Original Article J Korean Orthop Assoc 2017; 52: 192-198 • https://doi.org/10.4055/jkoa.2017.52.2.192 www.jkoa.org

서 론

골육종은 원발성 뼈암 중 가장 흔한 종양이다. 특히 국내에서는

보고에 따라 원발성 뼈암의 40%-50%가 골육종으로 보고될 정도

로 그 중요성이 크다. 골육종은 소아와 청년에서 많이 발생하며,

발생 부위에 따라 사지 구제술을 하여도 상당한 기능 장애를 초

래하기도 한다. 다학제적인 치료방법의 발달로 골육종의 5년 생

존율은 65%-80%에 이르고 있으나 최근 약 20여 년 동안은 생존

율이 크게 향상되지 못하고 답보 상태에 있는 실정이다. 그 주된

이유는 여러 가지 항암제 요법에도 불구하고 치료환자의 30%-

50%에서 전이가 발생하고 있기 때문이다.1)

CD74 (cluster of differentiation 74)는 MHC-II (major histocom-

patibility complex-II) molecules과 반응하는 type II transmembrane

protein으로 다양한 면역세포들과 상호작용하고, 면역반응과 염

pISSN : 1226-2102, eISSN : 2005-8918192

Copyright © 2017 by The Korean Orthopaedic Association

“This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.”

The Journal of the Korean Orthopaedic Association Volume 52 Number 2 2017

Received February 29, 2016 Revised August 29, 2016 Accepted October 7, 2016Correspondence to: Han-Soo Kim, M.D.Department of Orthopaedic Surgery, Seoul National University Hospital, 101 Daehak-ro, Jongno-gu, Seoul 03080, KoreaTEL: +82-2-2072-2362 FAX: +82-2-764-2718 E-mail: hankim@snu.ac.kr

*This reasearch was supported by grant from Seoul Natioanal University Hospital (042012540).

골육종의발암기전에서CD74의역할및MacrophageMigrationInhibitoryFactor와의관계

한일규 • 안선희 • 박종웅 • 이용준 • 김한수

서울대학교병원 정형외과

Role of CD74 and Its Relationship with Macrophage Migration Inhibitory Factor in Osteosarcoma Tumorigenesis

Ilkyu Han, M.D., Sun Hee Ahn, M.S., Jong Woong Park, M.D., Yong Jun Lee, M.D., and Han-Soo Kim, M.D.Department of Orthopaedic Surgery, Seoul National University Hospital, Seoul, Korea

Purpose: CD74 (cluster of differentiation 74) is a type II transmembrane protein that associates with MHC-II (major histocompatibility complex-II) molecules and binds with the macrophage migration inhibitory factor (MIF), which is known to be associated with tumorigenesis. The purpose of this study was to examine the relationship between CD74 with MIF and the role of CD74 in osteosarcoma tumorigenesis.Materials and Methods: A correlation between CD74 with MIF was examined using immunohistochemistry (IHC) of tissues from patients with osteosarcoma (n=45). The mRNA expression of CD74 from patient-derived primary cells of osteosarcoma (n=22) was examined by a real-time polymerase chain reaction. The role of CD74 and in cisplatin-resistance of osteosarcoma was examined using WST-1 and colony forming assay.Results: Of the 45 patients, 25 patients (55.6%) had a high level of expression in both CD74 and MIF by IHC. High level of MIF expression was observed in 40 patients (88.9%). We detected that mRNA expression of CD74 was higher in cells of all osteosarcoma patients (n=22) examined than in the control cells (hFOb 1.19). After cisplatin treatment, the inhibition of cell proliferation and suppression of colony formation were reduced in osteosarcoma cells expressing CD74. Interestingly, the effect of inhibiting anchorage independent growth was activated after cisplatin treatment in the cells with very high expression CD74 mRNA.Conclusion: This study suggests that the level of CD74 expression correlates with that of MIF expression. Moreover, CD74 might have a role in cisplatin resistance of osteosarcoma.

