rzeczpospolita tŁumaczenie patentu …public.sds.tiktalik.com/patenty/pdf/250685.pdf ·...
TRANSCRIPT
(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1957539 RZECZPOSPOLITA POLSKA
Urząd Patentowy Rzeczypospolitej
Polskiej
(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 08.12.2006 06848508.5 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 17.04.2013 Europejski Biuletyn Patentowy 2013/16 EP 1957539 B1
(13) (51)
T3 Int.Cl. C07K 16/30 (2006.01) C07K 16/40 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01)
(54) Tytuł wynalazku:
Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko białku kinazy tyrozynowej 7 (PTK7) i ich zastosowanie
(30) Pierwszeństwo:
08.12.2005 US 748373 P
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
20.08.2008 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/34
(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
30.08.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/08
(73) Uprawniony z patentu:
Medarex, Inc., Princeton, US
(72) Twórca(y) wynalazku:
LI-SHENG LU, Mountain View, US JONATHAN ALEXANDER TERRETT, Los Altos, US CHIN PAN, Los Altos, US
(74) Pełnomocnik:
PL/E
P 19
5753
9 T3
rzecz. pat. Anna Grzelak WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla 12 53-114 Wrocław
Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
1
Opis
Stan techniki
[0001] Receptory związane z aktywnością kinazy tyrozynowej (RTK, ang. receptor tyrosine kinase) to
transbłonowe białka sygnałowe, które przekazują sygnały biologiczne ze środowiska
zewnątrzkomórkowego do wnętrza komórki. Regulacja sygnałów RTK jest ważna w regulacji wzrostu
komórek, różnicowania, wzrostu aksonów, wzrostu nabłonka, rozwoju, adhezji, migracji oraz apoptozy
(Prenzel et al. (2001) Endocr. Relat. Cancer 8:11-31; Hubbard i Till (2000) Annu. Rev. Biochem. 69:373-
98). Wiadomo, że RTK biorą udział w rozwoju i progresji kilku form nowotworów. W większości
nowotworów powiązanych z RTK występowała raczej amplifikacja białka receptora niż mutacja genu
(Kobus i Fleming (2005) Biochemistry 44:1464-70).
[0002] Białko kinazy tyrozynowej 7 (PTK7, ang. protein tyrosine kinase 7), członek rodziny receptorów
związanych z aktywnością kinazy tyrozynowej, zostało wyizolowane po raz pierwszy z prawidłowych
ludzkich melanocytów i sklonowane przy pomocy RT-PCR (Lee et al., (1993) Oncogene 8:3403-10; Park
et al., (1996) J.Biochem 119:235-9). Niezależnie, gen sklonowano z linii komórkowej pochodzącej od
ludzkiego raka okrężnicy i nazwano kinazą raka okrężnicy 4 (CCK4, ang. colon carcinoma kinase 4)
(Mossie et al. (1995) Oncogene 11:2179-84). PTK7 należy do podzbioru RTK nie posiadających
wykrywalnej aktywności katalitycznej kinazy tyrozynowej, ale zachowujących aktywność przekazywania
sygnału i uważa się, że mogą one funkcjonować jako cząsteczki adhezji komórkowej.
[0003] Stwierdzono, że mRNA dla PTK7 podlega zmiennej ekspresji w liniach komórkowych
pochodzących od raka okrężnicy lecz nie podlega ekspresji w dojrzałych ludzkich tkankach okrężnicy
(Mossie et al., supra). Ekspresję PTK7 obserwowano także w niektórych liniach komórkowych czerniaka
oraz w biopsjach czerniaka (Easty, et al. (1997) Int. J. Cancer 71:1061-5). Stwierdzono ekspresję
alternatywnej formy splicingowej (składania) w komórkach raka wątroby i jelita grubego (Jung et al.
(2002) Biochim Biophys Acta 1579: 153-63). Ponadto, stwierdzono wysoką nadekspresję PTK7 w
próbkach ostrej białaczki szpikowej (Muller-Tidow et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10:1241-9).
Immunohistochemicznie, obserwowano specyficzne dla nowotworu barwienia PTK7 w rakach piersi, jelita
grubego, płuc, trzustki, nerki i pęcherza moczowego, jak opisano w publikacji PCT WO 04/17992. WO
2004/017992 opisuje PTK7, środki, które oddziałują z lub modulują ekspresję lub aktywność PTK7, oraz
ich zastosowanie w leczeniu raka. Kyriakos et al. (Cancer Research 52, luty 1992, nr. 4, strony 835-842)
opisują losy przeciwciał związanych do powierzchni komórek nowotworowych in vitro.
[0004] Zgodnie z tym, pożądane są środki rozpoznające PTK7 oraz sposoby stosowania takich środków.
Streszczenie wynalazku
[0005] Niniejszy wynalazek dostarcza izolowanych przeciwciał monoklonalnych, w szczególności
ludzkich przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się z PTK7 i które wykazują wiele pożądanych
właściwości. Właściwości te obejmują wiązanie z wysokim powinowactwem z ludzką PTK7 oraz wiązanie
do komórek guza Wilmsa. Dostarczone są również przeciwciała i kompozycje według wynalazku do
zastosowania w sposobach leczenia różnorodnych chorób powiązanych z PTK7.
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
2
[0006] Wynalazek dotyczy izolowanego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego, lub jego części wiążącej
antygen, przy czym przeciwciało:
(a) swoiście wiąże się z ludzką PTK7; oraz
(b) wiąże się do linii komórkowej guza Wilmsa o numerze dostępu ATCC CRL-1441 z EC50
wynoszącym 4,0 nM lub mniejszym, w badaniu, które obejmuje inkubowanie 1 x 105 komórek z
przeciwciałem przy początkowym stężeniu 30 µg/ml i seryjne rozcieńczanie przeciwciała w
rozcieńczeniach 1:10; oraz
(c) wiąże się z tym samym epitopem na ludzkiej PTK7 co przeciwciało odniesienia obejmujące:
(i) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:
2 oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR
ID: 7; lub
(ii) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:
3 oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR
ID: 8; lub
(iii) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:
4 oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR
ID: 10.
[0007] Korzystne przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, obejmuje:
(a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 12;
(b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 16;
(c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 20;
(d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 25;
(e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 31; oraz
(f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 37;
lub
(a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 14;
(b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 18;
(c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 22;
(d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 28;
(e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 34; oraz
(f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 40.
lub
(a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 13;
(b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 17;
(c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 21;
(d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 26;
(e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 32; oraz
(f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 38.
[0008] Inne korzystne przeciwciała według wynalazku, lub ich części wiążące antygen, obejmują:
(a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:2; oraz
(b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 7;
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
3
lub
(a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:4; oraz
(b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 10;
lub
(a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:3; oraz
(b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 8.
[0009] Przeciwciała według wynalazku mogą być, na przykład, przeciwciałami pełnej długości, na
przykład z izotypu IgG1 lub IgG4. Alternatywnie, przeciwciała mogą być fragmentami przeciwciał, takimi
jak fragmenty Fab lub Fab’2, lub przeciwciała jednołańcuchowe.
[0010] Wynalazek dostarcza także immunokoniugatu obejmującego przeciwciało według wynalazku, lub
jego część wiążącą antygen, połączone z środkiem terapeutycznym, takim jak cytotoksyna lub izotop
radioaktywny.
[0011] Dostarczone są kompozycje obejmujące przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, lub
immunokoniugat według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
[0012] Cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące przeciwciała, lub ich części wiążące antygen, według
wynalazku, również są objęte zakresem wynalazku, jak również wektory ekspresyjne obejmujące takie
kwasy nukleinowe oraz komórki gospodarza obejmujące takie wektory ekspresyjne.
[0013] Dostarczony jest także sposób in vitro dla przygotowania przeciwciała według wynalazku, który
obejmuje wyrażanie przeciwciała w komórce gospodarzu według wynalazku i izolację przeciwciała z
komórki gospodarza.
[0014] Ponadto, ujawniono mysz transgeniczną obejmującą transgeny ludzkich ciężkich i lekkich
łańcuchów immunoglobulin, przy czym mysz wyraża przeciwciało według wynalazku, jak również
hybrydomy przygotowane z takiej myszy, przy czym hybrydoma wytwarza przeciwciało według
wynalazku.
[0015] W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dostarcza przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen,
według wynalazku do zastosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania nowotworowi,
charakteryzującemu się wzrostem komórek guza wyrażających PTK7. Nowotwór może być rakiem
okrężnicy (obejmującym raka jelita cienkiego), rakiem płuc, rakiem piersi, rakiem trzustki, czerniakiem
(np. przerzutowym czerniakiem złośliwym), ostrą białaczką szpikową, rakiem nerki, rakiem pęcherza,
rakiem jajnika lub rakiem prostaty. Przykłady innych nowotworów obejmują raka nerek (np. raka
nerkowokomórkowego), glejaka, guzy mózgu, przewlekłe lub ostre białaczki w tym ostrą białaczkę
limfocytową (ALL, ang. acute lymphocytic leukemia), białaczkę T-komórkową dorosłych (T-ALL),
przewlekłą białaczkę szpikową, ostrą białaczkę limfoblastyczną, przewlekłą białaczkę limfocytową,
chłoniaki (np. chłoniak Hodgkina (ziarniczy) i nieziarniczy, chłoniak limfocytarny, pierwotny chłoniak
centralnego układu nerwowego, chłoniak z komórek-T, chłoniak Burkitta, chłoniaki anaplastyczne z
dużych komórek (ALCL, ang. anaplastic large-cell lymphoma), skórne chłoniaki T-komórkowe, chłoniaki z
małych komórek z wpuklonym jądrem komórkowym, chłoniaki z obwodowych komórek T, chłoniaki
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
4
Lennerta (limfoepitelialne), chłoniaki immunoblastyczne, chłoniaki/białaczki T-komórkowe (ATLL),
chłoniaki grudkowe centroblastyczne-centrocytarne (cb/cc), chłoniaki rozlane z dużych komórek B, typ
angioimmunoblastycznych chłoniaków T-komórkowych (typu AILD, ang. angioimmunoblastic
lymphadenopathy) oraz chłoniaki rozwijające się w jamach ciała związane z HIV), raki zarodkowe,
niezróżnicowane raki nosa i gardła (np. guz Schminckego), chorobę Castlemana, mięsaka Kaposiego,
szpiczaka mnogiego, makroglobulinemię Waldenströma i inne chłoniaki B-komórkowe, raki jamy nosowo-
gardłowej, raka kości, raka skóry, raka głowy i szyi, złośliwego czerniaka skórnego lub śródocznego, raka
macicy, raka odbytnicy, raka odbytu, raka żołądka, raka jąder, raka macicy, raka jajowodów, raka
endometrium, raka szyjki macicy, raka pochwy, raka sromu, raka przełyku, raka jelita cienkiego, raka
układu hormonalnego, raka tarczycy, raka przytarczyc, raka nadnercza, mięsaka tkanek miękkich, raka
cewki moczowej, raka prącia, guzy lite wieku dziecięcego, raka pęcherza moczowego, raka nerki lub
moczowodu, raka miedniczki nerwowej, nowotwory ośrodkowego układu nerwowego (OUN, ang. CNS),
angiogenezę nowotworową, guzy rdzenia kręgowego, glejaka pnia mózgu, gruczolaka przysadki, raka
naskórkowego, raka płaskonabłonkowego, nowotwory indukowane środowiskowo włączając indukowane
przez azbest, np. międzybłoniaka oraz kombinacje wymienionych nowotworów.
Krótki opis figur rysunku
[0016]
Figura 1A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 41) i sekwencję aminokwasową (SEKW
NR ID: 1) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkich monoklonalnych przeciwciał 3G8 i 3G8a.
Regiony CDR1 (SEKW NR ID: 11), CDR2 (SEKW NR ID: 15) i CDR3 (SEKW NR ID: 19) oznaczono
kreskami oraz wskazano pochodzenie germinalne V, D i J (wyprowadzenia linii germinalnej) .
Figura 1B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 45) i sekwencję aminokwasową (SEKW
NR ID: 5) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 3G8. Regiony
CDR1 (SEKW NR ID: 23), CDR2 (SEKW NR ID: 29) i CDR3 (SEKW NR ID: 35) oznaczono kreskami
oraz wskazano pochodzenie germinalne V i J .
Figura 1C przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 46) i sekwencję aminokwasową (SEKW
NR ID: 6) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 3G8a. Regiony
CDR1 (SEKW NR ID: 24), CDR2 (SEKW NR ID: 30) i CDR3 (SEKW NR ID: 36) oznaczono kreskami
oraz wskazano pochodzenie germinalne V i J.
Figura 2A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 42) i sekwencję aminokwasową (SEKW
NR ID: 2) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 4D5. Regiony
CDR1 (SEKW NR ID: 12), CDR2 (SEKW NR ID: 16) i CDR3 (SEKW NR ID: 20) oznaczono kreskami
oraz wskazano pochodzenie germinalne V, D i J.
Figura 2B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 47) i sekwencję aminokwasową (SEKW
NR ID: 7) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 4D5. Regiony
CDR1 (SEKW NR ID: 25), CDR2 (SEKW NR ID: 31) i CDR3 (SEKW NR ID: 37) oznaczono kreskami
oraz wskazano pochodzenie germinalne V i J.
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
5
Figura 3A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 43) i sekwencję aminokwasową (SEKW
NR ID: 3) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkich monoklonalnych przeciwciał 12C6. Regiony
CDR1 (SEKW NR ID: 13), CDR2 (SEKW NR ID: 17) i CDR3 (SEKW NR ID: 21) oznaczono kreskami
oraz wskazano pochodzenie germinalne V, D i J.
Figura 3B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 48) i sekwencję aminokwasową (SEKW
NR ID: 8) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 12C6. Regiony
CDR1 (SEKW NR ID: 26), CDR2 (SEKW NR ID: 32) i CDR3 (SEKW NR ID: 38) oznaczono kreskami
oraz wskazano pochodzenie germinalne V i J.
Figura 3C przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 49) i sekwencję aminokwasową (SEKW
NR ID: 9) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 12C6a. Regiony
CDR1 (SEKW NR ID: 27), CDR2 (SEKW NR ID: 33) i CDR3 (SEKW NR ID: 39) oznaczono kreskami
oraz wskazano pochodzenie germinalne V i J.
Figura 4A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 44) i sekwencję aminokwasową (SEKW
NR ID: 4) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 7C8. Regiony
CDR1 (SEKW NR ID: 14), CDR2 (SEKW NR ID: 18) i CDR3 (SEKW NR ID: 22) oznaczono kreskami
oraz wskazano pochodzenie germinalne V, D i J.
Figura 4B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 50) i sekwencję aminokwasową (SEKW
NR ID: 10) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 7C8. Regiony
CDR1 (SEKW NR ID: 28), CDR2 (SEKW NR ID: 34) i CDR3 (SEKW NR ID: 40) oznaczono kreskami
oraz wskazano pochodzenie germinalne V i J.
Figura 5 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennych regionów łańcucha ciężkiego
3G8 (SEKW NR ID: 1) i 3G8a (SEKW ID NR: 1) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego VH
3-30.3 (SEKW NR ID: 51) (germinalny JH4b ujawniony jako SEKW NR ID: 59).
Figura 6 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennego regionu łańcucha ciężkiego
4D5 (SEKW NR ID: 2) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego VH 3-30.3 (SEKW NR ID:
51) (germinalny JH4b ujawniony jako SEKW NR ID: 60).
Figura 7 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennych regionów łańcucha ciężkiego
12C6 (SEKW NR ID: 3) i 12C6a (SEKW NR ID: 2) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego
VH DP44 (SEKW NR ID: 52) (germinalne 3-7, 3-23 oraz JH4b ujawnione odpowiednio jako SEKW NR ID:
61-63).
Figura 8 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennego regionu łańcucha ciężkiego
7C8 (SEKW NR ID: 4) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego VH 3-33 (SEKW NR ID: 53)
(germinalny 3H6b ujawniony jako SEKW NR ID: 64).
Figura 9 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennych regionów łańcucha lekkiego
3G8 (SEKW NR ID: 5) i 3G8a (SEKW ID NR: 6) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego Vk
L15 (SEKW NR ID: 54) (germinalny JK1 ujawniony jako SEKW NR ID: 65).
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
6
Figura 10 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennego regionu łańcucha lekkiego
4D5 (SEKW NR ID: 7) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego Vk A10 (SEKW NR ID: 55)
(germinalny JK5 ujawniony jako SEKW NR ID: 66).
Figura 11 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennego regionu łańcucha lekkiego
12C6 (SEKW NR ID: 8) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego Vk A27 (SEKW NR ID: 56)
(germinalny JK2 ujawniony jako SEKW NR ID: 67).
Figura 12 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennego regionu łańcucha lekkiego
12C6a (SEKW NR ID: 9) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego Vk L15 (SEKW NR ID:
54) (germinalny JK2 ujawniony jako SEKW NR ID: 68).
Figura 13 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennego regionu łańcucha lekkiego
7C8 (SEKW NR ID: 10) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego Vk L6 (SEKW NR ID: 57)
(germinalny JK3 ujawniony jako SEKW NR ID: 69).
Figura 14 przedstawia wyniki doświadczeń cytometrii przepływowej wykazujące, że ludzkie przeciwciało
monoklonalne 7C8, skierowane przeciwko ludzkiej PTK7, wiąże się do powierzchni komórek HEK3
transfekowanych ludzką PTK7 pełnej długości.
Figura 15 przedstawia wyniki doświadczeń ELISA wykazujące, że ludzkie przeciwciała monoklonalne
przeciwko ludzkiej PTK7 wiążą swoiście PTK7.
Figura 16 przedstawia wyniki doświadczeń cytometrii przepływowej wykazujące, że przeciwciała
skierowane przeciwko ludzkiej PTK7 wiążą się do powierzchni komórek guza Wilmsa.
Figura 17 przedstawia wyniki doświadczeń cytometrii przepływowej wykazujące, że przeciwciała
skierowane przeciwko ludzkiej PTK7 wiążą się do powierzchni komórek różnych nowotworowych linii
komórkowych.
Figura 18 przedstawia wyniki doświadczeń cytometrii przepływowej wykazujące, że przeciwciała
skierowane przeciwko ludzkiej PTK7 wiążą się do powierzchni komórek dendrytycznych.
Figura 19 przedstawia wyniki doświadczeń cytometrii przepływowej wykazujące, że przeciwciała
skierowane przeciwko ludzkiej PTK7 wiążą się do limfocytów T CD4+ i CD8+, ale nie do limfocytów B.
Figura 20 przedstawia wyniki doświadczeń internalizacji Hum-Zap wykazujące, że ludzkie przeciwciała
monoklonalne przeciwko PTK7 mogą ulegać internalizacji do komórek PTK7+. (A) Internalizacja ludzkich
przeciwciał 3G8, 4D5 i 7C8 do komórek guza Wilmsa. (B) Internalizacja ludzkiego przeciwciała 12C6 do
komórek guza Wilmsa. (C) Internalizacja ludzkich przeciwciał 7C8 i 12C6 do komórek guza A-431. (D)
Internalizacja ludzkich przeciwciał 7C8 i 12C6 do komórek guza PC3.
Figura 21 przedstawia wyniki testu proliferacji komórek wykazujące, że ludzkie monoklonalne
przeciwciała anty-PTK7 sprzężone z toksyną zabijają komórki z linii ludzkiego raka nerki.
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
7
Figura 22 przedstawia wyniki testu proliferacji komórek wykazujące, że ludzkie monoklonalne
przeciwciała anty-PTK7 sprzężone z toksyną zabijają komórki linii wyrażających PTK7 o poziomach
ekspresji od niskiego do wysokiego.
Figura 23 przedstawia wyniki testu inwazji wykazujące, że przeciwciała anty-PTK7 hamują ruchliwość
inwazyjną komórek wyrażających PTK7 na powierzchni.
Figura 24 przedstawia wyniki badania ksenoprzeszczepu guza in vivo wykazujące, że przeciwciała anty-
PTK7 sprzężone z toksyną spowolniły progresję wzrostu guza w raku trzustki.
Figura 25 przedstawia wyniki badania ksenoprzeszczepu guza in vivo wykazujące, że przeciwciała anty-
PTK7 sprzężone z toksyną spowolniły progresję wzrostu guza w raku piersi.
Szczegółowy opis wynalazku
[0017] W jednym aspekcie, niniejszy wynalazek odnosi się do izolowanych przeciwciał monoklonalnych,
w szczególności ludzkich przeciwciał monoklonalnych, wiążących swoiście PTK7. W niektórych
wykonaniach, przeciwciała według wynalazku wykazują jedną lub więcej pożądanych właściwości
funkcjonalnych, takich jak wiązanie z wysokim powinowactwem z PTK7 i/lub zdolność do hamowania
wzrostu komórek guza in vitro i in vivo. W niektórych wykonaniach, przeciwciała według wynalazku
pochodzą od szczególnych sekwencji germinalnych łańcucha ciężkiego i lekkiego i/lub obejmują
szczególne cechy strukturalne, takie jak regiony CDR obejmujące szczególne sekwencje aminokwasowe.
Wynalazek dostarcza izolowanych przeciwciał, sposobów wytwarzania takich przeciwciał,
immunokoniugatów i cząsteczek dwuspecyficznych obejmujących takie przeciwciała oraz kompozycji
farmaceutycznych zawierających przeciwciała, immunokoniugaty lub cząsteczki dwuspecyficzne według
wynalazku. Wynalazek odnosi się także do sposobów stosowania przeciwciał, takich jak dla leczenia
chorób takich jak nowotwór.
[0018] Aby niniejszy wynalazek mógł być lepiej zrozumiany, zdefiniowano najpierw pewne terminy.
Dodatkowe definicje są umieszczone w szczegółowym opisie.
[0019] Terminy „PTK7” i „CCK4” stosowane są zamiennie i obejmują warianty, izoformy i homologi
gatunkowe ludzkiej PTK7. Zgodnie z tym, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą, w niektórych
przypadkach, reagować krzyżowo z PTK7 z gatunków innych niż człowiek. W niektórych wykonaniach,
przeciwciała mogą być zupełnie swoiste dla jednej lub więcej ludzkich PTK7 i mogą nie wykazywać
reaktywności krzyżowej dla innych gatunków niż człowiek lub innej. Kompletna sekwencja
aminokwasowa przykładowej ludzkiej PTK7 ma numer dostępu Genbank NM_002821 (SEKW NR ID:
58).
[0020] Termin „odpowiedź immunologiczna” odnosi się do działania, na przykład, limfocytów, komórek
prezentujących antygen, komórek fagocytujących, granulocytów, oraz rozpuszczalnych makromolekuł
wytwarzanych przez powyższe komórki lub wątrobę (włączając przeciwciała, cytokiny i białka
dopełniacza), które skutkuje selektywnymi uszkodzeniami, zniszczeniem lub usunięciem z ciała ludzkiego
infekujących patogenów, komórek lub tkanek zainfekowanych patogenami, komórek nowotworowych lub,
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
8
w przypadkach autoimmunizacji lub patologicznej reakcji zapalnej, normalnych ludzkich komórek lub
tkanek.
[0021] „Szlak transdukcji sygnału” odnosi się do biochemicznej zależności pomiędzy różnymi
cząsteczkami transdukcji sygnału, które odgrywają rolę w przekazywaniu sygnału z jednej części komórki
do innej części komórki. Stosowany tutaj zwrot „receptor na powierzchni komórki” obejmuje, na przykład,
cząsteczki lub kompleksy cząsteczek zdolne do odbierania sygnału i przekazywania takiego sygnału
poprzez błonę komórkową. Przykładem „receptora na powierzchni komórki” według niniejszego
wynalazku jest receptor PTK7.
[0022] Termin „przeciwciało”, w rozumieniu niniejszego opisu, obejmuje całe przeciwciała oraz dowolny
fragment wiążący antygen (tj. „część wiążącą antygen”) lub ich pojedyncze łańcuchy. „Przeciwciało”
odnosi się do glikoproteiny obejmującej co najmniej dwa łańcuchy ciężkie (H, ang. heavy) i dwa łańcuchy
lekkie (L, ang. light) wzajemnie połączone wiązaniami dwusiarczkowymi, lub jej części wiążącej antygen.
Każdy łańcuch ciężki obejmuje region zmienny łańcucha ciężkiego (skracany tutaj do VH, ang. variable
heavy) oraz region stały łańcucha ciężkiego. Rejon stały łańcucha ciężkiego obejmuje trzy domeny, CH1,
CH2 i CH3. Każdy łańcuch lekki obejmuje region zmienny łańcucha lekkiego (skracany tutaj do VL, ang.
variable light) oraz region stały łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego obejmuje jedną
domenę, CL. Regiony VH i VL można dalej podzielić na regiony hiperzmienne, nazywane regionami
determinującymi dopasowanie (komplementarność) (CDR, ang. complementarity determining regions),
poprzedzielane regionami bardziej konserwowanymi, nazywanymi regionami zrębowymi (szkieletowymi)
(FR, ang. framework regions). Każdy VH i VL składa się trzech CDR i czterech FR, ułożonych od końca
aminowego do końca karboksylowego w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3,
FR4. Regiony zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich zawierają domenę wiążącą, która oddziałuje z
antygenem. Regiony stałe przeciwciał mogą pośredniczyć w wiązaniu immunoglobuliny do tkanek lub
czynników gospodarza, włączając różne komórki układu immunologicznego (np. komórki efektorowe)
oraz pierwszy składnik (CIq) klasycznego układu dopełniacza.
