RZECZPOSPOLITA POLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej

Polskiej

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2076271

(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 01.10.2007 07834613.7 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 14.09.2011 Europejski Biuletyn Patentowy 2011/37 EP 2076271 B1

(13) (51)

T3 Int.Cl. A61K 31/702 (2006.01) A61K 31/715 (2006.01) C07H 3/06 (2006.01) C08B 37/00 (2006.01) A61P 1/12 (2006.01)

(54) Tytuł wynalazku:

Hamowanie toksyn cholery przez galaktooligosacharydy (GOS)

PL/E

P 20

7627

1 T3

(30) Pierwszeństwo:

02.10.2006 EP 06076810

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

08.07.2009 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2009/28

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

29.02.2012 Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/02

(73) Uprawniony z patentu:

Friesland Brands B.V., Amersfoort, NL

(72) Twórca(y) wynalazku:

HAYDN ROBERT SINCLAIR, Camerton, GB JAAP DE SLEGTE, Doetinchem, NL GIJSBERTUS KLARENBEEK, Ommen, NL

(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska

POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska 73 00-712 Warszawa

Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2

17/P29137PL00 EP 2 076 271 B1

Opis

[0001] Wynalazek dotyczy kompozycji odżywczych i 5

farmaceutycznych zawierających nieulegające trawieniu

galaktooligosacharydy (GOS) oraz ich zastosowań.

Konkretnie, dotyczy on zastosowania różnych rodzajów

GOS w profilaktyce, zmniejszaniu albo leczeniu w inny

sposób choroby powodowanej przez toksyny bakteryjne. 10

[0002] Zakażenie jelitowe toksyną Vibrio cholerae

dotyka kraje rozwijające się od niemal 200 lat. Vibrio

cholerae jest przenoszony drogą kałowo-ustną,

najczęściej poprzez spożywanie zanieczyszczonej wody i

w mniejszym stopniu żywności (W.H.O. Cholera, 2004. 15

Wkly Epidemiol Rec 2005;80(31):261-8). U osób o

obniżonej odporności i niedożywionych przecinkowce

przeżywają przejście przez barierę żołądkową i w końcu

kolonizują jelito cienkie (Tamplin i wsp., Appl Environ

Microbiol 1990;56(6): 1977-80). Ostatnie epidemie 20

choroby w konsekwencji tsunami azjatyckiego i huraganu

Katrina w USA są kolejnym dowodem na istotność

postępowania w tej chorobie.

[0003] Nie ma jednak żadnej profilaktyki wobec toksyny

cholery i bez leczenia częstość zgonów w przebiegu tej 25

choroby osiąga 30-50%. Osiągnięto ograniczony sukces,

stosując dwa typy doustnych szczepionek na cholerę

(OCV, ang. Oral Cholera Vaccines), jednak są one

nieskuteczne wobec patogennego szczepu Vibrio cholerae

0139. Ponadto odkrycie, że szczepy wytwarzające toksynę 30

Vibrio cholerae wykazują oporność wielolekową, ma

3

znaczące implikacje odnośnie stosowania antybiotyków

jako strategii leczenia i kontroli. Widać wyraźnie

pilną potrzebę opracowania alternatywnych technik walki

z cholerą i chorobami pokrewnymi.

[0004] Istnieje wiele toksyn bakteryjnych, które wiążą 5

się z gangliozydem, kwasowym glikosfingolipidem, jako

receptorem na powierzchni komórek docelowych i wnikają

do komórek docelowych poprzez następującą potem

internalizację kompleksu toksyna-receptor. Najbardziej

znaną z nich jest toksyna cholery (Ctx), enterotoksyna 10

wytwarzana przez Vibrio cholerae, i jej swoisty

receptor na powierzchni komórkowej, zidentyfikowany

jako monosialogangliozyd gal(beta1-3)galNAc(beta1-

4)[kwas sialowy (alfa2-3)]gal(beta1-4)glc(beta)1-

ceramidu (GM1). 15

[0005] Toksyna cholery to heksamerowe zgrupowanie AB5 o

strukturze pierścienia złożonego z pięciu identycznych

podjednostek B (Ctx-B) i jednej podjednostki A (Ctx-A).

Tak jak w przypadku wielu innych toksyn bakteryjnych,

aktywność katalityczna jest związana z Ctx-A, natomiast 20

w wiązaniu receptora i dostarczaniu toksyny do komórki

docelowej pośredniczy pentamer Ctx-B. Sądzi się, że

wiązanie podjednostek B z błonowym GM1 indukuje zmianę

konformacyjną w toksynie, skutkującą wchodzeniem

heksamerowego zgrupowania zawierającego toksyczną 25

podjednostkę A do komórki docelowej.

[0006] Podjednostka A wykazuje aktywność ADP-

rybozylotransferazy wobec Gs, które jest

przedstawicielem grupy białek hydrolizujących GTP,

odpowiedzialnych za regulację wielu aspektów działania 30

komórki (Shah BH. Exp Mol Med 1999;31(2):89-94). Gs

4

reguluje aktywność cyklazy adenylanowej i determinuje

stężenie cGMP w komórce gospodarza. Podjednostka A

następnie ADP-rybozyluje podjednostkę alfa Gs,

pozbawiając ją właściwej dla niej aktywności GTPazy. W

konsekwencji bodziec nie może być wyłączony i cyklaza 5

adenylanowa kontynuuje wytwarzanie cAMP, utrzymując

działanie włączonej twórcykaskady.

[0007] Normalnie, w nieobecności Ctx, mechanizm

włączania-wyłączania gwarantuje, że Gs jest aktywowana

tak, jak wymaga tego komórka w odpowiedzi na stymulację 10

jelitowej cyklazy adenylanowej. System ten zatem

normalnie utrzymuje dostatecznie wysokie stężenie cGMP,

aby mógł on pełnić swoją funkcję (Faruque i wsp., Mol

Biol Rev 1998;62(4):1301-14). Niekontrolowana ADP-

rybozylacja Gs skutkuje ciągłym wzrostem aktywności 15

cyklazy adenylanowej, który ostatecznie prowadzi do

nagromadzenia cGMP na wysokim poziomie. W jelicie

poziom cGMP wpływa na transportery sodowe i chlorkowe,

powodując nierównowagę jonową i zaburzenie błonowego

potencjału osmotycznego. Wynikający z tego masywny 20

wypływ jonów chlorkowych i wodorowęglanowych do światła

jelita cienkiego powoduje napływ do jelita dużych

ilości wody poprzez bierną osmozę.

[0008] Klasę toksyn AB5 można podzielić na rodziny na

podstawie homologii sekwencji i tropizmu względem 25

receptora. Toksyna cholery i termolabilne enterotoksyny

LT i LT-II E. coli są strukturalnie spokrewnione.

Podjednostki B obydwu toksyn wykazują duże powinowactwo

wobec części oligosacharydowej wielu glikolipidów, w

tym GM1. Przywieranie bądź toksyny cholery, bądź 30

termolabilnej enterotoksyny E. coli do GM1 obecnego na

5

powierzchni komórek śródbłonkowych wyściełających

jelito jest pierwszym etapem serii zdarzeń prowadzących

do indukcji wodnistej biegunki. Jakkolwiek cholera jest

poważniejsza, obydwie toksyny mogą prowadzić do śmierci

na skutek silnego odwodnienia. 5

[0009] Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie

kompozycji skutecznych w działaniu profilaktycznym

i/lub terapeutycznym wobec chorób związanych z

patogennymi toksynami bakteryjnymi Vibrio cholerae i

enterotoksynogennej E. coli. Konkretnie, twórcy 10

niniejszego wynalazku zidentyfikowali związki, które

mają zastosowanie jako inhibitory adhezji toksyny

cholery do jej receptora GM1 zgodnie z koncepcją, że

obranie za cel toksyny bakteryjnej może pozwolić na

obejście oporności na leki szczepu bakteryjnego. 15

[0010] Nieoczekiwanie stwierdzono, że pewne frakcje

nieulegającego trawieniu preparatu oligosacharydu o

jakości spożywczej (ang. food-grade) są wysoce

skutecznymi inhibitorami wiązania Ctx-B z jej

naturalnym receptorem. Bardziej konkretnie, 20

stwierdzono, że frakcje wzbogacone w

galaktooligosacharydy (GOS) o stopniu polimeryzacji

pięć lub wyższym, obejmujące pentasacharydy GOS

(określane tu jako DP5) i heksasacharydy GOS (DP6), są

skutecznymi czynnikami przeciwadhezyjnymi wobec Ctx-B, 25

które zapobiegają wiązaniu się Ctx z GM1 na komórce

docelowej.

[0011] Wynalazek dotyczy zatem kompozycji zawierającej

galaktooligosacharydy (GOS), w której obecne są rodzaje

GOS o stopniu polimeryzacji 5 lub wyższym, korzystnie 6 30

lub wyższym, w ilości co najmniej 35% wagowo (%w) w

6

stosunku do całkowitej suchej masy wszystkich rodzajów

GOS obecnych w kompozycji i w której zawartość penta-

i/lub heksasacharydów GOS wynosi 2-100% wagowo w

stosunku do całkowitej masy kompozycji. Dostarcza się

również zastosowania takiej kompozycji GOS do 5

wytwarzania kompozycji odżywczej albo farmaceutycznej

do leczenia lub profilaktyki ostrej albo przewlekłej

choroby związanej z adhezją i/lub wychwytem

przedstawiciela rodziny toksyny cholery lub choroby

spowodowanej taką adhezją lub wychwytem. 10

[0012] W innym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu

frakcjonowania do izolowania z mieszaniny GOS frakcji

GOS wykazującej aktywność hamującą wobec Ctx. Ujawnia

się również frakcję GOS, którą można otrzymać przy

zastosowaniu takiego sposobu i zastosowanie takiej 15

frakcji jako czynnika przeciwadhezyjnego wobec Ctx-B.

[0013] Ujawnia się również kompozycję, na przykład

kompozycję farmaceutyczną lub odżywczą albo jej

koncentrat, zawierającą duże ilości rodzajów DP5 i/lub

DP6 GOS. 20

[0014] GOS należy do grupy nieulegających trawieniu

węglowodanów, które można uważać za rozpuszczalny

błonnik pokarmowy, ponieważ spełniają ogólnie przyjętą

definicję błonnika pokarmowego, obejmującą zarówno

kryteria biochemiczne, jak i odżywczo-fizjologiczne 25

(Food Industry ad hoc Working Group on Dietary Fibre

(1994) Int. Food Ingred., 1, 46-49). GOS są przedmiotem

rosnącego zainteresowania, ponieważ mogą promować

proliferację bifidobakterii i bakterii kwasu mlekowego

w jelicie człowieka, wzmacniają zatem zdrowie 30

człowieka. GOS są nie tylko określone jako prebiotyki,

7

które poprawiają zdrowie jelit, ale wykazano również,

że zmniejszają ryzyko raka okrężnicy. Możliwa aktywność

przeciwnowotworowa GOS mogłaby wynikać z możliwego

działania przeciwnowotworowego maślanu, jednej z

substancji wytwarzanych z GOS w okrężnicy. 5

[0015] GOS można wytwarzać enzymatycznie, stosując jako

substrat oczyszczoną frakcję D-laktozy z serwatki

(Wallenfels i wsp., Adv Carbohydr Chem, (1961). 16:

str. 239-98). Enzym - -galaktozydaza z Aspergillus

oryzae – wykazuje transgalaktozylową aktywność 10

katalityczną wobec laktozy, prowadząc do wytworzenia

di- do oktasacharydów złożonych z 1-7 jednostek

galaktozy połączonych z cząsteczką glukozy na końcu

redukującym, tj. (galaktozo)nglukozy, gdzie n to 1-7

(Matsumoto i wsp., Galactooligosaccharides, w: 15

Oligosaccharides: production, properties and

applications, T. Nakakuki, red. 1995, Gordon and Breach

Science Publishers: Shizuoka, Japonia, str. 90-106). W

wyniku syntezy enzymatycznej powstają jednak mieszaniny

GOS, które często nie są czyste. Dostępny handlowo 20

syrop, Vivinal GOS®, zawiera na przykład jedynie 59%

GOS ww-1, a pozostałe 41% stanowią laktoza, glukoza i

galaktoza. Wśród rodzajów GOS obecnych w VivinalGOS

najwięcej jest disacharydów (DP2) i trisacharydów

(DP3), które stanowią, odpowiednio, około 33 %w i 25

39 %w, w stosunku do całkowitej suchej masy wszystkich

rodzajów GOS. DP4 i DP5 stanowią około 18 %w i 7 %w.