Key words: osteosarcoma, CD74, cisplatin, drug resistance

193

CD74 in Osteosarcoma Progression

증반응에 관여하는 물질로 알려져 있으며, 발암 기전과도 연관되

어 있다고 보고되었다.2,3) CD74는 macrophage migration inhibitory

factor (MIF)와 같은 발암 유도물질로 알려진 분자들과 작용하여

신호를 세포 안으로 전달하고 암의 발생과 전이에서 복잡한 역할

을 한다는 결과들이 보고되었다.4-6) MIF는 암환자의 예후 및 장기

생존율과 밀접한 관계가 있으며7) 또한 고형암에서도 발암 및 전

이에 관여하는 것으로 알려져 있다.8) CD74의 작용의 중요성이 입

증되고 있지만 골육종에서 CD74의 작용 및 신호 전달체계는 아

직 정확하게 밝혀지지 않았다.

이러한 이유로 본 연구에서는 CD74와 MIF의 상관관계를 골육

종에서 조사하고자 하였고, 효과적인 항암 요법을 위해서 CD74

의 골육종 발암 기전 역할을 조사하고자 하였다.

대상 및 방법

1. 연구 대상

서울대학교병원에서 골육종으로 진단 받고 수술 받은 45명의 환

자를 대상으로 하였다. 세포 분리 및 배양은 항암약물 치료가 시

작되기 전 조직검사에서 얻어진 세포를 이용하였다.

2. 환자의 골육종에서 세포 분리 및 배양

본 병원에서 수술한 골육종 환자(22명)에서 적출된 골육종에

0.2% proteinase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 처리한

후 37oC에서 30분간 흔들면서 배양하였다. 그후 0.2％ collagenase

(Sigma-Aldrich)로 바꿔 처리한 후 37oC에서 2-3시간 흔들면서 배

양시켰다. 그런 다음 70 μm mash를 통과시키고, 원심분리한 수거

된 세포들은 10% fetal bovine serum, 1% penicillin & streptomycin

이 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Gibco, St. Louis,

MO, USA) 배지에서 배양하였다. 5-7일간 배양한, 0.25% trypsin

이 섞인 0.53 mM ethylenediamine tetraacetic acid 4Na로 분리하였

고 계대배양하였다.

3. RNA 추출 및 quantitative real-time polymerase

chain reaction골육종 환자(22명) 조직으로부터 분리한 세포와 hFob 1.19, MG63

에서 RNA를 분리한 후(RNeasy mini kit, Cat. No. 74104; Qiagen,

Valencia, CA, USA), SuperScript II RNase H reverse transcriptase

를 이용하여 cDNA를 생합성하였다(RTase, Cat. No. 18064-014;

Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

Real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR)은 Taq-

man probe mixture (Applied Biosystems, Lincoln, CA, USA)를 이

용하였고, ABI 7000 sequence detection system (Thermo Fisher

Scientific Inc., Waltham, MA, USA)을 사용하였다. Primer는

primer express 2.0을 이용하여 제작하였다. Probe의 5’ 말단 부위

에는 reporter dye인 6-FAM을 부착하고, 3’ 말단 부위에는 tetra-

methylrhodamine을 부착하였다. Glyceraldehyde 3-phosphate de-

hydrogenase는 internal standard로 사용하여 정량분석은 standard

curve 방법을 이용하였다. 이 값은 hFob 1.19 mRNA의 normalized

expression에 상대적인 미확인 샘플의 target gene 값을 의미한다.

또한 이 data는 reference gene에 상대적인 target gene의 expression

의 차이를 배수로 나타내었다. CD74 유전자의 증폭을 위해 50oC

2분, 95oC에서 10분간의 변성 후 95oC 15초, 60oC 1분의 45 cycles

조건으로 PCR을 시행하였다. Total 25 μl의 혼합물에는 5 μl의

cDNA, 2× Taqman probe mixture 12.5 μl, probe (2.5 μm) 2.5 μl, 각

각의 primer (9 μm) 2.5 μl가 포함되도록 하였다. CD74 유전자 발

현의 대조군으로 hFOb 1.19 세포주를 사용하였다.