[0023] Stosowany tutaj termin „część wiążąca antygen” przeciwciała (lub po prostu „część przeciwciała”),
odnosi się do jednego lub więcej fragmentów przeciwciała, które zachowują zdolność swoistego wiązania
antygenu (np. PTK7). Wykazano, że funkcja wiązania antygenu przeciwciała może być pełniona przez
fragmenty przeciwciała pełnej długości. Przykłady wiążących fragmentów objętych terminem „część
wiążąca antygen” przeciwciała obejmują (i) fragment Fab, monowalentny fragment składający się z
domen VL, VH, CL, i CH1; (ii) fragment F(ab’)2, biwalentny fragment obejmujący dwa fragmenty Fab
połączone mostkiem dwusiarczkowym w regionie zawiasowym; (iii) fragment Fab’, będący w zasadzie
Fab z częścią regionu zawiasowego (patrz, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul wyd. 3 uzupełnione
1993); (iv) fragment Fd składający się z domen VH i CH1; (v) fragment Fv składający się z domen VL i VH
jednego ramienia przeciwciała, (vi) fragment dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), który składa
się z domeny VH; (vii) izolowany region determinujący dopasowanie (CDR); oraz (viii) nanociało, region
zmienny łańcucha ciężkiego zawierający jedną domenę zmienną i dwie domeny stałe. Ponad to, mimo że
dwie domeny fragmentu Fv, VL i VH kodowane są przez osobne geny, mogą być one połączone, z
zastosowaniem metod rekombinacyjnych, syntetycznym łącznikiem, który umożliwia ich połączenie w
jeden łańcuch białkowy, w którym regiony VL i VH tworzą pary dając cząsteczki monowalentne (znane
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
9
jako jednołańcuchowe Fv (scFv, ang. single chain Fv); patrz np. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; i
Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takie jednołańcuchowe przeciwciała
również są w zamierzeniu objęte terminem „część wiążąca antygen” przeciwciała. Te fragmenty
przeciwciała uzyskiwane są konwencjonalnymi technikami znanymi specjalistom w dziedzinie, a
fragmenty są sprawdzane pod kątem użyteczności w ten sam sposób co całe przeciwciała.
[0024] Stosowane tutaj „izolowane przeciwciało”, ma w zamierzeniu odnosić się do przeciwciała, które
jest zasadniczo wolne od innych przeciwciał mających inne swoistości antygenowe (np. izolowane
przeciwciało, które swoiście wiąże PTK7 jest zasadniczo wolne od przeciwciał, które swoiście wiążą
antygeny inne niż PTK7). Izolowane przeciwciało, które swoiście wiąże PTK7 może jednak reagować
krzyżowo z innymi antygenami, takimi jak cząsteczki PTK7 z innych gatunków. Ponad to, izolowane
przeciwciało może być zasadniczo wolne od innych składników komórkowych i substancji.
[0025] Stosowane tutaj terminy „przeciwciało monoklonalne” lub „kompozycja przeciwciał
monoklonalnych” odnoszą się do preparatu cząsteczek przeciwciał o pojedynczym składzie
cząsteczkowym. Kompozycja przeciwciał monoklonalnych wykazuje pojedynczą swoistość wiązania i
powinowactwo do konkretnego epitopu.
[0026] Stosowany tutaj termin „ludzkie przeciwciało”, ma w zamierzeniu obejmować przeciwciała o
regionach zmiennych, w których zarówno zrąb jak i regiony CDR pochodzą od ludzkich germinalnych
sekwencji immunoglobulin (ang. human germline immunoglobulin sequences).. Ponad to, jeśli
przeciwciało zawiera region stały, ten region stały również pochodzi od ludzkich germinalnych sekwencji
immunoglobulin. Ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą obejmować reszty aminokwasowe nie
kodowane przez sekwencje ludzkich germinalnych immunoglobulin (np. mutacje wprowadzone przez
mutagenezę losową lub ukierunkowaną in vitro lub poprzez mutacje somatyczne in vivo). Jednakże,
stosowany tutaj termin „ludzkie przeciwciało”, nie ma w zamierzeniu obejmować przeciwciał, w których
sekwencje CDR pochodzące z linii zarodkowej ssaka innego gatunku, takiego jak mysz, zostały
wstawione do ludzkich sekwencji zrębowych.
[0027] Termin „ludzkie przeciwciało monoklonalne” odnosi się do przeciwciał wykazujących pojedynczą
swoistość wiązania, które zawierają regiony zmienne, w których zarówno regiony zrębowe jak i CDR
pochodzą od sekwencji immunoglobulin ludzkiej linii zarodkowej. W jednym wykonaniu, ludzkie
przeciwciała monoklonalne wytwarzane są przez hybrydomę, obejmującą komórki B (limfocyty typu B)
pozyskane z transgenicznego zwierzęcia niebędącego człowiekiem, np. transgenicznej myszy, mającej
genom zawierający transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i transgen łańcucha lekkiego, włączone do
unieśmiertelnionej komórki.
[0028] Stosowany tutaj termin „rekombinowane ludzkie przeciwciało" obejmuje wszystkie ludzkie
przeciwciała przygotowywane, wyrażane, tworzone lub izolowane sposobami rekombinacyjnymi, takie jak
(a) przeciwciała wyizolowane ze zwierzęcia (np. myszy), które jest transgeniczne lub
transchromosomalne pod względem genów ludzkich immunoglobulin lub z otrzymanej z nich hybrydomy
(szerzej opisanej poniżej), (b) przeciwciała wyizolowane z komórki gospodarza transformowanej w celu
ekspresji ludzkiego przeciwciała, np. z transfektomy, (c) przeciwciała wyizolowane z rekombinowanych,
kombinatorycznych bibliotek ludzkich przeciwciał i (d) przeciwciała przygotowane, wyrażane, tworzone
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
10
lub izolowane wszelkimi innymi sposobami, obejmującymi splicing (składanie) sekwencji genów ludzkich
immunoglobulin do innych sekwencji DNA. Takie rekombinowane ludzkie przeciwciała mają regiony
zmienne, w których regiony zrębowe i CDR pochodzą od sekwencji immunoglobulin ludzkiej linii
zarodkowej. Jednakże, w niektórych wykonaniach, takie rekombinowane ludzkie przeciwciała mogą być
poddane mutagenezie in vitro (lub somatycznej mutagenezie in vivo, gdy stosowane jest zwierzę
transgeniczne pod względem ludzkich sekwencji Ig) i tym sposobem sekwencje aminokwasowe regionów
VH i VL rekombinowanych przeciwciał są sekwencjami, które, pomimo pochodzenia i powiązania z
sekwencjami VH i VL ludzkiej linii zarodkowej, nie muszą naturalnie występować w ludzkim repertuarze
przeciwciał linii zarodkowej (germinalnej) in vivo.
[0029] Stosowany tutaj „izotyp” odnosi się do klasy przeciwciała (np. IgM lub IgG1), kodowanej przez
geny regionu stałego łańcucha ciężkiego.
[0030] Zwroty „przeciwciało rozpoznające antygen” oraz „przeciwciało swoiste wobec antygenu”
stosowane są tutaj zamiennie z terminem „przeciwciało, które wiąże się swoiście z antygenem”.
[0031] Termin „pochodne ludzkiego przeciwciała” odnosi się do jakiejkolwiek zmodyfikowanej formy
ludzkiego przeciwciała, np. koniugatu przeciwciała z innym środkiem lub przeciwciałem.
[0032] Termin „przeciwciało humanizowane” ma w zamierzeniu odnosić się do przeciwciał, w których
sekwencje CDR pochodzące z linii zarodkowych innych gatunków ssaków, takich jak mysz, wstawiono do
ludzkich sekwencji zrębowych. W obrębie ludzkich sekwencji zrębowych mogą być wykonane dodatkowe
modyfikacje regionów zrębowych.
[0033] Termin „przeciwciało chimeryczne” ma w zamierzeniu odnosić się do przeciwciał, w których
sekwencje regionów zmiennych pochodzą z jednego gatunku, a sekwencje regionów stałych pochodzą z
innego gatunku, tak jak przeciwciało, w którym sekwencje regionów zmiennych pochodzą z przeciwciała
mysiego, a sekwencje regionów stałych pochodzą z przeciwciała ludzkiego.
[0034] Stosowane tutaj przeciwciało, które „swoiście wiąże się z ludzką PTK7” ma w zamierzeniu odnosić
się do przeciwciała, które wiąże się z ludzką PTK7 z KD wynoszącą 1x10-7
M lub mniejszą, korzystniej
5x10-8
M lub mniejszą, korzystniej 1x10-8
M lub mniejszą, korzystniej 5x10-9
M lub mniejszą.
[0035] Stosowany tutaj termin „zasadniczo nie wiąże się” z białkiem lub komórkami, oznacza nie wiąże
się lub nie wiąże się z wysokim powinowactwem z białkiem lub komórkami, tj. wiąże się z białkiem lub
komórkami z KD wynoszącą 1x10-6
M lub większą, korzystniej 1x10-5
M lub większą, korzystniej 1x10-4
M
lub większą, korzystniej 1x10-3
M lub większą, jeszcze korzystniej 1x10-2
M lub większą.
[0036] Stosowany tutaj termin "Kassoc" lub "Ka" ma w zamierzeniu odnosić się do szybkości asocjacji
danego oddziaływania przeciwciało-antygen, podczas gdy stosowany tutaj termin "Kdis" lub "Kd," ma w
zamierzeniu odnosić się do szybkości dysocjacji danego oddziaływania przeciwciało-antygen. Stosowany
tutaj termin "KD" ma za zadanie odnosić się do stałej równowagi dysocjacji, którą uzyskuje się ze
stosunku Kd do Ka (tj. Kd/Ka) i wyraża jako stężenie molowe (M). Wartości KD dla przeciwciał można
określić stosując sposoby powszechnie uznane w stanie techniki. Korzystnym sposobem określania KD
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
11
przeciwciała jest stosowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego, korzystniej stosowanie
systemu biosensorowego, takiego jak system Biacore®.
[0037] Stosowany tutaj termin „wysokie powinowactwo” (duże powinowactwo) dla przeciwciała IgG,
odnosi się do przeciwciała mającego KD wynoszącą 10-8
M lub mniejszą, korzystniej 10-9
M lub mniejszą,
a jeszcze korzystniej 10-10
M lub mniejszą wobec docelowego antygenu. Jednakże, „wysokie
powinowactwo” wiązania może różnić się dla innych izotypów przeciwciała. Na przykład, „wysokie
powinowactwo” wiązania dla izotypu IgM odnosi się do przeciwciała mającego KD wynoszącą 10-7
M lub
mniejszą, korzystniej 10-8
M lub mniejszą, jeszcze korzystniej 10-9
M lub mniejszą.
[0038] Stosowany tutaj termin „osobnik” obejmuje dowolne zwierzę będące lub niebędące człowiekiem.
Termin „zwierzę niebędące człowiekiem” obejmuje wszystkie kręgowce, np. ssaki i nie-ssaki, takie jak
naczelne inne niż człowiek, owce, psy, koty, konie, krowy, kury, płazy, gady itd.
[0039] Różne aspekty wynalazku opisane są bardziej szczegółowo w dalszych podrozdziałach.
Przeciwciała anty-PTK7.
[0040] Przeciwciała według wynalazku są scharakteryzowane przez szczególne cechy funkcjonalne lub
właściwości przeciwciał. Na przykład, przeciwciała specyficznie wiążą się z PTK7. Korzystnie,
przeciwciało według wynalazku wiąże się z PTK7 z wysokim powinowactwem, na przykład z KD
wynoszącą 1x10-7
M lub mniejszą. Korzystnie, przeciwciało wiąże się z ludzką PTK7 z KD wynoszącą
5x10-8
M lub mniejszą, wiąże się z ludzką PTK7 z KD wynoszącą 1x10-8
M lub mniejszą, wiąże się z
ludzką PTK7 z KD wynoszącą 5x10-9
M lub mniejszą, lub wiąże się z ludzką PTK7 z KD pomiędzy
1x10-8
M a 1x10-10
M lub mniejszą. Przeciwciało wiąże się z komórkami guza Wilmsa z EC50 wynoszącym
4,0 nM lub mniejszym, lub wiąże się z komórkami guza Wilmsa z EC50 wynoszącym 3,5 nM lub
mniejszym. W stanie techniki znane są badania oceniające zdolność wiązania przeciwciał względem
PTK7, w tym na przykład testy ELISA, Western blot i RIA. Kinetykę wiązania (np. powinowactwo
wiązania) przeciwciał można również ocenić standardowymi, znanymi w stanie techniki badaniami, takimi
jak test ELISA, analizy Scatchard i Biacore. W innym przykładzie, przeciwciała według niniejszego
wynalazku mogą wiązać się do komórek guza linii raka nerki, na przykład do linii komórkowej guza
Wilmsa. Odpowiednie badania oceniające dowolną z opisanych powyżej cech opisano szczegółowo w
Przykładach.
Przeciwciała monoklonalne 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8
[0041] Przeciwciała według wynalazku obejmują ludzkie przeciwciała monoklonalne 4D5, 12C6 oraz 7C8.
Inne ujawnione tutaj przeciwciała obejmują 3G8, 3G8a oraz 12C6. Wszystkie przeciwciała zostały
wyizolowane i scharakteryzowane strukturalnie jak opisano w Przykładach 1 i 2. Specjaliści w dziedzinie
zauważą, że przeciwciała 3G8 i 3G8a, tak jak i przeciwciała 12C6 i 12C6a mają te same sekwencje
łańcuchów ciężkich, różniąc się w sekwencjach łańcuchów lekkich. Sekwencje aminokwasowe VH dla
3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: 1 (3G8 i 3G8a), 2 (4D5), 3 (12C6 i
12C6a) oraz 4 (7C8). Sekwencje aminokwasowe VL dla 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8
przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 5, 6, 7, 8, 9 i 10.
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
12
[0042] Z uwagi na to, że każde z tych przeciwciał może wiązać się z PTK7, sekwencje VH i VL mogą być
„mieszane i dopasowywane” w celu stworzenia innych cząsteczek wiążących anty-PTK7. Wiązanie PTK7
przez takie „zmieszane i dopasowane” przeciwciała można być sprawdzane przy zastosowaniu testów
wiązania opisanych powyżej oraz w Przykładach (np. testy ELISA). Korzystnie, kiedy łańcuchy VH i VL są
mieszane i dopasowywane, sekwencja VH z konkretnej pary VH/VL podmieniana jest sekwencją VH
podobną strukturalnie. Podobnie, korzystnie sekwencja VL z konkretnej pary VH/VL podmieniana jest
sekwencją VL podobną strukturalnie.
[0043] Zgodnie z tym, w jednym aspekcie, ujawniono tutaj izolowane przeciwciało monoklonalne, lub jego
część wiążącą antygen, obejmujące:
(a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy
składającej się z SEKW NR ID: 1, 2, 3 i 4; oraz
(b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy
składającej się z SEKW NR ID: 5, 6, 7, 8, 9 i 10;
przy czym przeciwciało swoiście wiąże PTK7, korzystnie ludzką PTK7.
[0044] Przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, według wynalazku może obejmować:
(a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 2; oraz
(b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 7; lub
(a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 4; oraz
(b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 10; lub
(a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 3; oraz
(b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 8.
[0045] Inne ujawnione kombinacje łańcucha ciężkiego i lekkiego obejmują:
(a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 1; oraz
(b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 5; lub
(a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 1; oraz
(b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 6; lub
(a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 3; oraz
(b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 9.
[0046] W innym aspekcie, ujawniono tutaj przeciwciała, które obejmują CDR1, CDR2 i CDR3 łańcuchów
ciężkich i lekkich z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 lub ich kombinacje. Sekwencje aminokwasowe
CDR1 z VH z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: 11 (3G8 i 3G8a), 12
(4D5), 13 (12C6 i 12C6a) oraz 14 (7C8). Sekwencje aminokwasowe CDR2 z VH z 3G8, 3G8a, 4D5,
12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: 15 (3G8 i 3G8a), 16 (4D5), 17 (12C6 i 12C6a) oraz
18 (7C8). Sekwencje aminokwasowe CDR3 z VH z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w
SEKW NR ID: 19 (3G8 i 3G8a), 20 (4D5), 21 (12C6 i 12C6a) oraz 22 (7C8). Sekwencje aminokwasowe
CDR1 z Vk z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 23, 24,
25, 26, 27 i 28. Sekwencje aminokwasowe CDR2 z Vk z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8
przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 29, 30, 31, 32, 33 i 34. Sekwencje aminokwasowe CDR3 z
Vk z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 35, 36, 37, 38, 39
i 40. Regiony CDR są wytyczone z zastosowaniem systemu Kabata (Kabat, E. A., et al. (1991)
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
13
Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human
Services, NIH nr publikacji. 91-3242).
[0047] Z uwagi na to, że każde z tych przeciwciał może wiązać się z PTK7 oraz że swoistość wiązania
antygenu zapewniana jest głównie przez regiony CDR1, CDR2 i CDR3, sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3
z VH oraz sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 z Vk mogą być „mieszane i dopasowywane” (tj. CDRy z
różnych przeciwciał mogą być mieszane i dopasowywane, ale każde przeciwciało musi zawierać CDR1,
CDR2 i CDR3 z VH oraz CDR1, CDR2 i CDR3 z Vk) w celu stworzenia innych cząsteczek wiążących anty-
PTK7 według wynalazku. Wiązanie z PTK7 dla takich „zmieszanych i dopasowanych” przeciwciał można
sprawdzić stosując testy wiązania opisane powyżej i w Przykładach (np. ELISA, analiza Biacore).
Korzystnie, kiedy sekwencje CDR z VH są mieszane i dopasowywane, sekwencja CDR1, CDR2 i/lub
CDR3 z konkretnej sekwencji VH podmieniana jest sekwencją (/ami) CDR podobną (/ymi) strukturalnie.
Podobnie, kiedy sekwencje CDR z Vk są mieszane i dopasowywane, sekwencja CDR1, CDR2 i/lub CDR3
z konkretnej sekwencji Vk podmieniana jest korzystnie sekwencją (/ami) CDR podobną (/ymi)
strukturalnie. Dla specjalisty w dziedzinie oczywiste będzie, że nowe sekwencje VH i VL mogą być
tworzone poprzez zastępowanie jednej lub więcej sekwencji regionu CDR z VH i/lub VL sekwencjami
podobnymi strukturalnie, z sekwencji CDR ujawnionych tutaj dla przeciwciał monoklonalnych 3G8, 3G8a,
4D5, 12C6, 12C6a i 7C8.
[0048] Zgodnie z tym, w innym aspekcie, ujawniono tutaj izolowane przeciwciało monoklonalne, lub jego
część wiążąca antygen, obejmujące:
(a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z
grupy składającej się z SEKW NR ID: 11, 12, 13 i 14;
(b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z
grupy składającej się z SEKW NR ID: 15, 16, 17 i 18;
(c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z
grupy składającej się z SEKW NR ID: 19, 20, 21 i 22;
(d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z
grupy składającej się z SEKW NR ID: 23, 24, 25, 26, 27 i 28;
(e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z
grupy składającej się z SEKW NR ID: 29, 30, 31, 32, 33 i 34; oraz
(f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z
grupy składającej się z SEKW NR ID: 35, 36, 37, 38, 39 i 40;
przy czym przeciwciało swoiście wiąże PTK7, korzystnie ludzką PTK7.
[0049] Przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, według wynalazku może obejmować:
(a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 12;
(b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 16;
(c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 20;
(d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 25;
(e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 31; oraz
(f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 37;
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
14
lub
(a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 14;
(b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 18;
(c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 22;
(d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 28;
(e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 34; oraz
(f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 40;
lub
(a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 13;
(b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 17;
(c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 21;
(d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 26;
(e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 32; oraz
(f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 38.
[0050] Ujawniono tutaj również przeciwciała obejmujące:
(a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 11;
(b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 15;
(c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 19;
(d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 23;
(e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 29; oraz
(f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 35;
lub
(a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 11;
(b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 15;
(c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 19;
(d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 24;
(e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 30; oraz
(f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 36;
lub
(a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 13;
(b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 17;
(c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 21;
(d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 27;
(e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 33; oraz
(f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 39.
[0051] W stanie techniki znany jest fakt, że domena CDR3, niezależnie od domen(-y) CDR1 i/lub CDR2,
sama może determinować swoistość wiązania przeciwciała dla odpowiedniego antygenu oraz, że można
wytworzyć w przewidywalny sposób liczne przeciwciała o tej samej swoistości wiązania w oparciu o
wspólną sekwencję CDR3. Patrz, na przykład, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000)
(opisujące wytwarzanie humanizowanego przeciwciała anty-CD30 z zastosowaniem jedynie zmiennej
domeny CDR3 łańcucha ciężkiego z mysiego przeciwciała Ki-4 anty-CD30); Beiboer et al., J. Mol. Biol.
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
15
296:833-849 (2000) (opisujące rekombinowane przeciwciała przeciw glikoproteinie nabłonkowej-2 (EGP-
2, ang. epithelial glycoprotein-2), z zastosowaniem jedynie sekwencji CDR3 ciężkiego łańcucha
wyjściowego mysiego przeciwciała MOC-31 anty-EGP-2); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
95:8910-8915 (1998) (opisujący panel humanizowanych przeciwciał anty-integryna αvβ3, z
zastosowaniem zmiennych domen CDR3 łańcucha ciężkiego i lekkiego mysiego przeciwciała LM609
anty-integryna αvβ3, gdzie każde z przeciwciał zawiera odmienną sekwencję poza domeną CDR3 i
zdolne jest do wiązania się z tym samym epitopem, co wyjściowe, mysie przeciwciało, z powinowactwami
tak wysokimi jak lub wyższymi niż wyjściowe, mysie przeciwciało); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc.
116:2161-2162 (1994) (ujawniający, że domena CDR3 zapewnia najistotniejszy wkład w wiązanie
antygenu); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 2529-2533 (1995) (opisujący przeszczepienie
sekwencji CDR3 łańcucha ciężkiego trzech Fab (SI-1, SI-40 i SI-32) przeciw ludzkiemu, łożyskowemu
DNA, na łańcuch ciężki Fab toksoida przeciw-tężcowego, zastępujące w ten sposób istniejący CDR3
łańcucha ciężkiego i wykazujące, że sama domena CDR3 nadaje swoistość wiązania); oraz Ditzel et al.,
J. Immunol. 157: 739-749 (1996) (opisujący badania przeszczepiania, w których przeniesienie jedynie
CDR3 łańcucha ciężkiego wyjściowego wieloswoistego Fab LNA3 na łańcuch ciężki monoswoistego
przeciwciała Fab p313 IgG, wiążącego się z tężcowym toksoidem, było wystarczające do zachowanie
swoistości wiązania wyjściowego Fab).
[0052] Zgodnie z tym, ujawnione zostały przeciwciała monoklonalne obejmujące jedną lub więcej domen
CDR3 łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego z przeciwciała pochodzącego od człowieka lub zwierzęcia nie
będącego człowiekiem, przy czym przeciwciało monoklonalne jest zdolne do swoistego wiązania z PTK7.
Ujawniono tutaj także przeciwciała monoklonalne obejmujące jedną lub więcej domen CDR3 łańcucha
ciężkiego i/lub lekkiego z przeciwciała z gatunku innego niż człowiek, takiego jak przeciwciało mysie lub
szczurze, przy czym przeciwciało monoklonalne jest zdolne do swoistego wiązania z PTK7. Takie
przeciwciała obejmujące jedną lub więcej domen CDR3 łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego z przeciwciała z
gatunku innego niż człowiek (a) są zdolne do współzawodniczenia o wiązanie z; (b) zachowują
charakterystykę funkcjonalną; (c) wiążą się z tym samym epitopem; i/lub (d) mają podobne
powinowactwa wiązania jak odpowiadające wyjściowe przeciwciało z gatunku innego niż człowiek.
[0053] Ujawnione zostały także przeciwciała monoklonalne obejmujące jedną lub więcej domen CDR3
łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego z przeciwciała ludzkiego, takiego jak, na przykład, ludzkie przeciwciało
otrzymane od zwierzęcia innego niż człowiek, przy czym ludzkie przeciwciało jest zdolne do swoistego
wiązania z PTK7. Ujawniono tutaj również przeciwciała monoklonalne obejmujące jedną lub więcej
domen CDR3 łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego z pierwszego ludzkiego przeciwciała, takiego jak, na
przykład, ludzkie przeciwciało otrzymane od zwierzęcia innego niż człowiek, przy czym pierwsze
przeciwciało jest zdolne do swoistego wiązania z PTK7 i gdzie domena CDR3 z pierwszego ludzkiego
przeciwciała zastępuje domenę CDR3 w ludzkim przeciwciele któremu brak swoistości wiązania dla
PTK7, w celu stworzenia drugiego ludzkiego przeciwciała, które jest zdolne do swoistego wiązania z
PTK7. Takie przeciwciała obejmujące jedną lub więcej domen CDR3 łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego z
pierwszego ludzkiego przeciwciała (a) są zdolne do współzawodniczenia o wiązanie z; (b) zachowują
charakterystykę funkcjonalną; (c) wiążą się z tym samym epitopem; i/lub (d) mają podobne
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
16
powinowactwa wiązania jak odpowiadające wyjściowe pierwsze ludzkie przeciwciało. Pierwszym ludzk im
przeciwciałem może być 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a oraz 7C8.