Rodzaje GOS o stopniu polimeryzacji sześć lub wyższym

stanowią jedynie około 3 %w rodzajów GOS w VivinalGOS.

Inne dostępne handlowo mieszaniny GOS są podobnie 30

wzbogacone w rodzaje GOS o niskiej masie cząsteczkowej,

8

szczególnie di- i trisacharydy GOS. Jak ujawniono tu

poniżej, twórcy niniejszego zgłoszenia opracowali

sposób frakcjonowania złożonej mieszaniny rodzajów GOS

pochodzących z serwatki. Po usunięciu glukozy i

galaktozy mieszaninę rozdzielano poprzez chromatografię 5

jonowymienną. W wyniku tego uzyskano 15 frakcji z

różnym profilem rodzajów GOS, tj. różniących się

względną ilością tri-, tetra-, penta- i heksasacharydów

GOS, określanych tu, odpowiednio, jako DP3, DP4, DP5 i

DP6. Wykazano, że wraz ze zwiększaniem się numeru 10

frakcji, ilość DP5 i DP6 stopniowo się zmniejsza, z

równoczesnym wzrostem DP3 i DP4, co wskazuje na

przejście od frakcji zawierających głównie DP6-DP5 do

frakcji zawierających DP4-DP3.

[0016] Przeprowadzono kompetycyjny test ELISA, w którym 15

frakcje GOS oceniano pod kątem ich zdolności do

hamowania wiązania się podjednostki B Ctx z GM1.

Wykazano, że frakcje względnie wzbogacone w

pentasacharydy (DP5) i heksasacharydy (DP6) GOS, o

stosunkowo małej zawartości DP3 i DP4, są szczególnie 20

silnymi inhibitorami adhezji Ctx. Termin „względnie

wzbogacone” ma wskazywać, że ilość wzrasta w porównaniu

z niefrakcjonowanym materiałem wyjściowym.

[0017] Do aktywnych frakcji GOS należały frakcje

zawierające 15 %w lub więcej DP6 w stosunku do 25

całkowitej suchej masy rodzajów GOS obecnych we

frakcji, co odpowiada co najmniej 15 mg/ml w teście

ELISA. Ponadto, DP5 był obecny we frakcjach aktywnych w

ilości co najmniej 40 %w względem wszystkich obecnych

rodzajów GOS, co odpowiada co najmniej 40 mg/ml w 30

teście. Bez przywiązywania się do teorii, korelacje

9

statystyczne między stałą hamowania poszczególnych

frakcji a składem każdej frakcji ustalonym przy

zastosowaniu spektrometrii mas sugerują, że najbardziej

prawdopodobnym składnikiem hamującym frakcjonowanego

VivinalGOS jest DP6. Jednakże, inne rodzaje GOS obecne 5

we frakcjach aktywnych mogą również mieć udział w

pewnej albo całej obserwowanej aktywności.

[0018] W jednym z aspektów wynalazek dostarcza zatem

zastosowania kompozycji według zastrz. 1 lub zastrz. 6

do wytwarzania kompozycji odżywczej lub farmaceutycznej 10

do leczenia albo profilaktyki ostrej lub przewlekłej

choroby związanej z adhezją i/lub wychwytem

przedstawiciela rodziny toksyny cholery albo

powodowanej przez tę adhezję lub wychwyt. Kompozycja

odżywcza lub farmaceutyczna jest odpowiednia do 15

profilaktyki albo leczenia ostrej lub przewlekłej

choroby powodowanej przez przedstawiciela rodziny

toksyn cholery, w szczególności chorób biegunkowych. W

jednym z wykonań, choroba jest powodowana przez toksynę

cholery V. cholerae (Ctx-B) albo termolabilną 20

enterotoksynę (LT-B) enterotoksynogennej E. coli

(ETEC).

[0019] Dalszy aspekt wynalazku dotyczy kompozycji

przeciwadhezyjnej, zawierającej galaktooligosacharydy

(GOS), w której obecne są rodzaje GOS o stopniu 25

polimeryzacji 5 lub wyższym, korzystnie 6 lub wyższym,

w ilości co najmniej 35 %w, jeszcze korzystniej co

najmniej 40 %w w stosunku do całkowitej suchej masy

wszystkich rodzajów GOS obecnych w kompozycji i w

której zawartość penta- i/lub heksasacharydów GOS 30

wynosi 2-100% wagowo w stosunku do całkowitej masy

10

kompozycji. W jednym z wykonań kompozycja zawiera GOS o

stopniu polimeryzacji 6 w ilości co najmniej 10% wagowo

(%w), korzystnie co najmniej 15 %w, jeszcze korzystniej

co najmniej 20 %w, w stosunku do całkowitej suchej masy

wszystkich rodzajów GOS obecnych w kompozycji. 5

Alternatywnie albo dodatkowo kompozycja zawiera GOS o

stopniu polimeryzacji 5 w ilości co najmniej 15 %w,

korzystniej co najmniej 20 %w, jeszcze korzystniej co

najmniej 30 %w względem całkowitej suchej masy

wszystkich rodzajów GOS obecnych w kompozycji. 10

Konkretny aspekt dotyczy kompozycji zawierającej od

około 10 %w do około 20 %w GOS DP6, od około 40 %w do

około 50 %w DP5; resztę kompozycji stanowi GOS DP4.

[0020] Kompozycja według wynalazku poza rodzajami GOS

może zawierać inne składniki, na przykład 15

rozcieńczalnik, nośnik i/lub związki o wartości

odżywczej i/lub farmaceutycznej. Kompozycja może być

również stężoną kompozycją GOS, na przykład taką, w

której wszystkie rodzaje GOS obecne w kompozycji

stanowią co najmniej 50 %w, korzystnie co najmniej 60 20

%w, jeszcze korzystniej co najmniej 70 %w, na przykład

80 %w, 85 %w, 90 %w, 95 %w, a nawet 99 %w, w stosunku

do całkowitej suchej masy kompozycji. Ponadto, powyższe

względne udziały procentowe DP5 i DP6 w kompozycji mogą

zwiększyć się do wyższych wartości. Bierze się również 25

pod uwagę kompozycje składające się zasadniczo jedynie

z GOS DP5 i/lub DP6. Dostarcza się zatem kompozycje, w

których rodzaje GOS obecne w kompozycji stanowią

jedynie GOS DP5, jedynie GOS DP6 albo mieszaninę GOS

DP5 i DP6. 30

11

[0021] Powyższe dane wykazują, że samo frakcjonowanie

zwiększa skuteczność hamowania wiązania Ctx poprzez

zatężenie konkretnych rodzajów GOS, tj. penta- i

heksasacharydów, które są w innym razie rozcieńczone w

dostępnej handlowo kompozycji GOS. Proces dostarcza 5

zatem szybkich i skutecznych sposobów usuwania

węglowodanów o niskiej masie cząsteczkowej, które nie

mają właściwości prebiotycznych, odżywczych ani

biologicznych. Zatężenie aktywnych węglowodanów, a w

szczególności GOS DP5 i/lub DP6, umożliwia wytworzenie 10

kompozycji o wyższej aktywności (przeciwadhezyjnej

wobec Ctx) na jednostkę (suchej) masy. Taką kompozycję

korzystnie wykorzystuje się do wytwarzania kompozycji

farmaceutycznych lub odżywczych do leczenia albo

profilaktyki ostrej lub przewlekłej choroby związanej z 15

adhezją i/lub wychwytem przedstawiciela rodziny toksyny

cholery albo powodowanej przez taką adhezję lub

wychwyt.

[0022] Badania zależności odpowiedzi od dawki w celu

ustalenia EC50 frakcji GOS bogatych w DP6 wykazały, że 20

wartości EC50 dla DP6 mieszczą się w zakresie od około

30 do 42 mg/ml. Wartość EC50 odnosi się do stężenia

inhibitora, przy którym współzawodniczy on o połowę

swoistego wiązania i jest taka sama, jak wartość IC50.

Skorelowanie wartości EC50 z względną zawartością DP6 25

sugeruje, że wartość EC50 dla DP6 wynosi około 5 mg/ml.

[0023] W jednym z wykonań kompozycja przeciwadhezyjna

zawiera zatem co najmniej 0,5% (wag./wag.), korzystniej

co najmniej 0,7%, jeszcze korzystniej co najmniej 1,0%

heksasacharydów GOS. Taka kompozycja jest na przykład 30

kompozycją ciekłą, zawierającą co najmniej 5 mg/ml

12

heksasacharydów GOS, korzystniej co najmniej 7 mg/ml,

jeszcze korzystniej co najmniej 10 mg/ml.

[0024] Zastosowanie różnych typów oligosacharydów jako

inhibitorów adhezji patogenów do komórek ssaków zostało

opisane uprzednio. Leach i wsp. (Antimicrob Agents 5

Chemother. 2005, wrzesień; 49(9): 3842-3846) ujawnili

na przykład zdolność rozpuszczalnej, jednowartościowej

globotriozy do przyłączania się do uropatogennej

Escherichia coli i jej kolonizacji.

[0025] W WO 2005/02766 ujawniono zastosowanie kilku 10

oligosacharydów jako inhibitora adhezji patogenu do

komórek ssaków. Testowane związki obejmowały zakupione

GOS (Vivinal GOS; vGOS) i oligosacharydy pektynowe,

które zostały oczyszczone poprzez ultrafiltrację w celu

usunięcia azotanów. Nie przeprowadzono frakcjonowania 15

GOS. vGOS dawały dodatnie wyniki w testach hamowania

adhezji jednego ze szczepów E. coli VTEC (0157:H7). W

WO 2005/02766 nie są wspomniane ani V. cholera, ani

jego toksyny.

[0026] W US 6,224,891 opisano zastosowanie 20

wielowartościowej pochodnej oligosacharydów -

galaktozowych zawierającą podjednostkę Gal(l4)Gal,

jako inhibitora toksyn podobnych do Shiga (SLT, ang.

Shiga liketoxins), wiążącego się z komórkami, na

których powierzchni ulega ekspresji GB3 (glikolipid 25

obojętny, globotriozyloceramid Gb3 (-D-Gal(14)-D-

Gal(14)-D-Glc(1O-ceramid), znany również jako

CD77). SLT jest wytwarzany przez patogenną E. coli.

