actualmente es uno de
los métodos preferidos para la purificación de IgG total (Hage, 2006). Pero a pesar de
las especificaciones de uso de la matriz Sefarosa CL-6B-Proteína A, que señalan que
usándola en una sola etapa permite la purificación de la IgG, pudimos observar que al
utilizar la matriz de esa forma, la fracción de elución estaba muy contaminada con otras
proteínas. En cambio, al aplicar la fracción de lavado (4.8 mg/31 mL) proveniente de la
segunda etapa cromatográfica, a la Sefarosa-Proteína A que tenía un volumen de cama
de 3.14 cm3, a una velocidad de flujo de 0.25 mL/min, se logró una pureza de la IgG
mayor al 92%. En el cromatograma típico de la purificación de la IgG (Figura 13) se
observa el pico a, que corresponde a las inmunoglobulinas que no se adsorbieron a la
matriz (fracción de lavado) de aproximadamente 1.52 mg/ 38 mL, y el pico b contiene a
la IgG (fracción de elución) con una concentración de 2.18 mg/ 8.8 mL.
Estimación de la Masa Molecular y de la Pureza de la IgG
Para la estimación de la masa de la IgG obtenida en la última etapa
cromatográfica, la fracción de elución fue cargada en un gel SDS-PAGE al 12% en
condiciones desnaturalizantes y reductoras (Figura 14).
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Figura 13. Cromatograma del aislamiento de la IgG sérica en Sefarosa CL-6B Proteína-
A.
La muestra (4.8 mg/31 mL) proveniente de la fracción de lavado de la segunda etapa
cromatográfica, fue aplicada a la fase estacionaria (a) y lavada con PB 20 mM, pH 7.2.
La IgG que se adsorbió a la matriz fue eluida con glicina-HCl 0.05 M, pH 2.6 (b).
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 5 10 15 20 25 30 35 40
DO
(280 n
m)
Fracciones de 1 mL
38
Figura 14. Electroforesis SDS-PAGE de la fracción IgG.
En el carril A se aplicó la mezcla de marcadores de masa molecular. En el carril B se
cargó el suero total. La fracción de lavado y la elución de la cromatografía con Sefarosa
Proteína-A se aplicaron en los carriles C y D, respectivamente.
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En el carril 1 del gel, se cargaron 5 µL de una mezcla de proteínas de masa
conocida (SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Bio-Rad, USA), en el segundo
carril se aplicó suero total (10 µg/µL), en el tercer carril se aplicaron 25 μL de la
fracción de lavado de la cromatografía con Sefarosa-Proteína A, y en el carril 4, se
aplicaron 20 μL (7 μg de proteína) de IgG (fracción de elución cromatografía de
Sefarosa Proteína-A). La electroforesis se corrió a 90 volts constantes y el gel se tiñó
con azul de Coomassie R-250 para estimar la migración de las bandas características de
la IgG (Garfin, 2003). Con la ecuación de la recta obtenida se calculó la masa de las
cadenas pesadas de la IgG, que fue de 50 kDa y la masa de las cadenas ligeras, que fue
de 25 kDa (Figura 15). Paralelamente se corrió un gel, bajo las mismas condiciones
electroforéticas, que no fue teñido y en cambio fue electrotransferido a una membrana
de nitrocelulosa para la inmunodetección de la IgG con un antisuero monoclonal anti-
IgG humana marcado con peroxidasa; no se observaron proteínas contaminantes en la
fracción de IgG obtenida en la elución de la matriz Sefarosa-Proteína A (Figura 16) y el
antisuero reconoció específicamente las cadenas pesadas de la inmunoglobulina (Figura
17).
Estimación de la Glicosilación Terminal de la IgG
La estimación de la glicosilación terminal de la IgG de pacientes con DM2 y
controles se realizó por ELLA, para ello se utilizó una batería de lectinas vegetales con
afinidad especifica hacia uno o un grupo de carbohidratos. Las lectinas utilizadas fueron
SNA, MAA, PNA, WGA, RCAI, ECA, Con A y LCA. En primera instancia, las señales
emitidas por la interacción de cada una de las lectinas con el oligosacárido de la IgG, fue
analizada individualmente.