Przeciwciała wiążące się z tym samym epitopem co przeciwciała anty-PTK7 według wynalazku
[0054] Wynalazek dostarcza przeciwciał, które wiążą się z tym samym epitopem na ludzkiej PTK7 co
dowolne z przeciwciał monoklonalnych PTK7 według wynalazku.(tj. przeciwciał, które mają zdolność do
krzyżowego współzawodniczenia o wiązania z PTK7 z dowolnym z przeciwciał monoklonalnych według
wynalazku). Przeciwciałem odniesienia dla badań krzyżowego współzawodniczenia może być
przeciwciało monoklonalne 4D5 (mające sekwencje VH i VL jak przedstawiono w SEKW NR ID:
odpowiednio 2 i 7), lub przeciwciało monoklonalne 12C6 (mające sekwencje VH i VL jak przedstawiono w
SEKW NR ID: odpowiednio 3 i 8), lub przeciwciało monoklonalne 7C8 (mające sekwencje VH i VL jak
przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 4 i 10). Takie przeciwciała współzawodniczące krzyżowo
mogą być identyfikowane w oparciu o ich zdolność do krzyżowego współzawodniczenia z 4D5, 12C6 lub
7C8 w standardowych testach wiązania z PTK7. Na przykład, do wykazania krzyżowego
współzawodniczenia z przeciwciałami według niniejszego wynalazku, zastosowana może być analiza
BIAcore, testy ELISA lub cytometria przepływowa. Zdolność badanego przeciwciała do hamowania
wiązania, na przykład, 4D5, 12C6 lub 7C8 z ludzką PTK7 wykazuje, że badane przeciwciało może
współzawodniczyć z 4D5, 12C6 lub 7C8 o wiązanie z ludzką PTK7, a więc wiąże się z tym samym
epitopem na ludzkiej PTK7 co 4D5, 12C6 lub 7C8. Przeciwciało, które wiąże się z tym samym epitopem
na ludzkiej PTK7 co 4D5, 12C6 lub 7C8 jest ludzkim przeciwciałem monoklonalnym. Takie ludzkie
przeciwciała monoklonalne mogą być przygotowane i izolowane jak opisano w Przykładach.
Cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące przeciwciała według wynalazku
[0055] Kolejny aspekt wynalazku dotyczy cząsteczek kwasów nukleinowych, które kodują przeciwciała
według wynalazku. Kwasy nukleinowe mogą być obecne w całych komórkach, w lizacie komórkowym, lub
w postaci częściowo oczyszczonej albo zasadniczo oczyszczonej. Kwas nukleinowy jest „wyizolowany”
lub „uznany za zasadniczo oczyszczony” gdy jest oczyszczony z innych składników komórkowych lub
innych zanieczyszczeń, np. innych kwasów nukleinowych lub białek, standardowymi technikami,
włączając metodę alkaliczną/SDS, gradient CsCl, chromatografię kolumnową, elektroforezę w żelu
agarozowym i inne dobrze znane w stanie techniki. Patrz, F. Ausubel, et al., wyd. (1987) Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nowy York. Kwasem
nukleinowym według wynalazku może być, na przykład, DNA lub RNA i może on obejmować sekwencje
intronowe lub nie. W korzystnym wykonaniu, kwas nukleinowy jest cząsteczką cDNA.
[0056] Kwasy nukleinowe mogą być otrzymane z zastosowaniem standardowych technik biologii
molekularnej. Dla przeciwciał wyrażanych w hybrydomach (np. hybrydomach wytworzonych z myszy
transgenicznych niosących ludzkie geny immunoglobulin jak opisano poniżej), cDNA kodujące łańcuchy
lekkie i ciężkie przeciwciała wytwarzanego przez hybrydomę może być otrzymany poprzez standardową
amplifikację PCR lub techniki klonowania cDNA. Dla przeciwciał otrzymywanych z biblioteki genowej
immunoglobulin (np. z zastosowaniem technik ekspozycji fagowej (ang. phage display), kwasy
nukleinowe kodujące przeciwciało mogą być odzyskane z biblioteki.
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
17
[0057] Korzystnymi cząsteczkami kwasów nukleinowych są te kodujące sekwencje VH i VL z przeciwciał
monoklonalnych 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a lub 7C8. Sekwencje DNA kodujące sekwencje VH z
3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawione są w SEKW NR ID: 41 (3G8 i 3G8a), 42 (4D5), 43
(12C6 i 12C6a) oraz 44 (7C8). Sekwencje DNA kodujące sekwencje VL z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a
i 7C8 przedstawione są odpowiednio w SEKW NR ID: 45, 46, 47, 48, 49 i 50.
[0058] Po otrzymaniu fragmentów DNA kodujących segmenty VH i VL, te fragmenty DNA mogą być
poddane dalszej manipulacji standardowymi technikami rekombinacji DNA, na przykład aby przekształcić
geny regionu zmiennego do genów łańcucha przeciwciała pełnej długości, do genów fragmentu Fab lub
do genu scFv. W tych zabiegach, fragment DNA kodujący VL lub VH jest łączony funkcjonalnie z innym
fragmentem DNA kodującym inne białko, takie jak region stały przeciwciała lub elastyczny łącznik. Zwrot
„łączony funkcjonalnie”, stosowany w tym kontekście, ma oznaczać, że dwa fragmenty DNA połączone
są w ten sposób, że sekwencje aminokwasowe kodowane przez dwa fragmenty DNA pozostają w tej
samej ramce odczytu.
[0059] Wyizolowany DNA kodujący region VH może być przekształcony do genu łańcucha ciężkiego
pełnej długości poprzez funkcjonalne połączenie DNA kodującego VH z inną cząsteczką DNA kodującą
regiony stałe łańcucha ciężkiego (CH1, CH2 i CH3). Sekwencje ludzkich genów regionu stałego łańcucha
ciężkiego są znane w stanie techniki (patrz np. Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of
Immunological Interest, Wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Nr
publikacji. 91-3242) a fragmenty DNA obejmujące te regiony mogą być otrzymane przez standardową
amplifikację PCR. Region stały łańcucha ciężkiego może być regionem stałym z IgG1, IgG2, IgG3, IgG4,
IgA, IgE, IgM lub IgD, ale najkorzystniej jest regionem stałym z IgG1 lub IgG4. Dla genu łańcucha
ciężkiego fragmentu Fab, DNA kodujący VH może być łączony funkcjonalnie z inną cząsteczką DNA
kodującą tylko region stały CH1 łańcucha ciężkiego.
[0060] Wyizolowany DNA kodujący region VL może być przekształcony do genu łańcucha lekkiego pełnej
długości (jak również do genu łańcucha lekkiego z Fab) poprzez funkcjonalne połączenie DNA
kodującego VL z inną cząsteczką DNA kodującą region stały łańcucha lekkiego, CL. Sekwencje ludzkich
genów regionu stałego łańcucha lekkiego są znane w stanie techniki (patrz np. Kabat, E. A., el al. (1991)
Sequences of Proteins of Immunological Interest, Wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human
Services, NIH Nr publikacji. 91-3242) a fragmenty DNA obejmujące te regiony mogą być otrzymane przez
standardową amplifikację PCR. Region stały łańcucha lekkiego może być regionem stałym kappa lub
lambda, ale najkorzystniej jest regionem stałym kappa.
[0061] Aby wytworzyć gen scFv, fragmenty DNA kodujące VH i VL są łączone funkcjonalnie z innym
fragmentem kodującym elastyczny łącznik, np. kodującym sekwencję aminokwasową (Gly4 – Ser)3, tak
że sekwencje VH i VL mogą być wyrażane jako ciągły pojedynczy łańcuch białkowy, z regionami VL i VH
połączonymi elastycznym łącznikiem (patrz np. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al.
(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).
Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych według wynalazku
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
18
[0062] Przeciwciała monoklonalne (mAbs – ang. monoclonal antibodies) mogą być wytwarzane
różnorodnymi technikami, włączając konwencjonalną metodologię przeciwciał monoklonalnych np.
standardowa technika hybrydyzacji somatycznej – Kohler i Milstein (1975) Nature 256: 495. Chociaż
procedury hybrydyzacji somatycznej są korzystne, to zasadniczo można zastosować inne techniki
wytwarzania przeciwciała monoklonalnego np. transformacja wirusowa lub onkogenna limfocytów B.
[0063] Korzystnym systemem zwierzęcym do przygotowywania hybrydom jest system mysi. Wytwarzanie
hybrydomy w myszy jest bardzo dobrze udokumentowaną procedurą. Znane są w stanie techniki
procedury immunizacji i techniki izolacji immunizowanych splenocytów do fuzji. Znani są także partnerzy
fuzyjni (np. komórki mysiego szpiczaka) i procedury fuzji.
[0064] Przeciwciała chimeryczne lub ludzkie mogą być przygotowane w oparciu o sekwencję mysiego
przeciwciała monoklonalnego przygotowanego jak opisano powyżej. DNA kodujący łańcuch ciężki i lekki
immunoglobulin może być otrzymany z odpowiedniej mysiej hybrydomy i zaprojektowany tak aby
zawierał nie-mysie (np. ludzkie) sekwencje immunoglobulin z zastosowaniem standardowych technik
biologii molekularnej. Na przykład, aby stworzyć przeciwciało chimeryczne, mysie regiony zmienne mogą
być połączone z ludzkimi regionami stałymi sposobami znanymi w stanie techniki (patrz np. patent USA
nr 4,816,567 dla Cabilly et al.). W celu stworzenia przeciwciała humanizowanego, mysie regiony CDR
mogą być wstawione do ludzkiej sekwencji zrębowej z zastosowaniem sposobów znanych w stanie
techniki (patrz np. patent USA nr 5,225,539 dla Winter, oraz patenty USA nr 5,530,101; 5,585,089;
5,693,762 i 6,180,370 dla Queen et al.).
[0065] Przeciwciała według wynalazku to ludzkie przeciwciała monoklonalne. Takie ludzkie przeciwciała
monoklonalne skierowane przeciw PTK7 mogą być wytworzone z zastosowaniem myszy transgenicznych
lub transchromosomalnych, niosących części ludzkiego systemu immunologicznego zamiast systemu
mysiego. Te myszy transgeniczne i transchromosomalne obejmują myszy określane tutaj odpowiednio
jako myszy HuMAb i myszy KM miceTM
, i są wspólnie określane tutaj jako „myszy z ludzkimi Ig”.
[0066] Mysz HuMAb® (Medarex Inc.) zawiera miniloci ludzkich genów immunoglobulin, które kodują
niezrearanżowane ludzkie sekwencje łańcucha ciężkiego (µ i γ) i lekkiego κ immunoglobulin, razem z
ukierunkowanymi mutacjami, które inaktywują endogenne loci łańcucha µ i κ (patrz np. Lonberg, et al.
(1994) Nature 368 (6474): 856-859). Tak więc, myszy wykazują obniżoną ekspresję mysich IgM lub κ i w
odpowiedzi na immunizację wprowadzone transgeny ludzkiego łańcucha ciężkiego i lekkiego przechodzą
zmianę klasy i mutacje somatyczne dając ludzkie monoklonalne IgGκ o wysokim powinowactwie
(Lonberg, N. et al. (1994), supra; opisane w Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology
113:49-101; Lonberg, N. i Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, oraz Harding, F. i Lonberg,
N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). Przygotowanie i zastosowanie myszy HuMab oraz
modyfikacje genomowe tych myszy opisane są dalej w Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research
20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993)
EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994)
International Immunology 6: 579-591; oraz Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851.
Patrz dalej patenty USA nr 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397;
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
19
5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; wszystkie dla Lonberg i Kay; patent USA nr 5,545,807 dla
Surani et al.; publikacje PCT nr WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO
98/24884 i WO 99/45962, wszystkie dla Lonberg i Kay; oraz publikacja PCT nr WO 01/14424 dla
Korman et al.
[0067] W innym wykonaniu, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą być uzyskane z
zastosowaniem myszy niosącej ludzkie sekwencje immunoglobulin w transgenach lub na
transchromosomach, takich jak mysz niosąca transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego oraz
transchromosom ludzkiego łańcucha lekkiego. Takie myszy, określane tutaj jako „KM miceTM
”, opisane są
szczegółowo w publikacji PCT nr WO 02/43478 dla Ishida et al.
[0068] Dalsze, alternatywne zwierzęce systemy transgeniczne wyrażające ludzkie geny immunoglobulin
są dostępne w stanie techniki i mogą być stosowane do otrzymania przeciwciał anty-PTK7 według
wynalazku. Na przykład, zastosowany może być alternatywny system transgeniczny określany jako
Xenomouse (Abgenix, Inc.); takie myszy opisane są, na przykład, w patentach USA nr 5,939,598;
6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 i 6,162,963 dla Kucherlapati et al.
[0069] Ponad to, w stanie techniki dostępne są alternatywne zwierzęce systemy transchromosomalne
wyrażające ludzkie geny immunoglobulin i mogą być one stosowane w celu otrzymania przeciwciał anty-
PTK7 według wynalazku. Na przykład, mogą być stosowane myszy niosące zarówno transchromosom
ludzkiego łańcucha ciężkiego jak i transchromosom ludzkiego łańcucha lekkiego, określane tutaj jako „TC
mice”; takie myszy opisane są w Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Co
więcej, w stanie techniki opisano krowy niosące transchromosomy ludzkiego łańcucha ciężkiego i
lekkiego (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) i mogą być one stosowane w celu
otrzymania przeciwciał anty-PTK7 według wynalazku.
[0070] Ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku mogą być także przygotowane z
zastosowaniem metod ekspozycji fagowej (technik prezentacji na fagu) (ang. phage display) do
przeszukiwania bibliotek ludzkich genów immunoglobulin. Takie metody ekspozycji fagowej dla
izolowania ludzkich przeciwciał są ustalone w stanie techniki. Patrz na przykład: patenty USA nr
5,223,409; 5,403,484; i 5,571,698 dla Ladner et al.; patenty USA nr 5,427,908 i 5,580,717 dla Dower et
al.; patenty USA nr 5,969,108 i 6,172,197 dla McCafferty et al.; oraz patenty USA nt 5,885,793;
6,521,404; 6,544,731;.6,555,313; 6,582,915 i 6,593,081 dla Griffiths et al.
[0071] Ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku mogą być także przygotowane z
zastosowaniem myszy SCID, w których rekonstytuowano ludzkie komórki odpornościowe, tak że można
otrzymać odpowiedź ludzkich przeciwciał po immunizacji. Takie myszy opisano na przykład w patentach
USA nr 5,476,996 i 5,698,767 dla Wilson et al.
Immunizacja myszy z ludzkimi Ig
[0072] Kiedy do otrzymania ludzkich przeciwciał według wynalazku stosowane są myszy z ludzkimi Ig,
myszy te mogą być immunizowane oczyszczonym lub wzbogaconym preparatem antygenu PTK7 i/lub
rekombinowaną PTK7, lub białkiem fuzyjnym z PTK7, jak opisano w Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
20
(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; oraz publikacjach PCT nr
WO 98/24884 i WO 01/14424. Korzystnie, myszy będą w wieku 6-16 tygodni przy pierwszej infuzji. Na
przykład, oczyszczony lub rekombinowany preparat (5-50 µg) antygenu PTK7 może być zastosowany do
immunizacji myszy z ludzkimi Ig dootrzewnowo.
[0073] Szczegółowe procedury wytworzenia całkowicie ludzkich przeciwciał monoklonalnych dla PTK7 są
opisane w Przykładzie 1 poniżej. Zbiór doświadczeń z różnymi antygenami wykazał, że myszy
transgeniczne odpowiadają gdy początkowo immunizowane są dootrzewnowo (IP, ang. intraperitoneally)
z antygenem w kompletnym adiuwancie Freunda, z kolejnymi immunizacjami IP co drugi tydzień (do
łącznie 6) antygenem w niekompletnym adiuwancie Freunda. Jednakże, adiuwanty inne niż Freunda
również okazują się skuteczne. Dodatkowo, stwierdzono, że całe komórki przy braku adiuwanta są
wysoce immunogenne. Odpowiedź immunologiczna może być monitorowana w tracie trwania protokołu
immunizacji przy pomocy próbek osocza otrzymywanych ze skrwawiania pozagałkowego. Osocze może
być badane testem ELSIA (jak opisano poniżej), a myszy z wystarczającymi mianami ludzkiej
immunoglobuliny anty-PTK7 mogą być wykorzystane do fuzji. Myszy mogą być stymulowane antygenem
dożylnie 3 dni przed uśmierceniem i usunięciem śledziony. Spodziewane jest, że dla każdej immunizacji
będą musiały być wykonane 2-3 fuzje. Myszy zazwyczaj immunizowane są pomiędzy 6 a 24 dla każdego
antygenu. Zazwyczaj stosowane są szczepy zarówno HCo7 jak i HCo12. Dodatkowo, zarówno transgen
HCo7 jak i HCo12 mogą być wkrzyżowane do jednej myszy mającej dwa różne transgeny ludzkiego
łańcucha ciężkiego (HCo7/HCo12). Alternatywnie lub dodatkowo, może być stosowany szczep myszy KM
mouseTM
, jak opisano w przykładzie 1.
Tworzenie hybrydom wytwarzających ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku
[0074] W celu wytworzenia hybrydomy wytwarzającej ludzkie przeciwciała monoklonalne według
wynalazku, splenocyty i/lub komórki węzłów chłonnych z immunizowanych myszy mogą być wyizolowane
i poddane fuzji z odpowiednią unieśmiertelnioną linią komórkową, taką jak linia komórkowa mysiego
szpiczaka. Powstające hybrydomy mogą być przeszukane pod kątem wytwarzania przeciwciał swoistych
dla antygenu. Na przykład, zawiesiny pojedynczych komórek limfocytów śledziony z immunizowanych
myszy mogą być poddane fuzji z jedną szóstą liczby komórek niewydzielniczego szpiczaka myszy
P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) z 50% PEG. Komórki są wysiewane w ilości około 2 x 105 na
płaskodenną płytkę mikrotitracyjną, a następnie przez dwa tygodnie inkubowane w pożywce selekcyjnej
zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej, 18% pożywki kondycjonowanej „653”, 5% origen (IGEN), 4
mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 5mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanolu, 50 jednostek/ml
penicyliny, 50 mg/ml streptomycyny, 50 mg/ml gentamycyny oraz 1X HAT (Sigma; HAT dodawane jest 24
godziny po fuzji). Po około dwóch tygodniach, komórki mogą być hodowane w pożywce, w której HAT
zastąpione jest HT. Poszczególne studzienki mogą być wówczas sprawdzone testem ELISA pod kątem
ludzkich monoklonalnych przeciwciał IgM i IgG. Kiedy wystąpi znaczny wzrost hybrydomy, można
monitorować pożywkę zazwyczaj po 10-14 dniach. Hybrydomy wydzielające przeciwciało mogą być
przesiewane, ponownie sprawdzane, i jeżeli nadal dają wynik pozytywny dla ludzkich monoklonalnych
przeciwciał IgG, mogą być subklonowane co najmniej dwa razy przez ograniczające rozcieńczenia.
Stabilne subklony mogą być wówczas hodowane in vitro do wytworzenia małych ilości przeciwciał w
pożywce hodowli tkankowej w celu charakteryzacji.
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
21
[0075] W celu oczyszczenia ludzkich przeciwciał monoklonalnych, wybrane hybrydomy mogą być
hodowane w dwu-litrowych kolbach z mieszadłem obrotowym dla oczyszczania przeciwciał
monoklonalnych. Supernatanty mogą być filtrowane i zatężane przed chromatografią powinowactwa ze
złożem protein A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Eluowane IgG może być sprawdzone
poprzez elektroforezę w żelu i wysokosprawną chromatografię cieczową w celu zapewnienia czystości.
Roztwór buforowany może zostać zastąpiony PBS, a stężenie można ustalić przez OD280 stosując
współczynnik ekstynkcji 1,43. Przeciwciała monoklonalne można porcjować i przechowywać w -80° C.
Tworzenie transfektom wytwarzających przeciwciała monoklonalne według wynalazku
[0076] Przeciwciała według wynalazku mogą być także wytwarzane w transfektomie komórki gospodarza
z zastosowaniem, na przykład, kombinacji technik rekombinacji DNA i metod transfekcji genów, znanych
w stanie techniki (np. Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
[0077] Na przykład, w celu wyrażania przeciwciał, lub fragmentów tych przeciwciał, DNA kodujący lekkie i
ciężkie łańcuchy częściowe lub pełnej długości, można otrzymać standardowymi technikami biologii
molekularnej (np. amplifikacja PCR lub klonowanie cDNA z zastosowaniem hybrydomy wyrażającej
odpowiednie przeciwciało) i można wstawić DNA do wektorów ekspresyjnych takich, że geny są
połączone funkcjonalnie (operatywnie) do sekwencji kontrolnych transkrypcji i translacji. W tym
kontekście, zwrot „połączone funkcjonalnie” ma oznaczać, że gen przeciwciała jest zligowany z wektorem
tak, że sekwencje kontrolne transkrypcji i translacji w wektorze wypełniają swoją zamierzoną funkcję
regulacji transkrypcji i translacji genu przeciwciała. Wektor ekspresyjny i sekwencje kontrolne ekspresji
wybrane są tak aby były kompatybilne ze stosowaną do ekspresji komórką gospodarzem. Gen łańcucha
lekkiego przeciwciała i gen łańcucha ciężkiego przeciwciała mogą być wstawione do osobnych wektorów
lub, bardziej typowo, oba geny wstawione są do tego samego wektora ekspresyjnego. Geny przeciwciał
wstawiane są do wektora ekspresyjnego standardowymi sposobami (np. ligacja komplementarnych
miejsc restrykcyjnych fragmentu genu przeciwciała i wektora, lub ligacja tępych końców jeżeli brak miejsc
restrykcyjnych). Opisane tutaj regiony zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciał mogą być
stosowane do stworzenia genów przeciwciał pełnej długości dowolnego izotypu przeciwciała poprzez
wstawienie ich do wektorów ekspresyjnych już kodujących regiony stałe łańcucha ciężkiego i regiony
stałe łańcucha lekkiego żądanego izotypu, tak jak gdy segment VH jest połączony funkcjonalnie z
segmentem (-ami) CH w wektorze, a segment Vκ jest połączony funkcjonalnie z segmentem CL w
wektorze. Dodatkowo lub alternatywnie, rekombinowany wektor ekspresyjny może kodować peptyd
sygnałowy, który ułatwia wydzielanie łańcucha przeciwciała z komórki gospodarza. Gen łańcucha
przeciwciała może być wklonowany w wektor, tak że peptyd sygnałowy jest połączony z końcem
aminowym genu łańcucha przeciwciała, z zachowaniem ramki odczytu. Peptyd sygnałowy może być
peptydem sygnałowym immunoglobulin lub heterologicznym peptydem sygnałowym (tj. peptydem
sygnałowym z białka nie będącego immunoglobuliną).
[0078] Dodatkowo do genów łańcuchów przeciwciał, rekombinowane wektory ekspresyjne według
wynalazku niosą sekwencje regulatorowe, które kontrolują ekspresję genów łańcuchów przeciwciał w
komórce gospodarzu. Zwrot „sekwencja regulatorowa” ma w zamierzeniu obejmować promotory,
sekwencje wzmacniające i inne elementy kontroli ekspresji (np. sygnały poliadenylacji), które kontrolują
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
22
transkrypcję lub translację genów łańcuchów przeciwciał. Takie sekwencje regulatorowe są opisane, na
przykład, w Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San
Diego, CA (1990)). Specjaliści w dziedzinie zauważą, że konstrukcja wektora ekspresyjnego, łącznie z
wyborem sekwencji regulatorowych, może zależeć od czynników takich jak wybór komórki gospodarza do
transformacji, pożądany poziom ekspresji białka, itd. Korzystne sekwencje regulatorowe dla ekspresji w
ssaczej komórce gospodarzu obejmują elementy wirusowe, które kierują wysokim poziomem ekspresji
białka w komórkach ssaków, takie jak promotory i/lub sekwencje wzmacniające pochodzące z wirusa
cytomegalii (CMV), małpiego wirusa 40 (SV40), adenowirusa, (np. główny późny promotor adenowirusa
(AdMLP) i poliomy. Alternatywnie, można zastosować niewirusowe sekwencje regulatorowe, takie jak
promotor ubikwityny lub promotor β-globiny. Jeszcze dalej, elementy regulatorowe złożone z sekwencji z
różnych źródeł, takie jak system promotorowy SRα, który zawiera sekwencje z wczesnego promotora
SV40 i długie końcowe powtórzenia z wirusa ludzkiej białaczki komórek-T typu 1 (Takebe, Y. et al. (1988)
Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
[0079] W dodatku do genów łańcuchów przeciwciał i sekwencji regulatorowych, rekombinowane wektory
ekspresyjne według wynalazku mogą nieść dodatkowe sekwencje, takie jak sekwencje regulujące
replikację wektora w komórkach gospodarzach (np. miejsca inicjacji replikacji) i selekcyjne geny
markerowe. Selekcyjny gen markerowy ułatwia selekcję komórek gospodarzy, do których wprowadzono
wektor (patrz, np. patenty USA nr 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, wszystkie przez Axel et al.). Na
przykład, typowo selekcyjny gen markerowy nadaje oporność na leki, takie jak G418, hygromycyna czy
metotreksat, dla komórki gospodarza, do której wprowadzono wektor. Korzystne selekcyjne geny
markerowe obejmują gen reduktazy dihydrofolianu (DHFR) (do stosowania w komórkach gospodarzach
dhfr- z selekcją/amplifikacją metotreksatem) i gen neo (dla selekcji G418).