4. 세포 증식능

환자에서 유래된 골육종세포 중 CD74 mRNA 발현이 높은 pri-

mary cells를 96 well plate (2×104 cells/well)에 seeding하고 24시간

배양 후 cisplatin을 각각 농도별로 첨가한 다음, 각각 48시간 배양

후 cell proliferation reagent (WST-1; Roche, Grenzach-Wyhlen,

Germany)를 total 10%가 되도록 well마다 첨가하고 4시간 후에 세

포증식을 확인하기 위해 microplate reader기(Molecular Devices,

Silicon Valley, CA, USA)를 이용하여 440 nm에서 흡광도를 측정

하였다. 대조군으로 MG63 세포주를 이용하였다.

5. 콜로니 형성능

CD74 mRNA 발현이 높은 환자의 골육종세포를 0.5% agarose가

첨가된 cell culture 배지(1 ml)가 첨가된 6 well plate에 첨가하고,

0.3% melting agarose가 첨가된 배지에 cell을 혼합하여 500 μl씩

(5,000 cells/well) seeding하였다. 24시간 후 cisplatin (100 μg) 처리

후 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 2주 후 absolute methanol로

고정하고, 0.5% crystal violet으로 10분간 염색한 다음 현미경으로

형성된 colony 수를 계측하였다. 대조군으로 MG63 세포주를 이

용하였다,

6. 면역조직화학염색본 병원에서 수술한 골육종 환자(45명)에서 적출된 골육종 조직

을 포르말린으로 고정시킨 후 파라핀에 포매된 종양조직 절편

을 5 μm로 자르고 xylene으로 탈파라핀 후 ethanol로 함수시켰다.

Phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 뒤 endogenous per-

oxidase의 활성을 억제하기 위하여 0.3% hydrogen peroxide로 15

분간 처리한 후 다시 PBS로 세척하였다. 비특이적 항원-항체 반

응을 억제하기 위하여 정상 혈청으로 4oC에서 1시간 반응시킨 후

MIF antibody (1:100), CD74 antibody (1:100) (Abcam, Cambridge,

UK)로 4oC에서 overnight하였다. PBS로 세척한 후 biotin이 결합

된 2차 항체로 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 PBS로 세척한

194

Ilkyu Han, et al.

Figure 1. Representative microscopic images of CD74 and macrophage migration inhibitory factor (MIF) by immunohistochemistry (×200). (A) Normal bone tissue. (B) Low CD74 and low MIF expression. (C) High CD74 and high MIF expression.

A

B

C

195

CD74 in Osteosarcoma Progression

뒤 peroxidase conjugated streptavidin을 사용하여 실온에서 30분

간 반응시켰다. PBS로 세척하고 3,3-diaminobenzidine tetrahy-

drochloride로 염색하여 현미경으로 관찰하였다. 대조염색으로

hematoxylin (Sigma-Aldrich)으로 핵 염색하였다.

7. 통계 분석통계 분석은 IBM SPSS statistical software 한글판 ver. 21 (IBM

Co., Armonk, NY, USA)을 사용하였다. 다른 군 간의 평균 비교는

독립 t-test 검정법을 사용하였고, p-value가 0.05보다 작을 때 통

계적으로 유의하다고 판정하였다.

결 과

1. CD74와 macrophage migration inhibitory factor와

의 관계

대조군을 포함한 총 45명의 골육종환자의 골육종 조직을 포매

하여 이용하였다. 발현관계를 확인하기 위해 종양 조직 샘플을

박편하여 CD74와 MIF의 각각의 antibody로 면역염색을 시행하

여 현미경 관찰 결과, 총 45명의 환자의 조직 샘플 중 28개에서

(62.2%) CD74가 강하게 발현되었고, 40개(88.9%)에서 MIF의 고발

현을 보였다. 25개(55.6%)에서는 MIF와 CD74가 모두 고발현되는

것으로 측정되었다(Fig. 1).

