sÁn lÁ phỔi paragonimus heterotremus vÀ...

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

LƢU ANH TÚ

SÁN LÁ PHỔI Paragonimus heterotremus VÀ Paragonimus

westermani Ở VIỆT NAM: HÌNH THÁI, PHÂN TỬ,

SINH HỌC VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2018

ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

LƢU ANH TÚ

SÁN LÁ PHỔI Paragonimus heterotremus VÀ Paragonimus

westermani Ở VIỆT NAM: HÌNH THÁI, PHÂN TỬ,

SINH HỌC VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Ký sinh trùng học

Mã số: 62.42.01.05

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1. TS. Phạm Ngọc Doanh

2. TS. Bùi Khánh Linh

Hà Nội – 2018

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của chúng tôi. Các số liệu và kết

quả nêu trong luận án là trung thực, chưa từng được sử dụng trong luận án nào khác.

Hà Nội, ngày 2 tháng 3 năm 2018

Tác giả

ii

LỜI CẢM Ơ N

Trước tiên, cho phép tôi được bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Phạm Ngọc

Doanh và TS. Bùi Khánh Linh - giảng viên hướng dẫn khoa học, đã tạo điều kiện tối

đa và truyền dạy kiến thức, kinh nghiệm, hướng dẫn tôi thực hiện đề tài và viết luận án,

đồng thời luôn động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.

Xin trân trọng cảm ơn Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ quốc gia

(NAFOSTED) đã tài trợ kinh phí cho 2 đề tài mã số 106.12-2012.52 và 106-NN.05-

2016.17 để tôi được thực hiện các nội dung nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Học Viện Khoa học và Công nghệ, Ban lãnh đạo Viện

Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Phòng Quản lý tổng hợp, cùng các thầy cô trong Viện

Sinh thái và TNSV đã luôn động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn

thành luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS. Hoàng Văn Hiền cùng tập thể cán bộ Phòng Ký

sinh trùng học, Viện Sinh thái và TNSV đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi

thực hiện các thí nghiệm.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Bệnh viện Phổi Trung ương đã giúp đỡ,

động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo, các nhà khoa học,

các đồng nghiệp, bạn bè trong và ngoài Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã luôn

quan tâm, động viên và chỉ dẫn cho tôi để tôi hoàn thành luận án.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã luôn là chỗ dựa vững

chắc cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn vợ

và các con của tôi đã cho tôi thêm sức mạnh, động lực để tôi vượt qua mọi khó khăn.

Hà Nội, ngày 2 tháng 3 năm 2018

Tác giả

iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ/nghĩa tiếng Việt

CO1 Cytochrome c oxidase subunit mitochondrial gene

Gien ty thể CO1

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

Kỹ thuật hấp thụ miễn dịch liên kết enzym

dot-ELISA dot-ELISA

ELISA điểm trên giấy

DNA Deoxyribonucleic acid

ITS2 Internal transcribed spacer 2

Đoạn chèn hệ gen nhân ITS2

16S rDNA 16S ribosomal DNA/ Gien ty thể 16S

PCR Polymerase Chain Reaction

Phản ứng khuyếch đại gien

MC Metacercaria

LC Lào Cai

YB Yên Bái

QT Quảng Trị

SLP Sán lá phổi

iv

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. ii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................ iii

MỤC LỤC ....................................................................................................................... iv

DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... vii

DANH MỤC HÌNH...................................................................................................... viii

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................ 4

1.1. Khái quát chung về sán lá phổi ................................................................................ 4

1.1.1. Lịch sử phát hiện, hình thái, cấu tạo và phân loại sán lá phổi ............................ 4

1.1.2. Vòng đời phát triển của sán lá phổi .......................................................................... 8

1.1.3. Dịch tễ học bệnh sán lá phổi .................................................................................... 11

1.1.4. Đặc điểm lâm sàng và tổn thương bệnh sán lá phổi ............................................ 13

1.1.5. Chẩn đoán bệnh sán lá phổi .................................................................................... 14

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA): ....................................................... 16

1.1.6. Điều trị bệnh sán lá phổi .......................................................................................... 17

1.1.7. Phòng bệnh sán lá phổi ............................................................................................ 18

1.2. ........... Tình hình nghiên cứu hai loài Paragonimus heterotremus và Paragonimus

westermani trên thế giới ......................................................................................................... 19

1.2.1. Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus heterotremus ................................................ 19

1.2.2. Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus westermani ................................................... 20

1.3. Tình hình nghiên cứu sán lá phổi và bệnh sán lá phổi ở Việt Nam ..................... 21

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 25

2.1. Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 25

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................................... 25

2.1.3. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................................. 25

2.1.4. Thời gian nghiên cứu ................................................................................................... 26

2.2. Phương pháp tiếp cận và thiết kế thí nghiệm ..................................................................... 26

v

2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................................... 27

2.3.1. Xét nghiệm cua thu metacercaria của sán lá phổi ......................................................... 27

2.3.2. Điều tra tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria sán lá phổi ở cua suối tại địa điểm

nghiên cứu....................................................................................................................................... 29

2.3.3. Nghiên cứu hình thái metacercaria .................................................................................. 29

2.3.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử của loài Paragonimus heterotremus và

Paragonimus westermani .............................................................................................................. 30

2.3.5. Gây nhiễm cho vật chủ chính .................................................................................. 31

2.3.6. Nghiên cứu hình thái sán lá phổi trưởng thành .................................................. 31

2.3.7. Xác định vai trò vật chủ chứa .................................................................................. 32

2.3.8. Xác định vật chủ ngoài tự nhiên của sán lá phổi ................................................. 32

2.3.9. Nghiên cứu sức sống của metacercaria ................................................................. 35

2.3.10. Nghiên cứu phản ứng dot-ELISA chẩn đoán bệnh sán lá phổi ........................ 36

2.3.10.1. Nguyên vật liệu và hóa chất ..................................................................................... 36

2.3.10.2. Quy trình thực hiện dot-ELISA .............................................................................. 36

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 40

3.1. Kết quả xác định phương pháp xét nghiệm cua và điều tra tình hình nhiễm

metacercaria ở cua suối tại các địa điểm nghiên cứu ........................................................... 40

3.1.1. Xác định phương pháp xét nghiệm cua tìm metacercaria sán lá phổi ........................ 40

3.2. Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử của sán lá phổi ............... 47

3.2.1. Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử của loài P. westermani 47

3.2.2. Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử của loài P. heterotremus .

...................................................................................................................................... 54

3.3. ............... Một số đặc điểm sinh học của sán lá phổi Paragonimus heterotremus và

Paragonimus westermani ....................................................................................................... 59

3.3.1. Vật chủ trung gian thứ nhất .................................................................................... 59

3.3.2. Vật chủ chính ngoài tự nhiên của sán lá phổi ................................................................ 69

3.3.3. Sự phát triển của sán lá phổi ở vật chủ chứa và vật chủ chính ......................... 72

3.3.4. Sức sống của metacercaria sán lá phổi ở các điều kiện khác nhau .................. 81

3.4. Thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh sán lá phổi .................... 85

3.4.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ............................................................................. 85

3.4.2. Xác định nồng độ kháng nguyên và thời gian phản ứng ở 37°C ................................. 87

vi

3.4.3. Xác định thời gian phản ứng ở điều kiện nhiệt độ 20°C ..................................... 88

3.4.4. Xác định thời gian phản ứng ở điều kiện nhiệt độ 10°C ..................................... 89

3.4.5. Xác định thời gian phản ứng ở điều kiện nhiệt độ 4oC .................................................. 90

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 94

KẾT LUẬN .............................................................................................................................. 94

1. Phƣơng pháp xét nghiệm cua và tình hình nhiễm metacercaria của sán lá phổi ở

cua suối ...................................................................................................................................... 94

2. Đa dạng hình thái và di truyền của Paragonimus heterotremus và Paragonimus

westermani ................................................................................................................................ 94

3. Một số đặc điểm sinh học của Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani

..................................................................................................................................................... 94

4. Kỹ thuật dot-ELISA chẩn đoán miễn dịch ................................................................... 95

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................................. 95

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................................. 97

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .................................................... 98

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 99

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Những vẫn đề đã và chưa được giải quyết của 2 loài sán lá phổi

Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng để nhân bản trình tự đích nghiên cứu

ả g Metacercaria thu được với thời gian lắng cặn khác nhau

Bả g So sánh thời gian xét nghiệm ng phương pháp ép và giã-lọc cua

ả g So sánh số lượng metacercaria thu được từ 2 phương pháp xét nghiệm cua

Bảng 3.4 . Tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria sán lá phổi ở các địa điểm nghiên cứu

Bảng 3.5. Tỷ lệ và cường độ nhiễm các loài sán lá phổi ở cua suối

Bảng 3.6. Hình dạng và kích thước các dạng metacercaria của loài P. westermani

Bảng 3.7. Sai khác vị trí nucleotide của trình tự gen 16S giữa dạng diploid và triploid P.

westermani

Bảng 3.8. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu ốc thu từ Việt Nam so với các loài thuộc

giống Gammatricula dựa vào trình tự gen CO1.

Bảng 3.9. Kích thước ấu trùng sán lá phổi trong cơ thể ốc

Bảng 3.10. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá phổi ở ốc tại các địa điểm nghiên cứu

Bảng 3.11. Vật chủ ốc của các loài sán lá phổi ở các nước và Việt Nam

ả g . Kết quả gây nhiễm metacercaria P. westermani cho chuột bạch

ả g . Kích thước metacercaria mới thoát nang và sán non thu từ chuột bạch thí

nghiệm sau gây nhiễm 30 ngày

Bảng 3.14. Kết quả gây nhiễm P. westermani cho động vật nuôi

Bảng 3.15. Kích thước sán thu từ phổi m o sau 170-180 ngày gây nhiễm

Bảng 3.16. Sức sống của metacercaria ở điều kiện nhiệt độ phòng (25-30oC) trong nước

muối sinh lý

Bảng 3.17. Sức sống của metacercaria trong dung dịch nước muối sinh lý tại 4oC ở các

mật độ khác nhau

Bảng 3.18. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng dot-ELISA

Bảng 3.19. Thời gian phản ứng ELISA ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Hình dạng chung của sán lá phổi Paragonimus

Hình 1.2. Hình dạng chung của metacercaria sán lá phổi Paragonimus

Hình 1.3. Hình dạng chung cercaria của sán lá phổi Paragonimus

Hình 1.4. Hình dạng trứng sán lá phổi Paragonimus

Hình 1.5. Vòng đời phát triển của loài Paragonimus westermani

Hình 2.1. Địa điểm nghiên cứu

Hình 2.2. Sơ đồ nội dung nghiên cứu

Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm xác định vật chủ trung gian thứ nhất

Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm xác định vật chủ chính

Hình 2.5. Chuẩn bị nhỏ huyết thanh đối chứng và kháng nguyên lên giấy nitrocellulose

Hình 3.1. Các loài cua suối bắt được ở các địa điểm nghiên cứu

Hình 3.2. Metacercaria sán lá phổi tìm thấy ở cua suối thu tại Quảng Trị

Hình 3.3. Metacercaria sán lá phổi tìm thấy ở cua suối thu tại Yên Bái và Lào Cai

Hình 3.4. Paragonimus westermani metacercaria thu từ cua suối bắt tại Yên Bái

Hình 3.5. Các dạng P. westermani metacercaria thu từ cua suối tại tỉnh Quảng Trị.

Hình 3.6. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần thể P. westermani dựa trên trình tự

ITS2 được xây dựng b ng phương pháp Maximum Likelihood.

Hình 3.7. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần thể P. westermani dựa trên trình tự

gen 16S được xây dựng b ng phương pháp Maximum Likelihood.

Hình 3.8. Metacercaria loài P. heterotremus thu từ Yên Bái và Lào Cai

Hình 3.9. Metacercaria loài P. heterotremus thu từ Quảng Trị

Hình 3.10. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần thể P. heterotremus dựa trên trình

tự ITS2 được xây dựng b ng phương pháp Maximum Likelihood.

Hình 3.11. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần thể P. heterotremus dựa trên trình

tự CO1 được xây dựng b ng phương pháp Maximum Likelihood.

Hình 3.12. Ốc nhiễm ấu trùng Microcercaria

Hình 3.13. Trình tự CO1 của loài ốc nhiễm microcercaria thu từ Quảng Trị tương đồng

cao nhất (99%) với loài S. quangtriensis.

ix

Hình 3.14. Trình tự CO1 của loài ốc nhiễm microcercaria thu từ Yên Bái và Lào Cai

tương đồng cao nhất (91%) với loài G. fujiansis.

Hình 3.15. Trình tự CO1 của loài ốc nhiễm microcercaria thu từ Yên Bái và Lào Cai

tương đồng cao nhất (91%) với loài G. fujiansis.

Hình 3.16. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các loài ốc thuộc họ Pomatiopsidae.

Hình 3.17. Trình tự ITS2 của cercaria thu từ ốc Triculinae gen sp.1 tại Yên Bái và Lào

Cai 100% tương đồng với loài P. heterotremus.

Hình 3.18. Trình tự ITS2 của cercaria thu từ ốc Triculinae gen sp.2 tại Quảng Trị 100%

tương đồng với loài P. proliferus.

Hình 3.19. Trình tự ITS2 của cercaria thu từ ốc S. quangtriensis tại Quảng Trị 100%

tương đồng với loài P. westermani.

Hình 3.20. Cercaria (trên) và redia (dưới) của các loài sán lá phổi

Hình 3.21. Ốc vật chủ trung gian của các loài sán lá phổi

Hình 3.22. Trứng sán lá phổi Paragonimus sp. (a-c) và sán lá (d) thu từ mẫu phân của

mèo rừng tại Quảng Trị

Hình 3.23. Trình tự ITS2 của trứng sán lá phổi tương đồng với loài P. westermani.

Hình 3.24. Trình tự ITS2 của trứng sán lá phổi tương đồng với P. heterotremus.

Hình 3.25. Trình tự của trứng sán lá phổi tương đồng với loài P. skrjabini.

Hình 3.26. Trình tự ITS2 của trứng sán lá tương đồng với loài Pharyngostomum

cordatum.

Hình 3.27. Trình tự D-Loop từ các mẫu phân dương tính sán lá phổi tương đồng cao với

trình tự của mèo rừng, Prionailurus bengalensis.

Hình 3.28. Sự phát triển của sán lá phổi P. westermani ở động vật thí nghiệm.

Hình 3.29. Paragonimus westermani thu ở m o thí nghiệm sau gây nhiễm 120 ngày.

h . Bệnh tích phổi m o nhiễm sán lá phổi P. westermani (mũi tên chỉ ổ apxe, ên

trong thường chứa 2 cá thể sán, tổ chức phổi ị viêm).