STARFISH to nazwa nadana specyficznemu syntetycznemu

oligowalentnemu inhibitorowi, opracowanemu celem 30

blokowania wiązania SLT. Jest to syntetyczna cząsteczka

13

zbudowana z symetrią pseudopięciokrotną. Rdzeń to

funkcjonalizowana cząsteczka glukozy, do której

wszczepiono elementy rozdzielające, a na końcach

elementów rozdzielających umieszczono dwa identyczne

trisacharydy, które odpowiadają oligosacharydowi 5

rozpoznawanemu przez toksynę typu Shiga. Struktury

oligosacharydów z US 6,224,891 są niespokrewnione z

heksasacharydami GOS i są nieskuteczne jako czynniki

przeciwadhezyjne wobec Ctx. Nie jest to zaskakujące,

jeżeli weźmie się pod uwagę różnicę strukturalną między 10

receptorem SLT (gangliozyd Gb3) a receptorem Ctx

(gangliozyd GM1).

[0027] Kompozycje zawierające mieszaninę rodzajów GOS,

w tym struktury penta- i heksasacharydów GOS, są znane

w stanie techniki. 15

[0028] W WO2005/00332 ujawniono mieszaninę 20-85%

wag./obj. disacharydów, 20-35% wag./obj. trisacharydów,

15-25% wag./obj. tetrasacharydów i 10-20% wag./obj.

pentasacharydów i ich zastosowanie do wytwarzania leku

do zapobiegania adhezji patogenów lub toksyn do ściany 20

jelita.

[0029] WO2004/052121 dotyczy kompozycji odżywczych

zawierających oligosacharydy GOS i FOS do opanowywania

nieswoistych zapaleń jelit i chorób pokrewnych.

Przykładowe kompozycje zawierają GOS z 2-6 jednostkami 25

sacharydowymi. Wskazano, że korzystne są kompozycje

zawierające 0-30% wagowo pentasacharydów, korzystniej

2-10%, jeszcze korzystniej 7% wagowo. Podobną

preferencję wyrażono w WO2004/089115 i WO2005/035781.

[0030] Tzortzis i wsp. (2005, The Journal of Nutrition, 30

tom 135, strony 1726-1731) ocenili potencjał

14

prebiotyczny mieszaniny GOS, zawierającej 9,9%

disacharydów, 23,1% trisacharydów, 11,55%

tetrasacharydów i 10,45% pentasacharydów w stosunku do

całkowitej suchej masy sproszkowanej kompozycji.

Mieszanina silnie hamowała adhezję niektórych bakterii 5

w systemie modelowym jelita in vitro. Wpływ przypisano

frakcji disacharydowej.

[0031] Jest jasne, że kompozycja według wynalazku, w

której obecne są rodzaje GOS o stopniu polimeryzacji 5

lub wyższym, korzystnie 6 lub wyższym, w ilości 10

większej niż 35% wagowo (%w), nie była ujawniona ani

sugerowana w stanie techniki. Silny wpływ hamujący DP5

i/lub DP6 na wychwyt albo wiązanie przedstawiciela

rodziny toksyny cholery, jak tu ujawniono, nie może

także w żaden sposób wynikać ze stanu techniki. 15

[0032] Jedyne ujawnienie oligosacharydu mającego wpływ

na toksynę cholery znajduje się w Idota i wsp.

(Biotech. Biochem, 59(3), 417-419 (1995), gdzie

identyfikowano 3-sialilolaktozę, obecną w znaczących

ilościach w mleku ludzkim, jako inhibitor gromadzenia 20

się płynu indukowanego przez toksynę cholery w jelitach

królików.

[0033] Podsumowując, w stanie techniki nie ujawniono

ani nie sugerowano wcześniej obserwacji zawartej w

niniejszym zgłoszeniu - że rodzaje GOS o wysokiej masie 25

cząsteczkowej są zdolne do hamowania wiązania toksyny

cholery.

[0034] Jak wynika jasno z powyższego, korzystna

kompozycja zawiera względnie dużo penta- i/lub

heksasacharydów GOS. W jednym z wykonań wynalazek 30

dotyczy również kompozycji która wzbogacona jest w

15

heksapeptydy GOS. Wyrażenie „wzbogacony w” ma

wskazywać, że kompozycja była traktowana albo poddana

obróbce dowolnym sposobem, którego konkretnym celem

jest zwiększenie stężenia pożądanych rodzajów GOS. Może

to nastąpić poprzez ogólne zatężenie kompozycji i/lub 5

poprzez usunięcie struktur innych niż pożądane penta-

i/lub heksasacharydy GOS. W odniesieniu na przykład do

całkowitej liczby poszczególnych struktur (np. rodzajów

GOS o odrębnym stopniu polimeryzacji) obecnych w

kompozycji, kompozycja zawiera co najmniej 7, 10

korzystniej co najmniej 10, jeszcze korzystniej co

najmniej 15% (wag./wag.) GOS o stopniu polimeryzacji

wynoszącym sześć. W jednym z wykonań, GOS DP5-6 stanowi

od około 15 do około 100% wagowo wszystkich struktur

GOS, na przykład 20%-100%, 25%-90%, 35%-96%, 40%-60%, 15

50%-75%, 25-100%, 36-100%, 40-100%, 50-100%, 60-100%,

75-100%.

[0035] Korzystne jest, jeżeli kompozycja ma stosunkowo

niską zawartość trisacharydów GOS. W całkowitej ilości

poszczególnych struktur GOS, kompozycja zawiera na 20

przykład mniej niż 10, korzystniej, mniej niż 7,

jeszcze korzystniej, mniej niż 5% (wag./wag.) GOS o

stopniu polimeryzacji wynoszącym trzy. W jednym z

wykonań, kompozycja GOS jest zasadniczo wolna od

trisacharydów. 25

[0036] Względna zawartość tetrasacharydów GOS w

dostarczonej tu kompozycji GOS może wynosić mniej niż

50, korzystniej, mniej niż 45, jeszcze korzystniej,

mniej niż 40% (wag./wag.).

[0037] W kolejnym aspekcie kompozycja jest zasadniczo 30

wolna od mono- i/lub disacharydów, w szczególności

16

galaktozy i/lub laktozy. Laktoza może być hydrolizowana

z wytworzeniem glukozy i galaktozy przy zastosowaniu -

galaktozydazy. Te monosacharydy można usuwać, stosując

chromatografię kationowymienną.

[0038] W korzystnym wykonaniu kompozycja według 5

wynalazku zawiera połączone wiązaniem beta reszty

galaktozylowe o stopniu polimeryzacji sześć, w

szczególności heksasacharydy GOS z wiązaniami (1-4)

i/lub (1-6). Heksasacharydy GOS z wiązaniami beta

można otrzymać na przykład z mieszaniny GOS, którą 10

wytwarza się enzymatycznie z laktozy z serwatki jako

substratu przy zastosowaniu bakteryjnej -

galaktozydazy. -galaktozydaza z Aspergillus oryzae

wykazuje na przykład transgalaktozylową aktywność

katalityczną wobec laktozy, co skutkuje wytworzeniem 15

mieszaniny GOS zawierającej di- do oktasacharydy

złożone z 1-7 jednostek galaktozylowych połączonych

wiązaniami beta. Taka mieszanina jest również znana w

stanie techniki jako „transgalaktooligosacharydy”, w

skrócie TGOS lub TOS. 20

[0039] Do wytwarzania kompozycji według wynalazku można

korzystnie zastosować preparaty GOS dostępne w handlu.

Szczególnie odpowiednim źródłem GOS DP5 i/lub DP6 do

wykonywania niniejszego wynalazku jest dostępny

handlowo składnik prebiotyczny, zawierający 25

galaktooligosacharydy, sprzedawany pod nazwą handlową

VivinalGOS® przez firmę Friesland Foods Domo®,

Holandia.

[0040] Poszczególne struktury GOS można rozdzielać i

izolować z mieszaniny rodzajów GOS przy zastosowaniu 30

metod znanych w stanie techniki. Można zastosować na

17

przykład nanofiltrację, jak opisano w Goulas, A.K. i

wsp. (Journal of membrane science, 2002. 209(1): str.

321). W korzystnym wykonaniu mieszaninę GOS frakcjonuje

się przy zastosowaniu chromatografii kationowymiennej.

Korzystniej, przeciwjonem względem złoża do wymiany 5

kationowej jest potas (K+). Jak tu przykładowo

przedstawiono, szczególnie korzystne do frakcjonowania

mieszaniny GOS niewykazującej aktywności

przeciwadhezyjnej wobec Ctx na frakcje wykazujące

aktywność przeciwadhezyjną wobec Ctx jest złoże do 10

wymiany kationowej sprzedawane pod nazwą handlową

UniBead UBK-530 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd,

Tokio, Japonia).

[0041] Stopień polimeryzacji każdej z frakcji można

określić przy zastosowaniu różnych technik 15

analitycznych znanych w stanie techniki, takich jak

wysokosprawna chromatografia anionowymienna z pulsową

detekcją amperometryczną (HPAEC-PAD, ang. high-

performance anion-exchange chromatography with pulsed

amperometric detection) lub spektrometria mas z 20

desorpcją laserową z udziałem matrycy i analizatorem

czasu przelotu (MALDI-TOF, ang. matrix-assisted laser-

desorption ionization-time of flight) albo ich

stosowanie łącznie.

[0042] W następnym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu 25

dostarczania frakcji GOS wykazującej aktywność

przeciwadhezyjną wobec Ctx, obejmujący etapy:

- dostarczania mieszaniny galaktooligosacharydów (GOS)

o różnych stopniach polimeryzacji;

18

- ewentualnie usuwania wolnej laktozy poprzez

przekształcenie wolnej laktozy z mieszaniny GOS do

monosacharydów (glukozy i galaktozy);

- nakładania takiej (wolnej od laktozy) mieszaniny GOS

na złoże kationowymienne; 5

- stopniowego wymywania rodzajów GOS o wzrastającym

stopniu polimeryzacji przy zastosowaniu ruchomej fazy

wodnej i zbierania odrębnych wymytych frakcji, z

których każda zawiera rodzaje GOS o innym stopniu

polimeryzacji; 10

- analizowania każdej wymytej frakcji pod kątem wpływu

hamującego na wiązanie się Ctx z GM1;

- i wybierania jednej albo większej liczby frakcji

zdolnych do hamowania wiązania się Ctx z GM1.

[0043] Korzystne jest, jeżeli złożem kationowymiennym 15

jest Unibead UBK-530 albo jego funkcjonalny

równoważnik, jeszcze korzystniej w formie potasowej.

[0044] w EP1352967 przedstawiono sposób wytwarzania GOS

poprzez mieszanie galaktozy z galaktozydazą, co

prowadzi w rezultacie do wytworzenia GOS, z 20

zastosowaniem złoża kationowymiennego do rozdzielenia

mieszaniny na trzy różne frakcje. Jednakże, w

przeciwieństwie do sposobu według niniejszego

wynalazku, nie obejmuje to stopniowego

wymywania/frakcjonowania mieszaniny GOS na poszczególne 25

frakcje, zawierające rodzaje GOS o wzrastającym stopniu

polimeryzacji. Celem sposobu według EP1352967 jest

raczej oddzielenie i zatężenie GOS z laktozy; wszystkie

rodzaje GOS zostają wymyte w drugiej frakcji.