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Figura 15. Curva generada entre el Log de la masa molecular de los marcadores de peso
molecular y la movilidad relativa de las bandas en el gel.
A partir de la ecuación de la curva, se estimó la masa molecular de las cadenas pesadas y
ligeras de la IgG.
y = -1.3646x + 5.1789
0
1
2
3
4
5
6
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Log M
W
Rf
41
Figura 16. Electroforesis SDS-PAGE de IgG.
En el carril A contiene suero total, en el que se puede observar la banda correspondiente
a la albumina. Los carriles B contienen a la IgG purificada en tres etapas
cromatográficas; se observan las cadenas pesadas y ligeras de la IgG sin la presencia de
proteínas contaminantes.
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Figura 17. Inmunodetección específica de la IgG pura.
La flecha indica el reconocimiento de las cadenas pesadas de la IgG por el antisuero
monoclonal anti IgG-peroxidasa.
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Con la lectina SNA, que presenta marcada afinidad por residuos de acido siálico
en uniones α2-6 (Wiederschain, 2009) se observó que la media de la densidad óptica de
los pacientes fue menor, en comparación con la media de la densidad óptica de los
controles; esta disminución fue estadísticamente significativa (p < 0.01) (Tabla I)
(Figura18). Esta disminución en la densidad originada por la interacción de la SNA con
los oligosacáridos de la IgG de los pacientes es relevante porque se ha observado que en
la sialilación de la IgG sérica predominan las uniones α2-6 sobre las uniones α2-3
(Arnold y col., 2007), lo que significa que esta proteína está significativamente
desialilada en los pacientes con DM2 en comparación con los controles. Se sabe que el
ácido siálico de las inmunoglobulinas determina su vida media, su inmunogenicidad y su
actividad biológica (Arnold y col., 2007; Muraoka y Shulman, 1989; Worrmald y col.,
1991). Con la disminución en la cantidad de ácido siálico terminal de los oligosacáridos
de la IgG se esperaría la aceleración del mecanismo de aclaramiento proteico antes del
término de su vida media, porque se incrementa su afinidad por los asialoreceptores
hepáticos (Spiess, 1990). Este hallazgo es consistente con la observación de que la
concentración de IgG sérica en los pacientes con DM2 suele estar reducida (Del Roio-
Liberatore y col., 2005; Rodriguez-Segade y col., 1991).
La densidad óptica media derivada de la interacción entre la lectina Maackia
amurensis (MAA), que reconoce ácido siálico en uniones α2-3 (Wiederschain, 2009) y
los oligosacáridos de la IgG, también fue significativamente menor en los pacientes con
relación a los controles (Figura 19). Sin embargo, las señales generadas por la
interacción de MMA con la IgG fueron significativamente menores a las observadas
entre la IgG y la lectina SNA (Figura 18) lo que se explica por el hecho de que el ácido
siálico ligado a galactosa en α2-3 se encuentra en mucho menor proporción que el ácido
siálico ligado en α2-6 en los oligosacáridos de la IgG y sugiere la baja expresión de la
sialiltransferasa α2-3 en las células productoras de IgG (Arnold y col., 2007).
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Tabla I. Densidad óptica media obtenida por la interacción entre las lectinas y la IgG.
Los valores son expresados como medias ± la desviación estándar (DE).
a Nueve sujetos constituyeron el grupo de pacientes.
b Siete sujetos constituyeron el grupo de controles.