[0080] W celu ekspresji łańcuchów lekkich i ciężkich, wektor(-y) ekspresyjny kodujący łańcuchy ciężkie i
lekkie transfekowany jest do komórki gospodarza standardowymi technikami. Różne formy terminu
„transfekcja” mają w zamierzeniu obejmować całą różnorodność technik powszechnie stosowanych do
wprowadzania egzogennego DNA do prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza, np.
elektroporacja, strącanie fosforanem wapnia, transfekcja z DEAE-dekstranem i tym podobne. Chociaż
teoretycznie możliwa jest ekspresja przeciwciał według wynalazku zarówno w prokariotycznych jak i
eukariotycznych komórkach gospodarzach, najkorzystniejsza jest ekspresja przeciwciał w komórkach
eukariotycznych, a najkorzystniej w ssaczych komórkach gospodarzach, ponieważ takie komórki
eukariotyczne, a w szczególności komórki ssaków; z większym prawdopodobieństwem niż komórki
prokariotyczne złożą i wydzielą prawidłowo zwinięte i aktywne immunologicznie przeciwciało.
Stwierdzono, że prokariotyczna ekspresja genów przeciwciał jest nieskuteczna do wytwarzania
aktywnego przeciwciała z wysoką wydajnością (Boss, M. A. i Wood, C. R. (1985) Immunology Today
6:12-13).
[0081] Korzystne ssacze komórki gospodarze do ekspresji rekombinowanych przeciwciał według
wynalazku obejmują komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) (włączając komórki CHO dhfr-, opisane w
Urlaub i Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, stosowane z markerem selekcyjnym
DHFR, np. jak opisano w R. J. Kaufman i P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), komórki szpiczaka
NSO, komórki COS i komórki SP2. W szczególności, do zastosowania z komórkami szpiczaka NSO,
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
23
innym korzystnym systemem ekspresji jest system ekspresji genu GS ujawniony w WO 87/04462, WO
89/01036 i EP 338,841. Kiedy rekombinowane wektory ekspresyjne kodujące geny przeciwciał
wprowadzane są do ssaczych komórek gospodarzy, przeciwciała wytwarzane są poprzez hodowlę
komórek gospodarzy przez okres czasu wystarczający aby umożliwić ekspresję przeciwciała w
komórkach gospodarzach lub, korzystniej, wydzielenie przeciwciała do pożywki hodowlanej, w której
rosną komórki gospodarze. Przeciwciała można odzyskać z pożywki hodowlanej stosując standardowe
sposoby oczyszczania białka.
Charakteryzacja wiązania się przeciwciała z antygenem
[0082] Przeciwciała według wynalazku mogą być testowane pod kątem wiązania z PTK7 przez, na
przykład, standardowy test ELISA. W skrócie, płytki mikrotitracyjne pokrywane są oczyszczoną PTK7
0,25 µg/ml w PBS, a następnie blokowane 5% albuminą surowicy bydlęcej w PBS. Rozcieńczenia
przeciwciała (np. rozcieńczenia osocza od myszy immunizowanych PTK7) dodawane są do każdej
studzienki i inkubowane przez 1-2 godziny w 37°C. Płytki są płukane PBS/Tween, a następnie
inkubowane z odczynnikiem drugorzędowym (np. dla przeciwciał ludzkich, anty-ludzki swoisty względem
IgG-Fc poliklonalny reagent z kozy) sprzężonym z fosfatazą alkaliczną przez 1 godzinę w 37°C. Po
płukaniu, płytki są wywoływane substratem pNPP (1 mg/ml) i analizowane przy OD 405-650. Korzystnie,
do fuzji wykorzystywane będą myszy osiągające najwyższe miana.
[0083] Test ELISA taki jak opisany powyżej może także być stosowany dla hybrydom, które wykazują
pozytywną reaktywność z immunogenem PTK7. Hybrydomy, które wiążą się z wysokim powinowactwem
z PTK7 są subklonowane i dalej charakteryzowane. Jeden klon z każdej hybrydomy, który zachowuje
reaktywność komórek wyjściowych (w teście ELISA), może być wybrany do przygotowania banku
komórek z 5-10 fiolek, przechowywanego w -140°C, oraz do oczyszczenia przeciwciała.
[0084] W celu oczyszczenia przeciwciał anty-PTK7, wybrane hybrydomy można hodować w dwu-
litrowych kolbach z mieszadłem obrotowym do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych. Supernatanty
mogą być filtrowane i zatężane przed chromatografią powinowactwa ze złożem proteinA-sepharose
(Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluowane IgG może być sprawdzone poprzez elektroforezę w żelu i
wysokosprawną chromatografię cieczową w celu zapewnienia czystości. Roztwór buforowy może zostać
zastąpiony PBS, a stężenie może być ustalone przy OD280 z zastosowaniem współczynnika ekstynkcji
1,43. Przeciwciała monoklonalne mogą być porcjowane i przechowywane w -80°C.
[0085] W celu ustalenia czy wybrane przeciwciała monoklonalne anty-PTK7 wiążą się z unikalnymi
epitopami, każde przeciwciało może być biotynylowane z zastosowaniem odczynników dostępnych
komercyjnie (Pierce, Rockford, IL). Badania kompetencyjne z zastosowaniem niewyznakowanych
przeciwciał monoklonalnych i biotynylowanych przeciwciał monoklonalnych mogą być przeprowadzone z
zastosowaniem płytek ELISA opłaszczonych PTK7, jak opisano powyżej. Wiązanie biotynylowanych mAb
może być wykrywane przy pomocy sondy steptawidyna-fosfataza alkaliczna.
[0086] W celu ustalenia izotypu oczyszczonych przeciwciał, można przeprowadzić izotypowe testy
ELISA, z zastosowaniem odczynników swoistych dla konkretnego izotypu. Na przykład, do ustalenia
izotypu ludzkiego przeciwciała monoklonalnego, studzienki płytek mikrotitracyjnych można opłaszczyć 1
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
24
µg/ml anty-ludzkiej immunoglobuliny przez noc w 4°C. Po zablokowaniu 1% BSA, płytki są traktowane 1
µg/ml lub mniej testowych przeciwciał monoklonalnych lub oczyszczonych kontroli izotypowych, w
temperaturze otoczenia przez jedną do dwóch godzin. Studzienki mogą być potem traktowane
sprzężonymi z fosfatazą alkaliczną sondami swoistymi dla ludzkiego IgG1 lub ludzkiego IgM. Płytki
wywołuje się i analizuje jak opisano powyżej.
[0087] Ludzkie IgG anty-PTK7 mogą być dalej sprawdzone pod kątem reaktywności z antygenem PTK7 z
pomocą Western blot. W skrócie, PTK7 może być przygotowane i poddane elektroforezie w żelu
poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu. Po elektroforezie, rozdzielone antygeny są
transferowane na membrany nitrocelulozowe, blokowane 10% płodową surowicą bydlęcą i sondowane
przy użyciu testowanych przeciwciał monoklonalnych. Wiązanie ludzkiego IgG może być wykryte przy
zastosowaniu fosfataz alkalicznych anty-ludzkie IgG i wywołane tabletkami substratu BCIP/NBT (Sigma
Chem. Co., St. Louis, Mo.).
Immunokoniugaty
[0088] W innym aspekcie, niniejszy wynalazek obejmuje przeciwciało anty-PTK7, lub jego fragment,
sprzężone z środkiem terapeutycznym, takim jak cytotoksyna, lekiem (np. immunosupresantem) lub
radiotoksyną. Takie koniugaty określane są tutaj jako „immunokoniugaty”. Immunokoniugaty, które
obejmują jedną lub więcej cytotoksyn określane są jako „immunotoksyny”. Cytotoksyna lub środek
cytotoksyczny obejmują dowolne środki, które są szkodliwe (np. zabójcze) dla komórek. Przykłady
obejmują taksol, cytochalazynę B, gramicydynę D, bromek etydyny, emetynę, mitomycynę, etopozyd,
tenopozyd, winkrystynę, winblastynę, kolchicynę, doksorubicynę, daunorubicynę, dion
dihydroksyantracyny, mitoksantron, mitramycynę, aktynomycynę D, 1-dehydrotestosteron,
glukokortykoidy, prokainę, tetrakainę, lidokainę, propranolol i puromycynę i ich analogi lub homologi.
Środkii terapeutyczne obejmują także, na przykład, antymetabolity (np. metotreksat, 6-merkaptopurynę,
6-tioguaninę, cytrabinę, 5-fluorouracyl dekarbazynę), środki alkilujące (np. mechloretaminę, tiotepa
chlorambucyl, melfalan, karmustynę (BSNU) i lomustynę (CCNU), cyklofosfamid, busulfan,
dibromomannitol, streptozotocynę, mitomycynę C i cis-dichlorodiaminoplatynę (II) (DDP) cisplatynę),
antracykliny, (np. daunorubicynę (niegdyś daunomycynę) i doksorubicynę), antybiotyki (np. dakty-
nomycynę (niedgyś aktynomycynę), bleomycynę, mitramycynę i antramycynę (AMC)) i środki anty-
mitotyczne (np. winkrystynę i winblastynę).
[0089] Inne korzystne przykłady terapeutycznych cytotoksyn, które można sprzęgać z przeciwciałami
według wynalazku obejmują duokarmycyny, kalicheamycyny, maitanzyny i aurystatyny i ich pochodne.
Przykład koniugatu przeciwciała i kalichaemycyny jest komercyjnie dostępny (MylotargTM
; Wyeth-Ayerst).
Przykłady terapeutycznych cytotoksyn można znaleźć, przykładowo, w patentach USA nr 6548530 i
6281354 i w zgłoszeniach patentowych nr US 2003/0064984, US 2003/0073852 i US 2003/0050331.
[0090] Cytotoksyny można sprzęgać z przeciwciałami według wynalazku, stosując technologię łącznika,
dostępną w stanie techniki. Przykłady typów łączników, stosowanych do sprzęgania cytotoksyn z
przeciwciałami obejmują, ale nie ograniczają się do, hydrazonów, tioestrów, estrów, dwusiarczków i
łączników zawierających peptydy. Można wybrać łącznik, przykładowo, podatny na rozszczepianie niskim
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
25
pH w obrębie kompartmentu lizosomalnego lub podatny na rozszczepianie proteazami, takimi jak
proteazy preferencyjnie wyrażane w tkance nowotworowej, takie jak katepsyny (np. katepsyny B, C, D).
[0091] Dla dalszych rozważań nad typami cytotoksyn, łączników i sposobów sprzęgania środków
terapeutycznych z przeciwciałami, patrz także Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215;
Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer. Cell 3:207-
212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. i Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin.
Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. i Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.
[0092] Przeciwciała według niniejszego wynalazku można sprzęgać również z izotopem radioaktywnym,
aby wytworzyć cytotoksyczne radiofarmaceutyki, określane również jako radioimmunokoniugaty.
Przykłady izotopów radioaktywnych, które można sprzęgać z przeciwciałami, w celu użycia
diagnostycznego lub terapeutycznego, obejmują, ale nie ograniczają się do jodu131
, indu111
, itru90
i
lutetu177
. Sposoby wytwarzania radioimmunokoniugatów są ustalone w stanie techniki. Przykłady
radioimmunokoniugatów są komercyjnie dostępne, włączając ZevalinTM
(IDEC Pharmaceuticals) i
BexxarTM
(Corixa Pharmaceuticals), a podobne sposoby można stosować do wytwarzania
radioimmunokoniugatów z zastosowaniem przeciwciał według wynalazku.
[0093] Koniugaty przeciwciał według wynalazku można stosować do modyfikacji danej odpowiedzi
biologicznej, a cząstki leku nie należy rozumieć jako ograniczonej do klasycznych, chemicznych środków
terapeutycznych. Przykładowo, cząstką leku może być białko lub polipeptyd, mający pożądaną
aktywność biologiczną. Takie białka mogą obejmować, na przykład, enzymatycznie aktywną toksynę lub
jej aktywny fragment, takie jak abrynę, rycynę A, egzotoksynę pseudomonas lub toksynę błonicy; białko,
takie jak czynnik martwicy guza lub interferon-γ; lub modyfikatory odpowiedzi biologicznej, takie jak, na
przykład, limfokiny, interleukinę-1 ("IL-1"), interleukinę-2 ("IL-2"), interleukinę-6 ("IL-6"), czynnik
stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów ("GM-CSF"), czynnik stymulujący tworzenie
kolonii granulocytów ("G-CSF") lub inne czynniki wzrostu.
[0094] Techniki sprzęgania takich cząstek terapeutycznych z przeciwciałami są dobrze znane, patrz, np.
Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", w Monoclonal
Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (wyd.), s. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et
al., "Antibodies For Drug Delivery", w Controlled Drug Delivery (Wyd. 2.), Robinson et al. (wyd.), s. 623-
53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A
Review", w Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (wyd.), s. 475-
506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled
Antibody In Cancer Therapy", w Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.
(wyd.), s. 303-16 (Academic Press 1985) i Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of
Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
Kompozycje farmaceutyczne
[0095] W innym aspekcie, wynalazek dostarcza kompozycję np. kompozycję farmaceutycznązawierającą
jedno lub kombinację przeciwciał monoklonalnych, lub ich części wiążącej (wiążących) antygen, według
niniejszego wynalazku, formułowanej razem z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem. Takie
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
26
kompozycje mogą obejmować jedno lub kombinację (np. dwóch lub więcej różnych) przeciwciał lub
immunokoniugatów według wynalazku. Na przykład, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku
może obejmować kombinację przeciwciał (lub immunokoniugatów), wiążących się z różnymi epitopami
antygenu docelowego lub mających aktywności komplementarne.
[0096] Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać w terapii skojarzonej, tj.
połączonej z innymi środkami. Przykładowo, terapia skojarzona może obejmować przeciwciało anty-PTK7
według wynalazku, połączone z przynajmniej jednym innym środkiem przeciwzapalnym lub
immunosupresyjnym. Przykłady środków terapeutycznych, które można stosować w terapii skojarzonej,
opisano bardziej szczegółowo poniżej, w sekcji poświęconej stosowaniu przeciwciał według wynalazku.
[0097] Stosowany tu "nośnik dopuszczalny farmaceutycznie" obejmuje wszelkie rozpuszczalniki, środki
dyspersyjne, pokrycia, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, środki izotoniczne i opóźniające
wchłanianie i tym podobne, które są fizjologicznie kompatybilne. Korzystnie, nośnik jest odpowiedni do
podawania dożylnego, domięśniowego, podskórnego, pozajelitowego, dordzeniowego lub naskórkowego
(np. przez iniekcje lub infuzje). W zależności od drogi podawania, składnik aktywny, tj. przeciwciało,
immunokoniugat lub cząsteczka dwu-specyficzna może być pokryty materiałem chroniącym składnik
przed działaniem kwasów lub innych warunków naturalnych, mogących dezaktywować składnik.
[0098] Składniki farmaceutyczne według wynalazku mogą obejmować jedną lub więcej soli
dopuszczalnych farmaceutycznie. "Sól dopuszczalna farmaceutycznie" odnosi się do soli, zachowującej
pożądaną aktywność biologiczną składnika macierzystego i nie wywołującej żadnych skutków
niepożądanych (patrz, np. Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Przykłady takich soli
obejmują kwaśne sole addycyjne i zasadowe sole addycyjne. Kwaśne sole addycyjne obejmują te
pochodzące od nietoksycznych kwasów nieorganicznych, takich jak solny, azotowy, fosforowy, siarkowy,
bromowodorowy, jodowodorowy, fosforawy i tym podobne, jak również od nietoksycznych kwasów
organicznych, takich jak alifatyczne kwasy mono- i dikarboksylowe, kwasy alkanowe podstawione
fenylem, hydroksykwasy alkanokarboskylowe, kwasy aromatyczne, alifatyczne i aromatyczne kwasy
sulfonowe i tym podobne. Zasadowe sole addycyjne obejmują te pochodzące od metali ziem
alkalicznych, takich jak sód, potas, magnez, wapń i tym podobne, jak również od nietoksycznych amin
organicznych, takich jak N,N’-dibenzyloetylenodiamina, N-metyloglukamina, chloroprokaina, cholina,
dietanoloamina, etylenodiamina, prokaina i tym podobne.
[0099] Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może także obejmować farmaceutycznie
dopuszczalny przeciwutleniacz. Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych przeciwutleniaczy obejmują:
(1) przeciwutleniacze rozpuszczalne w wodzie, takie jak kwas askorbinowy, chlorowodorek cysteiny,
wodorosiarczan sodu, pirosiarczyn sodu, siarczyn sodu i tym podobne; (2) przeciwutleniacze
rozpuszczalne w tłuszczach, takie palmitynian askorbylu, butylowany hydroksyanizol (BHA), butylowany
hydroksytoluen (BHT), lecytyna, galusan propylu, alfa-tokoferol i tym podobne; i (3) środki chelatujące
metale, takie jak kwas cytrynowy, kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), sorbitol, kwas winowy, kwas
fosforowy i tym podobne.
[0100] Przykłady odpowiednich nośników wodnych i nie-wodnych, które można stosować w
kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku obejmują wodę, etanol, poliole (takie jak glicerol,
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
27
glikol propylenowy, glikol polietylenowy i tym podobne),oraz ich odpowiednie mieszaniny, oleje roślinne,
takie jak oliwa z oliwek i estry organiczne, odpowiednie do wstrzykiwania, takie jak oleinian etylu.
Odpowiednią płynność można utrzymać, na przykład, stosując materiały powlekające, takie jak lecytynę,
utrzymując wymagany rozmiar cząstek w przypadku dyspersji oraz stosując środki powierzchniowo
czynne.
[0101] Kompozycje te mogą również zawierać adiuwanty, takie jak konserwanty, środki zwilżające, środki
emulgujące i środki dyspergujące. Zapobieganie obecności mikroorganizmów można zapewnić zarówno
przez procedury sterylizacji, supra, i przez dodatek różnych środków przeciwbakteryjnych i
przeciwgrzybiczych, na przykład, parabenu, chlorobutanolu, fenolu, kwasu sorbowego i tym podobnych.
Pożądane może być również włączenie do kompozycji środków izotonicznych, takich jak cukry, chlorek
sodu i tym podobne. Dodatkowo, przedłużone wchłanianie wstrzykniętej postaci farmaceutycznej można
osiągnąć, przez włączenie środków opóźniających wchłanianie, takich jak monostearynian glinu i
żelatyna.
[0102] Nośniki dopuszczalne farmaceutycznie obejmują sterylne roztwory wodne lub dyspersje i sterylne
proszki do późniejszego przygotowywania sterylnych wstrzykiwanych roztworów i dyspersji. W stanie
techniki znane jest stosowanie takich podłoży i środków dla substancji aktywnych farmaceutycznie. Z
wyjątkiem sytuacji, w której jakieś podłoże lub środek jest niekompatybilny ze składnikiem aktywnym,
rozważane jest jego użycie w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku. Do kompozycji można
włączyć również uzupełniające składniki aktywne.
[0103] Kompozycje terapeutyczne zazwyczaj muszą być sterylne i stabilne w warunkach wytwarzania i
przechowywania. Kompozycję można formułować jako roztwór, mikroemulsję, liposom lub inną
zorganizowaną strukturę, odpowiednią do uzyskania wysokiego stężenia leku. Nośnik może być
rozpuszczalnikiem lub ośrodkiem dyspersyjnym, zawierającym, na przykład, wodę, etanol, poliol (na
przykład, glicerol, glikol propylenowy i ciekły glikol polietylenowy i tym podobne) oraz ich odpowiednie
mieszaniny. Odpowiednią płynność można utrzymać, przykładowo, stosując powleczenia, takie jak
lecytynę, utrzymując wymagany rozmiar cząstek w przypadku dyspersji oraz stosując środki
powierzchniowo czynne. W wielu przypadkach, korzystne będzie włączenie do kompozycji środków
izotonicznych, na przykład, cukrów, polialkoholi, takich jak mannitol, sorbitol lub chlorku sodu. Wydłużone
wchłanianie wstrzykiwanej kompozycji można osiągnąć dzięki włączeniu do kompozycji środka
opóźniającego wchłanianie, przykładowo, soli monostearynianu i żelatyny.
[0104] Sterylne roztwory do wstrzykiwania można przygotować poprzez wprowadzenie składnika
aktywnego w wymaganej ilości do odpowiedniego rozpuszczalnika, razem z jednym lub kombinacją
wyliczonych powyżej składników, zależnie od potrzeb, a następnie sterylizację przez mikrofiltrację.
Zasadniczo, dyspersje wytwarza się poprzez wprowadzenie składnika aktywnego do sterylnego nośnika,
zawierającego podstawowy ośrodek dyspersyjny i inne wymagane składniki, spośród wyliczonych
powyżej. W przypadku sterylnych proszków, służących do wytwarzania sterylnych roztworów do
wstrzykiwania, korzystnymi sposobami przygotowywania są suszenie próżniowe i suszenie sublimacyjne
(liofilizacja), skutkujące otrzymaniem proszku ze składnika aktywnego i każdego dodatkowego,
pożądanego składnika z ich wcześniej sterylnie odfiltrowanego roztworu.
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
28
[0105] Ilość aktywnego składnika, która może być połączona z materiałem nośnikowym, w celu
wytworzenia pojedynczej postaci dawkowania będzie różnić się, w zależności od leczonego osobnika i
szczególnego sposobu podania. Ilość aktywnego składnika, która może być połączona z materiałem
nośnikowym, w celu wytworzenia pojedynczej postaci dawkowania będzie generalnie tą ilością
kompozycji, która daje efekt terapeutyczny. Ogólnie, ze stu procent, ilość ta będzie się zawierać w
przedziale od około 0.01 procenta do około dziewięćdziesięciu dziewięciu procent składnika aktywnego,
korzystnie od około 0.1 procenta do około 70 procent, najkorzystniej od około 1 procenta do około 30
procent składnika aktywnego w kombinacji z nośnikiem dopuszczalnym farmaceutycznie.
[0106] Schematy dawkowania dostosowywane są, by zapewniać optymalną pożądaną odpowiedź (np.
odpowiedź terapeutyczną). Na przykład, można podać pojedynczy bolus, można podać kilka
podzielonych dawek w przeciągu czasu lub można proporcjonalnie zredukować lub zwiększyć dawkę,
zgodnie ze wskazaniami wymogów sytuacji terapeutycznej. Szczególnie korzystne jest formułowanie
kompozycji pozajelitowych w postaci jednostkowych dawek dla łatwości podawania i jednorodności
dawek. Stosowana tu postać jednostkowej dawki odnosi się do fizycznie odrębnych jednostek,
odpowiednich jako jednostkowe dawki dla leczonych osobników; każda jednostka zawiera z góry
określoną ilość składnika aktywnego, wyliczoną w celu uzyskania pożądanego efektu terapeutycznego, w
połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Wymagania techniczne dla postaci
jednostkowych dawek według wynalazku podyktowane są przez i bezpośrednio zależą od (a) unikalnych
cech charakterystycznych składnika aktywnego i konkretnego efektu terapeutycznego, który ma być
osiągnięty, oraz (b) ograniczeń właściwych dziedzinie wytwarzania takiego aktywnego składnika do
leczenia wrażliwości osobniczej.
[0107] Przy podawaniu przeciwciała, dawka pochodzi z zakresu od około 0,0001 do 100 mg/kg, a
częściej 0,01 do 5 mg/kg masy ciała gospodarza. Przykładowo, dawkować można 0,3 mg/kg masy ciała,
1 mg/kg masy ciała, 3 mg/kg masy ciała, 5 mg/kg masy ciała lub 10 mg/kg masy ciała lub w zakresie 1-10
mg/kg. Przykładowy schemat dawkowania wymaga podawania raz w tygodniu, raz na dwa tygodnie, raz
na trzy tygodnie, raz na cztery tygodnie, raz na miesiąc, raz na 3 miesiące lub raz na trzy do 6 miesięcy.
Korzystne sposoby dawkowania dla przeciwciała anty-PTK7 według wynalazku obejmują 1 mg/kg masy
ciała lub 3 mg/kg masy ciała przed podanie dożylne, z podawaniem przeciwciała z zastosowaniem
jednego z następujących schematów dawkowania: (i) co każde cztery tygodnie przez sześć dawek,
następnie co trzy miesiące; (ii) co trzy tygodnie; (iii) 3 mg/kg masy ciała jednorazowo, a następnie 1
mg/kg masy ciała, co trzy tygodnie.