Hình 3.31. Khác nhau về kích thước sán non thu ở cơ (a) và gan ( ) của chuột bạch sau

gây nhiễm 1 tháng.

Hình 3.32. Sự phát triển của P. heterotremus ở động vật thí nghiệm.

Hình 3.33. Bệnh tích đại thể phổi mèo nhiễm sán lá phổi P. heterotremus.

Hình 3.34. Sức sống của metacercaria ở điều kiện nhiệt độ phòng (25-30oC) trong nước

muối sinh lý.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=56139&lvl=3&lin=f&keep=1&srchmode=1&unlock

x

Hình 3.35. Sức sống của P. westermani metacercaria theo thời gian bảo quản ở 4oC ở các

mật độ khác nhau.

Hình 3.36. Sức sống của P. heterotremus metacercaria theo thời gian bảo quản ở 4oC ở

các mật độ khác nhau.

Hình 3.37. Metacercariae thoát khỏi nang ở nhiệt độ 4oC sau 2 tháng ở mật độ 200

metacercaria/2ml.

Hình 3.38. Kết quả phản ứng dot-ELISA với huyết thanh.

Hình 3.39. Phản ứng dot-ELISA với các nồng độ kháng nguyên và thời gian ủ khác nhau

ở điều kiện 37oC.

Hình 3.40. Thời gian hiện màu của phản ứng dot-ELISA ở 37oC.

Hình 3.41. Phản ứng dot-ELISA ủ với huyết thanh ở thời gian khác nhau ở 20oC.

Hình 3.42. Thời gian hiện màu của phản ứng ở 20oC.

Hình 3.43. Phản ứng dot-ELISA ủ với huyết thanh ở các thời gian khác nhau ở 10oC.


Hình 3.45. Phản ứng dot-ELISA ủ với huyết thanh ở các thời gian khác nhau ở 4oC.


1

MỞ ĐẦU

Sán lá phổi (SLP) thuộc giống Paragonimus, ký sinh ở phổi người và động vật,

gây nên bệnh sán lá phổi (paragonimiasis) có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của

người và động vật. Nguyên nhân nhiễm bệnh do ăn phải ấu trùng cảm nhiễm

metacercaria từ vật chủ trung gian thứ hai (chủ yếu là cua suối) hoặc sán non từ vật chủ

chứa [1]. Người bị nhiễm sán lá phổi có biểu hiện gầy yếu, khó thở, ho từng cơn, khạc ra

đờm có máu màu gỉ sắt, dễ bị chẩn đoán nhầm với lao phổi hoặc các bệnh khác ở phổi,

gây khó khăn cho công tác chẩn đoán và trị bệnh [1, 2].

Hơn 50 loài SLP thuộc giống Paragonimus đã được mô tả [1], trong số đó có 7

loài gây bệnh cho người: bao gồm 2 loài gây bệnh ở châu Mỹ, 2 loài ở châu Phi và 3 loài

ở châu Á [1, 2]. Tại châu Á, loài P. heterotremus gây bệnh cho người ở khu vực Nam Á

(Ấn Độ và Sri Lanka), Đông Nam Á (Thái Lan, Lào, Việt Nam) và 3 tỉnh phía Nam

Trung Quốc; loài P. westermani gây bệnh ở các nước Bắc Á (Nhật Bản, Hàn Quốc,

Trung Quốc, Đài Loan) và Philippines; ngoài ra loài P. skrjabini gây bệnh cho người tại

Nhật Bản và Trung Quốc [1].

Ở Việt Nam, SLP và bệnh SLP được quan tâm nghiên cứu trong hơn 20 năm qua

ở các tỉnh miền Bắc và Bắc Trung Bộ [3-24]. Cho đến nay, 7 loài SLP đã được phát hiện,

bao gồm P. heterotremus, P. bangkokensis, P. proliferus, P. vietnamensis,

P. westermani, P. skrjabini và P. harinasutai [22]. Trong số đó gồm cả 3 loài có khả

năng gây bệnh cho người tại châu Á là P. heterotemus, P. westermani và P. skrjabini.

Tuy nhiên, loài P. skrjabini hiếm gặp, mới tìm thấy ở cua suối tại Thanh Hóa với tỷ lệ

nhiễm thấp; loài P. heterotremus phân bố phổ biến ở các tỉnh miền Bắc và loài

P. westermani phổ biến ở các tỉnh Bắc Trung Bộ với tỷ lệ nhiễm metacercaria ở cua suối

rất cao [22]. Vì vậy, hai loài P. heterotremus và P. westermani cần được quan tâm nghiên

cứu.

Loài P. heterotremus đã được nghiên cứu về dịch tễ, bệnh học và vòng đời phát

triển [3-14], loài P. westermani mới chỉ dừng ở mức độ phát hiện metacercaria ở cua suối

tại Bắc Trung Bộ (19). Nhiều vấn đề về hai loài SLP này chưa được nghiên cứu: loài

P. heterotremus có phân bố ở miền Trung và P. westermani có phân bố ở miền Bắc hay

không? Tính đa dạng về hình thái metacercaria, đa dạng di truyền phân tử và đặc điểm

2

sinh học (như sức sống của metacercaria, vật chủ tự nhiên, vai trò vật chủ chứa trong

vòng đời phát triển…). Hơn nữa, các ca bệnh SLP vẫn được phát hiện [20]. Bệnh SLP

chủ yếu xuất hiện ở các tỉnh miền núi, vì vậy việc nghiên cứu kỹ thuật chẩn đoán nhanh

bệnh SLP tại thực địa, giúp điều trị bệnh kịp thời, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng là

cần thiết. Từ các cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Sán lá phổi

Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani ở Việt Nam: hình thái, phân tử,

sinh học và chẩn đoán miễn dịch”.

Mục tiêu chung của đề tài:

Hiểu biết về hai loài SLP P. heterotremus và P. westermani, cung cấp cơ sở khoa

học cho việc chẩn đoán và phòng trị bệnh SLP, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Mục tiêu cụ thể:

1. Xác định được phương pháp xét nghiệm cua suối tốt nhất để thu metacercaria và xác

định tình hình nhiễm metacercaria của SLP ở cua suối tại tỉnh Lào Cai, Yên Bái,

Quảng Trị.

2. Xác định được sự đa dạng hình thái metacercaria và đa dạng di truyền phân tử của hai

loài P. heterotremus và P. westermani.

3. Xác định được một số đặc điểm sinh học của hai loài P. heterotremus và

P. westermani.

4. Thiết lập được phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh SLP tại thực địa, giúp điều

trị bệnh kịp thời, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung nghiên cứu: Để đạt được các mục tiêu trên, đề tài thực hiện các nội dung

nghiên cứu sau:

1. Nghiên cứu phương pháp xét nghiệm cua suối để thu metacercaria và xác định tình

hình nhiễm metacercaria của SLP ở cua suối tại tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Quảng Trị.

2. Nghiên cứu tính đa dạng hình thái metacercaria và đa dạng di truyền phân tử của hai

loài SLP P. heterotremus và P. westermani.

3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học hai loài P. heterotremus và P. westermani, gồm:

- Xác định vật chủ trung gian thứ nhất và vật chủ chính ngoài tự nhiên.

- Xác định sự phát triển của sán lá phổi ở vật chủ chính và vai trò vật chủ chứa trong

vòng đời phát triển của P. heterotremus và P. westermani.

- Nghiên cứu sức sống của metacercaria.

3

4. Thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh SLP.

- Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh

SLP.

- Xác định nồng độ kháng nguyên của phản ứng.

- Xác định thời gian phản ứng ở các điều kiện nhiệt độ 37oC, 20

oC, 10

oC và 4

oC,

tương ứng với nhiệt độ các mùa trong năm ở miền Bắc.

4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Khái quát chung về sán lá phổi

1.1.1. Lịch sử phát hiện, hình thái, cấu tạo và phân loại sán lá phổi

Trường hợp nhiễm SLP của động vật có vú đầu tiên trên thế giới được phát hiện bởi

Diesing từ một con rái cá (Pteronura brasiliensis) ở Brazin năm 1828. Hai mươi năm

sau, ông đã đặt tên cho loài ký sinh là Distomum rude. Năm 1878, Ker ert mô tả một loài

SLP từ phổi của con hổ đã chết tại vườn bách thú Amsterdam với tên là Distoma

westermani. Năm 1899, Braun đã thành lập giống Paragonimus gồm các loài ký sinh ở

phổi, với loài chuẩn là P. westermani. Giống sán lá phổi an đầu được đặt trong họ

Fasciolidae, sau đó được chuyển sang họ Troglotrematidae. Năm 1939, Dollfus thành lập

họ Paragonimidae chỉ gồm một giống Paragonimus [1].

Phân loại truyền thống của các loài SLP dựa vào đặc điểm hình thái của sán trưởng

thành và metacercaria (giai đoạn ấu trùng ở vật chủ trung gian thứ hai), nhưng ít khi dựa

vào trứng và cercaria (giai đoạn ấu trùng ở vật chủ trung gian thứ nhất).

1.1.1.1. Sá trưởng thành

SLP trưởng thành có hình hạt cà phê (hình 1.1). Cơ thể dài 7-15 mm, rộng 3-8 mm

và dày 3-5 mm. Các đặc điểm hình thái quan trọng được sử dụng trong phân loại SLP bao

gồm: hình dạng cơ thể, tỷ lệ chiều dài/rộng cơ thể, kích thước và tỷ lệ của giác

miệng/giác bụng, mức độ phân nhánh của tinh hoàn và buồng trứng, gai cơ thể [25].

Hình 1.1. Hình dạng chung của sán lá phổi Paragonimus [25]

5

Tỷ lệ chiều dài/rộng cơ thể khác nhau giữa các loài SLP. Một số loài (như

P. skrjabini, P. proliferus và P. amazonicus) có dạng thon dài, các loài khác có chiều

rộng gần b ng chiều dài cơ thể.

Kích thước của giác miệng và giác bụng, cũng như tỷ lệ của chúng đã được sử

dụng để phân biệt các loài SLP. Loài P. heterotremus có giác miệng lớn gấp đôi giác

bụng, nhưng ở những loài khác kích thước giác miệng và giác bụng gần như ng nhau,

trong khi loài P. proliferus có giác bụng hơi lớn hơn giác miệng.

Buồng trứng và tinh hoàn của P. westermani điển hình có 5-6 thùy, trong khi các

loài khác phân chia thành nhiều nhánh. Tinh hoàn có kích thước lớn ở P. macrorchis,

nhưng tương đối nhỏ ở P. harinasutai và P. amazonicus.

Ở hầu hết các loài SLP, gai trên bề mặt cơ thể xếp đơn lẻ, nhưng một số loài (như

P. ohirai, P. bangkokensis, P. compactus, P. proliferus và P. siamensis) có gai xếp thành

nhóm [25].

1.1.1.2. Metacercaria

Metacercaria là giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm ở vật chủ trung gian thứ hai. Đặc

điểm đặc trưng của metacercaria SLP là ruột uốn lượn và túi bài tiết lớn chứa đầy hạt

glycogen (hình 1.2). Các đặc điểm hình dạng, kích thước metacercaria và độ dày lớp vỏ

được sử dụng để phân biệt giữa các loài [1, 25]. Metacercaria của hầu hết các loài đều có

một hoặc hai lớp vỏ có độ dày khác nhau, nhưng số ít loài như P. mexicanus và

P. proliferus không có vỏ nang. Metacercaria của P. westermani có nhiều lớp vỏ hơn các

loài khác.

Hình 1.2. Hình dạng chung của metacercaria sán lá phổi Paragonimus [25]

6

Về kích thước, metacercaria của SLP được chia thành 3 nhóm: nhóm có kích

thước lớn (như P. vietnamensis, P. harinasutai…), nhóm có kích thước trung bình

(P. westermani, P. bangkokensis…) và nhóm có kích thước nhỏ (P. heterotremus). Tuy

nhiên, hình thái và kích thước metacercaria của cùng một loài SLP dao động đáng kể,

điển hình là sự đa dạng của loài P. westermani [1, 25]. Trái lại, metacercaria của một số

loài SLP lại giống nhau về hình dạng và kích thước; ví dụ sự giống nhau giữa

metacercaria của loài P. vietnamensis và P. harinasutai; giữa loài P. westermani và

P. skrjabini đã được ghi nhận [22]. Trong những trường hợp này, các đặc điểm hình thái

của metacercaria thoát khỏi nang có ích trong việc phân biệt giữa các loài SLP [1, 22,

25].

1.1.1.3. Cercaria

Cercaria là giai đoạn ấu trùng ở vật chủ trung gian thứ nhất. Cercaria của các loài SLP

thuộc nhóm Microcercaria, với đặc trưng có stylet ở phần đầu và đuôi ngắn (hình 1.3)

[25]. Cercaria của các loài trong giống SLP rất giống nhau về hình thái và kích thước,

nên khó có thể phân biệt chúng ở cấp độ loài. Hiện nay chưa có nhiều số liệu về ấu trùng

cercaria của các loài SLP [1].

Hình 1.3. Hình dạng chung cercaria của sán lá phổi Paragonimus [25]

7

1.1.1.4. Trứng

Trứng SLP có hình dạng không đối xứng, một đầu to và một đầu nhỏ, đầu to có

nắp (hình 1.4). Mặc dù có sự khác nhau về kích thước trứng giữa các loài, nhưng rất khó

để phân biệt trứng giữa các loài SLP b ng hình thái [1, 25]. Hiện nay, trứng SLP được

định loại đến loài b ng kỹ thuật phân tử [22].

Hình 1.4. Hình dạng trứng sán lá phổi Paragonimus [25]

1.1.1.5. Phân loại sán lá phổi

Đến nay hơn 50 loài sán lá phổi thuộc giống Paragonimus đã được mô tả, phần

lớn các loài phân bố ở châu Á [1]. Phân loại truyền thống chủ yếu dựa vào đặc điểm hình

thái sán của trưởng thành và metacercaria. Tuy nhiên, các đặc điểm hình thái để phân biệt

các loài SLP tương đối ít so với số lượng lớn loài trong giống Paragonimus, vì vậy đôi

khi gặp khó khăn trong việc phân biệt giữa những loài có quan hệ gần [26].