Lectina Pacientesa Controles
b Valor de p
SNA 1.08 ± 0.288 1.56 ± 0.109 <0.01
MAA 0.058 ± 0.002 0.063 ± 0.003 < 0.01
PNA 0.070 ± 0.005 0.067± 0.003 =0.86
RCAI 0.096 ± 0.008 0.110 ± 0.010 < 0.01
ECA 0.101 ± 0.011 0.116 ± 0.017 < 0.04
WGA 0.146 ± 0.014 0.136 ± 0.010 = 0.08
Con A 1.724 ± 0.040 1.720 ± 0.027 = 0.60
LCA 0.358 ± 0.103 0.497 ± 0.118 < 0.02
45
Figura 18. Interacción entre la lectina SNA y la IgG de pacientes y controles.
La densidad óptica media observada en los pacientes fue significativamente menor que la
media de los controles.
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Figura 19. Interacción entre la lectina MAA y la IgG de pacientes y controles.
La densidad óptica media observada en los pacientes fue significativamente menor
que la media de los controles.
47
La lectina PNA, posee fuerte afinidad por los O-oligosacáridos con terminación
en galactosa unida a GlcNAc/GalNAc por uniones β1-3 (Goodarzi y col., 2002). La
densidad óptica media emitida por la interacción entre PNA y la IgG de pacientes y
controles no mostró diferencias estadísticamente significativas (Figura 20). Este
resultado se debe a que los N-oligosacáridos de la IgG carecen de uniones Gal-β1-3-
GlcNAc/ GalNAc. En las regiones Fab puede haber O-oligosacáridos (Mimura y col.,
2007), que sí tienen esta clase de disacáridos, pero la señal semejante entre la IgG de los
pacientes y controles con la lectina PNA sugiere que no hay diferencia en la
glicosilación a ese nivel.
La lectina RCAI ha sido ampliamente utilizada como una herramienta versátil
para detectar cambios en los carbohidratos de los glicanos complejos N-ligados. Esta
lectina muestra marcada afinidad por los residuos terminales de galactosa de
oligosacáridos complejos y presenta baja afinidad por oligosacáridos O-enlazados. La
lectina ECA presenta una especificidad similar a la RCAI, con la diferencia de que
RCAI reconoce β-galactosa y ECA prefiere estructuras disacáridas Galβ1-4GlcNAc
(Itakura y col., 2007). La señal media de la interacción de estas lectinas con la IgG de
pacientes, fue significativamente menor en comparación con la interacción media de
ambas lectinas con la IgG de los controles (Figura 21 y 22). Estos resultados sugieren
que la IgG de los pacientes con DM2 está hipogalactosilada.
En el caso del ensayo con la lectina WGA, que reconoce con un elevado grado
de afinidad a GlcNAc (Debray y col., 1981), no se observaron diferencias
estadísticamente significativas entre la media de los pacientes y los controles (Figura
23). Este resultado era el esperado, ya que si bien es cierto que los oligosacáridos de la
IgG de los pacientes están hipogalactosilados y tienen expuesta la GlcNAc responsable
de la interacción con la lectina, la IgG de los controles está más sialilada, lo cual
incrementa la afinidad de la WGA por sus oligosacáridos (Wiederschain, 2009; Wright,
1992).
48
Figura 20. Interacción entre la lectina PNA y la IgG de pacientes y controles.
La densidad óptica media observada en los pacientes y los controles no mostró
diferencias significativas.
49
Figura 22. Interacción entre la lectina RCAI y la IgG de pacientes y controles.
La densidad óptica media observada en los pacientes fue significativamente menor que
la media de los controles.
50
Figura 23. Interacción entre la lectina ECA y la IgG de pacientes y controles.
La densidad óptica media observada en los pacientes fue significativamente menor que la
media de los controles.
51
Figura 24. Interacción entre la lectina WGA y la IgG de pacientes y controles.
La densidad óptica media observada en los pacientes y los controles no mostró
diferencias significativas.
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Es importante destacar que la intensidad de la señal derivada de la interacción
entre la lectina y los carbohidratos es mayor cuando están en forma libre y menos
intensa cuando forman parte de los oligosacáridos, por ello la densidad óptica en los
ensayos con WGA es baja (Debray y col., 1981).