2. 환자에서 분리된 골육종세포에서 CD74의 발현

22명의 항암 치료 전 환자로부터 분리 배양한 골육종세포에서

real-time PCR로 CD74 mRNA의 발현 정도를 관찰하였다. 발현

양의 차이는 보이나 환자의 모든 세포에서 음성 대조군인 정상

골모세포(hFOb 1.19)에 비해 상대적으로 높게 발현되었고, 매우

높게 발현되는 세포들도 확인하였다(Fig. 2).

3. Cisplatin에 대한 약물 저항성과 CD74 mRNA 발현과의

관계항암제(cisplatin)에 대한 독성능력 실험은 대조군과 환자군으로

나누어 실시하였고, 그 결과 대조군에 비해 CD74 gene 발현이 높

은 세포에서 cisplatin의 항암작용 억제가 일어났다. 400 μg의 고농

도 cisplatin을 처리했을 때는 대조군에 비교할 수는 없으나 환자

군에서도 세포 독성 효과는 나타났다(Fig. 3).

Figure 2. mRNA expression of CD74 in 22 patient-derived osteosarcoma primary cells. The CD74 mRNA level was significantly higher in all 22 cells than human osteoblast cell line (hFob 1.19; standard[s]) and osteosarcoma cell line (MG63) (p<0.05).

SM

G63

Osteosarcoma sample

20018016014012010080604020

Rel

ativ

em

RN

Aex

pres

sion

ofst

anda

rd2

ddct

0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

CD74

Figure 3. Relationship between CD74 expression and the effect of cisplatin on osteosarcoma proliferation. The effect of cisplatin is reduced in osteosarcoma cells with high CD74 expression (patient derived osteosarcoma primary cell) compared with osteosarcoma cells (MG63) with low CD74 expression. *p<0.05.

Control

120

100

80

60

40

20

Perc

ento

fcon

trol

Cisplatin ( g/ml)�

0100 200 400 800

**

**

MG63Osteosarcoma patientControl=0 g�

Figure 4. Relationship between colony counts by colony forming assay and CD74 mRNA expression by real-time polymerase chain reaction. Osteosarcoma cells of patients with high CD74 mRNA expression (□; 2-ddct) showed a marked decrease in colony formation (■; % of control) by cisplatin treatment (100 μg), indicating increased effect on anchorage independent growth.

250

200

150

100

50

Rel

ativ

eof

cont

rol

Osteosarcoma patient samples

01 2 3 4 5 6 7 8 9Control

CD74 mRNA expression (2 )Colony formation (% of control)

ddct

196

Ilkyu Han, et al.

4. 콜로니 형성능

CD74의 발현과 anchorage independent growth의 관계를 알아보

기 위해 cisplatin (100 μg)을 처리한 후 soft agar에서 배양하여 형

성된 colony 수를 측정하였다. 실험 결과 CD74 gene 발현이 대조

군에 비해 높은 세포에서 colony 수가 증가되었다. 그러나 CD74

mRNA의 특정 발현량 이상으로 높게 발현한 경우에서는 형성된

colony의 수가 감소하였다. 이는 cisplatin에 의한 비부착 성장억제

작용이 오히려 활성화되었음을 보여주는 증거이다(Fig. 4).

고 찰

원발성 골육종 환자에서 세포 독성 항암제에 대한 내성 문제는

계속해서 제기되고 있다.9,10) 따라서 이를 극복하기 위한 원인을

찾는 것과 골육종 치료를 위한 새로운 타겟을 찾는 것이 필요하

다. 이러한 원인 중에 하나로 최근 MIF가 여러 종류의 고형암에

서 연구되었다.11-13) MIF는 CD74와 결합하여 신호를 세포 안으로

전달하고 암의 발생과 침투, 전이에서 복잡한 역할을 한다는 결

과들이 보고되고 있다.14,15) 그러나 MIF의 신호전달에 필수적인

수용체인 CD74에 대한 연구진척도는 높지 않다.

골육종에서 CD74의 역할을 조사한 바에 의하면, 골육종 환

자의 골육종 조직이나 세포에서 정상조직에 비해 MIF (88.9%),

CD74 (62.2%)가 고발현하는 환자가 높게 나타났고, MIF 발현이

높게 나타난 환자의 다수(55.6%)에서 CD74가 동시에 고발현하고

있음을 발견하였다. 또한 골육종 환자의 종양세포에서는 CD74

mRNA 발현이 높게 나타났다. 이는 CD74와 MIF 모두 골육종과

관련되어 있고, CD74와 MIF 간의 상관관계가 있음을 증명하는

결과라고 생각한다.

