sejt-aggregációs kultúrák

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

SEJT-AGGREGÁCIÓS KULTÚRÁK


Dr. Pongrácz JuditHáromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 15. Előadás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Aggregációs sejtkultúrák

• Az aggregáció segítségével gyorsan alakíthatunk ki kisméretű szövetdarabkákat

• Az aggregáció szoros kapcsolatot alakít ki a sejtek között, amely segít növelni a sejtek túlélését és megfelelő élettani funkcióinak végrehajtását

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011Alapvető feltételek az aggregációs kultúrák kialakításához• Sejtadhéziós molekulák (CAM, cellular

adhesion molecule) jelenléte a sejtfelszínen• Mátrix vagy mesterséges összetapadást

segítő molekulák jelenléte, amely serkenti azon sejtek aggregációját, amelyek egyébként nem tapadnának össze

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejtadhézió

Sejt-mátrix interakciók

Oldott állapotú ECM

Integrinek

Statikus ECM

Kadherinek

Sejt-sejtinterakciók

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A sejt-aggregáció kialakításának módszerei

Aggregáció gravitációs kultúrákban

Aggregáció alacsony tapadóképességű

anyagokhoz

Aggregáció scaffoldokon vagy kémiailag módosított

felszínű anyagokon

Aggregáció forgó vagy szuszpenziós kultúrákban

Aggregáció bioreaktorokban

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Gravitációs sejtkultúrák

A sejtek „gömböcskék”-ké, ún. szferoid-okká állnak össze természetes módon, természetes nagyságú vagy megnövelt gravitációs mezőben

Gravitációs kultúrák típusai:

• Szuszpenziós kultúrában kialakuló aggregátumok bioreaktorokban

• Függőcsepp-kutúrák• Centrifugált aggregátumok

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szuszpenzióban kialakuló aggregátum kultúrák

• Magas sűrűségű sejtszuszpenziók szükségesek a kialakuláshoz

• A tenyésztés dinamikusan mozgásban levő kultúrákban lehetséges, a sejt-sejt kapcsolatok kialakulásához szükséges találkozások számának növelése érdekében

• A dinamikusan mozgásban levő sejtkultúrák kialakítására a sejtszuszpenziókat lehet mozgásban levő lemezeken, petri-csészékben vagy bioreaktorokban tenyészteni

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Aggregáció forgó bioreaktorokban

Forgó bioreaktorAdherens sejtekhez

Forgó bioreaktorSejtszuszpenziókhoz

MintavevőnyílásokTöltőnyílás

LSMMG

NG

Gravitációserő

Gravitációserő

Forgásirány

Mintavevőnyílások

Töltőnyílás

Forgásirány

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Bioreaktorok és sejt-aggregáció

Rotációs bioreaktor: speciális bioreaktor, amelyben a sejtekre ható erők egyensúlya tartja szuszpenzióban a az aggregátumokoat. A nyíróerők minimálisak. Típusok:

• High aspect rotation vessel (HARV)• Slow turning lateral vessel (STLV)

Kevertetett bioreaktorok: különböző térfogatú edények léteznek, ipari célokra akár több, mint 100 l térfogat

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011Különböző sejttípusok aggregátumainak tenyésztése bioreaktorban

Bioreaktor típus Sejttípus

Forgó bioreaktorHepG2 sejtek, humán őssejtek, humán bőr fibroblasztok, humán embrionális vesesejtek

Kevertetett bioreaktorPorcsejtek, primer egér és patkány májsejtek, L6 mioblasztok, CHO sejtek

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejt-aggregátumok felhasználása

Sejt-aggregátumok Felhasználás

CHORekombináns fehérjék szintézise

Humán embrionális őssejtek

Embrionális test (EB) kialakulása és differenciáció

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Microgravitációs sejtkultúra – Függőcsepp I.

Vájt tárgylemez

A mintát kaccsal afedőlemezre helyezzük

Olajcsepp

Vazelin

180°

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Microgravitációs sejtkultúra – Függőcsepp II.