[0045] Według wynalazku, wpływ hamujący na wiązanie się 30

Ctx można łatwo określić przy zastosowaniu metod

19

znanych w stanie techniki, na przykład kompetycyjnego

względem GM1 enzymatycznego testu immunosorpcyjnego

(GM1-ELISA, ang. GM1-competitive-Enzyme Linked Immuno

Sorbent Assay) z wykorzystaniem Ctx połączonego z

peroksydazą chrzanową (Ctx-HRP). Korzystne jest, jeżeli 5

wybrana frakcja ma lub wybrane frakcje mają zdolność do

hamowania co najmniej 50%, korzystniej co najmniej 70%,

najkorzystniej co najmniej 80%, na przykład 90-99,9%,

wiązania się Ctx z GM1 obserwowanego w nieobecności

takiej(takich) frakcji. 10

[0046] Dostarcza się również przeciwadhezyjną frakcję

GOS, którą można otrzymać przy zastosowaniu sposobu

opisanego powyżej. Ewentualnie, otrzymana frakcja GOS

może być zatężana i/lub dalej oczyszczana, na przykład

w celu zwiększenia stężenia struktur GOS 15

zapobiegających adhezji Ctx, takich jak heksasacharydy

GOS. Do tego celu można zastosować na przykład drożdże

piekarnicze.

[0047] Etap dostarczania mieszaniny

galaktooligosacharydów (GOS) o różnych stopniach 20

polimeryzacji obejmuje na przykład poddanie przesączu

serwatki albo laktozy enzymatycznej transgalaktozydacji

przy zastosowaniu -galaktozydazy.

[0048] Alternatywnie, taką mieszaninę

galaktooligosacharydów (GOS) o różnych stopniach 25

polimeryzacji stanowi dostępna handlowo mieszanina GOS,

na przykład syrop GOS sprzedawany pod nazwą handlową

Vivinal GOS.

[0049] Kompozycja według wynalazku może składać się z

frakcji GOS o właściwościach przeciwadhezyjnych wobec 30

20

Ctx, którą można otrzymać przy zastosowaniu opisanego

powyżej sposobu, albo może zawierać taką frakcję.

[0050] Kompozycja według wynalazku może ponadto

zawierać inne przynoszące korzyści składniki, w tym

nieulegające trawieniu oligosacharydy inne niż GOS. 5

Wykazano, że nieulegające trawieniu sialilowane

oligosacharydy (SOS) o jakości spożywczej są zdolne do

hamowania wiązania się toksyny cholery z jej

receptorem. W jednym z wykonań wynalazek dostarcza

kompozycji zawierającej penta- i/lub heksasacharydy 10

GOS, zawierającej ponadto SOS o jakości spożywczej. SOS

(nieulegające trawieniu sialilowane oligosacharydy)

można izolować ze źródeł naturalnych, np. z żółtka jaja

albo produktów mlecznych. Można zastosować dostępną

handlowo mieszaninę sialilooligosacharydów Sunsial E® z 15

żółtka jaja kurzego, która zawiera około 17% SOS i

około 68% białka.

[0051] W jednym z wykonań kompozycja zawiera SOS

pochodzące z mleka, a w szczególności mleka krowiego. W

mleku krowim zidentyfikowano pięć 20

sialilooligosacharydów, wśród których najwięcej było

6'-sialilolaktozaminy i 3'-sialilolaktozy (S. Martin-

Sosa i wsp., (2003). J. Dairy Sci. 86:52-59).

[0052] Należy odnotować, że struktury SOS różnią się

znacząco od rodzajów GOS zidentyfikowanych tu jako 25

aktywne czynniki przeciwadhezyjne wobec Ctx.

[0053] Dostarcza się również zastosowania penta- i/lub

heksasacharydów GOS albo frakcji, którą można otrzymać

opisanym powyżej sposobem do wytwarzania kompozycji

odżywczej lub farmaceutycznej do profilaktyki albo 30

leczenia ostrej lub przewlekłej choroby powodowanej

21

przez toksynę cholery (Ctx) albo termolabilną

enterotoksynę, a w szczególności chorób biegunkowych.

[0054] Ujawnione jest również zastosowanie penta- i/lub

heksasacharydów GOS albo frakcji GOS, którą można

otrzymać opisanym powyżej sposobem, do hamowania in 5

vitro wiązania się przedstawiciela rodziny toksyny

cholery, a w szczególności jej pentametrycznej

podjednostki B, ze swoim receptorem GM1.

[0055] Lek, kompozycja odżywcza lub farmaceutyczna

według wynalazku może ewentualnie zawierać dopuszczalny 10

farmaceutycznie nośnik. Ponadto według wynalazku

zapewnia się złożoną kompozycję farmaceutyczną do

jednoczesnego, oddzielnego albo następującego po sobie

stosowania do hamowania adhezji patogenu do komórek

ssaków, np. do opanowywania, np. leczenia, profilaktyki 15

albo łagodzenia u ssaka ostrych lub przewlekłych,

związanych z bakteriami chorób jelitowych, które zależą

od wychwytu toksyn bakteryjnych za pośrednictwem GM1.

[0056] Kompozycje według wynalazku zawierają

ewentualnie powszechnie stosowane dodatki spożywcze, 20

takie jak dowolny z emulgatorów, środków

stabilizujących, słodzących, smakowych, barwiących,

konserwujących, chelatujących, osmotycznych, buforów i

środków do korekty pH, środków zakwaszających,

zagęszczających, nadających strukturę itd. 25

[0057] Kompozycje farmaceutyczne i suplementy diety

można wytwarzać w postaci miękkiego żelu, saszetek,

proszków, syropów, ciekłych zawiesin, emulsji i

roztworów w dogodnych postaciach dawkowych. W przypadku

kapsułek miękkich korzystne jest, jeżeli składniki 30

aktywne są rozpuszczone albo zawieszone w odpowiednich

22

cieczach, takich jak oleje tłuszczowe, olej parafinowy

lub ciekłe glikole polietylenowe. Ewentualnie można

dodać środki stabilizujące.

[0058] Ilość penta-/heksasacharydu GOS albo frakcji

aktywnej GOS zawartej w kompozycjach według wynalazku 5

może zależeć od postaci kompozycji według wynalazku,

np. proszek albo kompozycja gotowa do spożycia.

Odpowiednie ilości penta- i/lub heksasacharydu GOS

zawarte w kompozycjach według wynalazku mieszczą się

zatem się w zakresie od około 2 do 100% wagowo, na 10

przykład od około 5 do około 95% wagowo, np. od około

15 do około 90% wagowo w stosunku do całkowitej masy

kompozycji.

[0059] Ilość i tryb dawkowania kompozycji według

wynalazku, które mają być podawane, określa się w 15

świetle różnych istotnych czynników, w tym celu i

sposobu podawania, wieku, płci, masy ciała oraz

ogólnego stanu zdrowia oraz kondycji danego osobnika i

nasilenia objawów u osobnika. Gdy kompozycję według

wynalazku podaje się w postaci pożywienia albo napoju, 20

odpowiednia do podawania ilość oligosacharydów GOS może

wynosić od około 1 mg do około 20 g, korzystnie od

około 10 mg do około 10 g, korzystniej od około 10 mg

do około 1 g. Jeśli dostarcza się ją w postaci

farmaceutycznej, odpowiednie dawki dzienne GOS 25

przeciwadhezyjnych wobec Ctx według wynalazku wynoszą

do około 250 mg, korzystniej do około 150 mg, jeszcze

korzystniej do około 100 mg, optymalnie w zakresie od

około 1 mg do około 100 mg.

[0060] Postacie farmaceutyczne albo postacie suplementu 30

diety można wytwarzać przy zastosowaniu

23

konwencjonalnych procedur wytwarzania znanych w

dziedzinie farmacji, czyli poprzez mieszanie substancji

aktywnych razem z nadającymi się do spożycia

dopuszczalnymi farmaceutycznie stałymi albo ciekłymi

nośnikami i/lub zaróbkami, np. wypełniaczami, takimi 5

jak celuloza, laktoza, sacharoza, mannitol, sorbitol,

fosforany wapniowe i środki wiążące, takie jak skrobia,

żelatyna, tragakant, metyloceluloza i/lub

poliwinylopirolidon (PVP). Ewentualne dodatki obejmują

środki smarujące i środki ułatwiające przepływ, np. 10

kwas krzemowy, dwutlenek krzemu, talk, kwas stearynowy,

stearyniany magnezowe/wapniowe, rozcieńczalniki z grupy

glikoli polietylenowych (PEG), środki rozpraszające,

np. skrobię, skrobię karboksymetylową, sieciowany PVP,

agar, kwas alginowy i alginiany, środki barwiące, 15

środki smakowe i środki rozpuszczające. Do powłok

tabletek albo drażetek można dodawać barwniki albo

pigmenty, na przykład w celu identyfikacji albo

wskazania różnych dawek składnika aktywnego.

[0061] Ewentualnie, kompozycje według wynalazku mogą 20

być w pełni odżywcze, tj. mogą zawierać witaminy,

minerały, pierwiastki śladowe, jak również źródła

azotu, węglowodanów i kwasów tłuszczowych, tak, że mogą

być stosowane jako jedyne źródło pokarmu dostarczające

zasadniczo wszystkich wymaganych dziennie ilości 25

witamin, minerałów, węglowodanów, kwasów tłuszczowych,

białek i tym podobnych. Kompozycje według wynalazku

można zatem dostarczać w postaci zrównoważonego

odżywczo pełnego posiłku, np. odpowiedniego do

karmienia doustnego albo przez sondę. 30

24

[0062] Alternatywnie, kompozycje według wynalazku można

dostarczać jako część posiłku, tj. jako dodatek

odżywczy np. w postaci napoju zdrowotnego. Może być

pożądane dostarczenie kompozycji według wynalazku w

postaci niskokalorycznego zamiennika posiłku albo 5

innego produktu odżywczego. W tym przypadku korzystne

jest, jeżeli zamiennik posiłku albo inny produkt

odżywczy jest niskotłuszczowy, tj. zawiera mniej niż

około 10% tłuszczu albo jest zasadniczo wolny od

tłuszczu, tj. tłuszcz stanowi mniej niż około 2,5%, na 10

przykład około 2%, w stosunku do całkowitej zawartości

kalorycznej kompozycji. Odpowiednie jest, jeżeli

pojedyncza porcja niskokalorycznego zamiennika posiłku

będzie miała wartość kaloryczną mniejszą niż około 1000

cal, korzystnie między około 200 cal i około 500 cal. 15

[0063] Odpowiednie kompozycje według wynalazku, np.

odpowiedni niskokaloryczny produkt odżywczy, mogą

obejmować napoje bezalkoholowe, takie jak sok, koktajl

i napój sojowy, lub być rozproszone w środku spożywczym

dowolnego rodzaju, takim jak batony mleczne, zupy, 20

płatki śniadaniowe, musli, cukierki, pastylki,

ciasteczka, herbatniki, masy do smarowania, mieszanki

dla noworodków i niemowląt, mieszanki dla wcześniaków,

pokarm po odstawieniu od piersi, słodycze, ciasta,

krakersy, takie jak krakersy ryżowe i produkty mleczne, 25

takie jak koktajle mleczne, jogurty pitne i zsiadłe

mleko.

[0064] Kompozycje według wynalazku zawierają

ewentualnie powszechnie stosowane dodatki spożywcze,

takie jak dowolny z emulgatorów, środków 30

stabilizujących, słodzących, smakowych, barwiących,

25

konserwujących, chelatujących, osmotycznych, buforów i

środków do korekty pH, środków zakwaszających,

zagęszczających, nadających strukturę itd.