Por otro lado, la diferencia en la densidad óptica media emitida por la interacción
de la IgG con la lectina Con A, no fue estadísticamente significativa entre los pacientes
y los controles (Figura 24). Se ha reportado que Con A presenta una marcada afinidad
por residuos de α-manosas (Lei y Chang, 2009), por lo que los resultados de este análisis
sugieren que el contenido de manosa en los oligosacáridos de la IgG de pacientes y
controles es similar. Sin embargo, la interacción de la lectina LCA, que tiene mayor
afinidad por oligosacáridos cortos que presentan un residuo de fucosa en el centro
quitobiosa (Goodarzi y col., 2002), con la IgG de los pacientes generó una señal menos
intensa que con la IgG de los controles. En la Figura 25, se puede observar que la media
de los pacientes fue significativamente menor que la de los controles (p <0.02),
sugiriendo con ello que el centro quitobiosa de los oligosacáridos del grupo de pacientes,
se encuentra hipofucosilado. Este resultado concuerda con los reportados por Sumar y
col., 1990, quienes explican que el centro quitobiosa puede estar o no fucosilado en
condiciones normales, sin embargo la pérdida de fucosa aumenta ante procesos
patológicos (Sumar y col., 1990)
Las evidencias anteriores, derivadas del análisis individual de la afinidad de las
lectinas SNA, MAA, ECA, RCAI, WGA y Con A hacia la IgG de los pacientes y los
controles, fueron corroboradas con los resultados obtenidos posteriormente a partir de la
relación de absorbancia generada por pares de lectinas afines hacia estructuras
oligosacáridas.
53
Figura 25. Interacción entre la lectina Con A y la IgG de pacientes y controles.
La densidad óptica media observada en los pacientes y los controles no mostró diferencias
significativas.
54
Figura 26. Interacción entre la lectina LCA y la IgG de pacientes y controles.
La densidad óptica media observada en los pacientes fue significativamente menor
que la media de los controles.
55
La media de la relación SNA/MAA fue significativamente menor en los
pacientes que en los controles (Tabla II, Figura26), este resultado apoyó la hipótesis de
que las diferencias observadas en la IgG de los pacientes fue debida a la disminución de
ácido siálico en uniones α2-6. Las relaciones ECA/SNA, ECA/MAA, RCAI/SNA y
RCAI/MAA fueron utilizadas para determinar el grado de galactosilación de la molécula
(Figuras 27, 28, 29 y 30). Las relaciones ECA/MAA y RCAI/MAA no mostraron
diferencias entre los grupos, lo cual concuerda con los hallazgos de las lecturas
individuales de las lectinas, sugiere que no existen cambios en la sialilación en las
uniones α2-3 y reafirman que los cambios de sialilación son atribuibles a la disminución
del ácido siálico ligado en α2-6 a la IgG de los pacientes con DM2. Además, las
relaciones ECA/SNA y RCAI/SNA fueron significativamente superiores en los
pacientes en comparación con los controles, lo que indica que la cantidad relativa de
galactosa expuesta en la IgG de los pacientes es mayor que la cantidad de acido siálico;
este hallazgo confirma la disminución de acido siálico en la IgG de los pacientes con
DM2.
Dado que la lectina RCAI reconoce a galactosa en cualquier unión de tipo beta,
se obtuvo también la relación RCAI/ECA, de esta manera fue posible distinguir a los
residuos de galactosa que interaccionaron con las lectinas. La relación RCAI/ECA no
mostró diferencias significativas (Figura 31) entre los pacientes y los controles, lo que
sugirió que los residuos de galactosa reconocidos por las lectinas se encuentran unidos a
GlcNAc en uniones β1-4 y por lo tanto están ubicados en los N-oligosacáridos de la IgG.
56
Tabla II. Relación de densidad óptica entre pares de lectinas afines hacia estructuras
oligosacáridas de la IgG.