Sự ra đời của phân loại phân tử đã thúc đẩy nhiều nghiên cứu ở mức độ phân tử

của giống Paragonimus. Các trình tự Deoxyribonucleic acid (DNA) của hệ gen nhân

(bao gồm các gen và các đoạn chèn) và hệ gen ty thể từ lâu đã được sử dụng để nghiên

cứu mối quan hệ phân tử và phân loại giun sán. Đối với sán lá phổi, trình tự đoạn chèn

thứ hai the second internal transcribed spacer (ITS2) của hệ gen nhân là chỉ thị tốt để

phân biệt giữa các loài và trình tự gen Cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1) của hệ gen

ty thể là chỉ thị hữu ích để nghiên cứu các quần thể trong loài [27]. Hiện nay có hàng

trăm trình tự CO1 và ITS2 của các loài SLP trên GenBank và một số ít trình tự NADH

dehydrogenase subunit 1 (nad1) và 28S [29]. Ngoài ra, trình tự 16S rDNA có ý nghĩa

trong việc nghiên cứu các quần thể trong loài, cũng như phân iệt dạng lưỡng bội (2n) và

tam bội (3n) của loài P. westermani, chúng khác nhau ở 2 vị trí nucleotide [28].

8

Phân loại SLP gặp phải một số khó khăn do sự đa dạng giữa các quần thể của cùng

một loài về hình thái metacercaria, di truyền, sinh học và khả năng gây bệnh [1]. Phân

tích phân tử đã khẳng định một số loài là đồng danh của các loài khác. Ví dụ,

P. iloktuenensis và P. sadoensis là đồng danh của P. ohirai; loài P. hokuoensis và

P. microrchis là đồng danh của P. proliferus và P. harinasutai, tương ứng. Một số loài

khác trở thành phân loài, như P. miyazakii được xếp là phân loài P. skrjabini miyazakii.

Phân tích phân tử dựa trên trình tự gen ty thể hoặc gen nhân đánh giá được sự đa

dạng di truyền của các mẫu nghiên cứu, nhưng đôi khi không chỉ ra ranh giới phân biệt

giữa các loài. Sự khó khăn này dẫn đến việc sử dụng thuật ngữ "loài phức" (complex

species) để chỉ một nhánh bao gồm các loài bí ẩn (cryptic species), loài đa hình và các

taxon đang trong quá trình hình thành loài [29]. Phân tích tiến hóa phân tử của các loài

SLP ở châu Á cho thấy ngoài 2 loài P. vietnamensis và P. macrorchis làm thành các

nhánh riêng biệt, các loài khác làm thành 4 loài phức, bao gồm P. westermani, P. ohirai,

P. skrjabini và P. heterotremus [27]. Vì vậy, kết hợp định loại hình thái với phân tích

phân tử, đặc biệt là trình tự CO1 và ITS2, cho kết quả định loài SLP chính xác và thường

được sử dụng trong các công bố gần đây [27, 29].

1.1.2. Vòng đời phát triển của sán lá phổi

Các loài sán lá phổi có vòng đời phát triển phức tạp, cần trải qua 3-4 vật chủ, bao

gồm vật chủ chính, vật chủ trung gian thứ nhất, vật chủ trung gian thứ hai và vật chủ

chứa. Hình 1.1 thể hiện vòng đời phát triển của P. westermani.

Hình 1.5. Vòng đời phát triển của loài Paragonimus westermani [30]

9

1.1.2.1. Vật chủ chính

Một số loài thú ăn thịt, đặc biệt là chó và mèo, là vật chủ chính của SLP [1]. Vật

chủ bị nhiễm bệnh do ăn phải vật chủ trung gian 2 bị nhiễm mầm bệnh (metacercaria)

hoặc vật chủ chứa. Thời gian phát triển đến sán trưởng thành ký sinh ở phổi tùy thuộc

vào loài sán lá phổi và loài vật chủ, có thể từ 30 ngày đến hơn 4 tháng [25]. Tính thích

nghi với vật chủ khác biệt giữa các loài SLP, thậm chí giữa các quần thể thuộc cùng một

loài, thấy rõ nhất là ở nhóm loài P. westermani. Người bị nhiễm 7 loài SLP. Trong vật

chủ cuối cùng, SLP trưởng thành thường sống thành cặp tạo thành ổ apxe ở phổi vật chủ.

Tuy nhiên, cũng có thể tìm thấy sán không cặp đôi của P. westermani [1, 25].

Theo phương pháp truyền thống, việc xác định vật chủ chính của giun sán nói

chung và SLP nói riêng là dựa vào hình thái. Vật chủ được định tên loài, sau đó mổ khám

để thu sán lá trưởng thành, định tên loài sán thu được, từ đó xác định vật chủ tự nhiên của

loài SLP. Tuy nhiên, hiện nay việc mổ khám vật chủ để thu sán trưởng thành rất khó thực

hiện, đặc biệt là đối với động vật hoang. Với sự tiến bộ của khoa học, kỹ thuật phân tử đã

được sử dụng để định loài sán dây Echinococcus multilocularis và vật chủ của nó từ mẫu

phân động vật hoang [31]. Mẫu phân động vật chia làm hai phần: một phần được xét

nghiệm để thu trứng sán, mẫu trứng này được định loài b ng kỹ thuật phân tử dựa trên

trình tự ITS2, phần mẫu phân còn lại được phân tích phân tử để xác định loài vật chủ. Cơ

sở khoa học của phương pháp này là mẫu phân của động vật chứa các tế bào niêm mạc

ruột bị bong tróc, vì vậy có thể dùng các bộ sinh phẩm để tách chiết DNA từ mẫu phân

động vật, từ đó dùng kỹ thuật PCR để nhân bản trình tự đích, thường là vùng Dloop của

hệ gen ty thể với cặp mồi thích hợp, sau đó đọc trình tự gen, phân tích so sánh để xác

định loài vật chủ [31]. Đây là cơ sở để áp dụng kỹ thuật này trong việc xác định vật chủ

chính của SLP ngoài tự nhiên thông qua thu thập mẫu phân động vật ăn thịt hoang dã,

mặc dù ở thực địa không biết mẫu phân đó của loài động vật nào.

1.1.2.2. Vật chủ trung gian thứ nhất

Cũng như các loài sán lá khác, vật chủ trung gian thứ nhất của SLP là các loài ốc

nước ngọt. Miracidium nở ra từ trứng SLP ơi trong nước, tìm vật chủ ốc thích hợp để

xâm nhập. Trong cơ thể vật chủ ốc, ấu trùng SLP phát triển qua các giai đoạn sporocyst,

redia và cercariae. Thời gian phát triển đến cercaria trưởng thành thoát khỏi ốc tùy thuộc

vào nhiệt độ, có thể từ 3-5 tháng [1].

10

Số liệu về vật chủ trung gian thứ nhất của các loài SLP còn rất hạn chế, có thể vì

tỷ lệ nhiễm ấu trùng cercaria SLP ở vật chủ trung gian ốc tương đối thấp, thường dưới

1% [14, 32-34].

Xác định vật chủ ốc của SLP thường dựa vào hình thái của ấu trùng cercaria và

hình thái của vật chủ ốc. Cercaria của SLP thuộc nhóm microcercaria đặc trưng ởi đuôi

ngắn và stylet ở phần đầu. Định loại vật chủ ốc dựa vào hình thái cũng gặp khó khăn vì

số lượng loài trong một giống thường rất lớn, dễ dẫn đến nhầm lẫn [35, 36], vì vậy giám

định loài ở mức độ phân tử là cần thiết. Đối với vật chủ ốc, trình tự gen CO1 thường

được sử dụng để định loài [35, 36]. Vì vậy, để xác định chính xác vật chủ ốc của SLP,

cần kết hợp phương pháp định loại hình thái và phân tử để xác định loài cả ấu trùng SLP

và vật chủ ốc của chúng.

1.1.2.3. Vật chủ trung gian thứ hai

Trái với hiểu biết còn hạn chế về vật chủ trung gian thứ nhất, vật chủ trung gian

thứ hai của hầu hết các loài SLP đã được công bố. Vật chủ trung gian thứ hai là một số

loài tôm và cua nước ngọt, thường là cua suối thuộc họ Potamidae [1]. Một loài cua có

thể bị nhiễm nhiều hơn một loài SLP, thậm chí 4 hoặc 5 loài [22, 37, 38], cho thấy tính

thích nghi vật chủ thấp.

Hai con đường nhiễm ấu trùng cercaria sang cua là: cua ăn ốc nhiễm cercaria hoặc

cercaria xâm nhập qua bề mặt cơ thể của cua. Sự phân bố của metacercaria trong cơ thể

cua có thể tùy vào từng loài sán lá hoặc tùy vào từng loài cua [39], nhưng thường thấy ở

cơ, mang và gạch cua [1].

1.1.2.4. Vật chủ chứa (Paratenic host)

Vật chủ chứa bị nhiễm SLP do ăn phải metacercaria ở VCTG2. Trong cơ thể vật

chủ chứa, ấu trùng SLP không phát triển đến trưởng thành ở phổi, mà tồn tại dưới dạng

sán non ở cơ hoặc nội tạng [1]. Thời gian cần ở vật chủ chứa từ 1-40 ngày để có thể

nhiễm cho vật chủ chính [1]. Vật chủ chứa được xác định là nguồn lây nhiễm chính sang

các động vật ăn thịt lớn, vì các loài động vật này có thể không ăn cua suối [40]. Trong thí

nghiệm, động vật gặm nhấm và một số loài chim (gà, vịt và ngỗng) được xác định là vật

chủ chứa của SLP [1]. Ngoài tự nhiên, lợn rừng và hươu được xác định là vật chủ chứa

truyền bệnh SLP cho con người ở Nhật Bản [41, 42].

11

1.1.3. Dịch tễ học bệnh sán lá phổi

Các loài thuộc giống SLP phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Mặc dù

vật chủ chính chủ yếu là động vật ăn thịt, bao gồm cả động vật hoang dã và động vật

nuôi, nhưng có ít dữ liệu về tỷ lệ nhiễm SLP ở động vật. Mối quan tâm lớn nhất là bệnh

SLP trên người. Bệnh SLP thường ở các vùng cục bộ ở châu Á, châu Phi và châu Mỹ

[29].

Ở châu Phi, các ca bệnh chủ yếu xuất hiện ở Cameroon, Bờ Biển Ngà và Nigeria.

Bệnh nhân bị nhiễm các loài P. uterobilateralis và P. africanus.

Ở Bắc Mỹ, P. kellicotti là loài duy nhất nhiễm ở người, trong khi ở Trung và Nam

Mỹ là loài P. mexicanus.

Ở châu Á, các nước Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan đã từng được

coi là các khu vực nhiễm bệnh cao nhất, nhưng tỷ lệ mắc bệnh ở Nhật Bản, Hàn Quốc và

Đài Loan đã giảm mạnh từ những năm 1980. Tuy nhiên, gần đây sự tái xuất hiện bệnh đã

được báo cáo ở Nhật Bản [30]. Ngoài ra, các ổ bệnh mới được phát hiện ở Đông Bắc Ấn

Độ, miền Bắc Việt Nam và Lào [12, 37, 43, 44].

Các tác nhân gây bệnh SLP cho người ở châu Á là P. heterotremus,

P. westermani và P. skrjabini (bao gồm cả phân loài P. skrjabini miyazaki). Loài

P. heterotremus gây bệnh cho người ở một số nước Nam Á, Đông Nam Á và 3 tỉnh phía

Nam của Trung Quốc [1]. Loài P. westermani phân bố rộng ở châu Á, tuy nhiên, các ca

bệnh trên người do loài này chỉ gặp ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan và

Philippines [1]. Các báo cáo về bệnh SLP do P. westermani gây ra ở những nơi khác có

thể do nhầm lẫn, vì thường mặc định r ng bệnh SLP ở châu Á do loài P. westermani gây

nên. Ví dụ ở Ấn Độ, loài P. westermani được phát hiện lần đầu bởi Kerbert từ phổi của

một con hổ và sau đó được tìm thấy trong nhiều động vật hoang dã và vật nuôi khác. Vì

vậy, trước đây cứ phát hiện trứng SLP trong các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân thì được

xác định là loài P. westermani [45, 46]. Sau đó, kỹ thuật phân tử được sử dụng đã xác

định trứng trong các mẫu đờm của nhiều bệnh nhân ở Ấn Độ thuộc loài P. heterotremus

[47]. Do đó, các áo cáo trước đây cho r ng P. westermani là tác nhân gây bệnh trên

người là không chính xác. Gần đây, duy nhất một bệnh nhân nhiễm sán lá phổi ở Ấn Độ

đã được xác định nhiễm loài P. westermani dựa trên phân tích phân tử mẫu trứng thu từ

12

đờm của bệnh nhân [48]. Tuy nhiên, cần xác định nguồn gốc bệnh nhân này bị nhiễm

SLP ở đâu, ị nhiễm ở Ấn Độ hay ở vùng nào khác khi đi du lịch.

Ngoài ra, loài P. skrjabini được tìm thấy ở Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ, Thái

Lan và Việt Nam, nhưng các ca ệnh trên người do loài này mới chỉ được báo cáo ở Nhật

Bản và Trung Quốc, mà không có ở Thái Lan và Việt Nam [1].

Nhiễm bệnh SLP ở người có liên quan chặt chẽ đến thói quen ăn uống. Rất nhiều

món ăn địa phương từ cua hoặc tôm chưa được nấu chín. Nhiễm bệnh cũng có thể xảy ra

trong quá trình chế biến thực phẩm [26]. Tập quán sử dụng cua và tôm để chữa bệnh sởi

ở Hàn Quốc và Lào cũng có thể dẫn đến nhiễm SLP. Ngoài ra, ăn thịt vật chủ chứa cũng

là nguyên nhân nhiễm bệnh tại Nhật Bản, nơi người dân có tập quán ăn thịt động vật sống

[41].

Tỷ lệ nhiễm SLP có liên quan đến tuổi và giới tính. Ở một số vùng, tỷ lệ nhiễm

cao nhất được phát hiện ở trẻ em tại Ấn Độ [47], Trung Quốc [49], Việt Nam [12]. Về

giới tính, tỷ lệ nhiễm ở nam giới nói chung cao hơn ở nữ giới. Lý do có thể là vì nam giới

thường đánh bắt và ăn cua sống nhiều hơn nữ [26]. Tại Mỹ, các ca mắc SLP do nhiễm

loài P. kellicotti chủ yếu được phát hiện ở những người đàn ông đi cắm trại, những người

này thường bắt tôm và ăn sống [50].