[0108] W niektórych sposobach, jedno lub dwa przeciwciała monoklonalne o różnych swoistościach
(specyficznościach) wiązania podawane są równocześnie, i wówczas dawkowanie każdego z przeciwciał
znajduje się we wskazanym zakresie. Przeciwciało podawane jest zazwyczaj wielokrotnie. Odstępy
między poszczególnymi dawkowaniami mogą być, przykładowo, tygodniowe, miesięczne, trzymiesięczne
lub roczne. Odstępy mogą również być nieregularne, zgodnie ze wskazaniami pomiarów poziomów
przeciwciała wobec docelowego antygenu, we krwi pacjenta. W niektórych sposobach, dawkowanie jest
dopasowywane, aby uzyskać stężenie przeciwciała w surowicy na poziomie około 1-1000 μg /ml, a w
niektórych sposobach 25-300 μg /ml.
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
29
[0109] Alternatywnie, przeciwciało można podawać w postaci formulacji o długotrwałym uwalnianiu, w
przypadku której wymagane jest rzadsze dawkowanie. Dawkowanie i częstotliwość różnią się, w
zależności od czasu półtrwania przeciwciała w pacjencie. Ogólnie, ludzkie przeciwciała wykazują
najdłuższy czas półtrwania, następne są przeciwciała humanizowane, przeciwciała chimeryczne i
przeciwciała nie-ludzkie. Dawkowanie i częstość podawania mogą różnić się w zależności od tego, czy
leczenie jest profilaktyczne czy terapeutyczne. W aplikacjach profilaktycznych podawane są stosunkowo
niskie dawkowania w stosunkowo nieregularnych odstępach przez długi okres czasu. Niektórzy pacjenci
kontynuują przyjmowanie leczenia przez resztę życia. W aplikacjach terapeutycznych wymagane są
czasami stosunkowo wysokie dawkowania w stosunkowo krótkich odstępach, dopóki postęp choroby nie
zostanie zredukowany lub zakończony, a korzystnie dopóki pacjent wykazuje częściową lub całkowitą
poprawę objawów choroby. Od tego czasu pacjent może przejść na profilaktyczny sposób dawkowania.
[0110] Rzeczywiste poziomy dawkowania składników aktywnych kompozycji farmaceutycznych według
niniejszego wynalazku mogą być zróżnicowane, tak aby uzyskać ilość składnika aktywnego,
wystarczającą do osiągnięcia pożądanej odpowiedzi terapeutycznej dla konkretnego pacjenta,
kompozycji i sposobu podawania, nietoksyczną dla pacjenta. Wybrany poziom dawkowania zależeć
będzie od różnorodnych czynników farmakokinetycznych, włączając aktywność konkretnych,
zastosowanych kompozycji według wynalazku lub ich estrów, soli lub amidów, drogi podawania, czasu
podawania, stopnia wydalania konkretnego, zastosowanego składnika, czasu trwania leczenia, innych
leków, składników i/lub materiałów, zastosowanych w kombinacji z konkretnymi, zastosowanymi
kompozycjami, wieku, płci, wagi, kondycji, ogólnego zdrowia i wcześniejszej historii medycznej leczonego
pacjenta oraz podobnych czynników, dobrze znanych w stanie technik medycznych.
[0111] "Dawkowanie skuteczne terapeutycznie" (terapeutycznie skuteczna dawka) przeciwciała anty-
PTK7 według wynalazku, korzystnie skutkuje obniżeniem ostrości objawów choroby, wzrostem częstości i
długości okresów bezobjawowych choroby lub zapobieganiem osłabieniu lub niepełnej sprawności,
powodowanej dolegliwościami chorobowymi. Przykładowo, w leczeniu guzów, "dawkowanie skuteczne
terapeutycznie" korzystnie hamuje wzrost komórek lub wzrost guza o przynajmniej około 20%, korzystniej
o przynajmniej około 40%, jeszcze korzystniej o przynajmniej około 60%, a jeszcze korzystniej o
przynajmniej około 80%, w porównaniu do osobników nieleczonych. Zdolność składnika do hamowania
wzrostu guza można ocenić na podstawie zwierzęcego układu modelowego, prognostycznego względem
skuteczności w ludzkich guzach. Alternatywnie, tą właściwość kompozycji można ocenić, badając
zdolność składnika do hamowania, takim hamowaniem in vitro testami znanymi specjaliście.
Terapeutycznie skuteczna ilość składnika terapeutycznego może spowodować zmniejszenie rozmiaru
guza lub też inaczej złagodzić objawy u osobnika. Przeciętny specjalista będzie zdolny do wyznaczenia
takich ilości, w oparciu o czynniki takie jak wielkość osobnika, ostrość objawów u osobnika oraz
konkretna kompozycja lub droga podawania.
[0112] Kompozycję według niniejszego wynalazku można podawać jedną lub większą ilością dróg po-
dawania, stosując jeden lub więcej różnorodnych sposobów, znanych w stanie techniki. Znawca
zauważy, że drogi i/lub sposoby podawania będą zróżnicowane, w zależności od pożądanych rezultatów.
Korzystne drogi podawania przeciwciał według wynalazku obejmują dożylne, domięśniowe, śródskórne,
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
30
dootrzewnowe, podskórne, dordzeniowe lub inne, pozajelitowe drogi podawania, przykładowo, iniekcje
lub infuzje. Stosowany tu zwrot "podawanie pozajelitowe" oznacza sposoby podawania inne niż
podawanie dojelitowe lub miejscowe, zazwyczaj w formie iniekcji, i obejmuje, bez ograniczania, dożylne,
domięśniowe, dotętnicze, dooponowe, dotorebkowe, dooczodołowe, dosercowe, śródskórne,
dootrzewnowe, przeztchawicze, podskórne, podnaskórkowe, dostawowe, podtorebkowe,
podpajęczynówkowe, do kregosłupa, nadtwardówkowe i domostkowe iniekcje i infuzje.
[0113] Alternatywnie, przeciwciało według wynalazku można podawać drogą nie-pozajelitową, taką jak
droga podawania miejscowa, naskórkowa lub przez błony śluzowe, przykładowo, donosowo, doustnie,
dopochwowo, doodbytniczo, podjęzykowo lub miejscowo.
[0114] Związki aktywne można przygotowywać z nośnikami, które będą chroniły związek przed szybkim
uwalnianiem, takimi jak formulacje do kontrolowanego uwalniania, włącznie z implantami, plastrami
przezskórnymi i mikrokapsułkowanymi systemami podawania. Można stosować biodegradowalne,
biokompatybilne polimery, takie jak etylenu z octanem winylu, polibezwodniki, kwas poliglikolowy,
kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Wiele sposobów wytwarzania takich formulacji zostało
opatentowanych lub są one ogólnie znane specjalistom. Patrz, np. Sustained and Controlled Release
Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, wyd., Marcel Dekker, Inc., Nowy York, 1978.
[0115] Kompozycje terapeutyczne można podawać za pomocą urządzeń medycznych, znanych w stanie
techniki. Na przykład, w korzystnym przykładzie wykonania, kompozycja terapeutyczna według
wynalazku może być podawana za pomocą bezigłowego urządzenia do iniekcji podskórnych, takiego jak
urządzenia ujawnione w patentach USA nr 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880;
4,790,824; lub 4,596,556. Przykłady dobrze znanych implantów i modułów, użytecznych według
niniejszego wynalazku, obejmują: patent US nr 4,487,603, ujawniający wszczepialną pompę do mikro-
infuzji, do podawania leku w kontrolowanym tempie; patent US nr 4,486,194, ujawniający urządzenie
terapeutyczne do podawania substancji medycznych przez skórę; patent USA nr 4,447,233, ujawniający
pompę do infuzji leków, do dostarczania leków w precyzyjnych dawkach infuzji; patent USA nr 4,447,224,
ujawniający wszczepialny aparat o zmiennym przepływie do infuzji do ciągłego dostarczania leku; patent
USA nr 4,439,196, ujawniający system osmotyczny do dostarczania leków, mający wielkokomorowe
przedziały; i patent USA nr 4,475,196, ujawniający osmotyczny system dostarczania leku. Znawcom
znane są różne inne podobne implanty, systemy dostarczania i moduły.
[0116] W niektórych przykładach wykonania, ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku
można formułować tak, aby zapewnić ich prawidłową dystrybucję in vivo. Przykładowo, bariera krew-
mózg (BBB, ang. blood-brain barrier) wyklucza wiele wysoce hydrofilowych składników. Aby zapewnić
pokonanie BBB (jeśli wymagane) przez składniki terapeutyczne według wynalazku, można je formułować,
na przykład, w liposomach. Dla sposobów wytwarzania liposomów, patrz, np. patenty USA nr 4,522,811;
5,374,548; i 5,399,331. Liposomy mogą obejmować jedną lub więcej cząstek, selektywnie
transportowanych do specyficznych komórek lub organów, zwiększając tym samym ukierunkowane
dostarczanie leku (patrz, np. V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Przykładowe cząstki
kierujące obejmują kwas foliowy lub biotynę (patrz, np. patent nr US 5,416,016, dla Low et al.);
mannozydy (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); przeciwciała (P.G.
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
31
Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother.
39:180); receptor białka surfaktantowego A (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120
(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); patrz także K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS
Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
Zastosowania i sposoby według wynalazku
[0117] Przeciwciała, kompozycje przeciwciał i sposoby według wynalazku mają liczne diagnostyczne i
terapeutyczne zastosowania in vitro i in vivo, włączając diagnostykę i leczenie zaburzeń zależnych od
PTK7. Na przykład, cząsteczki te można podawać do komórek w hodowlach, in vitro lub ex vivo, lub
osobnikom ludzkim, np. in vivo, aby leczyć, zapobiegać i diagnozować różnorodne zaburzenia.
Stosowany tu termin "osobnik" ma w zamierzeniu obejmować ludzi i zwierzęta inne niż ludzie. Zwierzęta
inne niż ludzie obejmują wszystkie kręgowce, np. ssaki i nie-ssaki, takie jak naczelne inne niż ludzie,
owce, psy, koty, krowy, konie, kurczaki, płazy i gady. Korzystne osobniki obejmują ludzkich pacjentów,
mających zaburzenia zależne od aktywności PTK7. Sposoby są szczególnie odpowiednie do leczenia
ludzkich pacjentów, z zaburzeniem związanym z anormalną ekspresją PTK7. Gdy przeciwciała przeciw
PTK7 podawane są razem z innym środkiem, oba z nich można podawać w dowolnej kolejności lub
równocześnie.
[0118] Wziąwszy pod uwagę swoiste wiązanie się przeciwciał według wynalazku z PTK7, przeciwciała
według wynalazku można stosować do specyficznego wykrywania ekspresji PTK7 na powierzchni
komórek i, co więcej, stosować do oczyszczania PTK7 przez oczyszczanie z wykorzystaniem
immunopowinowactwa.
[0119] Wynalazek ponadto dostarcza sposoby wykrywania obecności antygenu ludzkiej PTK7 w próbce
lub pomiary ilości antygenu ludzkiej PTK7, obejmujące kontaktowanie próbki i próbki kontrolnej z ludzkim
przeciwciałem monoklonalnym lub jego częścią wiążącą antygen, które specyficznie wiąże się z ludzką
PTK7, w warunkach pozwalających na formowanie kompleksu między przeciwciałem lub jego częścią, a
ludzką PTK7. Następnie wykrywane jest formowanie kompleksu, przy czym różnica w formowaniu
kompleksu między próbką w porównaniu do próbki kontrolnej jest wyznacznikiem obecności antygenu
ludzkiej PTK7 w próbce.
[0120] PTK7 wyrażana jest w liniach komórkowych pochodzących od raka okrężnicy, ale nie stwierdzono
jej ekspresji w dojrzałych, ludzkich tkankach jelita grubego (Mossie et al. (1995) Oncogene 11:2179-84).
Ekspresję PTK7 obserwowano także w niektórych liniach komórkowych czerniaka i biopsjach czerniaka
(Easty, et al. (1997) Int. J. Cancer 71:1061-5). Ponadto, stwierdzono wysoką nadekspresję PTK7 w
próbkach ostrej białaczki szpikowej (Muller-Tidow et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10:1241-9).
Przeciwciało anty-PTK7 można stosować pojedynczo, w celu hamowania wzrostu guzów rakowych.
Alternatywnie, przeciwciało anty-PTK7 można stosować w połączeniu z innymi środkami
immunogennymi, standardowymi sposobami leczenia nowotworu lub innymi przeciwciałami, jak opisano
poniżej.
[0121] Korzystne nowotwory, których wzrost może być hamowany z zastosowaniem przeciwciał według
wynalazku obejmują nowotwory zasadniczo wrażliwe na immunoterapię. Nieograniczające przykłady
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
32
korzystnych nowotworów do leczenia obejmują raka okrężnicy (włączając raka jelita cienkiego), raka
płuca, raka piersi, raka trzustki, czerniaka (np. czerniaka złośliwego z przerzutami), ostrą białaczkę
szpikową, raka nerki, raka pęcherza moczowego, raka jajnika i raka prostaty. Przykłady innych raków,
które mogą być leczone z zastosowaniem sposobów według wynalazku obejmują raka nerek (np. raka
nerkowokomórkowego), glejaka, guzy mózgu, przewlekłe lub ostre białaczki w tym ostrą białaczkę
limfocytową (ALL, ang. acute lymphocytic leukemia), białaczkę T-komórkową dorosłych (T-ALL),
przewlekłą białaczkę szpikową, ostrą białaczkę limfoblastyczną, przewlekłą białaczkę limfocytową,
chłoniaki (np. chłoniak Hodgkina (ziarniczy) i nieziarniczy, chłoniak limfocytarny, pierwotny chłoniak
centralnego układu nerwowego, chłoniak z komórek-T, chłoniak Burkitta, chłoniaki anaplastyczne z
dużych komórek (ALCL, ang. anaplastic large-cell lymphoma), skórne chłoniaki T-komórkowe, chłoniaki z
małych komórek z wpuklonym jądrem komórkowym, chłoniaki z obwodowych komórek T, chłoniaki
Lennerta (limfoepitelialne), chłoniaki immunoblastyczne, chłoniaki/białaczki T-komórkowe (ATLL),
chłoniaki grudkowe centroblastyczne-centrocytarne (cb/cc), chłoniaki rozlane z dużych komórek B, typ
angioimmunoblastycznych chłoniaków T-komórkowych (typu AILD, ang. angioimmunoblastic
lymphadenopathy) oraz chłoniaki rozwijające się w jamach ciała związane z HIV), raki zarodkowe,
niezróżnicowane raki nosa i gardła (np. guz Schminckego), chorobę Castlemana, mięsaka Kaposiego,
szpiczaka mnogiego, makroglobulinemię Waldenströma i inne chłoniaki B-komórkowe, raki jamy nosowo-
gardłowej, raka kości, raka skóry, raka głowy i szyi, złośliwego czerniaka skórnego lub śródocznego, raka
macicy, raka odbytnicy, raka odbytu, raka żołądka, raka jąder, raka macicy, raka jajowodów, raka
endometrium, raka szyjki macicy, raka pochwy, raka sromu, raka przełyku, raka jelita cienkiego, raka
układu hormonalnego, raka tarczycy, raka przytarczyc, raka nadnercza, mięsaka tkanek miękkich, raka
cewki moczowej, raka prącia, guzy lite wieku dziecięcego, raka pęcherza moczowego, raka nerki lub
moczowodu, raka miedniczki nerwowej, nowotwory ośrodkowego układu nerwowego (OUN),
angiogenezę nowotworową, guzy rdzenia kręgowego, glejaka pnia mózgu, gruczolaka przysadki, raka
naskórkowego, raka płaskonabłonkowego, nowotwory indukowane środowiskowo włączając indukowane
przez azbest, np. międzybłoniaka oraz kombinacje wymienionych nowotworów.
[0122] Ponadto, biorąc pod uwagę ekspresję PTK7 na różnych komórkach guza, przeciwciała ludzkie,
kompozycje przeciwciał i sposoby według niniejszego wynalazku można stosować do leczenia osobnika z
chorobą rakotwórczą, np. chorobą, charakteryzującą się obecnością komórek guza, wyrażających PTK7,
włączając, na przykład, raka okrężnicy (włączając raka jelita cienkiego), czerniaka (np. czerniaka
złośliwego z przerzutami), ostrą białaczkę szpikową, raka płuca, raka piersi, raka pęcherza moczowego,
raka trzustki, raka jajnika i raka prostaty. Przykłady innych osobników z chorobą rakotwórczą obejmują
osobniki mające raka nerek (np. raka nerkowokomórkowego), glejaka, guzy mózgu, przewlekłe lub ostre
białaczki w tym ostrą białaczkę limfocytową (ALL, ang. acute lymphocytic leukemia), białaczkę T-
komórkową dorosłych (T-ALL), przewlekłą białaczkę szpikową, ostrą białaczkę limfoblastyczną,
przewlekłą białaczkę limfocytową, chłoniaki (np. chłoniak Hodgkina (ziarniczy) i nieziarniczy, chłoniak
limfocytarny, pierwotny chłoniak centralnego układu nerwowego, chłoniak z komórek-T, chłoniak Burkitta,
chłoniaki anaplastyczne z dużych komórek (ALCL, ang. anaplastic large-cell lymphoma), skórne chłoniaki
T-komórkowe, chłoniaki z małych komórek z wpuklonym jądrem komórkowym, chłoniaki z obwodowych
komórek T, chłoniaki Lennerta (limfoepitelialne), chłoniaki immunoblastyczne, chłoniaki/białaczki T-
komórkowe (ATLL), chłoniaki grudkowe centroblastyczne-centrocytarne (cb/cc), chłoniaki rozlane z
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
33
dużych komórek B, typ angioimmunoblastycznych chłoniaków T-komórkowych (typu AILD, ang.
angioimmunoblastic lymphadenopathy) oraz chłoniaki rozwijające się w jamach ciała związane z HIV),
raki zarodkowe, niezróżnicowane raki nosa i gardła (np. guz Schminckego), chorobę Castlemana,
mięsaka Kaposiego, szpiczaka mnogiego, makroglobulinemię Waldenströma i inne chłoniaki B-
komórkowe, raki jamy nosowo-gardłowej, raka kości, raka skóry, raka głowy i szyi, złośliwego czerniaka
skórnego lub śródocznego, raka macicy, raka odbytnicy, raka odbytu, raka żołądka, raka jąder, raka
macicy, raka jajowodów, raka endometrium, raka szyjki macicy, raka pochwy, raka sromu, raka przełyku,
raka jelita cienkiego, raka układu hormonalnego, raka tarczycy, raka przytarczyc, raka nadnercza,
mięsaka tkanek miękkich, raka cewki moczowej, raka prącia, guzy lite wieku dziecięcego, raka pęcherza
moczowego, raka nerki lub moczowodu, raka miedniczki nerwowej, nowotwory ośrodkowego układu
nerwowego (OUN), angiogenezę nowotworową, guzy rdzenia kręgowego, glejaka pnia mózgu,
gruczolaka przysadki, raka naskórkowego, raka płaskonabłonkowego, nowotwory indukowane
środowiskowo włączając indukowane przez azbest, np. międzybłoniaka oraz kombinacje wymienionych
nowotworów.
[0123] Odpowiednio, w jednym z przykładów wykonania, wynalazek dostarcza przeciwciała lub części
wiążącej antygen według wynalazku do zastosowania w sposobie hamowania wzrostu komórek guza u
osobnika, a wspomniany sposób obejmuje podawanie osobnikowi terapeutycznie skutecznej ilości
wspomnianego przeciwciała lub części wiążącej antygen.
[0124] Przeciwciała (np. ludzkie przeciwciała monoklonalne i kompozycje) według wynalazku można
stosować do wykrywania poziomów PTK7 lub poziomów komórek, zawierających PTK7 na powierzchni
błony, które to poziomy można następnie powiązać z pewnymi objawami choroby. Alternatywnie, można
stosować przeciwciała do hamowania lub blokowania funkcji PTK7, które z kolei można powiązać z
zapobieganiem lub łagodzeniem pewnych objawów choroby, wskazując w ten sposób, że PTK7
pośredniczy w chorobie. Można to osiągnąć, kontaktując próbkę eksperymentalną i próbkę kontrolną z
przeciwciałem anty-PTK7 w warunkach pozwalających na formowanie kompleksu między przeciwciałem,
a PTK7. Dowolne kompleksy, uformowane między przeciwciałem, a PTK7 są wykrywane i porównywane
w próbce eksperymentalnej i kontroli.
[0125] Przeciwciała (np. ludzkie przeciwciała i kompozycje) według wynalazku można początkowo
testować pod kątem aktywności wiązania, powiązanej z terapeutycznym lub diagnostycznym
stosowaniem in vitro. Na przykład, kompozycje według wynalazku można testować, stosując badania
cytometrii przepływowej, opisane w Przykładach poniżej.
[0126] Przeciwciała (np. ludzkie przeciwciała, immunokoniugaty i kompozycje) według wynalazku, mogą
mieć dodatkowe zastosowanie w terapii i diagnostyce chorób powiązanych z PTK7. Na przykład, ludzkie
przeciwciała monoklonalne, i immunokoniugaty można stosować, aby wywołać in vivo lub in vitro jedną
lub więcej z następujących, biologicznych aktywności: hamowanie wzrostu i/lub zabijanie komórki
wyrażającej PTK7; pośredniczenie w fagocytozie lub ADCC (cytotoksyczności komórkowej zależnej od
przeciwciał, ang. Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity) komórki wyrażającej PTK7 w obecności ludzkich
komórek efektorowych; lub blokowanie wiązania liganda PTK7 do PTK7.
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
34
[0127] Przeciwciała (np. ludzkie przeciwciała i kompozycje) mogą być stosowane in vivo do leczenia,
zapobiegania lub diagnozowania różnorodnych chorób powiązanych z PTK7. Przykłady chorób
powiązanych z PTK7 obejmują, między innymi, raka okrężnicy (włączając raka jelita cienkiego), czerniaka
(np. czerniaka złośliwego z przerzutami), ostrą białaczkę szpikową, raka płuca, raka piersi, raka pęcherza
moczowego, raka trzustki, raka jajnika i raka prostaty.
[0128] Odpowiednie drogi podawania in vivo i in vitro kompozycji przeciwciał (np. ludzkich przeciwciał
monoklonalnych i immunokoniugatów) według wynalazku są dobrze znane w stanie techniki i mogą
zostać wybrane przez specjalistów. Przykładowo, kompozycje przeciwciał mogą być podawane przez
iniekcję (np. dożylną lub podskórną). Odpowiednie dawkowania stosowanych cząsteczek będą zależały
od wieku i masy osobnika oraz stężenia i/lub formulacji kompozycji przeciwciał.
[0129] Jak opisano wcześniej, ludzkie przeciwciała anty-PTK7 według wynalazku można podawać razem
z jednym lub więcej środków terapeutycznych, np. środkiem cytotoksycznym, środkiem radiotoksycznym
lub środkiem immunosupresyjnym. Przeciwciało można połączyć z środkiem (w immunokompleks) lub
można podawać oddzielnie od środka. W tym ostatnim przypadku (osobne podawanie) przeciwciało
może być podawane przed, po lub równocześnie z środkiem lub może być podawane razem z innymi,
znanymi terapiami, np. terapią anty-nowotworową, np. promieniowaniem. Takie środki terapeutyczne
obejmują, między innymi, środki przeciwnowotworowe, takie jak doksorubicyna (adriamycyna), cispla-
tyna, siarczan bleomycyny, karmustyna, chlorambucyl i hydroksymocznik cyklofosfamidu, które same z
siebie są efektywne tylko na poziomach toksycznych lub podtoksycznych dla pacjenta. Cisplatynę podaje
się dożylnie 100 mg/ dawkadawkach, raz na cztery tygodnie, a adriamycynę podaje się dożylnie w
dawkach 60-75 mg/ml, raz na 21 dni. Łączne podawanie ludzkich przeciwciał anty-PTK7, lub ich
fragmentów wiążących antygen, według niniejszego wynalazku, z środkami chemioterapeutycznymi,
zapewnia dwa środki antynowotworowe, działające według różnych mechanizmów, dla ludzkich komórek
guza skutkujące efektem cytotoksycznym Takie podawanie łączne może rozwiązać problemy,
spowodowane rozwijaniem oporności na leki lub zmianą antygenności komórek guza, co czyniłoby je
niereagującymi z przeciwciałem.
[0130] W jednym z przykładów wykonania, immunokoniugaty według wynalazku można stosować do
kierowania składników (np. środków terapeutycznych, znaczników, cytotoksyn, radiotoksyn
immunosupresantów itd.) do komórek, mających receptory powierzchniowe dla PTK7, poprzez
przyłączanie takich składników do przeciwciała. Przykładowo, przeciwciało anty-PTK7 można przyłączyć
do dowolnego ze składników toksycznych, opisanych w patentach USA nr 6,281,354 i 6,548,530,
publikacjach patentowych nr US 20030050331, 20030064984, 20030073852 i 20040087497 lub
opublikowanych w WO 03/022806. A zatem, wynalazek zapewnia także sposoby lokalizowania ex vivo
lub in vivo komórek, wyrażających PTK7 (np. z wykrywalnym znacznikiem, takim jak radioizotop, składnik
fluorescencyjny, enzym lub kofaktor enzymu). Alternatywnie, immunokoniugaty można stosować do
zabijania komórek, mających receptory powierzchniowe dla PTK7, poprzez kierowanie cytotoksyn lub
radiotoksyn do PTK7.