[0065] W dalszym aspekcie wynalazku dostarcza się

zastosowania frakcji GOS albo kompozycji według 5

wynalazku jako dodatku spożywczego.

[0066] Odpowiednie postaci produktu według niniejszego

wynalazku obejmują roztwór, kompozycję gotową do

spożycia, np. kompozycje gotowe do wypicia, napoje do

rozpuszczenia, ciekłe produkty spożywcze, takie jak 10

napoje bezalkoholowe, soki, napoje izotoniczne, napoje

mleczne, koktajle mleczne, jogurty pitne lub zupy. W

kolejnym wykonaniu wynalazku kompozycje według

niniejszego wynalazku można wytwarzać i sprzedawać w

postaci koncentratu, proszku lub granulatu, np. 15

granulatu musującego, który rozpuszcza się w wodzie

albo innej cieczy, takiej jak mleko albo sok owocowy,

aby uzyskać kompozycję gotową do spożycia, np.

kompozycję gotową do wypicia albo rozpuszczalny napój.

[0067] Kompozycję według wynalazku można wytwarzać w 20

dowolnej postaci odpowiedniej do podawania ludziom, w

szczególności do podawania do dowolnej części przewodu

pokarmowego. Niniejszy wynalazek obejmuje podawanie

dojelitowe kompozycji według wynalazku, korzystnie

podawanie doustne oraz podawanie przez sondę albo 25

cewnik.

[0068] Kompozycje według wynalazku mogą być podawane

pod nadzorem specjalisty z zakresu ochrony zdrowia albo

samodzielnie.

[0069] Kompozycje farmaceutyczne lub odżywcze albo 30

produkty spożywcze lub napoje zawierające penta- i/lub

26

heksasacharydy GOS według niniejszego wynalazku mogą

być bezpiecznie spożywane przez każdego. Są one w

szczególności zalecane każdemu, kto jest postrzegany

jako narażony na ryzyko choroby, stanu albo objawów

związanych z toksynami z rodziny toksyn cholery, na 5

przykład osobnikom o osłabionej odporności i/lub

niedożywionym.

[0070] Wynalazek dotyczy także sposobu leczenia i/lub

profilaktyki choroby związanej z wychwytem lub

powodowanej przez wychwyt przedstawiciela rodziny 10

toksyny cholery, np. Ctx lub LT, u ssaka, w tym

człowieka, potrzebującego takiego leczenia,

obejmującego podawanie takiemu ssakowi skutecznej

ilości penta-/heksasacharydu GOS lub aktywnej frakcji

GOS według wynalazku. Stosowany tu termin „skuteczna 15

ilość” odnosi się do ilości skutecznej w zakresie

osiągnięcia pożądanego efektu terapeutycznego, takiego

jak leczenie albo profilaktyka ostrych objawów

związanych z działaniem toksyny, takich jak w

szczególności gromadzenie się płynu w jelitach. 20

[0071] W innym aspekcie dostarcza się sposobu hamowania

adhezji toksyny cholery do komórek ssaków, np. do

jelita albo komórek śródbłonka jelita ssaka.

[0072] W dalszym wykonaniu niniejszy wynalazek dotyczy

sposobu wytwarzania kompozycji według wynalazku, 25

obejmującego dokładne mieszanie składników kompozycji

według wynalazku z farmaceutycznie albo odżywczo

dopuszczalnymi zaróbkami. Takie sposoby są dobrze znane

specjaliście.

[0073] Przydatność wszystkich kompozycji według 30

niniejszego wynalazku można obserwować w standardowych

27

badaniach klinicznych, przykładowo we wskazaniach

opisanych powyżej, przy zastosowaniu na przykład jednej

lub więcej frakcji przeciwadhezyjnych wobec Ctx według

wynalazku w zakresie od 1 g do 15 g, np. około 10 g, u

ssaka, oraz w standardowych modelach zwierzęcych. 5

Złagodzenie objawów charakterystycznych dla ostrych lub

przewlekłych chorób jelitowych związanych z toksyną

cholery dostarczane przez kompozycje można obserwować w

standardowych badaniach na zwierzętach, na przykład

wykorzystując doświadczalny model cholery w pętli 10

jelitowej królików (Leitch i wsp., J Infect Dis. 1967,

czerwiec; 117(3): 197-202).

Opis figur

[0074]

Fig. 1: Korelacja między numerem frakcji GOS 15

oczyszczonej poprzez wymianę kationową a względną

zawartością tri-, tetra-, penta- i heksasacharydów GOS

(wskazanych, odpowiednio, jako DP3, DP4, DP5 i DP6).

Szczegóły doświadczenia - patrz przykład 1.

Fig. 2: Hamowanie Ctx-HRP n = 6 przez frakcję 2 20

GOS. P = 0,000 wskazuje, że oddziaływanie między

frakcją 2 GOS a Ctx-HRP w tym teście ELISA na bazie GM1

jest wysoce znaczące. ANOVA obliczono z wartości

wiązania Ctx-HRP po przekształceniu logarytmicznym.

Szczegóły doświadczenia - patrz przykład 2. 25

Fig. 3: Zależność odpowiedzi od dawki frakcji 2

GOS, n = 6. Globalna wartość r2 = 0,925 wskazuje na

dobrze pasującą odpowiedź sigmoidalną. Stwierdzono, że

różnice między wartościami log EC50 i EC 50 nie są

znacząco różne (P = 0,9411), hipoteza zerowa nie 30

została więc odrzucona.

28

Fig. 4: Aktywność hamowania wiązania się Ctx-HRP

z GM1 dla frakcji 1–15. Zawartości różnych rodzajów GOS

w każdej frakcji – patrz Fig. 1. Panel A: 100 mg ml-1 w

stosunku do hamowania 10 ngml-1 Ctx-HRP. n = 6. Duża

wartość r2 wskazuje, że 73,56% zmian jest powodowana 5

przez różnice w składzie pod względem rodzajów między

frakcjami GOS. Panel B: 100 mg ml-1 GOS frakcji 1-15 w

stosunku do hamowania 20 ngml-1 Ctx-HRP. n = 6. Duża

wartość r2 wskazuje, że 74,14% zmian jest powodowana

przez różnice w składzie pod względem rodzajów GOS 10

między frakcjami.

Fig. 5: Korelacja między dawką DP6 a hamowaniem

Ctx-HRP n = 6. P = 0,2748 wskazuje, że nie ma różnicy

statystycznej między poszczególnymi dopasowanymi

sigmoidalnymi krzywymi zależności odpowiedzi od dawki. 15

Ponadto stężenie Ctx-HRP nie wpływa na skuteczność DP6.

Wartości DP6 poddano przekształceniu do skali

logarytmicznej. R2 = 0,8516, a EC50 = 5,10% DP6.

PRZYKŁADY 20

Przykład 1: Oczyszczanie i określanie właściwości

galaktooligosacharydów (GOS) o „jakości spożywczej”

przy zastosowaniu chromatografii kationowymiennej i

HILIC-ESI-MS 25

[0075] Wytwarzane enzymatycznie galaktooligosacharydy

pochodzące z serwatki składają się z di- do

heptasacharydów złożonych z 1-7 jednostek galaktozy

przyłączonych do cząsteczki glukozy na końcu 30

redukującym. Ta złożona mieszanina GOS jest przykładem

29

dostępnego handlowo produktu zawierającego nieulegające

trawieniu, promujące zdrowie oligosacharydy i cukry o

niskiej masie cząsteczkowej, które niewiele zwiększają

wartość kaloryczną produktu. W tym przykładzie opisano

zastosowanie złoża do wymiany kationowej w postaci 5

sodowej w celu chromatograficznego usuwania glukozy i

galaktozy na skalę półprodukcyjną. Z powodzeniem

określono właściwości otrzymanych w rezultacie frakcji

oligosacharydowych i uzyskano ich profile, stosując

chromatografię na podstawie oddziaływania hydrofilowego 10

(HILIC, ang. hydrophilic interaction chromatography) w

połączeniu ze spektrometrią mas z elektrorozpylaniem

(ESI-MS, ang. electrospray mass spectrometry).

1. Materiały i metody 15

1.1. Chemikalia

[0076] Wszystkie roztwory wytworzono z zastosowaniem

ultraczystej wody MilliQ. Zastosowana dostępna handlowo

mieszanina galaktooligosacharydów VivinalGOS® miała 20

typowy skład: 73% ww-1 suchej masy, w której 57% ww-1

to galaktooligosacharydy, 23% ww-1 to bezwodna laktoza,

19% ww-1 to bezwodna glukoza, a 0,9% ww-1 to galaktoza

(Friesland Foods Domo, Zwolle, Holandia). Wzorcami do

sporządzenia krzywej standardowej do HPLC był 25

monohydrat D-(+)-glukozy i B-laktoza o czystości

analitycznej, zakupione w firmie Sigma-Aldrich Company

Ltd. (Gillingham, Dorset, Wielka Brytania). MeOH i H2O

do HPLC zakupiono w firmie Rathburns Chemical Co.,

(Peebleshire, Szkocja), a NH4AC - w BDH (VWR 30

International, Poole, Wielka Brytania). Maltoheptanozę,

30

maltoheksanozę, maltopentanozę, maltotetraozę,

rafinozę, laktozę i glukozę zakupiono w firmie Sigma-

Aldrich (Gillingham, Dorset, Wielka Brytania). Proszki

frakcjonowanych GOS wytworzono przy zastosowaniu złoża

do wymiany kationowej UBK-530 (Mitsubishi Chemical 5

Corporation, Tokio, Japonia). Drabinkę homopolimeru

glukozy (GHP, ang. Glucose Homopolymer) wyznakowaną 2-

AB (2-aminobenzamidem) zakupiono w firmie Ludger Ltd

(Abingdon, Oxfordshire, Wielka Brytania). Wyjściowo

wszystkie oligosacharydy rozpuszczono w H2O do 10

10 mgml-1, a następnie dalej rozcieńczano przed

wstrzyknięciem.

1.2. Hydroliza laktozy z VivinalGOS® przy zastosowaniu

-galaktozydazy 15

[0077] Przeprowadzono usuwanie laktozy z VivinalGOS w

celu polepszenia rozdziału między glukozą i galaktozą a

trisacharydami-heptasacharydami. W reakcji laktoza jest

hydrolizowana z wytworzeniem glukozy i galaktozy. Te

monosacharydy są zatrzymywane z wyższym powinowactwem 20

przy wymianie kationowej. W tym celu, VivinalGOS®

traktowano wstępnie preparatem -galaktozydazy

Maxilact® L5000 przed oczyszczaniem poprzez wymianę

kationową. Wyjściowo przygotowano 30% roztwór ww-1

VivinalGOS® i doprowadzono do pH 6,5 przy użyciu 1 M 25

wodorotlenku sodowego. Po ogrzaniu do temperatury 40°C

do VivinalGOS® dodano 0,9 g Maxilact i inkubowano przez

4 godziny. Po traktowaniu pH roztworu doprowadzono do

4,5 i roztwór ogrzewano w celu inaktywacji laktazy

przez 10 minut w temperaturze 100°C. Wytrącony enzym 30

usuwano poprzez odwirowanie przy 19 000 obr./min przez

31

60 minut. Otrzymany w rezultacie roztwór VivinalGOS

wolny od laktozy zastosowano w doświadczeniach z

wymianą kationową.