Thay đổi thói quen ăn uống cũng ảnh hưởng tới đặc điểm dịch tễ học của bệnh

SLP. Tại Nhật Bản trong những năm 1950, tỷ lệ nhiễm cao nhất thấy ở trẻ em, gần đây

các bệnh nhân SLP chủ yếu là nam giới trung niên [51]. Điều này lý giải là vì đàn ông

Nhật Bản thích ăn thịt lợn rừng sống, các ca này chiếm tới 70% số ca nhiễm bệnh ở Nhật

Bản. Ở Thái Lan và Nigeria, những người trẻ đã dần bỏ tập quán ăn cua sống, do đó, hầu

hết các bệnh nhân SLP thuộc nhóm trung niên [26]. Ở Trung Quốc, một khảo sát gần đây

đã phát hiện tỷ lệ nhiễm SLP cao nhất tại các thành phố lớn của Thượng Hải và Trùng

Khánh [52]. Nguyên nhân là do người thành phố muốn ăn cua nhập từ các vùng nông

thôn. Cua nhiễm metacercaria từ Nhật Bản cũng có thể được xuất khẩu sang các nhà hàng

Nhật Bản ở Mỹ, vì vậy người dân ở đây ăn cua chưa nấu chín cũng có thể bị nhiễm SLP

[53, 54]. Ở Cameroon, số lượng ca mắc SLP đã giảm ở người lớn, nhưng tỷ lệ nhiễm ở

trẻ em dưới 10 tuổi vẫn còn cao [55].

13

Tỷ lệ nhiễm SLP ở nhiều nơi đã giảm, nhưng ở một số vùng bệnh vẫn còn tỷ lệ

nhiễm cao và các ổ bệnh mới vẫn được phát hiện. Nhật Bản, Đài Loan, Hàn Quốc và

Thái Lan đã thành công trong việc giảm tỷ lệ nhiễm bệnh thông qua các chiến dịch chẩn

đoán đại trà, sau đó là hóa trị liệu và giáo dục phòng chống bệnh SLP. Trung Quốc cũng

có một chương trình kiểm soát quốc gia, nhưng ệnh vẫn còn hiện diện ở nhiều khu vực,

thậm chí tỷ lệ mắc gia tăng ở một số nơi [56, 57]. Ở Nigeria, bệnh SLP là một vấn đề lớn

trong giai đoạn chiến tranh (1967-1970), sau đó gần như biến mất khỏi nhiều khu vực.

Tuy nhiên, các khảo sát gần đây cho thấy tỷ lệ nhiễm ở đất nước này tương đối cao [58].

Các vùng bệnh mới đã được tìm thấy ở Ấn Độ [42, 43, 59], Việt Nam [22] và Lào [37,

60]. Điều này gợi ý r ng bệnh SLP có thể hiện diện ở nhiều nơi khác chưa được phát

hiện.

1.1.4. Đặc điểm lâm sàng và tổn thương bệnh sán lá phổi

Sán lá phổi thường ký sinh thành từng đôi ở phổi tạo thành các ổ áp xe ở nhu mô

phổi giống như các hang lao. Nếu bị nhiễm nặng, bệnh nhân có triệu chứng nghiêm

trọng, như vỡ ổ áp xe gây tràn khí và tràn dịch màng phổi, giãn phế quản, viêm phổi, kèm

theo là đau ngực và ho ra máu, khạc ra đờm sền sệt và có màu nâu đỏ. Sán lá phổi có thể

gây tử vong cho người do suy nhược cơ thể và những cơn ho ra máu.

Nếu bị nhiễm nhẹ thì bệnh nhân thể hiện các triệu chứng mãn tính như ho, có đờm,

đau ngực và khó thở khi gắng sức là những dấu hiệu chính của bệnh. Khi nghe phổi thấy

tiếng ral mạnh. Bác sĩ có thể không nghĩ đến bệnh SLP khi thấy bệnh nhân có những

triệu chứng này [2].

Cũng như các ệnh giun sán khác, đặc điểm cận lâm sàng của nhiễm SLP là sự

tăng bạch cầu ái toan máu ngoại vi, sự thâm nhiễm bạch cầu ái toan trong màng phổi

hoặc mô phổi. Tuy nhiên, ngay cả trong các trường hợp đó, ác sĩ thường chẩn đoán là

viêm phổi dị ứng hoặc bệnh viêm phổi vô căn mãn tính [2].

Một số trường hợp SLP có thể ký sinh lạc chỗ ở não, cũng có khi ở tủy sống, cơ

ngực, hoặc tổ chức dưới da, gây nên các triệu chứng tại chỗ và toàn thân phức tạp, vì vậy

thường rất khó khăn trong chẩn đoán, thậm chí nguy hiểm đến tính mạng bệnh nhân [2].

Tổ thươ g bệnh học: Ấu trùng SLP sau khi được nuốt vào ruột vật chủ sẽ xuyên

qua thành ruột non vào xoang bụng, gây nên những điểm xuất huyết rải rác trên niêm

14

mạc ruột, sau đó ấu trùng xuyên qua một số tổ chức trong xoang bụng, gây tổn thương và

xuất huyết ở nhu mô gan trước khi đến phổi.

Ở phổi, sán sống từng đôi tạo thành các ổ apxe với kích thước khác nhau (1-4 cm).

Trong ổ apxe chứa chất dịch đỏ, tổ chức phổi xung quanh bị viêm, xuất huyết và tăng

sinh.

1.1.5. Chẩn đoán bệnh sán lá phổi

Chẩn đoán bệnh SLP đôi khi gặp phải khó khăn vì các triệu chứng của bệnh SLP

thường không rõ ràng [2, 30]. Ngoài ra, chẩn đoán nhầm với bệnh lao phổi và ung thư

phổi rất dễ gặp vì có sự giống nhau về lâm sàng và chồng chéo về dịch tễ học. Các

phương pháp chẩn đoán bệnh SLP bao gồm bốn nhóm: ký sinh trùng học, huyết thanh

học/miễn dịch học, chẩn đoán hình ảnh và các kỹ thuật chẩn đoán phân tử.

1.1.5.1. Chẩ đoá ký si h trù g học

Phát hiện trứng SLP với đặc điểm đặc trưng có nắp ở một đầu trong phân, đờm, dịch

rửa phế quản là chẩn đoán chính xác nhất. Sự phát hiện trứng trong đờm hoặc phân có thể

được thực hiện b ng kỹ thuật Kato-Katz hoặc lắng cặn. Tuy nhiên, trứng SLP không phải lúc

nào cũng phát hiện được, ngay cả ở một số bệnh nhân có sán trưởng thành trong phổi và

không bao giờ tìm thấy trứng trong giai đoạn tiền phát hoặc khi SLP ký sinh lạc chỗ [1, 2].

Tỷ lệ bệnh nhân có trứng SLP ở đờm hoặc phân chiếm khoảng 40-50% [61]. Đối với các

bệnh nhân nghi ngờ giữa nhiễm lao và nhiễm SLP, khi xét nghiệm đờm sử dụng kỹ thuật

nhuộm Ziehl – Neelsen cải tiến để nhuộm vi khuẩn lao nh m tránh phá hủy trứng SLP [62].

Để chẩn đoán bệnh SLP thể ngoài phổi, mẫu sinh thiết được nhuộm haematoxylin

và eosin. Quan sát hiển vi cho thấy một u dày, tinh thể Charcort-Leyden và các tế bào

viêm như ạch cầu ái toan, lymophocytes và bạch cầu trung tính. Sán n m ở trung tâm

của u.

1.1.5.2. Chẩ đoá h h ảnh

Các kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh được sử dụng trong chẩn đoán bệnh SLP bao

gồm chụp x-quang ngực thông thường, chụp cắt lớp vi tính, chụp cộng hưởng từ và siêu

âm.

15

Chụp x-quang ngực đã được sử dụng để chẩn đoán bệnh SLP và thường được kết

hợp với chụp cắt lớp vi tính để quan sát chi tiết hơn. Các quan sát phổ biến khi mới

nhiễm sán phổi bao gồm tràn khí ngực, tràn dịch màng phổi, sự mờ đục. Trong các ca

bệnh đã nhiễm lâu có thể thấy các tổn thương nang và nốt có đường kính nhỏ hơn 3-4 cm

và giãn phế quản. Các nang có dạng vòng tròn, ở một số ca bệnh có thể phát hiện sán ở

bên trong. Xung quanh các nang sán có thể thấy hiện tượng dày hóa màng phổi [63].

Những phát hiện này thường giống với bệnh lao phổi, ngoại trừ hiện tượng mờ đục gây ra

bởi sự di chuyển của sán là không thấy trong bệnh lao.

Trên phim chụp cắt lớp vi tính vùng ngực thấy các tổn thương dạng nang tròn

giảm bắt màu chứa đầy dịch. Sự mờ đục là dấu hiệu gợi tới đường di chuyển của sán.

Chụp cắt lớp vi tính có thể giúp phát hiện một loạt các trường hợp mắc bệnh SLP ở gan

và ổ bụng, đồng thời cung cấp thêm thông tin về nang sán và đường di chuyển, tuy nhiên,

kết quả có thể khác nhau tùy vào giai đoạn nhiễm [26].

Chụp cắt lớp và cộng hưởng từ có giá trị trong chẩn đoán nhiễm SLP ở não. Phát

hiện phổ biến nhất ở các ca mới bị bệnh SLP ở não là tổn thương dạng vòng (giống chùm

nho) đường kính khoảng 1–3 cm có phù nề xung quanh ở một bán cầu não. Ngoài ra,

phát hiện thấy sự tụ máu não và các vùng không có ranh giới rõ ràng. Khi bị nhiễm thời

gian dài thường quan sát thấy các tổn thương dạng u hạt can-xi hóa. Trong bệnh SLP ở

não mãn tính, sự can-xi hóa của các cấu trúc giống bong bóng xà phòng được quan sát

thấy trong ảnh x-quang hộp sọ. Chụp cộng hưởng từ cũng được sử dụng để chụp ảnh các

thương tổn của bệnh SLP ở cột sống [26].

1.1.5.3. Chẩ đoá miễn dịch

Kỹ thuật chẩn đoán miễn dịch để phát hiện kháng thể đã được sử dụng từ lâu để

chẩn đoán ệnh SLP [64], bao gồm các kỹ thuật xét nghiệm tiêm nội bì, xét nghiệm hấp

thụ miễn dịch liên kết enzyme ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), ELISA

điểm trên giấy (dot-ELISA).

Xét nghiệm tiêm nội bì: Đây là kỹ thuật miễn dịch được sử dụng sớm nhất. Tiêm

1 µg dịch chiết của sán đã khử lipid vào cánh tay, nếu thấy vết an đỏ xuất hiện sau 15

phút thì kết quả dương tính. Xét nghiệm này đơn giản, không tốn kém và khá nhạy,

nhưng độ đặc hiệu thấp (đôi khi thấp hơn 20%) vì các phản ứng chéo với các bệnh khác,

đặc biệt nếu kháng nguyên không tinh khiết; hoặc sự tồn tại lâu dài của kháng thể sau khi

16

điều trị. Vì vậy, kỹ thuật xét nghiệm này hiện nay chỉ được sử dụng trong khảo sát thực

địa và sàng lọc bệnh nhân, chứ không dùng để chẩn đoán riêng rẽ từng bệnh nhân.

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA):

Nhiều kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme đã được mô tả [2].

ELISA gián tiếp là một trong những kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất để phát hiện

kháng thể kháng SLP. Nhiều chế phẩm kháng nguyên đã được sử dụng để phát hiện

kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân. Các chế phẩm này bao gồm các chiết xuất kháng

nguyên thô của sán trưởng thành, sán non, các sản phẩm tiết, các peptide tái tổ hợp và các

kháng nguyên tinh khiết hoặc bán tinh khiết gồm các protease cysteine hoặc các chiết

xuất từ trứng SLP [26]. Độ đặc hiệu của các kháng nguyên chất tiết cao hơn so với các

kháng nguyên thân (100% so với 91.3%). Một số protease cysteine của P. westermani từ

dịch chiết của sán trưởng thành đã được sử dụng trong xét nghiệm miễn dịch, chẳng hạn

như protease cysteine giống cruzipain (Pw28CCP). Gần đây, một peptide tổng hợp đã

được áp dụng để phát hiện kháng thể IgG4 [26].

Kỹ thuật ELISA điểm trên giấy gọi là dot-ELISA được sử dụng tại Nhật Bản, Thái

Lan, Trung Quốc để sàng lọc và chẩn đoán phân iệt với ký sinh trùng khác. Nguyên lý

của phản ứng dot-ELISA là ELISA gián tiếp thực hiện trên giấy, không phải trên đĩa

nhựa như ELISA thông thường. Trong kỹ thuật này, kháng nguyên được nhỏ vào các ô

riêng biệt trên giấy nitrocellulose, để khô, sau đó nhúng ( locking) vào dung dịch casein

1% trong 30 phút, lấy ra để khô và bảo quản ở 4oC. Khi xét nghiệm, thực hiện theo các

ước tương tự như trong ELISA trên đĩa nhựa [65]. Nhưng đánh giá kết quả b ng mắt

thường, không cần máy đọc quang phổ. Dựa vào các ô có hiện màu hay không, màu đậm

hay nhạt ở các ô nhỏ kháng nguyên đã iết để đánh giả kết quả. Kỹ thuật này có ưu điểm

là dễ thực hiện tại thực địa, không cần máy đọc quang phổ.

Tương tự, kỹ thuật điện di trên gel SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate -

Polyacrylamide gel electrophoresis) được sử dụng để sàng lọc nhiều ký sinh trùng, các

ăng kháng nguyên tách từ gel được nhỏ vào các đĩa và sàng lọc như với ELISA [66].

Trong trường hợp này, một ăng kích thước 35-kDa là kháng nguyên mục tiêu của bệnh

SLP.

Gần đây Qiu et al. (2016) [67] phát triển một kỹ thuật ELISA nh m phát hiện

IgG4 đặc hiệu kháng nguyên SLP trong mẫu nước tiểu. Nghiên cứu cho thấy xét nghiệm

17

có độ nhạy và đặc hiệu cao. Vì thu thập mẫu nước tiểu dễ dàng và an toàn nên xét nghiệm

này là hữu ích trong sàng lọc số lượng mẫu lớn khi điều tra đại trà. Những người có mẫu

nước tiểu dương tính sẽ được thực hiện các xét nghiệm khác, như xét nghiệm bạch cầu ái

toan, chẩn đoán hình ảnh để xác định tình trạng nhiễm bệnh.

1.1.5.4. Chẩ đoá phâ tử

Chẩn đoán phân tử b ng cách khuếch đại trình tự deoxyribonucleic acid (DNA)

của ký sinh trùng đã được sử dụng để chẩn đoán ệnh SLP. Trứng trong phân hoặc đờm

được phân tích phân tử để khẳng định loài SLP. Vùng chèn ITS2 của hệ gen nhân được

khuếch đại từ 3-5 trứng P. westermani [68], hoặc chỉ từ một trứng duy nhất của

P. heterotremus [20]. Trình tự ITS2 cũng được thu nhận từ một phần mô phổi đã đúc

paraffin của bệnh nhân nghi ngờ nhiễm bệnh SLP do P. kellicotti [69].