CD74 gene 발현이 높은 골육종 환자의 종양세포에서의 경우

cisplatin 처리에도 불구하고 고농도를 처리하지 않고는 암세포 성

장억제가 효과적으로 제어되지 않았고(Fig. 3), 비부착 세포성장

(colony formation) 억제 또한 실패하였다(Fig. 4). 이 결과로 cis-

platin과 CD74의 연관성은 약물내성작용과 연관되고, 이는 CD74

gene 발현량과 상관관계를 가진다고 추정된다. 흥미롭게도 CD74

mRNA 발현율이 특정량보다 높은 경우 골육종세포의 anchorage

independent growth에서 cisplatin의 항암효과 작용을 오히려 활성

화시키는 것이 관찰되었다. 골육종에서 CD 74 gene의 작용을 확

실하게 증명하기 위해 약재내성으로 작용하는 경우와 항암효과

를 증가시키게 하는 때의 발현량에 대한 상관관계에 대한 규명을

포함한 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다.

결 론

골육종에서 CD74의 발현은 MIF의 발현과 상관관계를 가지며,

CD74는 골육종의 cisplatin에 대한 약재 내성에 관여할 것으로 생

각한다. 본 연구의 결과는 골육종의 치료 target으로 CD74를 활용

하기 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다

CONFLICTS OF INTEREST

The authors have nothing to disclose.

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골육종의발암기전에서CD74의역할및MacrophageMigrationInhibitoryFactor와의관계

한일규 • 안선희 • 박종웅 • 이용준 • 김한수

서울대학교병원 정형외과

목적: CD74 (cluster of differentiation 74)는 골육종의 tumorigenesis와 연관된다고 알려진 macrophage migration inhibitory factor

(MIF)와 결합한다. 본 연구의 목적은 CD74와 MIF의 연관성과 골육종의 발암에서 CD74의 역할을 규명하는 것이다.

대상 및 방법: CD74와 MIF의 연관성은 환자(n=45)에서 분리한 골육종 조직에 면역염색법을 이용하여 조사하였다. 환자 유래 골육

종세포주(n=22)의 CD74 발현은 real-time polymerase chain reaction 방법으로 조사하였다. CD74와 골육종에서 cisplatin 항암작용

의 내성과의 관계는 WST-1, colony forming 분석법을 이용하였다.

결과: 면역염색 결과 55.6%에서 MIF와 CD74가 모두 높게 나타났고. 88.9%에서 MIF가 높게 발현되었다. CD74 mRNA 발현은 모든

골육종세포에서 정상세포에 비해 높았다. Cisplatin 처리 후 CD74 mRNA 발현이 높은 세포에서 세포 성장억제력과 colony formation

방해능력은 감소하였다.

결론: CD74의 발현은 MIF의 발현과 상관관계를 보였다. 그리고 CD74는 골육종의 cisplatin 내성작용에서 역할을 할 것으로 판단된

다.

색인단어: 골육종, CD74, cisplatin, 내성

접수일 2016년 2월 29일 수정일 2016년 8월 29일 게재확정일 2016년 10월 7일책임저자 김한수 03080, 서울시 종로구 대학로 101, 서울대학교병원 정형외과TEL 02-2072-2362, FAX 02-764-2718, E-mail hankim@snu.ac.kr

*본 연구는 서울대학교병원 일반연구과제 지원(0420120540)에 의하여 이루어진 결과임.

Original Article J Korean Orthop Assoc 2017; 52: 192-198 • https://doi.org/10.4055/jkoa.2017.52.2.192 www.jkoa.org

pISSN : 1226-2102, eISSN : 2005-8918198

Copyright © 2017 by The Korean Orthopaedic Association

“This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.”

대한정형외과학회지：제 52권 제 2호 2017