1.3. Oczyszczanie VivinalGOS® poprzez chromatografię 5

kationowymienną na skalę preparatywną

[0078] Technika jest zaadaptowana z Matsumoto i wsp.

(Method for producing galactooligosaccharides, E. P.

Office, red. 1987). Pokrótce, wybrano formę Na złoża

Unibead UBK-530 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd, 10

Tokio, Japonia). 2000 ml złoża UBK-530 uwodniono i

drobiny usunięto zgodnie z instrukcjami producentów.

Następnie złoże traktowano 1 M roztworem KCl przez 12

godzin w łaźni wodnej z mieszaniem w temperaturze 20°C

w celu wymiany jonów Na+ na jony K

+. 15

[0079] Kolumna była wykonana ze szkła borokrzemianowego

o średnicy wewnętrznej 0,05 m i długości 1 m. Ta

szklana kolumna była otoczona przez akrylowy,

plastykowy płaszcz termostatyczny (kolumna Pharmacia

XK-50/100, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, 20

Wielka Brytania). Wokół kolumny owinięte były dodatkowe

rurki teflonowe, działające jako wymiennik ciepła.

Kolumnę ogrzewano, wykorzystując łaźnię wodną Haake

Model FE z cyrkulacją (Haake, Wielka Brytania). Próbki

pompowano przez złoże przy użyciu wolnego modułu 3-25

tłokowej pompy pulsacyjnej (Model C-601, Buchi, Flawil,

Szwajcaria). Rozdzielone węglowodany z kolumny

wykrywano przy użyciu refraktometru różnicowego,

detektor Gilson model 132 RI (Anachem, Bedfordshire,

Wielka Brytania), który na początku każdego 30

doświadczenia odpowietrzano roztworem do wymywania.

32

[0080] Przed nałożeniem próbki całe oprzyrządowanie, w

tym złoże jonowymienne, kolumnę, VivinalGOS® i wodę

stosowaną do wymywania ogrzewano do temperatury 55°C

przez okres 60 minut celem zapewnienia równowagi.

Ogółem na kolumnę załadowano 1800 ml z 2000 ml złoża 5

UBK-530. Początkowo demineralizowaną wodę przepompowano

z prędkością 1 mlmin-1, stopniowo zwiększając ją do

końcowego przepływu 15 mlmin-1 w celu uniknięcia szoku

ciśnieniowego wobec złoża. Przed użyciem wszystkie

roztwory odgazowywano przy zastosowaniu helu. Po 10

wstępnym traktowaniu Maxilact L5000, 150 ml 30% ww-1

wolnego od laktozy roztworu Vivinal GOS® wstrzyknięto

na kolumnę z prędkością 15 mlmin-1. Stężenie wyższe niż

to powodowało zaburzenie wzoru rozdziału. Objętość

międzyziarnowa tej kolumny wynosiła 675 ml lub 45 minut 15

przed rozpoczęciem wymywania węglowodanu. Eluent

zawierający rozdzielone węglowodany zbierano co minutę

we frakcjach do momentu, gdy żaden węglowodan nie był

już wykrywany przez detektor RI (Model 2128 Fraction

Collector, Bio-Rad, Hertfordshire, Wielka Brytania). 20

1.4. Określenie czystości Vivinal GOS poprzez

wysokosprawną chromatografię anionowymienną przy

zastosowaniu chromatografii kationowymiennej na skalę

preparatywną 25

[0081] Frakcje zebrane w czasie chromatografii

jonowymiennej analizowano przy zastosowaniu

wysokosprawnej chromatografii anionowymiennej z pulsową

detekcją amperometryczną (HPAEC-PAD) (Dionex Corp., CA,

USA), postępując zgodnie z protokołem opracowanym do 30

galaktooligosacharydów przez de Slegte i wsp.

33

(„Determination of trans-Galactooligosaccharides in

Selected Food Products by Ion Exchange Chromatography:

Collaborative Study”. Journal of AOAC International,

2002. 85, część 2: str. 417-423). Pokrótce, zastosowano

adhezyjną kolumnę ze złożem anionowymiennym CarboPac 5

PA-1 z kolumną zabezpieczającą o średnicy wewnętrznej

250 x 4 mm z cząstek sulfonowanego

etylowinylobenzenodiwinylobenzenu. Fazą ruchomą był

gradient (A) 12,5 mM NaOH, (B) 125 mM NaOH i (C) 125 mM

NaOH z 500 mM octanem sodowym. Gradient eluentu do 10

analizy wykonano zgodnie z wcześniejszym doniesieniem

de Slegte i wsp. 20 l każdej próbki wstrzykiwano i

analizowano w temperaturze pokojowej przy prędkości

przepływu 1 mlmin-1.

15

1.5. Chromatografia oparta na oddziaływaniach

hydrofilowych (HILIC)

[0082] Wybrano kolumnę PEEK, ZIC®-HILIC, 150 x 2,1 mm 5

m, ponieważ wykazano, że „wyciek” fazy stacjonarnej z

kolumny był szczególnie niski (SeQuant AB, Umea, 20

Szwecja). Faza stacjonarna z jonami amfoterycznymi

ZIC®-HILIC jest przyłączona do porowatej krzemionki.

Rozdział uzyskuje się poprzez mechanizm hydrofilowego

dzielenia nałożony na słabe oddziaływania

elektrostatyczne. Innymi parametrami analizy były: 25

objętość wstrzykiwania - 1 l, wykrywanie UV - 214 nm i

czas przebiegu - 31 min. Jedną z frakcji GOS

analizowano w temperaturze 20, 30, 40, 50 i 60°C.

Wszystkie dalsze przebiegi chromatograficzne

przeprowadzano w temperaturze 60°C. Zamiast 30

acetonitrylu stosowano metanol, ponieważ możliwe było

34

rozpuszczenie frakcji GOS w wyższym stężeniu MeOH:H2O

niż ACN:H2O. Wstrzykiwanie węglowodanów w 100% H2O nie

pozwalało na rozdział roztworu do fazy stacjonarnej i w

konsekwencji próbka wymywała się jako „czop” bez

rozdziału. Faza ruchoma składała się z 95% MeOH-5 mM 5

NH4AC w H2O. Doświadczenia z gradientem różniły się

czasem, w którym uzyskiwano stężenie 50:50 MeOH: H2O

poprzez programowanie pompy gradientowej. Zastosowano

niską 5% zawartość wody, żeby utrzymać odpowiednie

uwodnienie i poprawić oddziaływania elektrostatyczne 10

między fazą stacjonarną a ruchomą. System HPLC Agilent

1100 składał się z serii pomp kapilarnych Agilent 1100

z przystawką odgazowującą (Agilent, Stockport, Wielka

Brytania), detektorem UV, automatycznym odbieralnikiem

próbek i zabezpieczeniem kationowymiennym Dionex CS 14 15

(4 mm x 50 mm). Prędkość przepływu mieściła się w

zakresie od 100 do 200 lmin -1; 214 nm śledzono przy

użyciu detektora UV.

1.6. Spektrometria mas z jonizacją poprzez 20

elektrorozpylanie do analizowania cukrów

[0083] Jonizacja i wykrywanie obejmujące konkretne

parametry operacyjne są opisane zgodnie ze

zmodyfikowanymi instrukcjami producentów (urządzenie

Bruker Daltonics MicroTOF, Bruker Daltonics, Brema, 25

Niemcy).

2. Wyniki

2.1. Wymiana kationowa frakcjonowanych GOS

[0084] Metoda wymiany kationowej została zmodyfikowana 30

względem Matsumoto i wsp. [12], zgodnie z informacjami

35

ustnymi od J. de Slegte z Royal Friesland Foods. Na

wstępie, badano przeciwjony Na+, K

+ i Ca

2+, aby ustalić,

które z nich zapewniają najbardziej czyste oddzielenie

GOS od laktozy, galaktozy i glukozy. Forma potasowa

złoża UBK-530 dawała najlepsze wyniki pod względem 5

rozdziału Vivinal GOS®, została więc wybrana do

dalszych doświadczeń (dane nieopublikowane). Wobec

każdej 1-minutowej frakcji zastosowano HPAEC-PAD w celu

określenia składu oligosacharydów. Początkowe frakcje

zawierały wysokie stężenie GOS. W kolejnych próbkach 10

zbieranych z kolumny jonowymiennej następowało

przesunięcie w składzie od galaktooligosacharydów o

dużej masie cząsteczkowej do glukozy i galaktozy. Złoże

UBK-530 wykazywało znakomitą odporność na kompresję,

cukry były wymywane również bez rozpuszczalnika 15

organicznego, a kolumna nie wymagała równoważenia

między wstrzykiwaniami: uzyskano zatem oczyszczanie

półciągłe.

2.2. Analiza i porównanie między frakcjami GOS o 20

numerach 1-15

[0085] Stosując kolumnę ogrzewaną do temperatury 60°C

0,5°C, prędkość przepływu 200 lmin-1 i gradient 95%

MeOH-5 mM NH4AC w wodzie do 50% MeOH-5 mM NH4AC w

wodzie, w ciągu 25 minut uzyskano częściowy rozdział 25

kompozycji GOS na frakcje 1-15. Przy wykorzystaniu

programu do całkowania danych w oprogramowaniu

DataAnalysis v3.2 możliwe było całkowanie pola pod

każdą z grup cukrów zidentyfikowanych jako DP3, po

których następowały DP4, DP5, DP6 i DP7. 30

36

[0086] Poprzez całkowanie wybranych chromatogramów dla

każdego cukru możliwe było obliczenie zawartości di-,

tri-, tetra-, penta-, heksa- i heptasacharydów w każdej

frakcji. Jednakże wykazano, że oligosacharydy nie

ulegają jonizacji w źródle z tą samą wydajnością 5

(Harvey, D. J., Rapid communications in mass

spectrometry: RCM, 1993. 7(7): str. 614), powszechną

praktyką w spektrometrii mas jest więc wyrażanie danych

w postaci zawartości względnej (Lamari, i wsp., J

Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2003. 10

793(1): str. 15-36). Jeżeli poszczególne cukry nie

ulegają jonizacji z równą wydajnością bądź

heksasacharydy (DP6) słabo ulegają jonizacji, względny

poziom jonizacji w procentach zmniejsza ten wpływ,

kiedy dokonuje się porównania między frakcjami. Jeżeli 15

na przykład doda się całkowitą zawartość wszystkich

adduktów węglowodanowych we frakcji X i obliczy udział

procentowy każdej DP, zawartość poszczególnych DP (na

przykład wszystkich DP3) nanosi się na wykres względem

wszystkich powstałych jonów. Fig. 1 to przedstawienie 20

graficzne względnych ilości tri-, tetra-, penta- i

heksasacharydów względem numeru frakcji. Regresja

liniowa między numerem frakcji i zawartością DP6 daje

współczynnik korelacji wynoszący 0,958, co wskazuje na

istnienie silnej zależności między tymi dwiema 25

zmiennymi. Prawdopodobieństwo otrzymania obliczonej

wartości r większej niż 0,9 przy więcej niż 10

powtórzeniach, kiedy dwie zmienne są niezależne, wynosi

<0,001. Zawartość DP5 jest również odwrotnie

proporcjonalna do numeru frakcji, ze współczynnikiem 30

0,720.