Các đoạn dò (pro e) DNA đã được phát triển để chẩn đoán bệnh SLP. Kỹ thuật

này rất đặc hiệu và nhạy, có thể phát hiện khi chỉ có 5 trứng/gram phân [70].

Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt (Loop mediated isothermal amplification =

LAMP) đã được sử dụng để chẩn đoán nhiễm P. westermani [71]. Kỹ thuật này sử dụng

4 đoạn mồi (primer) đặc hiệu loài có khả năng nhận biết sáu vùng DNA đích. Phản ứng

có thể được hoàn thành trong một giờ ở một nhiệt độ duy nhất 60°C và có thể quan sát

thấy kết quả của phản ứng khuếch đại ngay trên ống phản ứng [72]. Kỹ thuật LAMP

không cần các thiết bị phức tạp, nhưng có độ nhạy cao hơn so với PCR thông thường. Kỹ

thuật này cũng có thể được áp dụng để định loài SLP từ các dạng ấu trùng và trứng SLP.

1.1.6. Điều trị bệnh sán lá phổi

Hiện tại có 2 loại thuốc thường được khuyến cáo để điều trị bệnh SLP là

triclabendazole và praziquantel.

Praziquantel đã được sử dụng từ lâu trong điều trị bệnh SLP. Liều lượng khuyến

cáo là 25 mg/kg x 3 lần/ngày trong 2-3 ngày. Tỷ lệ chữa khỏi thường cao hơn 95%. Tuy

nhiên, đôi khi cần phải lặp lại quá trình điều trị, đặc biệt là khi xuất hiện tràn dịch màng

phổi. Praziquantel với liều lượng 25 mg/kg trong 14 ngày hoàn toàn có hiệu quả trong

giai đoạn đầu của bệnh SLP ở não. Việc sử dụng cùng với thuốc kháng viêm đôi khi được

khuyến cáo với bệnh SLP ở não để chống lại các chất tiết ra từ sán đang chết.

Praziquantel hiếm có tác dụng phụ và thường nhẹ, bao gồm chứng mất ngủ nhẹ và thoáng

18

qua, buồn nôn, nhức đầu, chóng mặt, nôn mửa, đau ụng. Rất ít bệnh nhân thể hiện phản

ứng dị ứng sau khi sử dụng praziquantel [26].

Tricla endazole cũng hiệu quả trong việc điều trị sán lá phổi và có thể có một số

lợi thế. Chỉ cần 1 hoặc 2 liều với liều lượng thấp hơn so với praziquantel. Liều khuyến

cáo là 10 mg/kg trọng lượng, có thể được lặp lại sau 12-24 h ở các ca nhiễm nặng hoặc

20mg/kg trọng lượng cơ thể, chia làm 2 lần 10mg/kg, dùng trong cùng một ngày. Thậm

chí liều 5 mg/kg trong 3 ngày hoặc 10 mg/kg trong một ngày cũng có hiệu quả với bệnh

SLP mà không có tác dụng phụ. Triclabendazole có thể được dung nạp tốt hơn

praziquantel. Nó cũng là lựa chọn tốt hơn khi cấp thuốc cho số đông, một phần bởi vì có

thể cấp một hoặc hai liều một ngày dưới sự giám sát của ác sĩ, tránh được các vấn đề về

tuân thủ có thể phát sinh nếu bệnh nhân uống thuốc tại nhà trong vài ngày. Tuy nhiên, nó

ít hiệu quả trong các thử nghiệm quy mô nhỏ tại Philippines, Nhật Bản và Hàn Quốc

[26].

Phẫu thuật là sự can thiệp duy nhất với bệnh SLP ở não trước khi có thuốc

ithionol được sử dụng trong những năm 1960. Kể từ đó, phẫu thuật chỉ được thực hiện ở

những ca tổn thương ề mặt mà có thể tiếp cận và dễ dàng loại bỏ, đặc biệt là dưới da

hoặc trong các ca nhiễm ở màng phổi [26].

1.1.7. Phòng bệnh sán lá phổi

Để kiểm soát bệnh SLP cần tập trung vào việc giảm hoặc loại bỏ yếu tố lây truyền

bệnh. Cũng như đối với các bệnh sán truyền qua thực phẩm khác, các giải pháp bao gồm:

giảm nguồn lây nhiễm thông qua điều trị hiệu quả cho bệnh nhân và động vật nhiễm

bệnh; bảo vệ hệ thống nuôi trồng thủy sản khỏi nhiễm phân người và động vật; kiểm soát

số lượng ốc; thực hiện các chiến dịch giáo dục về bệnh để tránh ăn phải ấu trùng cảm

nhiễm từ vật chủ cua/tôm và sán non từ các vật chủ chứa.

Vì bệnh SLP là bệnh chung giữa người và động vật, có liên quan đến động vật

hoang dã và thói quen ăn uống, nên công tác kiểm soát có phần khó khăn. Tuy nhiên,

công tác phòng chống và kiểm soát đã thành công ở một số quốc gia như Nhật Bản, Hàn

Quốc và Thái Lan, b ng hóa trị liệu cho cộng đồng và các chiến dịch giáo dục. Nâng cao

nhận thức về bệnh và cách phòng chống đối với cả các chuyên gia y tế/thú y và đại chúng

là chìa khóa trong việc giảm nhiễm bệnh SLP. Sự thiếu nhận thức đã được chứng minh là

19

một trong những yếu tố góp phần làm tăng số ca mắc bệnh gần đây tại Nigeria [58]. Tại

Trung Quốc, một chương trình mới đã được xây dựng ở Trùng Khánh nh m đào tạo các

nhân viên y tế về SLP [73]. Các chiến dịch nâng cao nhận thức của người dân địa phương

cũng được thực hiện gần đây ở Mỹ hướng tới những người cắm trại và đi ca-nô, những

người có thể ăn tôm trong quá trình dã ngoại [74] và ở Colom ia hướng tới các em học

sinh [75].

1.2. Tình hình nghiên cứu hai loài Paragonimus heterotremus và Paragonimus

westermani trên thế giới

1.2.1. Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus heterotremus

Loài P. heterotremus được mô tả lần đầu tiên vào năm 1964 ở tỉnh Quảng Tây,

Trung Quốc, sau đó phát hiện ở 3 tỉnh phía Nam Trung Quốc (Quảng Tây, Vân Nam,

Quảng Châu), các nước Đông Nam Á (Thái Lan, Lào, Việt Nam) và Nam Á (Ấn Độ, Sri

Lanka) [1], gần đây được phát hiện ở Myanmar [76]. Đây cũng là nguyên nhân gây bệnh

SLP quan trọng cho người ở các nước này.

Đặc điểm đặc trưng của sán trưởng thành là giác miệng lớn gấp đôi giác ụng và

metacercaria hình oval hoặc tròn, kích thước khoảng 200-300 µm, nhỏ nhất so với các

loài sán lá phổi khác [77].

Vật chủ trung gian thứ nhất là ốc thuộc họ Assimineidae và Pomatiopsidae [1]. Ở

Thái Lan, vật chủ trung gian thứ nhất xác định qua gây nhiễm thực nghiệm là các chủng

của loài Oncomenalia hupensis và Tricula aperta, còn ở Trung Quốc vật chủ trung gian

thứ nhất ngoài tự nhiên và thí nghiệm là Tricula sp. chưa xác định đến loài [34].

Vật chủ trung gian thứ hai phát hiện ở Trung Quốc và Thái Lan là 6 loài cua thuộc

họ Potamidae [1]. Các nghiên cứu gần đây ở Lào và Ấn Độ, Sri Lanka công bố vật chủ

trung gian thứ hai của loài P. heterotremus là cua thuộc giống Potamiscus cũng thuộc họ

Potamidae.

Vật chủ chính ngoài tự nhiên được phát hiện ở mèo và sóc ở Thái Lan [1]. Các ca

người nhiễm loài SLP này được phát hiện chủ yếu do liên quan đến ăn cua suối. Chưa có

thông áo trường hợp người nhiễm P. heterotremus do ăn thịt vật chủ chứa. Tuy nhiên,

trong thí nghiệm đã xác định chuột đóng vai trò vật chủ chứa của loài P. heterotremus

[1].

20

Gần đây, loài P. pseudoheterotremus được mô tả ở Thái Lan có đặc điểm hình thái

và phân tử gần giống với loài P. heterotremus. Metacercaria của P. pseudoheterotremus

khoảng 200 µm, được cho là hơi nhỏ hơn P. heterotremus (khoảng 200-300 µm). Phân

tích phân tử cho thấy khoảng cách di truyền giữa 2 loài là 10% dựa vào gen ty thể CO1,

nhưng chỉ khác nhau 1 nucleotid ở đoạn chèn ITS2 [78]. Tuy nhiên, khi phân tích đặc

điểm hình thái và phân tử của các quần thể P. heterotremus từ các nước khác nhau cùng

với P. peudoheterotremus cho thấy đặc điểm của P. pseudoheterotremus n m trong phạm

vi dao động của loài P. heterotremus và được coi là một quần thể địa lý của phức hợp

loài P. heterotremus [23].

1.2.2. Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus westermani

Paragonimus westermani được mô tả năm 1878. Đây là loài phân ố rộng nhất

trong số các loài SLP và là tác nhân gây bệnh quan trọng cho người ở châu Á [1]. Sán

trưởng thành của P. westermani đặc trưng ởi tinh hoàn và buồng trứng phân thành 5-6

nhánh. Metacercaria điển hình của chúng có hình tròn hoặc cầu, đặc trưng ởi lớp vỏ dầy,

tuy nhiên metacercaria của P. westermani rất đa dạng về hình thái và kích thước [1, 25].

Nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể cho thấy P. westermani chủ yếu gồm 2 dạng: lưỡng

bội (diploid 2n) và tam bội (triploid 3n). Dạng diploid phân bố rộng ở châu Á, trong khi

triploid chỉ gặp ở các nước Bắc Á (Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc). Dạng triploid có

khả năng gây ệnh ở người mạnh hơn so với dạng diploid [1, 2]. Chúng có thể phân biệt

được b ng hình thái: ở sán trưởng thành, túi nhận tinh của dạng triploid chứa đầy tinh

trùng, trong khi túi nhận tinh của dạng diploid không chứa tinh trùng [25]. Ngoài ra,

metacercaria của dạng triploid được cho là lớn hơn so với dạng diploid [25]. Chúng cũng

có thể phân biệt với nhau qua dữ liệu phân tử dựa trên trình tự 16S rDNA, dạng lưỡng

bội và tam bội khác nhau ở 2 vị trí nucleotid [28].

Số liệu phân tử cũng cho thấy sự khác biệt lớn về di truyền giữa các quần thể từ Bắc

Á, Nam Á và Đông Nam Á. Khoảng cách di truyền giữa các quần thể P. westermani thậm

chí lớn hơn sự khác biệt giữa các loài của giống sán lá phổi [27, 29, 77].

Vòng đời của P. westermani sử dụng 3-4 loài vật chủ. Vật chủ trung gian thứ nhất

khác nhau giữa các quần thể địa lý: quần thể ở Malaysia và Philippines sử dụng các loài

ốc thuộc giống Brotia, trong khi các quần thể ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài

21

Loan sử dụng ốc thuộc giống Semisulcospirus. Vật chủ ốc ở các nước khác chưa được

biết [1].

Vật chủ trung gian thứ hai của loài P. westermani đã được thống kê bao gồm 8

loài tôm và 40 loài cua [1].

Vật chủ chính là nhiều loài động vật có vú, như chó, cáo, m o, m o rừng, sư tử,

hổ, báo, cầy, khỉ… Tuy nhiên, sự mẫn cảm của động vật với P. westermani cũng khác

nhau rõ rệt giữa các vùng địa lý [1]. Đáng chú ý, người bị nhiễm loài P. westermani chỉ

giới hạn ở Bắc Á và Philiipines. Tại các nước khác ở khu vực Đông Nam Á chưa phát

hiện người nhiễm P. westermani [1, 77]. Gần đây, một ca bệnh SLP do nhiễm

P. westermani được thông báo ở Ấn Độ [48].

Vật chủ chứa tự nhiên là lợn, lợn rừng và vật chủ chứa trong thí nghiệm là chuột,

chuột lang, thỏ [1]. Người và chó săn nhiễm P. westermani do ăn thịt lợn rừng đã được

thông báo ở Nhật Bản [30, 79]. Gần đây, một số bệnh nhân mắc sán lá phổi khẳng định

r ng họ không ăn cua nước ngọt hoặc lợn rừng, nhưng đã ăn thịt sống (sashimi) chế biến

b ng thịt hươu, đó là một món ăn địa phương tại Nhật Bản [80]. Điều tra nghiên cứu đã

thu được sán non P. westermani còn sống từ cơ của hươu (Cervus nippon) bắt ở tỉnh

Kagoshima, Nhật Bản [81]. Một nghiên cứu hồi quy 567 ca bệnh thấy r ng 76 người đã

ăn thịt hươu hoang dã trước khi phát bệnh [42]. Ăn thịt hươu dẫn đến nhiễm bệnh SLP ở

Nhật Bản ước tính chiếm từ 6,8% đến 20.0% tổng số bệnh nhân SLP. Rõ ràng hươu là

động vật ăn cỏ, không chủ đích ăn cua nước ngọt, có thể chúng vô tình ăn phải cua sống

trong bụi cỏ [42]. Điều này cho thấy r ng các loài động vật khác có thể đóng vai trò vật

chủ chứa cho các loài SLP. Vì vậy, để tránh nhiễm sán lá phổi thì không nên ăn thịt sống

của bất kỳ loài động vật nào trong vùng có bệnh.

1.3. Tình hình nghiên cứu sán lá phổi và bệnh sán lá phổi ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh SLP được Monzel phát hiện đầu tiên năm 1906 [82]. Những năm

sau đó, ệnh ít được quan tâm, chỉ có những công bố lẻ tẻ các trường hợp bệnh nhân điều trị

tại các bệnh viện, mà chưa có các nghiên cứu điều tra dịch tễ bệnh. Từ năm 1994, khi một ổ

bệnh SLP tại Sìn Hồ - Lai Châu được phát hiện, bệnh SLP được quan tâm nghiên cứu ở

nước ta. Theo nghiên cứu điều tra của Bệnh viện nhiệt đới trung ương từ 1994-1997 tại Sìn

Hồ – Lai Châu, bắt đầu từ một bệnh nhân nhiễm sán lá phổi được phát hiện vào năm 1993,

đến năm 1997 tổng số ca bệnh phát hiện là 102 trường hợp. Các tác giả cũng thu được sán lá

phổi trưởng thành ở động vật, bao gồm chó nhà (12/18=67%), cầy móc cua (Herpestes

22

urva) (2/2 = 100%) và lợn nhà (1/25 = 4%). Tỷ lệ nhiễm metacercaria SLP ở cua suối

Potamicus mieni (= Ranguna luangprabangesis) là 52,6% [4].