Razón Pacientesa Controles
b Valor de p
SNA/MAA 18.634 ± 4.983 24.822 ± 2.514 <0.01
ECA/SNA 0.100 ± 0.030 0.075 ± 0.014 < 0.04
ECA/MAA 1.744 ± 0.188 1.839 ± 0.261 =0.76
RCAI/SNA 0.095 ± 0.027 0.070 ± 0.010 <0.04
RCAI/MAA 1.653 ± 0.158 1.737 ± 0.136 = 0.85
RCAI/ECA 0.950 ± 0.050 0.953 ± 0.085 = 0.53
WGA/ECA 1.449 ± 0.117 0.851 ± 0.114 <0.01
WGA/RCAI 1.528 ± 0.133 0.805 ± 0.072 <0.01
WGA/SNA 0.144 ± 0.043 0.088 ± 0.008 <0.01
Con A/WGA 11.857 ± 1.057 12.670 ± 1.089 = 0.09
Los valores son expresados como medias ± la desviación estándar (DE).
a Nueve sujetos constituyeron el grupo de pacientes.
b Siete sujetos constituyeron el grupo de controles.
57
Figura 27. Relación de densidad óptica SNA/MAA entre pacientes y controles.
La media de la relación fue significativamente menor en el grupo de pacientes en
comparación con los controles.
58
Figura 28. Relación de densidad óptica ECA/SNA entre pacientes y controles.
La media de la relación fue significativamente mayor en el grupo de pacientes en
comparación con los controles.
59
Figura 29. Relación de densidad óptica ECA/MAA entre pacientes y controles.
No se observa diferencia significativa entre las medias de la relación entre pacientes y
controles.
60
Figura 30. Relación de densidad óptica RCAI/SNA entre pacientes y controles.
La media de la relación fue significativamente mayor en el grupo de pacientes en
comparación con los controles.
61
Figura 31. Relación de densidad óptica RCAI/MAA entre pacientes y controles.
No se observa diferencia significativa entre las medias de la relación entre pacientes y
controles.
62
Figura 32. Relación de densidad óptica RCAI/ECA entre pacientes y controles.
No se observa diferencia significativa entre las medias de la relación entre pacientes y
controles.
63
La disminución de la galactosilación de la IgG de los pacientes fue comprobada
con las relaciones WGA/RCAI y WGA/ECA gracias a la afinidad de la lectina WGA
hacia la GlcNAc. Ambas relaciones fueron significativamente mayores en los pacientes
que en los controles (p<0.01) (Figuras 32 y 33). Estos resultados sugieren que la señal
relativa derivada de GlcNAc es mayor que la de galactosa en el grupo de los pacientes y
corroboran la hipogalactosilación de la IgG de los pacientes, que contribuye a la mayor
exposición del siguiente carbohidrato de la cadena oligosacárida: la GlcNAc. La relación
WGA/SNA, también confirmó los resultados obtenidos anteriormente, ya que la media
de la relación WGA/SNA fue significativamente mayor en el grupo de los pacientes que
en el de los controles (Figura 34). De esta manera podemos inferir que la cantidad
relativa de β1-4GlcNAc (por su mayor exposición) es mayor que la cantidad de ácido
siálico en el grupo de los pacientes. Por último la relación Con A/WGA permitió
confirmar que no existen cambios a nivel del contenido de manosa en la estructura
oligosacárida de la IgG, ya que la media de la razón no presentó diferencias
significativas entre el grupo de pacientes y el de controles (Figura 35).
El conjunto de resultados individuales y de las relaciones de las densidades
ópticas emitidas por la interacción entre las lectinas y el oligosacárido de la IgG de los
pacientes con DM2, sugiere que la disminución de galactosa terminal (incluyendo al
ácido siálico), expone al siguiente carbohidrato (GlcNAc) de la cadena oligosacárida.
Esto quiere decir que las estructuras oligosacáridas predominantes en los sitios de N-
glicosilación corresponden a la glicoforma IgG-G0.
64
Figura 33. Relación de densidad óptica WGA/RCAI entre pacientes y controles.
La media de la relación fue significativamente mayor en el grupo de pacientes en
comparación con los controles.