37

PRZYKŁAD 2: Hamowanie przez galaktooligosacharydy

wiązania się toksyny cholery z jej receptorem

[0087] W tym przykładzie mierzy się zdolność frakcji

galaktooligosacharydów otrzymanych w przykładzie 1 do 5

hamowania wiązania się toksyny cholery z GM1 przy

zastosowaniu kompetycyjnego testu ELISA. Bioaktywność

albo wartości EC50 koreluje się z informacją

strukturalną z doświadczeń z HILIC-ESI-MS z przykładu

1, aby ustalić, które struktury z GOS są najbardziej 10

wydajne w hamowaniu wiązania się Ctx z naturalnymi

receptorami GM1. Jako cukier modelowy zastosowano

naturalny receptor GM1, ponieważ wykazano, że ma

największą skuteczność wobec toksyny cholery.

15

1. Materiały i metody

1.1 Chemikalia

[0088] Monohydrat D-(+)-glukozy o czystości

analitycznej, -laktozę, monosialogangliozyd-GM1 20

izolowany z mózgu bydlęcego, TWEEN® 20, bydlęcą

albuminę surowicy (BSA), 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę

(TMB), dimetylosulfotlenek (DMSO) i kwas siarkowy

(H2SO4) zakupiono w firmie Sigma Aldrich (Gillingham,

Dorset, Wielka Brytania). Sól fizjologiczną buforowaną 25

fosforanem (PBS) zakupiono w Oxoid Ltd (Basingstoke,

Hamps, Wielka Brytania) w postaci tabletek; odpowiada

to oryginalnej kompozycji według Dulbecco i Vogt (1954)

z tą różnicą, że pominięty jest wapń i magnez. Każdą

tabletkę rozpuszczono w wodzie destylowanej zgodnie z 30

instrukcjami producentów. Podjednostkę B toksyny Vibrio

38

cholera sprzężoną z peroksydazą chrzanową zakupiono w

importującej ją firmie Quadratech Ltd, Surrey, Wielka

Brytania (produkcja: List Biologicals, CA, USA).

Galaktooligosacharydy były darem z Friesland Foods Domo

(Zwolle, Holandia); przed użyciem oczyszczono je i 5

frakcjonowano przy zastosowaniu chromatografii

kationowymiennej. Wszystkie roztwory przygotowano przy

użyciu ultraczystej wody MilliQ.

1.2 Inhibitorowy test ELISA po związaniu GM1 10

[0089] Płytki do mikromiareczkowania (F96 Maxisorp;

Fisher Scientific, Loughborough, Wielka Brytania)

inkubowano w temperaturze pokojowej przez noc ze 100 l

gangliozydu GM1 o stężeniu 500 ngml-1 na studzienkę,

rozcieńczonego w soli fizjologicznej buforowanej 15

fosforanem (pH 7,2), zawierającej 160 mM NaCl i 9 mM

fosforan potasowy (PBS). Nieprzyłączony gangliozyd

usuwano poprzez trzykrotne płukanie studzienek PBS

zawierającym 0,1% Tween 20. Dodatkowe miejsca wiązania

na powierzchni płytki blokowano poprzez inkubowanie 20

studzienek z 200 l 2% (wag./obj.) bydlęcej albuminy

surowicy (BSA)-PBS przez noc w temperaturze pokojowej,

a następnie przepłukano trzykrotnie 0,1% Tween 20-PBS.

[0090] Przygotowano roztwory do testowania w 0,1% BSA-

PBS (każdy z nich składał się z 5, 10 i 15 ng/ml 25

koniugatu Ctx-B5 z peroksydazą chrzanową) i inkubowano

je wstępnie z potencjalnymi inhibitorami przez 2 h w

temperaturze pokojowej. Po dodaniu 200 l każdego z

testowanych roztworów płytki inkubowano przez 2 godziny

w temperaturze pokojowej. Niezwiązaną toksynę usuwano 30

poprzez trzykrotne płukanie 0,1% Tween 20-PBS.

39

Następujące etapy wykazały następnie obecność toksyny

związanej z GM1: (1) inkubacja ze 100 l świeżo

sporządzonego roztworu (TMB) (1 mg TMB w 500 l DMSO,

50 ml 0,1 M buforu – cytrynianu potasu i 5 l 30%

nadtlenku wodoru) przez 15 min w temperaturze 5

pokojowej. TMB jest niekancerogennym zamiennikiem

benzydyny i był stosowany jako substrat peroksydazy. Z

substratu powstał rozpuszczalny produkt końcowy, który

miał zabarwienie bladoniebieskie i był odczytywany

spektrofotometrycznie (Genios, Tecan UK Ltd, Thatcham, 10

Wielka Brytania) po zatrzymaniu reakcji 2 M H2SO4 (co

dawało żółty kolor) przy 450 nm.

[0091] Wszystkie doświadczenia wykonywano w czterech

powtórzeniach i odnoszono do krzywej standardowej dla

0, 0,97, 1,95, 3,90, 7,81, 15,62, 31,25 i 62,5 ngml-1 15

koniugatu toksyna-peroksydaza chrzanowa. Sporządzono

roztwór podstawowy 30 ngml-1 Ctx-HRP i zastosowano go

jako kontrolę na wszystkich płytkach, aby zmierzyć

współczynnik zmienności w obrębie testu albo odchylenia

w absorbancji i stabilności. Nieznane odczyty 20

absorbancji, a następnie wartości EC50 obliczono z

krzywej standardowej i porównano przy użyciu

oprogramowania Prism wersja 4.0 (GraphPad® Software

Inc, CA, USA). ANOVA obliczono, stosując Minitab®

wersja 14 (Minitab Ltd, Coventry, Wielka Brytania). 25

[0092] Średnie statystyczne każdego z zestawu odczytów

absorbancji zastosowano do obliczenia stężenia toksyny

cholery, która nie było hamowana i w konsekwencji była

zdolna do wiązania się z powierzchnią z unieruchomionym

GM1. Wyższe odczyty absorbancji wskazywały na wyższe 30

stężenie niezahamowanej toksyny cholery i/lub słabe

40

działanie inhibitora. Słupki błędów przedstawiają błąd

standardowy średniej rzeczywiście niezahamowanej Ctx-

HRP w różnych dniach powtarzanych doświadczeń.

2. Wyniki 5

2.1 Hamowanie przez frakcje GOS wiązania się Ctx-HRP z

GM1 w teście ELISA

[0093] Fig. 2 ukazuje wykres wzajemnej zależności

między stężeniem wiązanego Ctx-HRP a dawką frakcji GOS 10

numer 2 w każdym z różnych stężeń Ctx-HRP. Frakcję GOS

numer 2 wybrano jako przykład, jakkolwiek podobne

poziomy hamowania obserwowano typowo dla frakcji 1-9, z

widocznym zmniejszeniem odpowiedzi kolorymetrycznej we

wszystkich 3 stężeniach Ctx-HRP przy zawartości cukru 15

co najmniej 12,5 mgml-1. Większe słupki błędów przy

niższych stężeniach GOS są powodowane przez częściowe

hamowanie w obrębie powtórzeń i/lub słabe powinowactwo

przy niższych stężeniach. Ponadto, dwustronna ANOVA

między stężeniem związanego Ctx-HRP a dawką frakcji 2 20

GOS i dawką Ctx-HRP potwierdza, że dawka GOS wpływa na

hamowanie (P<0,001). Dodatkowo, w statystyce opisowej

R2 (2, czyli eta do kwadratu) oznacza część całkowitej

wariancji, którą można przypisać różnicom wśród

średnich „dawki Ctx-HRP” i „dawki GOS”. R2 wynosząca 25

98,43% oznacza, że duża część zmienności powstaje na

skutek sposobu postępowania, który definiuje grupę (tj.

wzrastającego stężenia) i dalej umacnia zależność

między związanym Ctx-HRP a stężeniem frakcji 2 GOS.

Duża wartość F oznacza, że zmiana między wartościami 30

średnimi „dawki GOS” i „związanego Ctx-HRP” jest

41

większa niż byłaby obserwowana losowo, co dalej

potwierdza tezę, że „dawka GOS” wpływa na „związaną

Ctx-HRP”.

[0094] Średnie stężenie Ctx-HRP związanego we

wszystkich doświadczeniach z frakcją 2 GOS bez żadnego 5

inhibitora wynosiło 4,25, 8,31 i 21,90 ngml-1, a nie 5,

10 i 20 ngml-1, jak obliczono. Jednakże te różnice

mieszczą się w granicach współczynników

wewnątrztestowych i międzytestowych (nieprzedstawione).

Ponadto, stwierdzano również niewielkie różnice w 10

wartościach inbibitora zerowego między frakcjami, w

celu dokonania porównania między frakcjami obliczono

więc wartości EC50 i dokonano porównania między

krzywymi. Do przekształcenia stężenia Ctx-HRP z ngml-1

na procent hamowania i znormalizowania wartości 15

inhibitora do skali logarytmicznej zastosowano

oprogramowanie Prism® v4 (GraphPad Software, Inc, CA,

USA). Prism® dokonał dopasowania do sigmoidalnej

krzywej zależności odpowiedzi od dawki lub logistyki

trójparametrowej (Fig. 3). Normalizacja przeprowadzona 20

w ten sposób rozciąga oś y pionowo od 0 do 100% z

definicji; istotna zatem była dokładność wartości

minimalnych i maksymalnych. Program Prism porównał

również krzywe zależności odpowiedzi od dawki dla

każdego stężenia Ctx-HRP i wykazał, że wartości EC50 25

nie są statystycznie różne (P = 0,9411, F = 0,061). To

wskazuje, że frakcja 2 GOS skutecznie hamowała Ctx-HRP,

z równą skutecznością niezależnie od ilości Ctx-HRP,

jak przedstawiono na Fig. 3. Ta sytuacja prawdopodobnie

zmieni się po zwiększeniu stężenia Ctx-HRP powyżej 20 30

ng.ml

-1. Przeciwnie, ten test jest ograniczony przez

42

liniowość krzywej standardowej dla substratu

peroksydazy i obserwację, że połowa maksymalnego

wiązania jest szacowana na 15 ng.ml

-1 lub 0,153 nM [34].

EC50 obliczono jako 30,77 mg ml-1, co ściśle pasuje do

sigmoidalnej krzywej z R2 wynoszącą 0,9253. 5

[0095] Wśród frakcji 1-10, wartości EC50 różniły się

minimalnie, szczególnie w porównaniu z wartościami EC50

wynoszącymi 30,77 mgml-1 dla frakcji 2 GOS i 42,19

mgml-1 dla frakcji 8 GOS. Wartości EC50 względem Ctx-

HRP nie powinno się uzyskiwać dla frakcji 9–15, 10

ponieważ nie obserwowano całkowitego hamowania lub

dopasowanie do sigmoidalnej krzywej zależności

odpowiedzi od dawki było słabe. W celu porównania

skuteczności miedzy frakcjami wybrano zatem maksymalne

hamowanie z 100 mgml-1 frakcją GOS. Co ciekawe, frakcje 15

GOS o numerach 11-15 dawały wykres z większymi słupkami

błędu standardowego, jednak jest to prawdopodobnie

spowodowane wiązaniem nieswoistym albo słabszym

powinowactwem wobec Ctx-HRP. Pomimo tej obserwacji,

jednostronna analiza ANOVA hamowania Ctx-HRP 20

wynoszącego 10 ngml-1 (0,102 nM) i każdej frakcji GOS

wykazała istnienie różnicy statystycznej między

frakcjami, z P<0,0001 (Fig. 4A). Frakcje 1-8 hamują,

odpowiednio, między 91,84% a 89,05% Ctx-HRP. Przy

porównaniu tego procentu hamowania z rzeczywistym 25

stężeniem związanego Ctx-HRP przy inkubacji ze 100

mgml-1 frakcji 2 GOS, ta wartość jest niska (0,621

ngml-1) przy granicach 95% przedziału ufności

wynoszących 0,374–0,868 ngml-1. Ponadto, przy

100 mgml-1 istnieje 95% pewności, że frakcja 2 z 30

43

wymiany jonowej będzie hamować między 95,67% a 89,95%

Ctx-HRP, 95% czasu.