Viện Sốt rét, ký sinh trùng và côn trùng Trung ương điều tra rộng hơn đã phát hiện

bệnh nhân SLP ở nhiều tỉnh miền núi phía bắc với tỷ lệ nhiễm ở người từ 0,2-15%, ở chó

nhà từ 18,2-33,3%, ở cua suối từ 52,5-98,1% [7-12].

Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật điều tra SLP ở vật chủ trung gian trên 56 địa

điểm của 3 tỉnh Tây Bắc phát hiện mầm bệnh SLP ở 6 xã. Các tác giả đã tìm thấy

metacercaria của SLP ở 3 loài cua suối là: Potamiscus mieni, Potamiscus tannanti và

Potamiscus kimboiensis. Các loài cua đồng Somannithelphusa sinensis,

Somannithelphusa brandti và tôm Macrobrachium nipponense, Macrobrachium

dienbienphuense không bị nhiễm metacercaria của SLP. Các tác giả cũng đã phát hiện ấu

trùng cercaria của sán lá phổi ở ốc Oncomelania [14].

Trước đây, bệnh SLP ở Việt Nam được cho là do loài P. westermani gây nên, vì

đó là loài phổ biến [83]. Khi phát hiện ổ bệnh ở Sìn Hồ, các mẫu SLP được xác định là

loài P. heterotremus [5, 84, 85]. Việc chẩn đoán ệnh SLP ở người tại Việt Nam hiện nay

chủ yếu là dựa vào lâm sàng, cận lâm sàng và chẩn đoán hình ảnh. Các chẩn đoán cận

lâm sàng bao gồm xét nghiệm công thức máu, chú ý bạch cầu ái toan, xét nghiệm ELISA

phát hiện kháng thể. Kỹ thuật ELISA được sử dụng là ELISA thông thường, cần có máy

đọc quang phổ và phải thực hiện ở các bệnh viện lớn thường ở Hà Nội. Tuy nhiên, bệnh

nhân SLP chủ yếu gặp ở các tỉnh miền núi, vì vậy, đối với người dân nghi nhiễm bệnh

phải về các bệnh viện tại Hà Nội để chẩn đoán, hoặc các đoàn nghiên cứu điều tra SLP

phải lấy huyết thanh của người dân địa phương miền núi đưa về các phòng thí nghiệm

hoặc các bệnh viện ở Hà Nội để xét nghiệm ELISA, sau đó gửi kết quả cho các cơ sở y tế

địa phương để điều trị cho người bị nhiễm bệnh. Điều này gây khó khăn cho công tác

chẩn đoán và phòng trị bệnh kịp thời. Vì vậy, cần nghiên cứu áp dụng các kỹ thuật xét

nghiệm có thể thực hiện ở thực địa để chẩn đoán nhanh ệnh SLP, giúp cho công tác trị

bệnh được nhanh chóng và hiệu quả.

Cho đến năm 2006, chỉ có loài P. heterotremus được phát hiện phổ biến ở các tỉnh

miền núi phía Bắc và được xác định là nguyên nhân gây bệnh ở người [12, 85]. Các cuộc

điều tra sau đó đã phát hiện thêm các loài sán lá phổi [16, 17]. Năm 2009, lần đầu tiên

metacercaria của loài P. westermani được phát hiện ở tỉnh Quảng Trị [19], và sau đó là ở

23

các tỉnh khác thuộc khu vực miền Trung [22]. Cho đến nay, 7 loài sán lá phổi đã được

phát hiện ở các tỉnh miền Bắc và miền Trung: bao gồm P. heterotremus, P. westermani,

P. skjabini, P. proliferus, P. bangkokensis, P. harinasutai và P. vietnamensis [22]. Trong

đó, loài P. heterotremus phổ biến ở các tỉnh miền Bắc và P. westermani phổ biến ở các

tỉnh miền Trung, các loài khác có tỷ lệ nhiễm thấp hơn [22].

Như vậy, có thể nói r ng SLP ở Việt Nam tương đối đa dạng và phân bố ở nhiều

tỉnh miền núi, gây bệnh cho người cũng như động vật. Ba loài (P. heterotemus,

P. westermani và P. skrjabini) có khả năng gây bệnh cho người đều được phát hiện ở

Việt Nam. Trong đó loài P. skrjabini hiếm gặp, mới tìm thấy ở cua suối tại Thanh Hóa

với tỷ lệ nhiễm thấp; loài P. heterotremus phân bố phổ biến ở các tỉnh miền Bắc; loài

P. westermani phổ biến ở các tỉnh miền Trung với tỷ lệ nhiễm metacercaria ở cua suối rất

cao [22]. Vì vậy, hai loài P. heterotremus và P. westermani cần được quan tâm nghiên

cứu. Loài P. heterotremus đã được nghiên cứu về dịch tễ, bệnh học và vòng đời phát triển

[3, 7-12, 14]; còn loài P. westermani mới chỉ dừng ở mức độ phát hiện metacercaria ở

cua núi tại Bắc Trung bộ [19]. Nhiều vấn đề về 2 loài sán lá này chưa được làm sáng tỏ

(bảng 1.2).

Bảng 1.1. Những vẫn đề đã và chưa được giải quyết của 2 loài sán lá phổi

Vấn đề nghiên cứu P. heterotremus P. westermani

Phân bố - Miền Bắc

- Miền Trung

+

?

?

+

Vật chủ trung gian thứ nhất ngoài tự nhiên

trong thí nghiệm

-

+

-

-

Vật chủ trung gian thứ hai ngoài tự nhiên + +

Vật chủ trung chính ngoài tự nhiên

trong thí nghiệm

+

+

-

+

Vật chủ chứa trong thí nghiệm + -

Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền + -

Sức sống metacercaria - -

Chẩn đoán nhiễm bệnh nhanh ở thực địa - -

24

Tóm lại, số ca mắc bệnh SLP đã giảm ở nhiều nơi trên thế giới. Tuy nhiên, nó lại

trở thành bệnh bị lãng quyên và có thể tái xuất hiện ở một số nơi. Ngoài ra, nhiều ổ bệnh

mới cũng được phát hiện. Thói quen ăn uống không chỉ ở các nước nghèo có thu nhập

thấp và giáo dục thấp, mà còn ở các nước phát triển cũng góp phần vào việc nhiễm SLP.

Hơn nữa, nhu cầu khám phá văn hóa trong thời đại du lịch dễ dàng, cộng với việc nhập

khẩu thực phẩm có thể khiến cho bệnh SLP xuất hiện ở những nơi không phải là vùng

dịch tễ của bệnh, dễ gây nhầm lẫn cho công tác chẩn đoán bệnh. Do đó, để giảm nhiễm

SLP, cần tăng nhận thức về bệnh và cách phòng chống bệnh, đối với cả các chuyên gia y

tế/thú y và đại chúng. Về phân loại và sinh học, giống SLP rất phức tạp và đa dạng, phân

loại và tiến hóa của chúng vẫn còn chưa được giải quyết toàn diện, vì vậy nghiên cứu

toàn diện hơn về SLP và bệnh SLP là cần thiết.

Ở Việt Nam, đến nay đã phát hiện 7 loài SLP ở miền Bắc và miền Trung, trong

đó 3 loài có khả năng gây ệnh cho người đều được phát hiện. Tuy nhiên, phổ biến nhất

là loài P. heterotremus ở miền Bắc và P. westermani ở miền Trung. Nhiều vấn đề về 2

loài SLP quan trọng này chưa được giải quyết: như loài P. heterotremus có phân bố ở

miền Trung và P. westermani có phân bố ở miền Bắc hay không? Tính đa dạng về hính

thái, di truyền phân tử và đặc điểm sinh học (như sức sống của metacercaria, vật chủ

ngoài tự nhiên, vai trò vật chủ chứa trong vòng đời phát triển). Hơn nữa, các ca bệnh

SLP và những vùng bệnh SLP mới vẫn được tiếp tục phát hiện. Vì vậy, cần có những

nghiên cứu chẩn đoán nhanh, đơn giản để chẩn đoán và trị bệnh kịp thời, góp phần bảo

vệ sức khỏe cộng đồng. Nghiên cứu của chúng tôi sẽ tập trung giải quyết những vấn đề

này.

25

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Sán lá phổi P. heterotremus và P. westermani.

2.1.2. Vật liệu nghiên cứu:

Vật chủ trung gian thứ nhất là ốc nước ngọt.

Vật chủ trung gian thứ hai là cua suối.

Vật chủ chính: chó nhà và m o nhà, phân động vật hoang.

Vật chủ chứa: chuột nhắt trắng.

2.1.3. Địa điểm nghiên cứu

Điều tra ở thực địa tại 6

xã thuộc 3 tỉnh Lào Cai,

Yên Bái và Quảng Trị

(hình 2.1), bao gồm:

- Xã Lương Sơn, huyện

Bảo Yên, tỉnh Lào Cai .

- Xã An Lạc, huyện Lục

Yên, tỉnh Yên Bái,

- 4 xã: Hướng Sơn và Tân

Thành (huyện Hướng

Hóa), xã Da Krong và Tà

Long (huyện Da Krong)

thuộc tỉnh Quảng Trị.

Hình 2.1. Địa điểm nghiên cứu

Nguồn: Wikimedia

- Nghiên cứu hình thái, sinh học, phân tử và chẩn đoán miễn dịch trong phòng thí

nghiệm tại Phòng Ký sinh trùng học và phòng Hệ thống học phân tử và di truyền bảo tồn,

Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

26

2.1.4. Thời gian nghiên cứu

- Từ 10/2014 đến tháng 10/2017.

2.2. Phƣơng pháp tiếp cận và thiết kế thí nghiệm

Dựa vào kết quả nghiên cứu của các công bố trước đây, metacercaria của loài SLP

P. heterotremus phổ biến ở các tỉnh miền Bắc (như Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái) và loài

P. westermani phổ biến ở một số tỉnh Bắc Trung Bộ, đặc biệt là tỉnh Quảng Trị [22]. Vì

vậy, chúng tôi chọn địa điểm nghiên cứu tại 3 tỉnh Lào Cai, Yên Bái và Quảng Trị.

Metacercaria ở vật chủ trung gian thứ hai là chỉ thị nhanh và chính xác nhất để xác

định vùng phân bố của SLP, vì vật chủ chính (người và động vật) có thể bị nhiễm bệnh ở

nơi khác, còn tỷ lệ nhiễm ở vật chủ trung gian thứ nhất thường rất thấp [1], dẫn đến xác

xuất bắt gặp thấp. Vì vậy, tại các điểm nghiên cứu, trước tiên thu thập cua suối, nghiên

cứu phương pháp xét nghiệm cua để thu metacercaria dễ và chính xác nhất. Sử dụng

phương pháp xét nghiệm tốt nhất để xét nghiệm cua suối xác định tình hình nhiễm

metacercaria SLP. Thu metacercaria để sử dụng cho các nội dung nghiên cứu khác.

Từ kết quả điều tra tỷ lệ nhiễm metacercaria của SLP xác định được các địa điểm

có tỷ lệ nhiễm 2 loài P. heterotremus và P. westermani cao nhất để tiếp tục điều tra xác

định vật chủ chính, vật chủ trung gian thứ nhất ngoài tự nhiên. Kết hợp cả phương pháp

định loại hình thái và phân tử để định danh cả loài SLP cũng như vật chủ chính và vật

chủ trung gian thứ nhất của SLP. Sơ đồ nội dung nghiên cứu trình bày ở hình 2.2.

Hình 2.2. Sơ đồ nội dung nghiên cứu

27

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Xét nghiệm cua thu metacercaria của sán lá phổi

Hai phương pháp xét nghiệm cua đang được sử dụng phổ biến là giã-lọc cua [86]

và ép cua giữa 2 tấm kính [87] để thu metacercaria SLP. Tuy nhiên, chưa có tác giả nào

mô tả cụ thể thời gian lắng cặn của phương pháp giã-lọc cua, cũng như chưa có nghiên

cứu so sánh 2 phương pháp xét nghiệm cua để biết phương pháp nào tốt hơn. Vì vậy, để

xác định phương pháp xét nghiệm cua tốt hơn, chúng tôi thử nghiệm để xác định thời

gian lắng cặn của phương pháp giã lọc cua và so sánh với phương pháp ép cua.

Nguyên tắc của phương pháp giã-lọc là giã cua để tách metacercaria khỏi phần cơ

(thịt cua) và các nội quan của cua, sau đó dùng nước để lọc qua lưới lọc có kích thước 1 x

1 mm vì metacercaria sán lá phổi lớn nhất có đường kính khoảng 0,8 mm [27] để loại bỏ

bớt phần cặn có kích thước lớn. Sau đó gạn-lọc để loại bỏ những cặn có tỷ trọng nhỏ hơn

metacercaria còn lơ lửng ở trên khi metacercaria đã lắng xuống đáy. Do đó, nếu thời gian

để lắng quá lâu thì các cặn nhỏ cũng lắng xuống đáy, sẽ khó lọc đến khi dung dịch trong

có thể quan sát dưới kính hiển vi để thu metacercaria. Ngược lại, nếu thời gian để lắng

quá ngắn thì sẽ bị mất metacercaria. Vì vậy, xác định thời gian lắng giữa các lần lọc thích

hợp để thu được metacercaria nhanh và chính xác nhất là rất cần thiết trong nghiên cứu

dịch tễ SLP.

Các công bố trước đây chỉ mô tả chung chung để lắng trong vài phút, duy nhất

công bố của Sohn et al. (2009) [86] ghi cụ thể thời gian lắng trong 15 phút. Khi áp dụng

thời gian lắng cặn này chúng tôi thấy tất cả các chất cặn đều lắng xuống đáy, không lọc

được đến dung dịch trong, thậm chí thời gian lắng cặn là 5 phút cũng khó thu được dung

dịch trong. Vì vậy, chúng tôi thử nghiệm ở thời gian lắng cặn 3 phút, 2 phút và 1 phút.

Nguyên liệu

Metacercaria của loài P. heterotremus và P. westermani thu ở các địa điểm nghiên

cứu và một con cua suối bắt tại xã Yên Quang, huyện Lương Sơn, tỉnh Hòa Bình - vùng

không bị nhiễm SLP [14].