[0131] Komórki efektorowe, swoiste względem celu; np. komórki efektorowe, połączone z kompozycjami
(np. ludzkimi przeciwciałami, wielospecyficznymi i dwuspecyficznymi cząsteczkami) według wynalazku,
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
35
również można stosować jako środki terapeutyczne. Komórkami efektorowymi do nakierowywania mogą
być ludzkie leukocyty, takie jak makrofagi, neutrofile lub monocyty. Inne komórki obejmują eozynofile,
komórki NK i inne komórki, mające receptory dla IgG lub IgA. W razie potrzeby, komórki efektorowe
można uzyskać od leczonego osobnika. Komórki efektorowe, swoiste względem celu, można podawać
jako zawiesinę komórek w roztworze dopuszczalnym fizjologicznie. Ilość podawanych komórek może być
rzędu 108-10
9, ale będzie różnić się w zależności od celu terapeutycznego. Zasadniczo, ilość będzie
wystarczająca do umiejscowienia na docelowej komórce, np. na komórce guza, wyrażającej PTK7 i do
uskutecznienia zabijania komórki przez, np. fagozytozę. Drogi podawania mogą również być różne.
[0132] Terapię z komórkami efektorowymi, swoistymi wobec celu, można przeprowadzać w połączeniu z
innymi technikami usuwania docelowych komórek. Na przykład, terapia anty-nowotworowa, stosująca
kompozycje (np. ludzkich przeciwciał) według wynalazku i/lub komórki efektorowe, wyposażone w te
kompozycje, może być stosowana w połączeniu z chemioterapią. Dodatkowo, można stosować
kombinowaną immunoterapię, aby skierować dwie odrębne populacje cytotoksycznych efektorów w celu
eliminacji komórki guza. Przykładowo, przeciwciała anty-PTK7, połączone z anty-Fc-gamma RI lub anty-
CD3 można stosować w połączeniu z środkiem swoiście wiążącym receptor IgG lub IgA.
[0133] Kompozycje (np. ludzkich przeciwciał i immunokoniugatów) według wynalazku, mające miejsca
wiązania dopełniacza, takie jak części z IgG1, -2 lub -3 lub IgM, wiążące dopełniacz, mogą być również
stosowane w obecności dopełniacza. W jednym z przykładów wykonania, leczenie ex vivo populacji
komórek, zawierających komórki docelowe, środkiem wiążącym według wynalazku i odpowiednimi
komórkami efektorowymi, może być uzupełniane dodatkiem dopełniacza lub surowicy, zawierającej
dopełniacz. Fagocytoza komórek docelowych, pokrytych środkiem wiążącym według wynalazku, może
być usprawniona przez wiązanie białek dopełniacza. W innym przykładzie wykonania, komórki docelowe,
pokryte kompozycjami (np. ludzkimi przeciwciałami) według wynalazku mogą być również lizowane przez
dopełniacz. W jeszcze innym przykładzie wykonania, kompozycje według wynalazku nie aktywują
dopełniacza.
[0134] Kompozycje (np. ludzkich przeciwciał i immunokoniugatów) według wynalazku, można również
podawać razem z dopełniaczem. Odpowiednio, w zakresie wynalazku są kompozycje, obejmujące
ludzkie przeciwciała i surowicę lub dopełniacz. Kompozycje te są korzystne w związku z tym, że
dopełniacz zlokalizowany jest w bliskim sąsiedztwie ludzkich przeciwciał. Alternatywnie, ludzkie
przeciwciała według wynalazku i dopełniacz lub surowicę można podawać oddzielnie.
[0135] Odpowiednio, pacjentom, leczonym kompozycjami przeciwciał według wynalazku, można
dodatkowo podawać (wcześniej, równocześnie lub po podaniu ludzkiego przeciwciała według wynalazku)
inny środek terapeutyczny, taki jak środek cytotoksyczny lub radiotoksyczny, wzmacniający lub
zwiększający terapeutyczny efekt ludzkich przeciwciał.
[0136] W innych przykładach wykonania, osobnik może być dodatkowo leczony środkiem modulującym,
np. wzmacniającym lub hamującym ekspresję lub aktywność Fcγ lub receptorów Fcγ przez, na przykład,
leczenie osobnika cytokiną. Korzystne cytokiny do podawania podczas leczenia wielospecyficzną
cząsteczką obejmują czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), czynnik stymulujący
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
36
tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), interferon-γ (IFN-y) i czynnik martwicy guza
(TNF).
[0137] Kompozycje (np. ludzkie przeciwciała) według wynalazku można również stosować do celowania
w komórki wyrażające FcγR lub PTK7, przykładowo, do znakowania takich komórek. Do takiego
zastosowania, środek wiążący można połączyć z wykrywalną cząsteczką. A zatem, ujawnienie zapewnia
sposoby lokalizowania ex vivo lub in vitro komórek, wyrażających receptory Fc, takie jak FcγR lub PTK7.
Wykrywalnym znacznikiem może być, np. radioizotop, składnik fluorescencyjny, enzym lub kofaktor
enzymu.
[0138] W zakresie niniejszego wynalazku znajdują się również zestawy, obejmujące kompozycje
przeciwciał według wynalazku (np. ludzkie przeciwciała lub immunokoniugaty) oraz instrukcje do
stosowania. Zestaw może dodatkowo zawierać jeden lub więcej dodatkowych reagentów, takich jak
reagent immunosupresyjny, środek cytotoksyczny lub środek radiotoksyczny lub jedno lub więcej
dodatkowych ludzkich przeciwciał według wynalazku (np. ludzkie przeciwciało mające aktywność
komplementarną, wiążące się z epitopem na antygenie PTK7, odmiennym od pierwszego ludzkiego
przeciwciała). Zestawy zawierają zazwyczaj etykietę, wskazującą na zamierzone zastosowanie
zawartości zestawu. Termin etykieta obejmuje jakikolwiek pisany lub nagrany materiał, dostarczany na
lub z zestawem lub w inny sposób towarzyszący zestawowi.
[0139] Niniejszy wynalazek jest dalej zilustrowany następującymi przykładami, które nie powinny być
interpretowane jako dalej ograniczające.
Przykłady
Przykład 1: Wytworzenie ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciwko PTK7
Antygen
[0140] Protokoły immunizacji jako antygen stosowały zarówno (i) rekombinowane białko fuzyjne
obejmujące zewnątrzkomórkową część PTK7 z tagiem zarówno myc jak i his oraz (ii) powiązaną z błoną
PTK7 pełnej długości. Oba antygeny wytworzono metodami transfekcji rekombinantów w linii komórkowej
CHO.
Transgeniczne myszy HuMab i KM miceTM
[0141] W pełni ludzkie przeciwciała przeciw PTK7 przygotowano, stosując szczepy HCo7 i HCo12,
transgenicznych myszy HuMab i szczep KM myszy transgenicznych transchromosomalnych, z których
każdy wyraża geny ludzkiego przeciwciała. W każdym z tych mysich szczepów endogenny gen łańcucha
lekkiego kappa został homozygotycznie przerwany, jak opisano w Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-
820, a endogenny mysi gen łańcucha ciężkiego został homozygotycznie przerwany, jak opisano w Przy-
kładzie 1 publikacji PCT WO 01/09187. Każdy z tych mysich szczepów zawiera ludzki transgen łańcucha
lekkiego kappa, KCo5, jak opisano w Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. Szczep
HCo7 zawiera transgen HCo7 ludzkiego łańcucha ciężkiego, jak opisano w patentach USA nr 5,770,429;
5,545,806; 5,625,825; i 5,545,807. Szczep HCo12 zawiera transgen HCo12 ludzkiego łańcucha
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
37
ciężkiego, jak opisano w Przykładzie 2 WO 01/09187 lub przykładzie 2 WO 01/14424. Szczepy
HCo7+HCo12 zawierają oba transgeny łańcucha ciężkiego, HCo7 i HCo12. Szczep KM zawiera
transchromosom SC20, jak opisano w publikacji PCT WO 02/43478.
Immunizacje HuMab i KM:
[0142] Aby wytworzyć w pełni ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciw PTK7, myszy HuMab i KM
miceTM
immunizowano oczyszczonym rekombinowanym białkiem fuzyjnym PTK7 oraz komórkami CHO
transfekowanymi PTK7 jako antygenem. Ogólne schematy immunizacji dla myszy HuMab opisano w
Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:
845-851 i publikacji PCT WO 98/24884. Myszy były w wieku 6-16 tygodni przy pierwszym podaniu
antygenu. Antygen oczyszczonego rekombinowanego preparatu (5-50 µg) białka fuzyjnego PTK7 i 5 –
106 komórek zastosowano do immunizacji myszy HuMab i KM mice
TM dootrzewnowo, podskórnie (Sc,
ang. subcutaneously) lub przez wstrzykiwanie do opuszki łapy.
[0143] Transgeniczne myszy dwukrotnie immunizowano IP (dootrzewnowo) antygenem w kompletnym
adiuwancie Freunda lub adiuwancie Ribi. a następnie 3-21 dni IP (dootrzewnowo) (do łącznie 11
immunizacji) antygenem w niekompletnym adiuwancie Freunda lub adiuwancie Ribi. Odpowiedź
immunologiczną monitorowano skrwawieniami pozagałkowymi. Osocze sprawdzano testem ELISA (jak
opisano poniżej), a do fuzji zastosowano myszy z wystarczającymi mianami ludzkiej immunoglobuliny
anty-PTK7. Myszy stymulowano dożylnie antygenem 3 dni przed uśmierceniem i usunięciem śledziony.
Zazwyczaj wykonywano 10-35 fuzji dla każdego antygenu. Dla każdego antygenu immunizowano kilka
tuzinów myszy.
Selekcja myszy HuMab lub KM MiceTM
wytwarzających przeciwciała anty-PTK7:
[0144] W celu wyselekcjonowania myszy HuMab lub KM miceTM
wytwarzających przeciwciała wiążące
się z PTK7, surowice od immunizowanych myszy sprawdzano testem ELISA jak opisano w Fishwild, D. et
al. (1996). W skrócie, płytki mikrotitracyjne opłaszczono oczyszczonym rekombinowanym białkiem
fuzyjnym PTK7 z transfekowanych komórek CHO przy 1-2 µg/ml w PBS, 100 µl/studzienkę, inkubowano
w 4 °C przez noc, następnie blokowano 200 µl/studzienkę 5% płodowej surowicy bydlęcej w PBS/Tween
(0,05%). Do każdej studzienki dodawano rozcieńczenia surowicy z myszy immunizowanych PTK7, a
następnie inkubowano przez 1-2 godzin w temperaturze otoczenia. Płytki płukano PBS/Tween, a potem
inkubowano z kozim przeciwciałem poliklonalnym anty-ludzkie IgG sprzężonym z peroksydazą
chrzanową (HRP, ang. horseradish peroxidase) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po płukaniu,
płytki wywoływano substratem ABTS (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml) i analizowano spektrofotometrem przy
OD 415-495. Do infuzji stosowano myszy, które osiągnęły najwyższe miana przeciwciał anty-PTK7.
Infuzje wykonywano tak jak opisano poniżej, a supernatanty hybrydom sprawdzano pod kątem
aktywności anty-PTK7 testem ELISA.
Wytworzenie hybrydom wytwarzających ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciw PTK7:
[0145] Mysie splenocyty, wyizolowane z myszy HuMab, poddawano fuzji z użyciem PEG z linią
komórkową mysiego szpiczaka, w oparciu o standardowe procedury. Powstające hybrydomy
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
38
przeszukiwano następnie pod kątem wytwarzania przeciwciał swoistych dla antygenu. Zawiesiny
pojedynczych komórek splenocytów z immunizowanych myszy poddawano fuzji z jedną czwartą liczby
komórek niewydzielniczego szpiczaka SP2/0 (ATCC, CRL 1581) z 50% PEG (Sigma). Komórki
wysiewano przy około 1x105/studzienkę na płaskodenną płytkę mikrotitracyjną, a następnie inkubowano
przez około dwa tygodnie w pożywce selekcyjnej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 10%
pożywki kondycjonowanej P388D1 (ATCC, CRL TIB-63), 3-5% origen (IGEN) w DMEM (Mediatech, CRL
10013, z wysoką zawartością glukozy, L-glutaminą i pirogronianem sodu) z dodatkiem 5 MM HEPES,
0,055 mM 2-merkaptoetanolu, 50 mg/ml gentamycyny i 1x HAT (Sigma, CRL P-7185). Po 1-2 tygodniach,
komórki hodowano w pożywce, w której HAT zastąpiono HT. Poszczególne studzienki sprawdzono
następnie testem ELISA (opisanym powyżej) pod kątem ludzkich monoklonalnych przeciwciał IgG anty-
PTK7. Kiedy wystąpił znaczny wzrost hybrydomy, pożywkę monitorowano, zazwyczaj po 10-14 dniach.
Hybrydomy wydzielające przeciwciało były przesiewane, ponownie sprawdzane, i jeżeli nadal dawały
wynik pozytywny dla ludzkich monoklonalnych przeciwciał IgG anty-PTK7, były subklonowane co
najmniej dwa razy przez ograniczające rozcieńczenia. Stabilne subklony były wówczas hodowane in vitro
do wytworzenia małych ilości przeciwciał w pożywce hodowli tkankowej w celu dalszej charakteryzacji.
[0146] Do dalszej analizy wyselekcjonowano klony hybrydom 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8.
Przykład 2: Charakterystyka strukturalna ludzkich przeciwciła monoklonalnych 3G8, 3G8a, 4D5,
12C6, 12C6a i 7C8
[0147] Sekwencje cDNA kodujące regiony zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich z przeciwciał
monoklonalnych 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 uzyskano z hybrydom, odpowiednio, 3G8, 3G8a,
4D5, 12C6, 12C6a i 7C8, z zastosowaniem standardowych technik PCR i sekwencjonowano z
zastosowaniem standardowych technik sekwencjonowania DNA.
[0148] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego z 3G8 są
przedstawione na Figurze 1A i odpowiednio w SEKW NR ID: 41 i 1.
[0149] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego z 3G8 są
przedstawione na Figurze 1B i odpowiednio w SEKW NR ID: 45 i 5.
[0150] Porównanie sekwencji łańcucha ciężkiego immunoglobuliny 3G8 ze znanymi ludzkimi
germinalnymi sekwencjami łańcuchów ciężkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch ciężki 3G8 zawiera
segment VH z ludzkiego germinalnego VH 3-30.3, nieustalony segment D i segment JH z ludzkiego
germinalnego JH 4b. Dopasowanie sekwencji VH 3G8 do sekwencji germinalnego VH 3-30.3
przedstawiono na Figurze 5. Dalsza analiza sekwencji VH 3G8 z zastosowaniem systemu Kabata do
określania regionów CDR doprowadziła do wytyczenia regionów CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha
ciężkiego, jak przedstawiono na Figurach 1A i 5 oraz odpowiednio w SEKW NR ID: 11, 15 i 19.
[0151] Porównanie sekwencji łańcucha lekkiego immunoglobuliny 3G8 ze znanymi ludzkimi germinalnymi
sekwencjami łańcuchów lekkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch lekki 3G8 zawiera segment VL z
ludzkiego germinalnego VK L15 i segment JK z ludzkiego germinalnego JK 1. Dopasowanie sekwencji
VL 3G8 do sekwencji germinalnego VK L15 przedstawiono na Figurze 9. Dalsza analiza sekwencji VL
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
39
3G8 z zastosowaniem systemu Kabata do określania regionów CDR doprowadziła do wytyczenia
regionów CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego, jak przedstawiono na Figurach 1B i 9 oraz
odpowiednio w SEKW NR ID: 23, 29 i 35.
[0152] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego z 3G8a są
przedstawione na Figurze 1A i odpowiednio w SEKW NR ID: 41 i 1.
[0153] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego z 3G8a są
przedstawione na Figurze 1C i odpowiednio w SEKW NR ID: 46 i 6.
[0154] Porównanie sekwencji łańcucha ciężkiego immunoglobuliny 3G8a ze znanym i ludzkimi
germinalnymi sekwencjami łańcuchów ciężkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch ciężki 3G8a
zawiera segment VH z ludzkiego germinalnego VH 3-30.3, nieustalony segment D i segment JH z
ludzkiego germinalnego JH 4b. Dopasowanie sekwencji VH 3G8a do sekwencji germinalnego VH 3-30.3
przedstawiono na Figurze 5. Dalsza analiza sekwencji VH 3G8a z zastosowaniem systemu Kabata do
określania regionów CDR doprowadziła do wytyczenia regionów CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha
ciężkiego, jak przedstawiono na Figurach 1A i 5 oraz odpowiednio w SEKW NR ID: 11, 15 i 19.
[0155] Porównanie sekwencji łańcucha lekkiego immunoglobuliny 3G8a ze znanymi ludzkimi
germinalnymi sekwencjami łańcuchów lekkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch lekki 3G8a zawiera
segment VL z ludzkiego germinalnego VK L15 i segment JK z ludzkiego germinalnego JK 3.
Dopasowanie sekwencji VL 3G8a do sekwencji germinalnego VK L15 przedstawiono na Figurze 9.
Dalsza analiza sekwencji VL 3G8a z zastosowaniem systemu Kabata do określania regionów CDR
doprowadziła do wytyczenia regionów CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego, jak przedstawiono na
Figurach 1C i 9 oraz odpowiednio w SEKW NR ID: 24, 30 i 36.
[0156] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego z 4D5 są
przedstawione na Figurze 2A i odpowiednio w SEKW NR ID: 42 i 2.
[0157] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego z 4D5 są
przedstawione na Figurze 2B i odpowiednio w SEKW NR ID: 47 i 7.
[0158] Porównanie sekwencji łańcucha ciężkiego immunoglobuliny 4D5 ze znanymi ludzkimi
germinalnymi sekwencjami łańcuchów ciężkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch ciężki 4D5 zawiera
segment VH z ludzkiego germinalnego VH 3-30.3, nieustalony segment D i segment JH z ludzkiego
germinalnego JH 4b. Dopasowanie sekwencji VH 4D5 do sekwencji germinalnego VH 3-30.3
przedstawiono na Figurze 6. Dalsza analiza sekwencji VH 4D5 z zastosowaniem systemu Kabata do
określania regionów CDR doprowadziła do wytyczenia regionów CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha
ciężkiego, jak przedstawiono na Figurach 2A i 6 oraz odpowiednio w SEKW NR ID: 12, 16 i 20.
[0159] Porównanie sekwencji łańcucha lekkiego immunoglobuliny 4D5 ze znanymi ludzkimi germinalnymi
sekwencjami łańcuchów lekkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch lekki 4D5 zawiera segment VL z
ludzkiego germinalnego VK A10 i segment JK z ludzkiego germinalnego JK 5. Dopasowanie sekwencji
VL 4D5 do sekwencji germinalnego VK A10 przedstawiono na Figurze 10. Dalsza analiza sekwencji VL
4D5 z zastosowaniem systemu Kabata do określania regionów CDR doprowadziła do wytyczenia
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
40
regionów CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego, jak przedstawiono na Figurach 2B i 10 oraz
odpowiednio w SEKW NR ID: 25, 31 i 37.
[0160] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego z 12C6 są
przedstawione na Figurze 3A i odpowiednio w SEKW NR ID: 43 i 3.
[0161] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego z 12C6 są
przedstawione na Figurze 3B i odpowiednio w SEKW NR ID: 48 i 8.
[0162] Porównanie sekwencji łańcucha ciężkiego immunoglobuliny 12C6 ze znanymi ludzkimi
germinalnymi sekwencjami łańcuchów ciężkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch ciężki 12C6
zawiera segment VH z ludzkiego germinalnego VH DP44, nieustalony segment D i segment JH z
ludzkiego germinalnego JH 4b. Dopasowanie sekwencji VH 12C6 do sekwencji germinalnego VH DP44
przedstawiono na Figurze 7. Dalsza analiza sekwencji VH 12C6 z zastosowaniem systemu Kabata do
określania regionów CDR doprowadziła do wytyczenia regionów CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha
ciężkiego, jak przedstawiono na Figurach 3A i 7 oraz odpowiednio w SEKW NR ID: 13, 17 i 21.
[0163] Porównanie sekwencji łańcucha lekkiego immunoglobuliny 12C6 ze znanymi ludzkimi
germinalnymi sekwencjami łańcuchów lekkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch lekki 12C6 zawiera
segment VL z ludzkiego germinalnego VK A27 i segment JK z ludzkiego germinalnego JK 2.
Dopasowanie sekwencji VL 12C6 do sekwencji germinalnego VK A27 przedstawiono na Figurze 11.
Dalsza analiza sekwencji VL 12C6 z zastosowaniem systemu Kabata do określania regionów CDR
doprowadziła do wytyczenia regionów CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego, jak przedstawiono na
Figurach 3B i 11 oraz odpowiednio w SEKW NR ID: 26, 32 i 38.
[0164] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego z 12C6a są
przedstawione na Figurze 3A i odpowiednio w SEKW NR ID: 43 i 3.
[0165] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego z 12C6a są
przedstawione na Figurze 3C i odpowiednio w SEKW NR ID: 49 i 9.
[0166] Porównanie sekwencji łańcucha ciężkiego immunoglobuliny 12C6a ze znanymi ludzkimi
germinalnymi sekwencjami łańcuchów ciężkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch ciężki 12C6a
zawiera segment VH z ludzkiego germinalnego VH DP44, nieustalony segment D i segment JH z
ludzkiego germinalnego JH 4b. Dopasowanie sekwencji VH 12C6a do sekwencji germinalnego VH DP44
przedstawiono na Figurze 7. Dalsza analiza sekwencji VH 12C6a z zastosowaniem systemu Kabata do
określania regionów CDR doprowadziła do wytyczenia regionów CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha
ciężkiego, jak przedstawiono na Figurach 3A i 7 oraz odpowiednio w SEKW NR ID: 13, 17 i 21.
[0167] Porównanie sekwencji łańcucha lekkiego immunoglobuliny 12C6a ze znanymi ludzkimi
germinalnymi sekwencjami łańcuchów lekkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch lekki 12C6a zawiera
segment VL z ludzkiego germinalnego VK L15 i segment JK z ludzkiego germinalnego JK 2.
Dopasowanie sekwencji VL 12C6a do sekwencji germinalnego VK L15 przedstawiono na Figurze 12.
Dalsza analiza sekwencji VL 12C6a z zastosowaniem systemu Kabata do określania regionów CDR
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
41
doprowadziła do wytyczenia regionów CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego, jak przedstawiono na
Figurach 3C i 12 oraz odpowiednio w SEKW NR ID: 27, 33 i 39.
[0168] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego z 7C8 są
przedstawione na Figurze 4A i odpowiednio w SEKW NR ID: 44 i 4.
[0169] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego z 7C8 są
przedstawione na Figurze 4B i odpowiednio w SEKW NR ID: 50 i 10.
[0170] Porównanie sekwencji łańcucha ciężkiego immunoglobuliny 7C8 ze znanymi ludzkimi
germinalnymi sekwencjami łańcuchów ciężkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch ciężki 7C8 zawiera
segment VH z ludzkiego germinalnego VH 3-33, segment D z ludzkiego zarodkowego 3-10 i segment JH
z ludzkiego germinalnego JH 6b. Dopasowanie sekwencji VH 7C8 do sekwencji germinalnego VH 3-33
przedstawiono na Figurze 8. Dalsza analiza sekwencji VH 7C8 z zastosowaniem systemu Kabata do
określania regionów CDR doprowadziła do wytyczenia regionów CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha
ciężkiego, jak przedstawiono na Figurach 4A i 8 oraz odpowiednio w SEKW NR ID: 14, 18 i 22.
[0171] Porównanie sekwencji łańcucha lekkiego immunoglobuliny 7C8 ze znanymi ludzkimi germinalnym i
sekwencjami łańcuchów lekkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch lekki 7C8 zawiera segment VL z
ludzkiego germinalnego VK L6 i segment JK z ludzkiego germinalnego JK 3. Dopasowanie sekwencji VL
7C8 do sekwencji germinalnego VK L6 przedstawiono na Figurze 13. Dalsza analiza sekwencji VL 7C8 z
zastosowaniem systemu Kabata do określania regionów CDR doprowadziła do wytyczenia regionów
CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego, jak przedstawiono na Figurach 4B i 13 oraz odpowiednio w
SEKW NR ID: 28, 34 i 40.
Przykład 3: Mutacja mAb 12C6 i zastosowanie alternatywnej linii zarodkowej (germinalnej)
[0172] Jak opisano w Przykładzie 2 powyżej, przeciwciała monoklonalne 12C6 i 12C6a zawierają region
zmienny łańcucha ciężkiego pochodzący od ludzkiej sekwencji germinalnej DP-44 obecnej w transgenie
HCo7 szczepu myszy HuMab Mouse®. Ponieważ DP-44 nie jest sekwencją germinalną stosowaną w
repertuarze natywnych ludzkich immunoglobulin, korzystne może być zmutowanie sekwencji VH z 12C6 i
12C6a w celu obniżenia potencjalnej immunogenności. Korzystnie, jedna lub więcej reszt zrębowych z
sekwencji VH 12C6 i 12C6a jest mutowanych do reszt obecnych w sekwencji zrębowej germinalnej
sekwencji VH powiązanej strukturalnie, stosowanej w repertuarze natywnych ludzkich immunoglobulin.