[0096] Fig. 4B podobnie porównuje hamowanie Ctx-HRP

przy 20 ngml-1 (0,204 nM) i każdą frakcję GOS w

stężeniu 100 mgml-1. Wartości hamowania ponownie 5

wyrażono względem Ctx-HRP związanej z 0 mgml-1

inhibitora. Frakcje GOS 1-7 dostarczają minimum 92%

hamowania, podczas gdy frakcje 10-15 hamują mniej niż

66% Ctx-HRP, z wyższym odchyleniem standardowym między

powtórzeniami. Jak poprzednio, jednostronna analiza 10

ANOVA hamowania Ctx-HRP między 20 ngml-1 a każdą z

frakcji GOS wykazała istnienie różnicy statystycznej

między frakcjami, z P<0,0001. Maksymalna różnica w

hamowaniu między różnymi stężeniami Ctx-HRP jest

niewielka w porównaniu z wpływem obserwowanym pomiędzy 15

frakcjami GOS. Stosując chromatografię kationowymienną,

wyjaśniono różnicę między profilami rodzajów GOS dla

każdej frakcji. Metodą HILIC-ESI-MS zmierzono

bezpośrednio różnicę między stopniami polimeryzacji w

każdej frakcji i wykazano, że stężenie DP6 i DP5 20

zmniejsza się wraz z kolejnym numerem frakcji,

natomiast stężenie DP3 i DP4 wzrasta. Stosując modele

matematyczne i techniki statystyczne, badano korelację

między zmianami w masie a skutecznością biologiczną.

25

2.2 Porównanie między hamowaniem Ctx-HRP przez frakcje

GOS a składem GOS

[0097] Fig. 1 przedstawia zmianę w profilu GOS między

poszczególnymi frakcjami rozdzielonymi poprzez

chromatografię kationowymienną, jak opisano w 30

przykładzie 1. Ponieważ zawartość DP6, jak się wydaje,

44

ściśle koreluje z aktywnością przeciwadhezyjną wobec

Ctx, średnią dla związanego Ctx-HRP naniesiono na

wykres względem względnej zawartości DP6

(heksasacharydów) GOS w każdej frakcji (Fig. 5).

Korelacja jest zgodna z zależnością zanikającą 5

wykładniczo; ponadto, wyrażenie stężenia DP6 w skali

logarytmicznej (wykres półlogarytmiczny) daje

sigmoidalny zbiór rozproszonych punktów (ang.

scattergram). Zastosowano następnie oprogramowanie

Prism, aby znormalizować dane dotyczące hamowania Ctx-10

HRP i dopasować je do sigmoidalnej krzywej zależności

odpowiedzi od dawki w celu obliczenia wartości EC50 dla

każdego stężenia Ctx-HRP. Tak jak wcześniej, wartość

EC50 odnosi się do stężenia inhibitora, który

współzawodniczy o połowę swoistego wiązania i jest taka 15

sama, jak wartość IC50. 95% przedziały ufności

poszczególnych krzywych wartości EC50 zachodzą na

siebie; ponadto, nie ma różnicy statystycznej między

wartościami log EC50. Obliczono, że wartości EC50

względnej zawartości DP6 wynoszą 4,40, 5,11 i 6,25%, z 20

ogólną obliczoną wartością wynoszącą 5,1%. To

podobieństwo dalej potwierdziło, że skuteczność GOS

jest podobna w obrębie zastosowanych stężeń Ctx-HRP. Co

istotne, aktywność biologiczną każdej frakcji GOS

mierzono przy stężeniu 100 mgml-1, główną różnicą 25

między każdą frakcją jest zatem względna zawartość

cukru, czyli skład.

3. Wnioski

[0098] Frakcje GOS 1-8 wykazują konsekwentnie wysokie 30

poziomy hamowania wobec toksyny cholery w teście ELISA.

45

Profile rodzajów GOS każdej frakcji GOS z HILIC-ESI-MS

korelowano ze stężeniem związanego Ctx w teście ELISA i

wykazano, że najbardziej prawdopodobnym ligandem

hamującym są struktury DP6, z globalną wartością R2

wynoszącą 0,925. Przykład 1 powyżej dowodzi, że 5

zawartość DP6 zmniejsza się stopniowo z każdą frakcją,

od 23% we frakcji 1 GOS do 9% we frakcji 10 GOS i 0% we

frakcji 16 GOS. Również zawartość DP5, jak się wydaje,

koreluje z aktywnością hamowania. Obserwowano

jednoczesny wzrost DP3 i DP4, co wskazuje na przejście 10

od frakcji zawierającej głównie DP6-DP4 do frakcji

zawierających DP4-DP3. Wysokie ogólne stężenia we

frakcjach GOS mogą być ważne dla utrzymania stężenia

DP6 dostatecznie wysokiego do całkowitego hamowania

Ctx-HRP. Mogłoby to wyjaśniać, dlaczego GOS 15

niefrakcjonowane nie hamują Ctx wcale (frakcja 0 GOS;

Fig. 4A i B). Samo frakcjonowanie zwiększało zatem

skuteczność poprzez zatężenie konkretnych rodzajów GOS,

tj. penta- i heksasacharydów GOS, które są w przeciwnym

razie, w dostępnej handlowo kompozycji GOS, 20

rozcieńczone.

25

30

46

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja zawierająca galaktooligosacharydy

(GOS), w której obecne są rodzaje GOS o stopniu

polimeryzacji 5 lub wyższym, korzystnie 6 lub wyższym, 5

w ilości co najmniej 35% wagowo (%w) w stosunku do

całkowitej suchej masy wszystkich rodzajów GOS obecnych

w kompozycji i w której zawartość penta- i/lub

heksasacharydów GOS wynosi 2-100% wagowo w stosunku do

całkowitej masy kompozycji. 10

2. Kompozycja według zastrz. 1, zawierająca

rodzaje GOS zawierające reszty galaktozylowe połączone

wiązaniami , w szczególności wiązaniami (1-4) i/lub

(1-6).

3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, w której 15

wszystkie rodzaje GOS obecne w kompozycji stanowią co

najmniej 50 %w, korzystnie co najmniej 60 %w, jeszcze

korzystniej co najmniej 70 %w w stosunku do suchej masy

kompozycji.

4. Kompozycja według dowolnego z zastrz. od 1 do 20

3, zawierająca GOS o stopniu polimeryzacji 5 w ilości

co najmniej 40 %w w stosunku do suchej masy kompozycji.

5. Kompozycja według dowolnego z poprzednich

zastrz., zawierająca GOS o stopniu polimeryzacji 6 lub

wyższym, w ilości co najmniej 10 %w w stosunku do 25

suchej masy kompozycji.

6. Kompozycja zawierająca galaktooligosacharydy

(GOS), w której rodzaje GOS o stopniu polimeryzacji 5

lub wyższym są obecne w nadmiarze w stosunku do

rodzajów GOS o stopniu polimeryzacji niższym niż 5 w 30

stosunku do całkowitej suchej masy wszystkich rodzajów

47

GOS w kompozycji i w której zawartość penta- i/lub

heksasacharydów GOS wynosi 2-100% wagowo w stosunku do

całkowitej masy kompozycji.

7. Kompozycja według dowolnego z zastrz. od 1 do

6, która to kompozycja jest zasadniczo wolna od mono- 5

i/lub disacharydów, w szczególności galaktozy i/lub

glukozy i/lub laktozy.

8. Kompozycja według dowolnego z zastrz. od 1 do

7, zawierająca co najmniej 15 %w rodzajów GOS o stopniu

polimeryzacji 6 lub wyższym, w stosunku do całkowitej 10

suchej masy wszystkich rodzajów GOS obecnych w

kompozycji.

9. Kompozycja według dowolnego z zastrz. od 1 do

8, zawierająca ponadto nieulegające trawieniu

sialilowane oligosacharydy (SOS) o jakości spożywczej, 15

korzystnie SOS pochodzące z mleka, takie jak 3'-

sialilolaktoza.

10. Kompozycja według dowolnego z poprzednich

zastrz., będąca pożywieniem albo napojem zawierającym

od około 1 mg do około 20 g heksasacharydu GOS na 20

podawaną porcję.

11. Sposób dostarczania frakcji GOS zdolnej do

hamowania wiązania się toksyny cholery (Ctx) z GM1,

przy czym taki sposób obejmuje etapy:

- dostarczania mieszaniny galaktooligosacharydów 25

(GOS) o różnych stopniach polimeryzacji;

- ewentualnie usuwania wolnej laktozy z takiej

mieszaniny GOS;

- nakładania takiej (wolnej od laktozy)

mieszaniny GOS na złoże kationowymienne; 30

48

- stopniowego wymywania GOS o wzrastającym

stopniu polimeryzacji przy zastosowaniu ruchomej fazy

wodnej i zbierania odrębnych wymytych frakcji;

- analizowania każdej wymytej frakcji pod kątem

wpływu hamującego na wiązanie się Ctx z GM1; 5

- i wybierania jednej albo większej liczby

frakcji zdolnych do hamowania wiązania się Ctx z GM1.

12. Sposób według zastrz. 11, w którym

dostarczanie takiej mieszaniny GOS o różnych stopniach

polimeryzacji obejmuje poddawanie przesączu serwatki 10

albo laktozy enzymatycznej transgalaktozydacji przy

zastosowaniu -galaktozydazy.

13. Sposób według zastrz. 11 albo 12, w którym

taką mieszaninę GOS o różnych stopniach polimeryzacji

zawiera dostępną handlowo mieszaninę GOS, korzystnie 15

mieszaninę GOS sprzedawaną pod nazwą handlową

VivinalGOS®.

14. Zastosowanie kompozycji jak określono w

dowolnym z zastrz. od 1 do 10 do wytwarzania kompozycji

odżywczej lub farmaceutycznej do leczenia albo 20

profilaktyki ostrej lub przewlekłej choroby związanej z

adhezją i/lub wychwytem przedstawiciela rodziny toksyny

cholery albo powodowanej przez taką adhezję lub

wychwyt.

15. Zastosowanie według zastrz. 14 do wytwarzania 25

kompozycji odżywczej lub farmaceutycznej do

profilaktyki albo leczenia ostrej lub przewlekłej

choroby powodowanej przez przedstawiciela rodziny

toksyny cholery, w szczególności chorób biegunkowych.

16. Zastosowanie według zastrz. 14 albo 15, w 30

którym takim przedstawicielem rodziny toksyny cholery

49

jest toksyna cholery V. cholerae (Ctx-B) lub

termolabilna enterotoksyna (LT-B) enterotoksynogennej

E. coli (ETEC).

17. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. od 14

do 16, w którym dzienna dawka penta- i/lub 5

heksasacharydów GOS wynosi do około 250 mg.

10

Friesland Brands B.V.

Pełnomocnik:

50

5

10

15

51

5

10

52

5

53

5

54

5

55

5

10