Thực hiện thí nghiệm

Phươ g pháp giã-lọc cua: Để xác định số lần gạn lọc và thời gian lắng cặn giữa

các lần lọc, thực hiện các ước sau:

28

- Lấy một cá thể cua suối có kích thước trung bình chiều ngang mai cua 30 mm bắt

ở vùng không nhiễm SLP. Loại bỏ mai cua, dùng chày giã nhuyễn trong cối giã

cua.

- Đếm 50 metacercaria của loài P. westermani (thu từ cua suối bắt tại Hướng Sơn,

Hướng Hóa, Quảng Trị) nhỏ vào cối cua đã giã nhuyễn, cho thêm 250 ml nước,

khuấy đều và lọc qua lưới lọc kích thước 1 x 1 mm vào cốc nhựa thể tích 300 ml.

Để lắng trong thời gian thử nghiệm, sau đó gạn ½ phần dung dịch phía trên sang

một cốc khác, giữ lại để kiểm tra. Tiếp tục cho thêm đầy nước vào phần cặn. Tiến

hành gạn-lọc đến khi phần cặn trong có thể xem dưới kính hiển vi soi nổi. Thử

nghiệm thời gian lắng cặn giữa các lần lọc là: 3 phút, 2 phút và 1 phút b ng cách

dùng đồng hồ bấm giờ.

- Đem phần cặn cuối cùng kiểm tra dưới kính hiển vi soi nổi tìm metacercaria SLP.

Nếu đếm đủ 50 metacercaria chứng tỏ với thời gian lắng đó toàn ộ metacercaria

đã lắng xuống đáy, thực hiện thí nghiệm với thời gian gạn lọc ngắn hơn. Nếu đếm

không đủ 50 metacercaria thì kiểm tra phần nước lọc của tất cả các ước trước đó

để biết số lượng metacercaria đã ị gạn đi ở các lần lọc trước.

Xác định thời gian lắng cặn thích hợp nhất là thời gian để lắng ngắn nhất mà vẫn

thu lại đủ 50 metacercariae ở phần cặn của lần lọc cuối cùng. Thí nghiệm với mỗi

thời gian lắng cặn lặp lại 3 lần. Làm tương tự như vậy với metacercaria của loài

P. heterotremus.

Phươ g pháp ép cua giữa 2 tấm kính: thực hiện theo quy trình theo mô tả bởi

Sugiyama et al. (2013) [87]. Loại bỏ mai cứng, dùng panh gắp riêng phần mang và gạch

(gan) cua ép giữa 2 tấm kính để kiểm tra dưới kính hiển vi. Đối với phần cơ thân và cơ

chân, dùng kéo và dao để nạo lấy phần cơ, ép giữa 2 tấm kính, quan sát dưới kính hiển vi

tìm metacercaria SLP. Đếm số lượng metacercaria ở từng bộ phận cơ thể cua.

So sá h phươ g pháp ép cua và giã-lọc cua:

So sánh 2 phương pháp xét nghiệm cua về thời gian xét nghiệm và số metacercaria

thu được từ 10 cá thể cua suối bắt tại Yên Bái - nơi có tỷ lệ nhiễm P. heterotremus cao.

Xét nghiệm riêng từng bộ phận (mang, gạch cua, cơ thân và cơ chân) của từng cá

thể cua b ng phương pháp ép giữa 2 tấm kính [87]. Đếm số lượng metacercaria ở từng bộ

phận cơ thể cua.

29

Sau khi đếm xong số lượng metacercaria ở từng bộ phận cơ thể theo phương pháp

ép cua giữa 2 tấm kính thì chuyển sang cối giã cua để xét nghiệm theo phương pháp giã-

lọc cua. Đối với phần cơ thân và cơ chân thì chuyển cả phần thịt đã nạo ra ép trên kính và

phần vỏ cứng vào cối giã để giã lọc cua theo quy trình mô tả như trên với số lần lọc và

thời gian để lắng thích hợp nhất đã được xác định. Đếm số lượng metacercaria ở từng bộ

phận cơ thể cua. So sánh thời gian xét nghiệm và số lượng metacercaria thu được từ 2

phương pháp trên.

2.3.2. Điều tra tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria sán lá phổi ở cua suối tại địa

điểm nghiên cứu.

- Bắt cua ở các khe suối tại các địa điểm nghiên cứu. Cua suối thường núp dưới các

hòn đá, lật đá lên để bắt cua. Tỷ lệ nhiễm metacercaria ở các khu vực nghiên cứu

đã được công bố tương đối cao [22], vì vậy mỗi địa điểm nghiên cứu xét nghiệm ít

nhất 50 con cua suối. Định loại cua dựa vào hình thái theo khóa định loại cua ở

Việt Nam [88-91]. Các đặc điểm hình thái chủ yếu là dựa vào giáp đầu ngực (mai

cua), chân giao cấu con đực và các đốt cuối phần bụng (yếm cua).

- Xét nghiệm cua theo phương pháp tốt nhất đã được xác định, tính tỷ lệ nhiễm theo

công thức sau

- Cường độ nhiễm trung ình tính như sau

2.3.3. Nghiên cứu hình thái metacercaria

- Nhận diện metacercaria của SLP với đặc điểm đặc trưng là ruột uốn lượn và túi bài

tiết lớn chứa đầy hạt glycogen màu đen [1].

- Quan sát hình dạng và đo kích thước chiều dài, rộng, độ dày lớp vỏ của

metacercaria dưới kính hiển Olympus vi gắn trắc vi thị kính.

30

- Định loại metacercaria SLP dựa vào hình thái theo khóa định loại của Doanh et al.

[22].

2.3.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử của loài Paragonimus heterotremus và

Paragonimus westermani

- Chọn mẫu: mục đích nghiên cứu này là so sánh di truyền phân tử của các quần thể

cách xa nhau về địa lý ở miền Bắc và miền Trung. Ở mỗi quần thể chọn ít nhất 3

mẫu metacercaria (nếu đủ số lượng), với mỗi dạng metacercaria chọn ít nhất 2

mẫu, bảo quản trong cồn ethanol 100%.

- Chọn gen nghiên cứu: Nghiên cứu đa dạng di truyền của SLP thường sử dụng một

gen/đoạn chèn của hệ gen nhân và một gen ty thể, vì gen nhân là chỉ thị tốt để

phân biệt giữa các loài SLP, còn gen ty thể là chỉ thị tốt để nghiên cứu các quần

thể trong loài [1]. Vì vậy, đối với loài P. heterotremus chọn đoạn chèn ITS2 và

gen ty thể CO1, đối với loài P. westermani chọn đoạn chèn ITS2 và gen 16S, vì

gen này có thể phân biệt dạng 2n hay 3n của loài P. westermani [28].

- Tách chiết DNA tổng số b ng QIAamp DNA stool MiniKit (Qiagen, Hilden,

Germany), thực hiện phản ứng PCR để nhân bản trình tự đích với cặp mồi lựa

chọn ở bảng 2.1.

Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng để nhân bản trình tự đích nghiên cứu

Trình tự

đích

Cặp mồi Tài liệu tham khảo

ITS2 3S : 5’- AGCGGTGGATCACTCGGCTCGTG- 3’

A28 : 5’-GGGATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCGC-3’

[92]

CO1 JB3:5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′

JB4.5: TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′

[93]

16S T7-1: 5’-ATTTACATCAGTGGGCCGTC-3’

SP6-1: 5’-GATCCAAAAGCATGTGAAAC-3’

[28]

- Điện di kiểm tra kết quả PCR trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide và

soi đ n UV.

- Tinh khiết sản phẩm PCR b ng QIAquick PCR purification kit (QIAGEN Inc.

Mỹ), giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR b ng máy tự động ABI Prism 3130

31

Genetic Analyser (Applied Biosystem), sử dụng BigDye Terminator Cycle

Sequencing Kit (Applied Biosystem).

- So sánh trình tự thu được với các trình tự tương đồng trên GenBank b ng chương

trình Blast (NCBI) và vẽ cây phát sinh chủng loại b ng phương pháp Maximum

Likelihood với mô hình tốt nhất (best model test) trên phần mềm MEGA 6.0 [94].

2.3.5. Gây nhiễm cho vật chủ chính

- Động vật thí nghiệm: 4 cá thể chó nhà và 8 cá thể mèo nhà mua tại Hà Nội, được

kiểm tra và tẩy giun sán trước khi thí nghiệm. Mục đích của nghiên cứu này là xác

định sự phát triển của SLP ở vật chủ chính, không nghiên cứu sự biến đổi sinh lý,

sinh hóa vì vậy không cần lô động vật đối chứng.

- Trước khi gây nhiễm để động vật nhịn ăn trong 4h, gây nhiễm cho động vật với số

lượng 30-50 metacercaria/vật chủ. Đếm số lượng metacercaria, dùng pipet hút số

metacercaria đã đếm nhỏ vào giữa miếng thức ăn mà động vật thí nghiệm ưa thích:

cho m o ăn cá và chó ăn phổi lợn. Theo dõi đảm bảo động vật thí nghiệm ăn hết

thức ăn chứa metacercaria.

- Sau khi gây nhiễm, nuôi nhốt động vật thí nghiệm, cho động vật ăn thức ăn nấu

chín, theo dõi động vật thí nghiệm. Vì thời gian thải trứng sớm nhất của các loài

SLP ở vật chủ chính là 45 ngày [1], vì vậy sau gây nhiễm 45 ngày xét nghiệm

phân tìm trứng sán theo phương pháp lắng cặn [95] để xác định thời gian trưởng

thành và thải trứng của sán ở động vật thí nghiệm.

- Sau khi phát hiện trứng SLP khoảng 30 ngày để sán phát triển đầy đủ nhất thì mổ

động vật thí nghiệm thu sán trưởng thành cho nghiên cứu hình thái và thu kháng

nguyên chất tiết để thực hiện phản ứng dot-ELISA.

2.3.6. Nghiên cứu hình thái sán lá phổi trưởng thành

- Thu SLP từ động vật thí nghiệm, ép nhẹ giữa 2 lam kính, định hình và bảo quản

trong cồn ethanol 70%.

- Sau khi bảo quản trong cồn ít nhất 2 tuần thì làm tiêu bản cố định b ng phương

pháp nhuộm carmine [95]. Đo kích thước cơ thể và nội quan của sán (bao gồm

chiều dài, rộng cơ thể, giác miệng và giác bụng, tinh hoàn, buồng trứng và kích

thước trứng) b ng kính hiển vi lắp trắc vi thị kính, vẽ sán b ng phần mềm

Illustrator.

32

2.3.7. Xác định vai trò vật chủ chứa

- Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng dòng BALB/c mua tại Viện Vệ sinh dịch

tễ trung ương.

- Số lượng chuột gây nhiễm: mỗi loài SLP gây nhiễm cho 10 cá thể chuột với số

lượng 50 metacercaria/chuột.

- Khi gây nhiễm, gây mê chuột b ng Diethyl Ether, dùng pipet hút số lượng

metacercaria nhỏ vào cuống họng chuột.

- Sau khi gây nhiễm, nuôi chuột trong lồng, cho ăn thức ăn công nghiệp. Sau gây

nhiễm 1-2 tháng, mổ khám chuột thí nghiệm, thu sán non ở cơ và các nội quan

b ng dung dịch nước muối sinh lý và pepsin 1% theo mô tả của Sadaow et al.

(2013) [96]. Thu sán non để nghiên cứu hình thái và gây nhiễm chuyển tiếp cho

mèo nhà để xác định sán có tiếp tục phát triển ở vật chủ chính hay không theo các

ước trình bày ở mục 2.3.5.

2.3.8. Xác định vật chủ ngoài tự nhiên của sán lá phổi

2.3.8.1. Xác định vật chủ trung gian thứ nhất

- Xác định vật chủ trung gian thứ nhất bao gồm thu mẫu ốc, xét nghiệm ốc tìm

cercaria, định loài cercaria và định loài vật chủ ốc theo sơ đồ hình 2.3.

Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm xác định vật chủ trung gian thứ nhất

33

- Bắt các loài ốc ở suối nơi cua suối nhiễm metaceracria SLP cao. Bắt ốc b ng tay.

Ốc thường ám vào các hòn đá hoặc lá cây ở suối. Vì tỷ lệ nhiễm ở ốc thường thấp

dưới 1%, vì vậy với loài ốc có số lượng lớn thì xét nghiệm trên 1.000 cá thể. Với

những loài ốc ít gặp, có số lượng ít thì bắt trong 5 ngày liên tục.

- Tách riêng từng loài ốc dựa vào hình thái, định tên sơ ộ loài ốc theo khóa định

loại ốc hiện hành ở Việt Nam [88, 97-99]. Các đặc điểm cơ ản để định loại ốc là

kích thước, các vòng xoắn và miệng vỏ.

- Với ốc có kích thước nhỏ thì ép riêng từng cá thể ốc giữa 2 tấm kính, với ốc có

kích thước lớn dùng dao/kéo đập hoặc cắt vỡ vỏ ốc, rút lấy phần gan ruột ốc ép

giữa 2 tấm kính và kiểm tra dưới kính hiển vi soi nổi để thu cercaria của sán lá

phổi [100], với đặc trưng có stylet ở phần đầu và đuôi ngắn thuộc nhóm

microcercaria [1].

- Microcercaria ở các loài ốc được nghiên cứu hình thái và phân tử để xác định loài.

o Nghiên cứu hình thái cercaria: quan sát dưới kính hiển vi, đo kích thước cơ

thể, giác miệng, giác bụng, stylet và đuôi, chụp ảnh và mô tả. Đồng thời

nghiên cứu hình thái của giai đoạn ấu trùng redia: đo kích thước, chiều dài

ruột, số lượng cercaria/ redia.

o Định loài cercaria b ng kỹ thuật phân tử: cercaria của sán lá phổi ở mỗi cá

thể ốc nhiễm được phân tích phân tử dựa trên trình tự ITS2 theo quy trình

mô tả ở mục 2.3.4. So sánh mức độ tương đồng của trình tự thu được với

các trình tự trên GenBank b ng chương trình BLAST để định loài.

- Định loài ốc bị nhiễm SLP b ng kỹ thuật phân tử: loài ốc nhiễm ấu trùng SLP

được xác định loài qua phân tích trình tự gen CO1 với cặp mồi LCO1490 (5’-

GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’) và HCO2198 (5’-TAAACT

TCGGGTGACCAAAAAATYA-3’) [101]. So sánh mức độ tương đồng của các

trình tự thu được với các trình tự trên GenBank để định loài. Nếu tỷ lệ tương đồng

cao 99-100% thì khẳng định loài, đối với các loài có độ tương đồng thấp hơn 95%

thì vẽ cây phát sinh loài để xem xét vị trí phân loại của chúng.