180° 180°

180°

Idő(napok)

Az embrionális testek növekedése és a spontán csíralemez-differenciálódás

megkezdődik

0

2

5

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Egyforma embrionális testek tenyésztéséhez és az intercelluláris kapcsolatok szabályozásához szükséges mikrolemezek

40 mm

150 mm

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Aggregáció alacsony adherenciájú felszínhez• Az alacsony adherenciájú felszín segíti a

szuszpenziós sejtkultúrák kialakulását• A sejt-sejt kapcsolatok növekednek• Néhány ECM-származékkal (pl. Martigel)

borított felszín növeli a sejtek motilitását és sejtek közötti aggregációt.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A magas proliferációs képességgel rendelkező májsejtek szelekciója

Természetes aggregáció

PVLA potenciálisan jól használható mesterséges máj

kialakítására a különböző koncentrációjú borítások révén

PVLA (Poli-N-p-vinil venzil D-laktóz lakton amid)

ASGP-R

EgyébIntegrinEGF-RHGF-R

Fas

MájsejtekASGP-Rmagas

lassú proliferáció

Szferoid kialakulása

MájsejtekASGP-Ralacsony

gyors proliferáció

+EGF

Sejtalak szabályozása

Szferoid

100 mg/ml PVLA-val borított edény

PVLA bevonat koncentrációja

15-20 ng/ml PVLA-valborított edény

Kitapadás

1 mg/ml PVLAbevonat

100 mg/ml PVLAbevonat

Lekerekedés

E-Kadherin

Epevezeték

Májsejt

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejtaggregáció serkentése mesterséges módszerekkel

Polimerből álló híd képzése a sejtek között.

Típusok:

• Természetes adhéziós molekula• ECM-eredetű molekula része• Polimer mátrix

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Mesterséges sejt-aggregáció

Aggregálódott sejtekSejtek

Bifunkcionális polimer

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejtek keresztkötése biotinnal

Avidin

Sejtaggregátum

Biotinhidrazid

Perjodát-funkcionalizáltsejtek

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Felszínek kémiai módosítása

• Chitosan, természetes, biodegradábilis polimer (molekulatömeg: 810 kDa)

• Kémiailag módosított PEG (polietilén glikol)• Laktonnal módosított eudragit• PLGA nanogyöngyök• Lektinek és származékaik

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Chitosan

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Kémiailag módosított PEG

MA(PEG)n

Methyl-PEGn-AmineMethyl-(#ethyleneglycol) amine

H2NCH3

OO

OO

MA(PEG)8

M.W. 383.48Spacer arm 29.7 Å

[ ]8CH3

H2NO

MA(PEG)12


H2N[ ]12

CH3O

MA(PEG)24


[ ]24CH3

H2NO

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Lakton-módosított eudragit

pH > 6

HOOC

COOH

COOH

HOOC

COOH

COOH

Ellenionok

Ko-ionok

COO-

-OOC

-OOC

COO-

COO-

COO-

+

-

+-

+ -

+

-

+

-

+

-+

-

+

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

PLGA nanogyöngyök

Oldott polimer(PLGA)

Diszperziósfázis

Pumpa

Pumpa

Előkeverés

Mágneses keverő

Magasnyomású vízbefolyás

Magasnyomású vízkifolyás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Lektinek és származékaik I.

• A sejtfelszíni molekulák szénhidrátcsoportjait képesek megkötni a lektinek

• A lektinek, vagy fitohemagglutininek (PHA), olyan fehérjék, melyeknek nincsen sem enzimatikus sem immunológiai aktivitásuk, és reverzibilisen képesek szénhidrátokhoz kötődni azok megváltoztatása nélkül

• Mivel a lektinek specifikus, reverzibilis sejt-sejt adhéziós reakcióban vesznek részt, jól alkalmazhatóak sejtfelszíni molekulák keresztkötésén keresztül a sejtadhézió serkentésére

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Lektinek és származékaik II.

• Hat lektin család ismeretes: – Legume lektinek (a pillangósvirágúak családjában) – Gabona-eredetű lektinek, – P-, C-, és S-típusú lektinek (állati fehérjék)– A pentraxinok (állati fehérjék)

• A lektinek sokfajta sejttípushoz kötődnek, amelyek különböző sejtfelszíni glikoproteinek vagy glikolipidek alkotórészei. A sejtek lehetnek vörösvértestek, leukémiás blasztok, élesztőgombák vagy baktériumok.