65
Figura 34. Relación de densidad óptica WGA/ECA entre pacientes y controles.
La media de la relación fue significativamente mayor en el grupo de pacientes en
comparación con los controles.
66
Figura 35. Relación de densidad óptica WGA/SNA entre pacientes y controles.
La media de la relación fue significativamente mayor en el grupo de pacientes en
comparación con los controles.
67
Figura 36. Relación de densidad óptica Con A/WGA entre pacientes y controles.
No se observa diferencia significativa entre las medias de la relación entre pacientes y
controles.
68
Se sabe que la glicoforma IgG-G0 es una de las más abundantes en la IgG
humana, representando el 35% del total de glicoformas (Arnold y col., 2007), sin
embargo los resultados de este estudio sugieren que en sujetos con DM2, la IgG-G0 se
encuentra en una proporción mucho mayor. La alteración en la relación cuantitativa de
las distintas glicoformas de la IgG podría influir en la función efectora de la
inmunoglobulina; algunos estudios demuestran que la lectina con afinidad a manosa
(MBL) puede unirse a formas hipogalactosiladas de la IgG, activando la vía alterna del
complemento. Por lo anterior, es posible especular que en los pacientes con DM2 la
IgG-G0 podría contribuir a la activación inapropiada de la vía del complemento y, en
consecuencia al mantenimiento del estado inflamatorio (Arnold y col., 2006; Arnold y
col., 2007) asociado con las complicaciones vasculares y renales de la DM (Hansen y
col., 2004; Hansen y col., 2003). El estado inflamatorio sistémico por el que cursan los
pacientes con DM2 (Browning y col., 2004; Duncan y col., 2003) ha sido ampliamente
estudiado y se ha asociado también con el aumento en la concentración sérica de
proteínas de fase aguda que presentan cambios en la glicosilación (Chavan y col., 2005;
Havenaar y col., 1998; Higai y col., 2003); se ha especulado que estas alteraciones están
íntimamente relacionadas con la elevación de ácido siálico sérico en los pacientes con
DM2 (Gavella y col., 2003). Adicionalmente, el incremento de las glicoformas IgG-G0
podría favorecer el aclaramiento proteico de la IgG sérica, porque estas glicoformas
tienen mayor afinidad por los asialoreceptores hepáticos que las glicoformas sialiladas
(Spiess, 1990).
Ahora bien, se ha observado un incremento importante de las estructuras
agalactosiladas de la IgG (IgG-G0) relacionado con el envejecimiento (Rademacher y
col., 1994). Por esta razón la muestra de pacientes incluida en este estudio fue pareada
por sexo y edad con el grupo control; de esta manera se redujo la influencia de la edad
sobre los resultados obtenidos y, por lo tanto, la hipogalactosilación encontrada en la
IgG del paciente diabético se puede atribuir directamente a los eventos patogénicos
vinculados con la DM2.
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Poco se sabe acerca de los procesos metabólicos del paciente con DM2 que
podrían afectar la glicosilación de la inmunoglobulina G. En el 2001, Yarema y
Bertozzi, sugirieron que diversos factores externos al proceso de biosíntesis pueden
afectar el proceso de glicosilación, incluyendo la hiperglicemia crónica, el estrés
oxidativo o incluso alteraciones en la biodisponibilidad de sustratos o intermediarios del
proceso de glicosilación. De igual forma en el 2006, Pasek y col., sugirieron que la
disminución en el contenido de galactosa y ácido siálico en las cadenas oligosacáridas
podría deberse a la alteración en la acción de las enzimas galactosiltransferasa y la
sialiltransferasa, respectivamente. El conjunto de evidencias nos deja claro que los
cambios encontrados en la IgG no son producto de la edad, sino que se podrían ser
atribuidos a los eventos patogénicos por los que cursa el paciente diabético, los cuales
pueden influir directa o indirectamente en la síntesis de los oligosacáridos y/o en su
estabilidad estructural.