Na przykład, Figura 7 przedstawia dopasowanie sekwencji VH z 12C6 i 12C6a do sekwencji germinalnej
DP44, jak również do dwóch ludzkich sekwencji germinalnych powiązanych strukturalnie, VH 3-23 i VH 3-
7. Z uwagi na powiązanie tych sekwencji, można przewidzieć, że można wyselekcjonować ludzkie
przeciwciało, które swoiście wiąże się z ludzką PTK7 i które zawiera region VH pochodzący od sekwencji
germinalnych VH 3-23 lub VH 3-7. Ponad to, można zmutować jedną lub więcej reszt w obrębie
sekwencji VH z 12C6 lub 12C6a, które różnią się od reszt w porównywalnych pozycjach w sekwencji VH
3-23 lub VH 3-7, na resztę (/y) obecne w VH 3-23 lub VH 3-7 lub na konserwatywne podstawienia tych
aminokwasów.
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
42
Przykład 4: Charakterystyka swoistości wiązania i kinetyki wiązania ludzkich przeciwciał
monoklonalnych anty-PTK7
[0173] W tym przykładzie, zbadano powinowactwo wiązania i kinetykę wiązania przeciwciał anty-PTK7
analizą Biacore. Swoistość wiązania i współzawodnictwo krzyżowe badano cytometrią przepływową.
Swoistość wiązania w cytometrii przepływowej
[0174] Skonstruowano linie komórkowe HEK3 wyrażające rekombinowaną ludzką PTK7 na powierzchni
komórek i zastosowano je do ustalenia swoistości ludzkich przeciwciał monoklonalnych PTK7 z pomocą
cytometrii przypływowej. Komórki HEK3 transfekowano plazmidami ekspresyjnymi zawierającymi cDNA
pełnej długości kodujący transbłonowe postaci PTK7. Wiązanie ludzkiego przeciwciała monoklonalnego
anty-PTK7 7C8 oceniano inkubując transfekowane komórki z ludzkim przeciwciałem monoklonalnym
anty-PTK7 przy stężeniu 10 µg/ml. Komórki płukano i wykrywano wiązanie z pomocą Ab (przeciwciała)
anty-ludzkie IgG znakowanego FITC. Analizy cytometrii przepływowej wykonano z zastosowaniem
cytometru przepływowego FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Wyniki są przedstawione na
Figurze 14. Ludzkie przeciwciało monoklonalne anty-PTK7 7C8 wiązało się z komórkami HEK3
transfekowanymi PTK7 ale nie z komórkami HEK3 nie transfekowanymi ludzką PTK7. Dane te wykazują
swoistość ludzkich przeciwciał monoklonalnych anty-PTK7 dla PTK7.
Swoistość wiązania w teście ELISA
[0175] Wiązanie przeciwciał anty-PTK7 oceniano także standardowym testem ELISA w celu zbadania
swoistości wiązania dla PTK7.
[0176] Sprawdzono wiązanie rekombinowanej domeny pozakomórkowej z PTK7 z ludzkimi
przeciwciałami monoklonalnymi anty-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 i 12C6a w różnych stężeniach. Wykonano
standardowe procedury ELISA. Ludzkie przeciwciała monoklonalne anty-PTK7 dodano w początkowym
stężeniu 10 µg/ml i seryjnie rozcieńczano rozcieńczeniem 1:2. Jako przeciwciało drugorzędowe
zastosowano kozie przeciwciało poliklonalne anty-ludzkie IgG (swoiste dla łańcucha kappa), sprzężone z
peroksydazą chrzanową (HRP). Wyniki przedstawione są na Figurze 15. Każde z ludzkich przeciwciał
monoklonalnych anty-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 i 12C6a wiązało się z PTK7. Dane te wykazują swoistość
ludzkich przeciwciał monoklonalnych anty-PTK7 dla PTK7.
Mapowanie epitopów przeciwciał anty-PTK7
[0177] W celu ustalenia grupowania epitopów dla HuMAb anty-PTK7 zastosowano cytometrię
przepływową. Komórki guza Wilmsa G-401 (ATCC nr dostępu CRL-1441) transfekowano plazmidami
ekspresyjnymi zawierającymi cDNA pełnej długości kodujący transbłonowe postaci PTK7. Wiązanie z
epitopem dla każdego z ludzkich przeciwciał monoklonalnych anty-PTK7 oceniano inkubując 1x105
transfekowanych komórek z 10 µg/ml zimnego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego anty-PTK7,
płukano, a następnie dodawano 10 µg/ml ludzkiego przeciwciała monoklonalnego anty-PTK7
znakowanego fluorescencyjnie. Wiązanie wykrywano Ab anty-ludzkie IgG znakowanym FITC. Analizy
cytometrii przepływowej wykonano z zastosowaniem cytometru przepływowego FACScan (Becton
Dickinson, San Jose, CA). Przy analizie danych, przeciwciała anty-PTK7 podzielono na 3 grupy
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
43
epitopowe – grupa A, obejmująca 7D11, grupa B, obejmująca 3G8 i 3G8a oraz grupa C, obejmująca 7C8,
12C6 i 12C6a.
Przykład 5: Charakterystyka wiązania przeciwciała anty-PTK7 z PTK7 wyrażaną na powierzchni
komórek ludzkiego nowotworu
[0178] Linię komórkową nerczaka płodowego guza Wilmsa G-401 (ATCC nr dost. CRL-1441)
sprawdzono pod kątem wiązania HuMAb ludzkich przeciwciał monoklonalnych anty-PTK7 12C6 i 7C8 w
różnych stężeniach. Wiązanie ludzkich przeciwciał monoklonalnych anty-PTK7 oceniano inkubując 1x105
komórek z przeciwciałem przy początkowym stężeniu 30 µg/ml i seryjnych rozcieńczeniach przeciwciała
rozcieńczeniem 1:10. Komórki płukano i wykrywano wiązanie za pomocą Ab anty-ludzkie IgG
znakowanego PE. Analizy cytometrii przepływowej wykonano z zastosowaniem cytometru
przepływowego FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Wyniki przedstawiono na Figurze 16.
Przeciwciała monoklonalne anty-PTK7 12C6 i 7C8 wiązały się z linią komórkową nerczaka płodowego
guza Wilmsa w sposób zależny od stężenia, na co wskazuje średnia fluorescencja (MFI, ang. mean
fluorescence intensity) barwienia. Wartości EC50 dla przeciwciał monoklonalnych anty-PTK7 12C6 i 7C8
wynosiły odpowiednio 4,035 nM i 3,428 nM.
[0179] Dane te wykazują, że HuMab anty-PTK7 wiążą się z liniami komórkowymi raka nerki.
Przykład 6: Wiązanie ludzkiego przeciwciała anty-PTK7 do nowotworowych linii komórkowych
[0180] Przeciwciała anty-PTK7 sprawdzono pod kątem wiązania do różnorodnych nowotworowych linii
komórkowych z pomocą cytometrii przepływowej.
[0181] Wiązanie ludzkich przeciwciał monoklonalnych anty-PTK7 3G8, 12C6a, 4D5 i 12C6 do panelu
nowotworowych linii komórkowych oceniano inkubując nowotworowe linie komórkowe z ludzkimi
przeciwciałami monoklonalnymi anty-PTK7 w stężeniu 10 µg/ml. Testowane nowotworowe linie
komórkowe to A-431 (ATCC nr dost. CRL-1555), komórki guza Wilmsa G-401 (ATCC nr dost. CRL-
1441), Saos-2 (ATCC nr dost. HTB-85), SKOV-3 (ATCC nr dost. HTB-77), PC3 (ATCC nr dost. CRL-
1435), DMS 114 (ATCC nr dost. CRL-2066), ACHN (ATCC nr dost. CRL-1611), LNCaP (ATCC nr dost.
CRL-1740), DU 145 (ATCC nr dost. HTB-81), LoVo (ATCC nr dost. CCL-229) i MIA PaCa-2 (ATCC nr
dost. CRL-1420). Jako kontrolę negatywną zastosowano izotypowe przeciwciało kontrolne. Komórki
płukano i wykrywano wiązanie z pomocą Ab anty-ludzkie IgG znakowanego FITC. Analizy cytometrii
przepływowej wykonano z zastosowaniem cytometru przepływowego FACScan (Becton Dickinson, San
Jose, CA). Wyniki przedstawiono na Figurze 17. Przeciwciała monoklonalne anty-PTK7 3G8, 12C6a, 4D5
i 12C6 wiązały się do nowotworowych linii komórkowych A-431, komórki guza Wilmsa G-401, Saos-2,
SKOV-3, PC3, DMS 114, ACHN, LNCaP, DU 145, LoVo i MIA Paca-2, na co wskazuje średnia
fluorescencja (MFI, ang. mean fluorescence intensity) barwienia. Dane te wykazują że HuMab anty-PTK7
wiążą się z zakresem komórek nowotworowych wyrażających PTK7 na powierzchni komórek.
Przykład 7: Wiązanie anty-PTK7 do ludzkich komórek T, B i dendrytycznych
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
44
[0182] Przeciwciała anty-PTK7 sprawdzono pod kątem wiązania do komórek-T CD4+, CD8+, komórek-B
CD19+ i ludzkich dendrytycznych komórek szpikowych krwi, wyrażających PTK7 na powierzchni
komórek, z pomocą cytometrii przepływowej.
[0183] Ludzkie komórki T aktywowano przeciwciałem anty-CD3 w celu zaindukowania ekspresji PTK7 na
komórkach T przed wiązaniem z ludzkim przeciwciałem monoklonalnym anty-PTK7. Wiązanie ludzkiego
przeciwciała monoklonalnego anty-PTK7 7c8 oceniano inkubując komórki z ludzkimi przeciwciałami
monoklonalnymi anty-PTK7 w stężeniu 10 µg/ml. W niektórych doświadczeniach zastosowano znane
przeciwciało wiążące się ze swoistym markerem komórek T i B, jako kontrolę pozytywną. Komórki
płukano i wykrywano wiązanie z pomocą Ab anty-ludzkie IgG znakowanego FITC. Analizy cytometrii
przepływowej wykonano z zastosowaniem cytometru przepływowego FACScan (Becton Dickinson, San
Jose, CA). Wyniki przedstawiono na Figurach 18 (aktywowane komórki T i komórki B) i 19 (komórki
dendrytyczne). Przeciwciało monoklonalne anty-PTK7 7C8 wiązało się z aktywowanymi ludzkimi
komórkami-T CD4+ i CD8+ oraz komórkami dendrytycznymi, ale nie z komórkami-B, na co wskazuje
średnia fluorescencja (MFI, ang. mean fluorescence intensity) barwienia. Dane te wykazują że HuMab
anty-PTK7 wiążą się z ludzkimi komórkami T i komórkami dendrytycznymi.
Przykład 8: Internalizacja przeciwciała monoklonalnego anty-PTK7
[0184] HuMAb anty-PTK7 testowano pod kątem zdolności do internalizacji do linii komórkowych
wyrażających PTK7 z zastosowaniem testu internalizacji Hum-Zap. Test Hum-Zap bada internalizację
przeciwciała pierwszorzędowego przez wiązanie przeciwciała drugorzędowego z powinowactwem do
ludzkiego IgG sprzężonego z toksyczną saporyną.
[0185] Nowotworowe linie komórkowe wyrażające PTK7 guz Wilmsa G-401 (ATCC nr dost. CRL-1441),
A-431 (ATCC nr dost. CRL-1555) i PC3 (ATCC nr dost. CRL-1435) wysiewano przy 1x104
komórek/studzienkę bezpośrednio do 100 µl studzienek. Przeciwciała HuMAb anty-PTK7 3G8, 4D5,
12C6 lub 7C8 dodawano do studzienek w początkowym stężeniu 30 nM, dalej zmniejszanym seryjnymi
rozcieńczeniami 1:3. Jako kontrolę negatywną zastosowano izotypowe przeciwciało kontrolne, nieswoiste
dla PTK7. Hum-Zap (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, IT-22-25) dodawano w stężeniu 11
nM i płytki inkubowano przez 72 godziny. Płytki następnie traktowano 1,0 µCi 3H-tymidyny przez 24
godziny, zbierano i sczytywano w liczniku Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments, Meriden,
CT). Wyniki przedstawiono na Figurze 20A-D. Dla przeciwciał anty-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 i 7C8
wykazano spadek włączania 3H-tymidyny w linii komórkowej guza Wilmsa wyrażającej PTK7 zależny od
stężenia przeciwciała. Dla przeciwciał anty-PTK7 12C6 i 7C8 wykazano spadek włączania 3H-tymidyny w
wyrażających PTK7 nowotworowych liniach komórkowych A-431 i PC3, zależny od stężenia przeciwciała.
Wartości EC50 dla przeciwciał anty-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 i 7C8 w komórkach guza Wilmsa wynosiły
odpowiednio 0,6437 nM, 0,2516 nM, 0,2053 nM i 0,1788 nM. Wartości EC50 dla przeciwciał anty-PTK7
12C6 i 7C8 w komórkach A-431 wynosiły odpowiednio 0,1657 nM i 0,1826 nM. Wartości EC50 dla
przeciwciał anty-PTK7 12C6 i 7C8 w komórkach guza PC3 wynosiły odpowiednio 0,3175 nM i 0,2648 nM.
Dane te wykazują, że przeciwciała anty-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 i 7C8 internalizują do komórek
nowotworowych.
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
45
Przykład 9: Ocena zabijania komórek dla przeciwciała anty-PTK7 sprzężonego z toksyną na
ludzkich nowotworowych liniach komórkowych
[0186] W tym przykładzie przeciwciała monoklonalne anty-PTK7 sprzężone z toksyną sprawdzono pod
kątem zdolności do zabijania ludzkich nowotworowych linii komórkowych PTK7+ w teście proliferacji
komórek.
[0187] Przeciwciało HuMAb anty-PTK7 12C6a sprzężono z toksyną poprzez łącznik, taki jak łącznik
peptydylowy, hydrazonowy lub dwusiarczkowy. Przykłady związków toksyn, które można sprzęgać z
przeciwciałami według niniejszego wynalazku opisano w WO 2007/038658. Ludzką linię komórkową raka
nerki guza Wilmsa G-401 (ATCC nr dost. CRL-1441) wyrażającą PTK-7 wysiewano przy 104
komórek/studzienkę w 100 µl studzienkach na 3 godziny. Do studzienek dodawano koniugat przeciwciało
anty-PTK7-toksyna w początkowym stężeniu 100 nM, dalej zmniejszanym seryjnymi rozcieńczeniami 1:3.
Płytki pozostawiono do inkubacji na 48 godzin. Płytki następnie traktowano 1 µCi 3H-tymidyny przez 24
godziny przed zakończeniem hodowli, zbierano i sczytywano w liczniku Top Count Scintillation Counter
(Packard Instruments). Figura 21 przedstawia wpływ koniugatu 12C6a na komórki guza Wilmsa. Dla
przeciwciała anty-PTK7 12C6 wykazano spadek włączania 3H-tymidyny w ludzkiej linii komórkowej raka
nerki guza Wilmsa wyrażającej PTK7 zależny od stężenia przeciwciała-toksyny.
[0188] Dane te wykazują, że przeciwciała anty-PTK7 sprzężone z toksyną wykazują swoistą
cytotoksyczność dla ludzkich komórek raka nerki.
Przykład 10: Ocena zabijania komórek dla przeciwciała anty-PTK7 sprzężonego z toksyną na
ludzkich liniach komórkowych guza
[0189] W tym przykładzie przeciwciała monoklonalne anty-PTK7 sprzężone z toksyną sprawdzono w
teście proliferacji komórek pod kątem zdolności do zabijania ludzkich linii komórkowych guza PTK7+,
mających niską, średnią lub wysoką ekspresję PTK7 na powierzchni komórek.
[0190] Przeciwciało HuMAb anty-PTK7 12C6a sprzężono z toksyną łącznikiem, takim jak łącznik
peptydylowy, hydrazonowy lub dwusiarczkowy. Przykłady związków toksyn, które można sprzęgać z
przeciwciałami według niniejszego wynalazku opisano w WO 2007/038658. Ludzkie nowotworowe linie
komórkowe guza, wyrażające PTK-7, A-431, SKOV3 i LoVo wysiewano przy 104 komórek/studzienkę w
100 µl studzienkach. Linie komórkowe sprawdzono wcześniej pod kątem wyrażania PTK7 na powierzchni
komórek standardowym testem FACS. Linia komórkowa A-431 miała najwyższy poziom ekspresji PTK7
na powierzchni komórek, a linia komórkowa LoVo miała najniższy poziom ekspresji PTK7 na powierzchni
komórek. Do studzienek dodano koniugat przeciwciało anty-PTK7-toksyna w początkowym stężeniu 20
nM dalej zmniejszanym seryjnymi rozcieńczeniami 1:2. Jako kontrolę negatywną zastosowano izotypowe
przeciwciało kontrolne. Płytki pozostawiono do inkubacji na 3 godziny i odpłukano niezwiązane (wolne)
koniugaty przeciwciało-toksyna. Płytki inkubowano dalej przez 96 godz. i mierzono śmiertelność
(jednostki fluorescencji, FU, ang. fluorescence units) luminescencyjnym testem przeżywalności komórek
CellTiter-Glo® zgodnie z protokołem (Promega, WI, USA, Biuletyn techniczny nr 288) stosując czytnik
BIO-TEK (Bio-Tek Instruments, Inc, VT, USA). Wyniki przedstawiono na Figurze 22. Dla koniugatu
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
46
przeciwciało anty-PTK7-toksyna wykazano spadek w teście proliferacji zależny od stężenia przeciwciała-
toksyny w wyrażających PTK7 A431wysoka
, SKOV3średnia
, LoVoniska
.
[0191] Dane te wykazują, że przeciwciała anty-PTK7 sprzężone z toksyną wykazują swoistą
cytotoksyczność dla różnych ludzkich komórek nowotworowych.
Przykład 11: Immunohistochemia z 3G8, 12C6a, 2E11
[0192] Zdolność HuMab anty-PTK7 3G8, 12C6a i 2E11 do rozpoznawania PTK7 immunohistochemicznie
zbadano z zastosowaniem biopsji klinicznych z raka płuc, raka piersi, raka pęcherza moczowego, raka
trzustki, raka okrężnicy, raka jajnika, raka jelita cienkiego i raka prostaty.
[0193] Do immunohistochemii, zastosowano 5 µm mrożone skrawki (Ardais Inc. USA). Po suszeniu przez
30 minut, skrawki utrwalono w acetonie (w temperaturze pokojowej przez 10 minut) i suszono na
powietrzu przez 5 minut. Skrawki płukano PBS, a następnie pre-inkubowano z 10% prawidłową surowicą
kozią w PBS, przez 20 min, i dalej inkubowano z 10µg/ml FITC-przeciwciała w PBS, z 10% prawidłową
surowicą kozią, przez 30 min. w temperaturze pokojowej. Dalej skrawki płukano trzy razy w PBS, i
inkubowano przez 30 minut z mysim anty-FITC (10µg/ml DAKO) w temperaturze pokojowej. Skrawki
ponownie płukano w PBS i inkubowano z kozim anty-mysz sprzężonym z HRP (DAKO) przez 30 minut w
temperaturze pokojowej. Skrawki ponownie płukano 3x PBS. Jako substrat stosowano
diaminobenzydynę (Sigma), dającą brązowe zabarwienie. Po płukaniu wodą destylowaną, skrawki
barwiono kontrastowo hematoksyliną przez 1 min. Następnie skrawki płukano przez 10 sek. pod bieżącą
wodą destylowaną i osadzano w glicerożelu (Glycergel, DAKO). Barwienie immunohistochemiczne biopsji
klinicznych pokazało pozytywne barwienie w skrawkach raka płuc, raka piersi, raka pęcherza
moczowego, raka trzustki, raka okrężnicy, raka jajnika, raka jelita cienkiego i raka prostaty. Tkanka
prawidłowa zawsze dawała wynik negatywny w barwieniu PTK7, podczas gdy dla tkanki złośliwej,
zarówno fibroblastów aktywowanych nowotworowo jak i zrakowaciałych komórek nabłonkowych,
obserwowano wynik pozytywny w barwieniu PTK7. Potwierdzono identyfikację fibroblastów
aktywowanych nowotworowo w skrawkach raka pęcherza moczowego i raka piersi barwieniem z użyciem
przeciwciała przeciw białku aktywującemu fibroblasty (FAP, ang. Fibroblast Activation Protein, Alexis
Biochemicals, San Diego, USA). FAP jest znanym markerem fibroblastów aktywowanych nowotworowo
(Hofheinz et al. (2003) Oncologie 26:44-48).
Przykład 12: Badanie inwazji
[0194] W tym przykładzie, przeciwciała skierowane przeciwko PTK7 sprawdzono pod kątem zdolności do
wywierania wpływu na inwazję linii komórkowej CHO transfekowanej PTK7.
Badanie wykonano z zastosowaniem płytki wielodołkowej HTS 96-Multiwell Insert System (nr kat.
351162, BD Biosciences, CA) zgodnie z protokołem. Wyjściową linię komórkową CHO lub komórki CHO
transfekowane PTK7 pełnej długości lub kontrolną linię komórkową HEK293 wymieszano z pulą HuMab
anty-PTK7 lub izotypowym przeciwciałem kontrolnym przed dodaniem komórek na płytki. Mieszankę
(komórki + pula Ab) dodawano do studzienki na płytce inwazyjnej. Po inkubacji w 37 °C, w 5% CO2 przez
24 godziny, komórki wyznakowano barwnikiem fluorescencyjnym i oznaczono ilościowo komórki, które
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
47
spenetrowały na dno membrany, z zastosowaniem fluorescencyjnego czytnika płytek. Wyniki
przedstawiono na Figurze 23. Dane te wykazują, że przeciwciała anty-PTK7 hamują inwazyjną
ruchliwość komórek wyrażających PTK7 na powierzchni komórek.
Przykład 13: Leczenie modelu ksenoprzeszczepu komórek raka trzustki in vivo z zastosowaniem
przeciwciał anty-PTK7, nagich i sprzężonych z cytotoksyną
[0195] Ten Przykład ujawnia leczenie in vivo myszy z wszczepionym guzem raka trzustki przeciwciałami
anty-PTK7 sprzężonymi z toksyną, w celu zbadania wpływu przeciwciał na wzrost guza in vivo.
[0196] HPAC (ludzki gruczolakorak trzustki, ang. human pancreatic adenocarcinoma, ATCC numer
dostępu CRL-2119) lub inne odpowiednie komórki raka trzustki namnażano in vitro stosując standardowe
procedury laboratoryjne. Samcom Ncr bezgrasiczych nagich myszy (Taconic, Hudson, NY) w wieku
między 6-8 tygodni wszczepiono podskórnie w prawy bok 2,5x106 komórek HPAC w 0,2 ml PBS/Matrigel
(1:1) na mysz. Myszy ważono i mierzono w trzech wymiarach szukając guzów, z użyciem elektronicznej
suwmiarki dwa razy w tygodniu po implantacji. Objętości guzów obliczano jako wysokość x szerokość x
długość/2. Myszy z guzami HPAC średnio 90 mm3 randomizowano do grup leczenia. Myszom podawano
jedną dawkę dożylną nagiego przeciwciała anty-PTK7 lub HuMAb anty-PTK7 sprzężonego z toksyną, w
nośniku PBS, w Dniu 0 we wskazanej dawce (µmol/kg). Przykłady związków toksycznych, którą mogą
być sprzęgane z przeciwciałami według niniejszego wynalazku opisano w oczekującym amerykańskim
zgłoszeniu patentowym, numer publikacji 2006/0024317 A1. Myszy monitorowano pod kątem wzrostu
guza przez 61 dni po podaniu dawki. Myszy poddawano eutanazji gdy guzy osiągały punkt końcowy guza
(2000 mm3) lub ulegały owrzodzeniu. Przeciwciała anty-PTK7 sprzężone z toksyną spowalniały progresję
wzrostu guza. Wyniki przedstawiono na Figurze 24. Wpływ koniugatu anty-PTK7 toksyna
przeciwdziałający guzowi zależał od dawki, z najsilniejszym efektem obserwowanym przy dawce 0,3
µmol/kg. Leczenie koniugatem anty-PTK7 toksyna było dobrze tolerowane, a osobniki nigdy nie
doświadczały średniej utraty masy ciała większej niż 5% (dane nie przedstawione). Tak więc, leczenie
koniugatem przeciwciało anty-PTK7-toksyna ma bezpośredni wpływ hamujący in vivo na wzrost guza
raka trzustki.
Przykład 14: Leczenie modelu ksenoprzeszczepu komórek raka piersi in vivo z zastosowaniem
przeciwciał anty-PTK7, nagich i sprzężonych z cytotoksyną
[0197] Ten Przykład ujawnia leczenie in vivo myszy z wszczepionym guzem raka piersi opornym na
adriamycynę, przy pomocy przeciwciał anty-PTK7 sprzężonych z toksyną w celu zbadania wpływu
przeciwciał na wzrost guza in vivo.