• A lektinek szénhidrátspecificitása is különböző lehet, mannóz, galaktóz, N-acetil-glükózamin, N-acetil-galaktózamin, L-fruktóz, és N-acetil-neraminsav.

• Mivel egy lektinmolekulán több szénhidrát-kötőhely található, képes agglutinálni a sejteket.

• A lektinek kötődése az egyes szénhidrátokra specifikus.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A lektinek által felismert N-glikánok típusai

Type PHA

Bisected di-, tridiantennary complex-type N-glycan

Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin (E-PHA)Inhibitor: GalNAc

Tri- and tetraantennary complex-type N-glycan

Phaseolus vulgaris Leukoagglutinin (L-PHA)Inhibitor: GalNAc

Tri- and tetraantennary complex-type N-glycan

Datura stramonium Agglutinin(DSA)Inhibitor: Chitotriose (GlcNAc3)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejt-aggregáció scaffoldokon

• Homogén és heterogén sejtpopulációk aggregációja

• Sejtfelszíni fehérjék biotinálása és avidin alkalmazása keresztkötő ágensként

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Nanoszerkezetű scaffold-ok

• Spontán összeszerelődő scaffold-ok• Nanokompozit anyagok• Nanoszálak

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Nanoszerkezetű anyagok felhasználása

Anyag Jellemzők Felhasználás

FullerénekSzénatomok hexagonális és pentagonális térszerkezetbe rendeződve

Gyógyszerek enkapszulációja, képalkotó vizsgálatok

Fluoreszcens „Quantum dot”-ok

Félvezetőkből készült nanokristályok

Bioszenzorok, képalkotás

LiposzómákFoszfolipid membránnal burkolt vezikulák

Gyógyszerek leadása, génterápiás alkalmazás

Dedrimerek Polimer szerkezetekGyógyszerek leadása, génterápiás alkalmazás

Arany nanorészecskék Kolloid aranyBioszenzorok, sejtszintű képalkotás

Szuper-paramágneses vas-oxid

Vas-oxid MRI kontrasztanyag

SZÖVETEK NYOMTATÁSA


Dr. Pongrácz JuditHáromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 16. Előadás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A szövetnyomtatás alapjai

• Scaffoldmentes konstrukció• Tisztított sejtek aggregált halmazait

alkalmazzák• A sejthalmazokból áll a „biotinta”• A 3D szövetkonstrukciók felépítése a

sejthalmazok spontán fúziós képességén alapul

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejthalmazok fúziója 3D szövet-konstrukciókká I.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejthalmazok fúziója 3D szövet-konstrukciókká II.

Közel helyezett sejtaggregátumok és embrionális szív mezenchima fragmentek gyűrű vagy csőszerű struktúrákká

egyesülnek

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szervek nyomtatása

3D nyomtatás: a sejthalmazokat gyors, automatizált módszerrel rétegenként, biokompatibilis anyaggal körülvéve helyezzük egymásra, így alakul ki a 3D szerkezet.

Szövetnyomtatás típusok:• Lézernyomtatás (osteoszarkóma, embrionális

carcinoma)• Tintasugaras nyomtatás (hippocampális és

kortikális neuronok)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Az első szövetnyomtató

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Érett, szervspecifikus primer sejtek I.

Biopszia Tisztítás

Sejtkultúra

TE-ben használható

sejtek

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Érett, szervspecifikus primer sejtek II.

Biopszia

Tisztítás

TE-ben használható

sejtek

Differenciálódott szöveti sejtek

Szövetspecifikusrezidens őssejtek Sejtkultúrák

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Érett, differenciálódott sejtek alkalmazása TE céljára• Forrás: biopszia vagy reszekció• Tisztítás• Expanzió in vitro tenyésztés során• Újradifferenciáltatás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Vérerek képzése szöveti nyomtatással

Fontos a megfelelő nyomóerő

alkalmazása

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

TE-vel előállított erek potenciális alkalmazása• Koszorúér betegség, bypass készítése• Trombózis kezelése• Baleseti érsérülés • Komplex szöveti szerkezetek kialakítása TE-

vel

sejt-aggregációs kultúrák

Documents