[0198] MCF7-adr (linię komórkową ludzkiego raka piersi oporną na adriamycynę) namnażano in vitro z
zastosowaniem standardowych procedur laboratoryjnych. Samicom myszy CB17.SCID (Taconic,
Hudson, NY) w wieku między 6-8 tygodni wszczepiono podskórnie 1,7 mg granulek uwalniających
estrogen przez 90 dni, wielkości 3,0 mm (Innovative Research of America, Sarasota, FL) w rejonie
szyjnym, na dzień przed wszczepieniem podskórnym w prawy bok 10 x106 komórek MCF7-Adr w 0,2 ml
PBS/Matrigel (1:1) na mysz. Myszy ważono i mierzono w trzech wymiarach szukając guzów, z użyciem
elektronicznej suwmiarki dwa razy w tygodniu po implantacji. Objętości guzów obliczano jako wysokość x
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
48
szerokość x długość/2. Myszy z guzami MCF7-Adr około 160 mm3 randomizowano do grup leczenia.
Myszom podawano jedną dawkę dożylną 0,1 µmol/kg nagiego przeciwciała anty-PTK7 lub HuMAb anty-
PTK7 sprzężonego z toksyną, w nośniku PBS, w Dniu 0. Przykłady związków toksycznych, którą mogą
być sprzęgane z przeciwciałami według niniejszego wynalazku opisano w oczekującym amerykańskim
zgłoszeniu patentowym, numer publikacji 2006/0024317 A1. Myszy monitorowano pod kątem wzrostu
guza przez 63 dni po podaniu dawki. Myszy poddawano eutanazji gdy guzy ulegały owrzodzeniu. Wyniki
przedstawiono na Figurze 25. Przeciwciała anty-PTK7 sprzężone z toksyną spowalniały progresję
wzrostu guza. Tak więc, leczenie koniugatem przeciwciało anty-PTK7-toksyna ma bezpośredni wpływ
hamujący in vivo na wzrost guza raka piersi.
SEKW NR ID: SEKWENCJA SEKW NR ID: SEKWENCJA
1 VH a.a. 3G8, 3G8a 23 VK CDR1 a.a. 3G8
2 VH a.a. 4D5 24 VK CDR1 a.a. 3G8a
3 VH a.a. 12C6, 12C6a 25 VK CDR1 a.a. 4D5
4 VH a.a. 7C8 26 VK CDR1 a.a. 12C6
27 VK CDR1 a.a. 12C6a
5 VK a.a. 3G8 28 VK CDR1 a.a. 7C8
6 VK a.a. 3G8a
7 VK a.a. 4D5 29 VK CDR2 a.a. 3G8
8 VK a.a. 12C6 30 VK CDR2 a.a. 3G8a
9 VK a.a. 12C6a 31 VK CDR2 a.a. 4D5
10 VK a.a. 7C8 32 VK CDR2 a.a. 12C6
33 VK CDR2 a.a. 12C6a
11 VH CDR1 a.a. 3G8 34 VK CDR2 a.a. 7C8
12 VH CDR1 a.a. 4D5
13 VH CDR1 a.a. 12C6 35 VK CDR3 a.a. 3G8
14 VH CDR1 a.a. 7C8 36 VK CDR3 a.a. 3G8a
37 VK CDR3 a.a. 4D5
15 VH CDR2 a.a. 3G8 38 VK CDR3 a.a. 12C6
16 VH CDR2 a.a. 4D5 39 VK CDR3 a.a. 12C6a
17 VH CDR2 a.a. 12C6 40 VK CDR3 a.a. 7C8
18 VH CDR2 a.a. 7C8
41 VH n.t. 3G8, 3G8a
19 VH CDR3 a.a. 3G8 42 VH n.t. 4D5
20 VH CDR3 a.a. 4D5 43 VH n.t. 12C6, 12C6a
21 VH CDR3 a.a. 12C6 44 VH n.t. 7C8
22 VH CDR3 a.a. 7C8
I
45 VK n.t. 3G8 51 VH 3-30.3 germinalna a.a.
46 VK n.t. 3G8a 52 VH DP44 germinalna a.a.
47 VK n.t. 4D5 53 VH 3-33 germinalna a.a.
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
49
SEKW NR ID: SEKWENCJA SEKW NR ID: SEKWENCJA
48 VK n.t. 12C6
49 VK n.t. 12C6a 54 VK L15 germinalna a.a.
50 VK n.t. 7C8 55 VK A10 germinalna a.a.
56 VK A27 germinalna a.a.
57 VK L6 germinalna a. a.
I
58 PTK7 a.a.
59 JH4b germinalna a.a
60 JH4b germinalna a.a.
61 3-7 germinalna a.a.
62 3-23 germinalna a.a.
63 JH4b germinalna a.a
64 JH6b germinalna a.a.
65 JK1 germinalna a.a.
66 JK5 germinalna a.a.
67 JK2 germinalna a.a.
68 JK2 germinalna a.a.
69 JK3 germinalna a.a.
LISTA SEKWENCJI
[0199]
<110> MEDAREX, INC.
<120> LUDZKIE PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE PRZECIW BIAŁKU KINAZY TYROZYNOWEJ 7
(PTK7) I SPOSOBY STOSOWANIA PRZECIWCIAŁ ANTY-PTK7
<130> MXI-345PC
<140>
<141>
<150> 60/748,373
<151> 2005-12-08
<160> 69
<170> PatentIn Ver. 3.3
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
50
<210> 2
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
51
<210> 4
<211> 126
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
52
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
<210> 8
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
53
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
54
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
55
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
<210> 21
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
56
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
57
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
58
<213> Homo sapiens
<400> 34
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
59
<210> 41
<211> 348
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(348)
<400> 41
<210> 42
<211> 345
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(345)
<400> 42
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
60
<210> 43
<211> 336
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<400> 43
<210> 44
<211> 378
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 44
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
61
<210> 45
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 45
<210> 46
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
62
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 46
<210> 47
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 47
<210> 48
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
63
<211> 327
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(327)
<400> 48
<210> 49
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321).
<400> 49
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
64
<210> 50
<211> 324
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<400> 50
<210> 51
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
65
<210> 52
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
<210> 53
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
<210> 54
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
66
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
<210> 55
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
<210> 56
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
67
<210> 57
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
<210> 58
<211> 1070
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
68
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
69
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
70
<210> 59
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
71
<210> 61
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
<210> 62
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
<210> 63
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
<210> 64
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
72
<400> 64
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
<210> 66
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
<210> 67
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
<210> 68
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
<210> 69
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
73
Zastrzeżenia
1. Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, lub jego część wiążąca antygen, przy czym
przeciwciało:
(a) swoiście wiąże się z ludzką PTK7; oraz
(b) wiąże się do linii komórkowej guza Wilmsa o nr dost. ATCC CRL-1441, z EC50 4,0 nM lub
mniejszym, w badaniu, które obejmuje inkubowanie 1 x 105 komórek z przeciwciałem przy
początkowym stężeniu 30 µg/ml i seryjne rozcieńczanie przeciwciała w rozcieńczeniach 1:10; oraz
(c) wiąże się z tym samym epitopem na ludzkiej PTK7 co przeciwciało odniesienia obejmujące:
(i) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR
ID: 2 oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW
NR ID: 7; lub
(ii) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR
ID: 3 oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW
NR ID: 8; lub
(iii) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR
ID: 4 oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW
NR ID: 10.
2. Przeciwciało według zastrz. 1, które jest:
(a) przeciwciałem pełnej długości izotypu IgG1 lub IgG4; lub
(b) fragmentem przeciwciała lub przeciwciałem jednołańcuchowym.
3. Przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, według zastrz. 1 albo 2, przy czym przeciwciało wiąże
się do komórek guza Wilmsa z EC50 3,5 nM lub mniejszym.
4. Przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, według dowolnego z zastrz. 1 do 3, które obejmuje:
(a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 12,
CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 16,
CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 20,
CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 25,
CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 31 oraz
CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 37; lub
(b) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 14,
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
74
CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 18,
CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 22,
CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 28,
CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 34 oraz
CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 40; lub
(c) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 13,
CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 17,
CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 21,
CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 26,
CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 32 oraz
CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 38
5. Przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, według dowolnego z zastrz. 1 do 4, które obejmuje:
(a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:2 oraz
region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 7; lub
(b) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:4 oraz
region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 10; lub
(c) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:3 oraz
region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 8.
6. Immunokoniugat obejmujący przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, jak określone w dowolnym
z zastrz. 1 do 5, połączone z środkiem terapeutycznym, takim jak cytotoksyna lub izotop radioaktywny.
7. Kompozycja obejmująca przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, jak określone w dowolnym z
zastrz. 1 do 5 lub immunokoniugat określony w zastrz. 6 oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
8. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, jak
określone w dowolnym z zastrz. 1 do 5.
9. Wektor ekspresyjny obejmujący cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 8.
10. Komórka gospodarz obejmująca wektor ekspresyjny określony w zastrz. 9.
11. Sposób in vitro dla przygotowania przeciwciała anty-PTK7, który obejmuje wyrażanie przeciwciała w
komórce gospodarzu jak określonej w zastrz. 10 i izolację przeciwciała z komórki gospodarza.
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
75
12. Przeciwciało lub jego część wiążąca antygen, jak określone w dowolnym z zastrz. 1 do 5 do
zastosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania nowotworowi znamiennemu wzrostem komórek
guza wyrażających PTK7.
13. Przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, według zastrz. 12, przy czym nowotwór jest wybrany z
raka okrężnicy, raka płuc, raka piersi, raka trzustki, czerniaka, ostrej białaczki szpikowej, raka nerek, raka
pęcherza moczowego, raka jajnika i raka prostaty.
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
76
An
ty-P
TK7
3G
8 V
H
Segm
ent
V:
3-3
0.3
Se
gmen
t D
: n
ieu
stal
on
y Se
gmen
t J:
JH
4b
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
77
An
ty-P
TK7
3G
8 V
K
Segm
ent
V:
L15
Se
gmen
t J:
JK
1
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
78
An
ty-P
TK7
3G
8a
VK
Se
gmen
t V
: L1
5
Segm
ent
J:
JK3
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
79
An
ty-P
TK7
4D
5 V
H
Segm
ent
V:
3-3
0.3
Se
gmen
t D
: n
ieu
stal
on
y
Segm
ent
J:
JH4
b
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
80
An
ty-P
TK7
4D
5 V
K
Segm
ent
V:
A1
0
Segm
ent
J:
JK5
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
81
An
ty-P
TK7
12
C6
VH
Se
gmen
t V
: D
P-4
4 Se
gmen
t D
: n
ieu
stal
on
y
Segm
ent
J:
JH4
b
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
82
An
ty-P
TK7
12
C6
VK
Se
gmen
t V
: A
27
Se
gmen
t J:
JK
2
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
83
An
ty-P
TK7
12
C6
a V
K
Segm
ent
V:
L15
Se
gmen
t J:
JK
2
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
84
An
ty-P
TK7
7C
8 V
H
Segm
ent
V:
3-3
3 Se
gmen
t D
: 3
-10
Segm
ent
J:
JH6
b
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
85
An
ty-P
TK7
7C
8 V
K
Segm
ent
V:
L6
Segm
ent
J:
JK3
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
86
An
ty-P
TK7
, reg
ion
VH
3G
8 i
3G
8a
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
87
An
ty-P
TK7
, reg
ion
VH
4D
5
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
88
An
ty-P
TK7
, reg
ion
VH
12
C6
i 1
2C
6a
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
89
An
ty-P
TK7
, reg
ion
VH
7C
8
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
90
An
ty-P
TK7
, reg
ion
VK
3G
8 i
3G
8a
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
91
An
ty-P
TK7
, reg
ion
VK
4D
5
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
92
An
ty-P
TK7
, reg
ion
VK
12
C6
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
93
An
ty-P
TK7
, reg
ion
VK
12
C6
a
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
94
An
ty-P
TK7
, reg
ion
VK
7C
8
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
germ
inal
ny
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
95
Wią
zan
ie H
uM
ab a
nty
-PTK
7 d
o k
om
óre
k tr
ansf
eko
wan
ych
PTK
7
HEK
29
3 t
ran
sfek
ow
ane
PTK
7
wyj
ścio
we
HEK
29
3
kon
tro
la iz
oty
po
wa
Względna # komórek
Względna # komórek
Inte
nsy
wn
ośd
flu
ore
sce
ncj
i In
ten
syw
no
śd f
luo
resc
en
cji
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
96
Wią
zan
ie p
rzec
iwci
ał P
TK7
z b
iałk
iem
PTK
7 t
este
m E
LISA
kon
tro
la n
egat
ywn
a
Stęż
enie
(u
g/m
l)
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
97
Mia
recz
kow
anie
FA
CS
na
kom
órk
ach
gu
za W
ilmsa
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
98
Intensywnośd fluorescencji (MFI)
kon
tro
la iz
oty
po
wa
Eksp
resj
a P
TK7
w e
nd
oge
nn
ych
lin
iach
ko
mó
rko
wyc
h g
uza
, z
zast
oso
wan
iem
FA
CS
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
99
Względna # komórek
kon
tro
la p
ozy
tyw
na
kon
tro
la
Inte
nsy
wn
ośd
flu
ore
sce
ncj
i (P
TK7
)
kom
órk
i ko
mó
rki
kom
órk
i
An
aliz
a FA
CS
akty
wo
wan
ych
lud
zkic
h li
mfo
cytó
w p
od
kat
em P
TK7
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
100
kon
tro
la iz
oty
po
wa
Względna # komórek
An
aliz
a FA
CS
Hu
MA
b a
nty
-PTK
7 n
a ko
mó
rkac
h d
end
ryty
czn
ych
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
101
kontrola izotypowa
Stężenie przeciwciał (nM)
Stężenie przeciwciał (nM)
Włą
czan
ie 3 H
-tym
idyn
y (
CP
M)
Włą
czan
ie 3 H
-tym
idyn
y (
CP
M)
HumZaP – guz Wilmsa
HumZaP – guz Wilmsa
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
102
kontrola izotypowa
kontrola izotypowa
Stężenie przeciwciał (nM)
Stężenie przeciwciał (nM)
Włą
czan
ie 3 H
-tym
idyn
y (
CP
M)
Włą
czan
ie 3 H
-tym
idyn
y (
CP
M)
test HumZaP – PC3
test HumZaP – A-431
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
103
kontrola
Stężenie UPT (nM)
Włą
czan
ie 3 H
-tym
idyn
y (
CP
M)
Proliferacja Wilmsa 72 godz. – bez
płukania
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
104
A4
31
(P
TK7
wys
) SK
OV
3 (
PTK
7śr)
LoV
o (
PTK
7n
is)
kon
tro
la iz
oty
po
wa-
tox
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
105
Inwazja (24 godz.)
Ab stosowane w 50 ug/ml
Pożywka Ab kontr izo
anty-PTK7
Linie komórkowe (1,5x10e5/studzienkę)
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
106
sam
a to
ksyn
a
sam
a to
ksyn
a
no
śnik
Ab
ko
ntr
ola
izo
typ
ow
a
Dn
i po
po
dan
iu
Śre
dn
ia o
bję
tośd
guza
n=8
Objętośd guza (długośd x szerokośd x wysokośd/2)
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
107
Objętośd guza (długośd x szerokośd x wysokośd/2)
Dn
i po
po
dan
iu
No
śnik
Ko
ntr
ola
izo
typ
ow
a 0
,1
Ko
ntr
ola
izo
typ
ow
a-to
x 0
,1
13
72-
00
9
MC
F7/A
dr
Śre
dn
ia o
bję
tośd
guza
n=9
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
108
Odnośniki cytowane w opisie
Poniższa lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma na celu wyłącznie pomoc dla czytającego
i nie stanowi części dokumentu patentu europejskiego. Pomimo, że dołożono największej staranności
przy jej tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej
odpowiedzialności w tym względzie.
Dokumenty patentowe cytowane w opisie
• WO 0417992 A [0003] • WO 2004017992 A [0003] • US 4816567 A, Cabilly [0064] • US 5225539 A, Winter [0064] • US 5530101 A [0064] • US 5585089 A [0064] • US 5693762 A [0064] • US 6180370 A, Queen [0064] • US 5545806 A [0066] [0141] • US 5569825 A [0066] • US 5625126 A [0066] • US 5633425 A [0066] • US 5789650 A [0066] • US 5877397 A [0066] • US 5661016 A [0066] • US 5814318 A [0066] • US 5874299 A [0066] • US 5770429 A, Lonberg i Kay [0066] [0141] • US 5545807 A, Surani [0066] [0141] • WO 9203918 A [0066] • WO 9312227 A [0066] • WO 9425585 A [0066] • WO 9713852 A [0066] • WO 9824884 A [0066] [0072] [0142] • WO 9945962 A, Lonberg and Kay [0066] • WO 0114424 A, Korman [0066] [0072] [0141] • WO 0243478 A, Ishida [0067] [0141] • US 5939598 A [0068] • US 6075181 A [0068] • US 6114598 A [0068] • US 6150584 A [0068] • US 6162963 A, Kucherlapati [0068] • US 5223409 A [0070] • US 5403484 A [0070] • US 5571698 A, Ladner [0070] • US 5427908 A [0070] • US 5580717 A, Dower [0070] • US 5969108 A [0070] • US 6172197 A, McCafferty [0070] • US 5885793 A [0070] • US 6521404 A [0070] • US 6544731 A [0070] • US 6555313 A [0070] • US 6582915 A [0070] • US 6593081 A, Griffiths [0070] • US 5476996 A [0071] • US 5698767 A, Wilson [0071] • US 4399216 A [0079] • US 4634665 A [0079] • US 5179017 A, Axel [0079] • WO 8704462 A [0081]
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
109
• WO 8901036 A [0081] • EP 338841 A [0081] • US 6548530 B [0089] [0130] • US 6281354 B [0089] [0130] • US 20030064984 A [0089] [0130] • US 20030073852 A [0089] [0130] • US 20030050331 A [0089] [0130] • US 5399163 A [0115] • US 5383851 A [0115] • US 5312335 A [0115] • US 5064413 A [0115] • US 4941880 A [0115] • US 4790824 A [0115] • US 4596556 A [0115] • US 4487603 A [0115] • US 4486194 A [0115] • US 4447233 A [0115] • US 4447224 A [0115] • US 4439196 A [0115] • US 4475196 A [0115] • US 4522811 A [0116] • US 5374548 A [0116] • US 5399331 A [0116] • US 5416016 A, Low [0116] • US 20040087497 A [0130] • WO 03022806 A [0130] • WO 0109187 A [0141] • US 5625825 A [0141] • WO 2007038658 A [0187] [0190] • US 20060024317 A1 [0196] [0198] • US 60748373 B [0199] Literatura nie patentowa, cytowana w opisie • PRENZEL et al. Endocr. Relat. Cancer, 2001, tom 8, 11-31 [0001] • HUBBARD ; TILL. Annu. Rev. Biochem., 2000, tom 69, 373-98 [0001] • KOBUS ; FLEMING. Biochemistry, 2005, tom 44, 1464-70 [0001] • LEE et al. Oncogene, 1993, tom 8, 3403-10 [0002] • PARK et al. J. Biochem, 1996, tom 119, 235-9 [0002] • MOSSIE et al. Oncogene, 1995, tom 11, 2179-84 [0002] [0120] • EASTY et al. Int. J. Cancer, 1997, tom 71, 1061-5 [0003] [0120] • JUNG et al. Biochim Biophys Acta, 2002, tom 1579, 153-63 [0003] • MULLER-TIDOW et al. Clin. Cancer Res., 2004, tom 10, 1241-9 [0003] [0120] • KYRIAKOS et al. Cancer Research, February 1992, tom 52 (4), 835-842 [0003] • WARD et al. Nature, 1989, tom 341, 544-546 [0023] • BIRD et al. Science, 1988, tom 242, 423-426 [0023] [0061] • HUSTON et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, tom 85, 5879-5883 [0023] [0061] • KABAT, E. A. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. U.S. Department of Health and Human Services, 1991 [0046] [0060] • KLIMKA et al. British J. of Cancer, 2000, tom 83 (2), 252-260 [0051] • BEIBOER et al. J. Mol. Biol., 2000, tom 296, 833-849 [0051] • RADER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998, tom 95, 8910-8915 [0051] • BARBAS et al. J. Am. Chem. Soc., 1994, tom 116, 2161-2162 [0051] • BARBAS et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1995, tom 92, 2529-2533 [0051] • DITZEL et al. J. Immunol., 1996, tom 157, 739-749 [0051] • Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing and Wiley Interscience, 1987 [0055] • KABAT, E. A. Sequences of Proteins of Immunological Interest. U.S. Department of Health and Human Services, 1991 [0059] • MCCAFFERTY et al. Nature, 1990, tom 348, 552-554 [0061] • KOHLER; MILSTEIN. Nature, 1975, tom 256, 495 [0062] • LONBERG et al. Nature, 1994, tom 368 (6474), 856-859 [0066]
PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1
110
• LONBERG, N. Handbook of Experimental Pharmacology. 1994, tom 113, 49-101 [0066] • LONBERG, N. ; HUSZAR, D. Intern. Rev. Immunol., 1995, tom 13, 65-93 [0066] • HARDING, F. ; LONBERG, N. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1995, tom 764, 536-546 [0066] • TAYLOR, L. et al. Nucleic Acids Research, 1992, tom 20, 6287-6295 [0066] • CHEN, J. et al. International Immunology, 1993, tom 5, 647-656 [0066] • TUAILLON et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, tom 90, 3720-3724 [0066] • CHOI et al. Nature Genetics, 1993, tom 4, 117-123 [0066] • CHEN, J. et al. EMBO J., 1993, tom 12, 821-830 [0066] • TUAILLON et al. J. Immunol., 1994, tom 152, 2912-2920 [0066] • TAYLOR, L. et al. International Immunology, 1994, tom 6, 579-591 [0066] • FISHWILD, D. et al. Nature Biotechnology, 1996, tom 14, 845-851 [0066] [0072] [0142] • TOMIZUKA et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, tom 97, 722-727 [0069] • KUROIWA et al. Nature Biotechnology, 2002, tom 20, 889-894 [0069] • LONBERG, N. et al. Nature, 1994, tom 368 (6474), 856-859 [0072] [0142] • MORRISON, S. Science, 1985, tom 229, 1202 [0076] • GOEDDEL. Gene Expression Technology. Methods in Enzymology. Academic Press, 1990, tom 185 [0078] • TAKEBE, Y. et al. Mol. Cell. Biol., 1988, tom 8, 466-472 [0078] • BOSS, M. A. ; WOOD, C. R. Immunology Today, 1985, tom 6, 12-13 [0080] • URLAUB ; CHASIN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, tom 77, 4216-4220 [0081] • R. J. KAUFMAN ; P. A. SHARP. Mol. Biol., 1982, tom 159, 601-621 [0081] • SAITO, G. Adv. Drug Deliv. Rev., 2003, tom 55, 99-215 [0091] • TRAIL, P.A. et al. Cancer Immunol. Immunother, 2003, tom 52, 328-337 [0091] • PAYNE; G. Cancer. Cell, 2003, tom 3, 207-212 [0091] • ALLEN, T.M. Nat Rev Cancer, 2002, tom 2, 750-763[0091] • PASTAN, I. ; KREITMAN, R. J. Curr. Opin. Investig. Drugs, 2002, tom 3, 1089-1091 [0091] • SENTER, P.D. ; SPRINGER, C.J. Adv. Drug Deliv. Rev., 2001, tom 53, 247-264 [0091] • Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy. ARNON et al. Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy. Alan R. Liss, Inc, 1985, 243-56 [0094] • Antibodies For Drug Delivery. HELLSTROM et al. Controlled Drug Delivery. Marcel Dekker, Inc, 1987, 623-53 [0094] • Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review. THORPE et al. Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications. 1985, 475-506 [0094] • Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy. Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy. Academic Press, 1985, 303-16 [0094] • THORPE et al. The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates. Immunol. Rev., 1982, tom 62, 119-58 [0094] • BERGE, S.M. et al. J. Pharm. Sci., 1977, tom 66, 1-19 [0098] • Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems. Marcel Dekker, Inc, 1978 [0114] • V.V. RANADE. J. Clin. Pharmacol., 1989, tom 29, 685 [0116] • UMEZAWA et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1988, tom 153, 1038 [0116] • P.G. BLOEMAN et al. FEBS Lett., 1995, tom 357, 140 [0116] • M. OWAIS et al. Antimicrob. Agents Chemother, 1995, tom 39, 180 [0116] • BRISCOE et al. Am. J. Physiol., 1995, tom 1233, 134 [0116] • SCHREIER et al. J. Biol. Chem., 1994, tom 269, 9090 [0116] • K. KEINANEN ; M.L. LAUKKANEN. FEBS Lett., 1994, tom 346, 123 [0116] • J.J. KILLION ; I.J. FIDLER. Immunomethods, 1994, tom 4, 273 [0116] • CHEN et al. EMBO J., 1993, tom 12, 811-820 [0141] • FISHWILD et al. Nature Biotechnology, 1996, tom 14, 845-851 [0141] • HOFHEINZ et al. Oncologie, 2003, tom 26, 44-48 [0193]