34

2.3.8.2. Xác định vật chủ chính

Như đã trình ày ở phần Tổng quan, vật chủ chính ngoài tự nhiên của loài

P. heterotremus đã được xác định, vật chủ chính của các loài sán lá phổi khác, bao gồm

cả loài P. westermani, chưa được xác định. Mục đích của nghiên cứu này là xác định vật

chủ chính ngoài tự nhiên của loài P. westermani. Vì vậy, chúng tôi điều tra ở các điểm

nghiên cứu tại tỉnh Quảng Trị, nơi có tỷ lệ nhiễm metacercaria loài P. westermani ở cua

suối cao.

- Tại các điểm nghiên cứu ở Quảng Trị, người dân địa phương ít nuôi m o, chủ yếu

nuôi chó. Vì vậy, thu mẫu phân chó nhà và mẫu phân động vật ăn thịt hoang dã tại

huyện Hướng Hóa và Da Krong, Quảng Trị.

- Xét nghiệm 30 mẫu phân chó nhà thu tại 2 xã Hướng Sơn và Da Krong.

- Đối với mẫu phân động vật hoang: Mục đích của nghiên cứu này là xác định loài

vật chủ chính, nên không quan tâm mẫu phân thu được của cùng một cá thể vật

chủ hay không. Nếu xét nghiệm thấy mẫu phân bị nhiễm trứng SLP thì phân tích

phân tử để xác định loài SLP và mẫu phân cũng được phân tích phân tử để xác

định loài vật chủ theo sơ đồ thí nghiệm ở hình 2.4.

Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm xác định vật chủ chính

- Thu mẫu phân động vật ăn thịt hoang dã ở trong rừng và dọc theo con suối - nơi

cua suối bị nhiễm metacercaria SLP cao. Mỗi mẫu phân được chia làm 2 phần lưu

trữ trong 2 ống falcol 50 ml, bảo quản trong cồn ethanol 100%.

35

- Tại phòng thí nghiệm, mẫu phân ở một ống falcol được dùng để xét nghiệm tìm

trứng SLP theo phương pháp gạn lọc [95]. Nhận diện trứng SLP với đặc trưng có

nắp ở một đầu, kích thước khoảng 0,09 x 0,05 mm [1]. Nếu thu được trứng SLP

thì bảo quản trong cồn ethanol 100% để định loài b ng kỹ thuật phân tử dựa trên

trình tự ITS2 theo quy trình đã được mô tả bởi Doanh et al. (2011) [20]. So sánh

trình tự thu được với các trình tự trên GenBank b ng chương trình BLAST để định

loài SLP. Nếu có trứng sán lá khác thì cũng thu để định loài b ng kỹ thuật phân tử

như định loài trứng SLP.

- Một nửa mẫu phân còn lại của những mẫu phân có nhiễm trứng SLP được sử dụng

để định loài vật chủ b ng kỹ thuật phân tử theo quy trình đã được mô tả bởi

Nonaka et al. [31] như sau:

+ Tách chiết DNA từ mẫu phân sử dụng QIAamp DNA StoolMini Kit (Qiagen).

+ Chạy PCR để nhân bản trình tự vùng D-Loop của hệ gen ty thể với cặp mồi sau:

prL (5’-CACCATTAGCACCCAAAGCT-3’ và

prH (5’-CCTGAAGTAGGAACCAGATG-3’) [31].

+ Đọc trình tự D-Loop, so sánh mức độ tương đồng với các trình tự trên GenBank

để định loài vật chủ.

2.3.9. Nghiên cứu sức sống của metacercaria

Quan sát an đầu cho thấy metacercaria nuôi trong nước cất nhanh thoát khỏi vỏ

nang sán, trong môi trường nước muối sinh lý NaCl 9‰ thì metacercaria lâu thoát khỏi

nang hơn, điều này chứng tỏ nước cất là môi trường nhược trương đối với metacercaria

của SLP. Vì vậy, metacercaria SLP được theo dõi sức sống trong nước muối sinh lý

(NaCl 9‰) ở các điều kiện nhiệt độ phòng và 4°C, với các mật độ 5, 50, 100, 200

metacercaria/ 2 ml. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Định kỳ thay nước muối sinh lý mới

theo ngày đối với nuôi ở nhiệt độ phòng và theo định kỳ tháng đối với nuôi ở nhiệt độ

4°C, quan sát dưới kính hiển vi để xác định sự thoát nang và sức sống của metacercaria.

Metacercaria được xác định là còn sống nếu còn nguyên cấu trúc và hoạt động

trong vỏ nang. Metacercaria chết không hoạt động và thay đổi cấu trúc, hoặc thoát khỏi

nang.

36

2.3.10. Nghiên cứu phản ứng dot-ELISA chẩn đoán bệnh sán lá phổi

2.3.10.1. Nguyên vật liệu và hóa chất

- Chuẩn bị kháng nguyên: Kháng nguyên chất tiết thu từ sán trưởng thành từ động

vật thí nghiệm b ng cách cho 10 sán vào 10 ml dung dịch PBS và nuôi trong tủ ấm

trong thời gian 12h. Thu chất dịch, ly tâm ở 13.000v/phút/5 phút, thu dịch trong ở

trên, đo nồng độ kháng nguyên và giữ ở tủ âm -20°C.

- Chuẩn bị huyết thanh: 30 mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm loài P. heterotremus

thu tại các tỉnh miền núi phía Bắc, bao gồm 10 bệnh nhân có trứng SLP và 20

bệnh nhân không có trứng đã được khẳng định nhiễm SLP b ng ELISA thường

với giá trị OD từ 0,7-1,6.

Các mẫu huyết thanh âm tính với SLP để kiểm tra phản ứng chéo bao gồm: 8 mẫu

huyết thanh bệnh nhân nhiễm sán lá gan lớn (Fasciola sp.) đã được khẳng định

qua lâm sàng, cận lân sàng và ELISA thông thường; 8 mẫu huyết thanh nhiễm sán

lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis) của bệnh nhân phát hiện sán trưởng thành ở phân

sau khi tẩy, 8 mẫu huyết thanh nhiễm lao phổi và 6 mẫu huyết thanh người bình

thường âm tính với các bệnh ký sinh trùng, tỷ lệ bạch cầu ái toan ình thường. Các

mẫu huyết thanh này được lưu trữ ở Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, được

cung cấp bởi Viện Sốt rét, ký sinh trùng, côn trùng trung ương và Bệnh viện Phổi

trung ương. Hiện nay ở Việt Nam chưa phát hiện bệnh nhân nhiễm loài P.

westermani, nên chưa có huyết thanh.

- Giấy nitrocellulose kẻ ô nhãn hiệu HAWG 304 FO của hãng Millipore (Nhật Bản),

kích thước mỗi ô 3 x 3 mm.

- Kháng thể 2nd

(Conjugate): Peroxidase-labeled goat-anti-human IgG (DAKO).

- Hóa chất hiện màu: 4-chloro-1-naphthol và 30% H2O2.

2.3.10.2. Quy trình thực hiện dot-ELISA

Áp dụng kỹ thuật dot-ELISA đã được thiết lập theo quy trình của Itoh và Sato

(1990) [65] với nồng độ kháng nguyên 1 mg/ml, nồng độ pha loãng huyết thanh 1/200, ủ

huyết thanh và conjugate ở nhiệt độ 37°C trong 30 phút và hiện màu 15 phút.

Quy trình thực hiện theo các ước sau:

+ Chuẩn bị nhỏ kháng nguyên và huyết thanh đối chứng lên màng nitrocellulose

37

- Nhỏ 1 µl huyết thanh người 1‰ làm đối chứng dương cho kháng thể 2nd

(với mục

đích để xác định thành phần phản ứng có hoạt động hay không) lên một ô của

màng nitrocellulose.

- Nhỏ 1 µl kháng nguyên P. heterotremus và P. westermani (nồng độ 1 mg/ml) lên

mỗi ô của màng nitrocellulose (hình 2.5).

Hình 2.5. Chuẩn bị nhỏ huyết thanh đối chứng và kháng nguyên lên giấy nitrocellulose

- Sau khi nhỏ kháng nguyên và huyết thanh đối chứng để giấy tự khô.

- Nhúng giấy đã nhỏ kháng nguyên và huyết thanh đối chứng trong dung dịch

blocking buffer (casein 1%) ở 37°C trong 30 phút. Sau đó lấy ra, để tự khô trong

không khí, cắt thành từng miếng nhỏ, bảo quản ở 4°C trong túi nilong có silica gel

chống ẩm.

+ Các ước thực hiện kỹ thuật dot-ELISA

Bước 1. Cắt mẫu giấy theo hình 2.5, nhúng vào 1 ml huyết thanh cần kiểm tra ở

độ pha loãng 1/200 (pha với casein 1%) và ủ ở 37°C trong 30 phút.

Bước 2. Rửa 3 lần với casein 1% hoặc PBS.

Bước 3. Phản ứng với kháng thể 2nd

. Ủ với 1 ml kháng thể 2nd

(peroxidase-labeled

goat-anti-human IgG (DAKO), ở độ pha loãng 1/2000 với casein 1%, ở

37°C trong 30 phút.

Bước 4. Rửa 3 lần với PBS.

Bước 5. Hiện màu: Nhúng vào 1 ml dung dịch hiện và ủ ở 37°C trong 15 phút.

Pha dung dịch hiện màu: trộn 2ml 4-chloro-1-naphthol (0.2 g in 100 ml of

80% ethanol) với 8ml PBS, thêm 5 µl 30%H2O2.

Đọc kết quả b ng mắt thường, so sánh với đối chứng dương.

38

Nếu ô nhỏ huyết thanh đối chứng dương hiện màu thì các thành phần phản ứng

hoạt động tốt.

Nếu ô nhỏ kháng nguyên có màu đậm b ng hoặc sẫm hơn ô đối chứng thì mẫu

huyết thanh được xác định là dương tính. Nếu không có màu, hoặc màu nhạt được xác

định là âm tính.

Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương tính và giá trị tiên đoán âm tính

được tính như sau

dot-ELISA

Thực tế

Dương tính Âm tính Tổng số

Nhiễm bệnh a c a + c

Không nhiễm bệnh b d b + d

Tổng số a + b c + d

Độ nhạy của phản ứng = (a/ a + c) x 100

Độ đặc hiệu của phản ứng = (d/ b + d) x 100

Giá trị tiên đoán dương tính = (a/ a + b) x 100

Giá trị tiên đoán âm tính = (d/ c + d) x 100

Xác định nồ g độ kháng nguyên và thời gian phản ứng ở 37oC.

- Sử dụng 3 mẫu huyết thanh dương tính với P. heterotremus để kiểm tra.

- Thử nghiệm ở 3 nồng độ kháng nguyên: 1mg/ml, 0.5mg/ml và 0.25mg/ml.

- Ủ ở 37°C. Ủ với huyết thanh và kháng thể 2

nd ở 10 phút, 20 phút và 30 phút. Thời

gian hiện màu 15 phút. Quan sát màu để xác định nồng độ kháng nguyên và thời

gian ủ thích hợp.

- Sau đó thực hiện phản ứng ở thời gian ủ huyết thanh thích hợp trên 7 mẫu, để xác

định thời gian hiện màu ở 7 thời điểm 1, 2, 3, 4, 5, 10 và 15 phút. Dùng đồng hồ

bấm giờ, cứ mỗi thời điểm lấy ra một mẫu để dừng phản ứng.

Xác định thời gian ủ với huyết thanh và kháng thể 2, thời gian hiện màu ở 20°C.

- Thử nghiệm ở 20°C với thời gian ủ với huyết thanh và kháng thể 2 ở 10 phút, 20

phút và 30 phút. Thời gian hiện màu 15 phút.

39


định thời gian hiện màu ở 3 thời điểm 5, 10 và 15 phút. Dùng đồng hồ bấm giờ, cứ

mỗi thời điểm lấy ra một mẫu để dừng phản ứng.

Xác định thời gian ủ với huyết thanh và kháng thể 2nd

, thời gian hiện màu ở 10°C

- Thử nghiệm ở 10°C với thời gian ủ với huyết thanh và kháng thể 2 ở 30, 60 và 90

phút. Thời gian hiện màu 15 phút.




Xác định thời gian ủ với huyết thanh và kháng thể 2, thời gian hiện màu ở 4°C.

- Thử nghiệm ở 4°C với thời gian ủ với huyết thanh và kháng thể 2 ở 30, 60 và 90

phút. Thời gian hiện màu 15 phút.




2.3.11. Phương pháp xử lý số liệu:

Số liệu được nhập vào cơ sở dữ liệu trên Excel sheet và được phân tích thống kê

b ng phần mềm SPSS dùng hàm so sánh T-test hoặc Anova với sự sai khác có ý nghĩa

thống kê khi giá trị P ≤ 0,05 và sai khác không có ý nghĩa thống kê khi P > 0,05.

40

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả xác định phƣơng pháp xét nghiệm cua và điều tra tình hình nhiễm

metacercaria ở cua suối tại các địa điểm nghiên cứu

3.1.1. Xác định phương pháp xét nghiệm cua tìm metacercaria sán lá phổi

Xác định thời gian lắng cặn của phươ g pháp giã-lọc cua.

Kết quả thí nghiệm thời gian lắng cặn 3 phút, 2 phút và 1 phút cho thấy ở cả 3 thời

gian lắng cặn, sau 8 lần lọc thì dung dịch lọc đã trong có thể xem dưới kính hiển vi. Đối

với metacercaria của loài P. westermani, nếu thời gian lắng cặn là 3 hoặc 2 phút đều thu

đủ 50 metacercaria ở lần lọc cuối cùng. Với thời gian lắng cặn 1 phút chỉ có một lần thí

nghiệm thu đủ 50 metacercaria ở lần lọc cuối cùng, ở 2 đợt thí nghiệm lặp lại chỉ thu

được 48 và 49 metacercaria, 1-2 metacercaria thu được ở nước lọc của các lần lọc trước

(bảng 3.1).

Đối với metacercaria của loài P. heterotremus, thời gian lắng cặn 3 phút cũng thu

đủ 50 metacercaria ở lần lọc cuối cùng. Nhưng với thời gian lắng cặn 2 phút chỉ thu được

46-47 metacercaria ở lần lọc cuối cùng, 3-4 metacercaria thu được ở nước lọc các lần lọc

thứ 1-7 (bảng 3.1).

ả g Metacercaria thu được với thời gian lắng cặn khác nhau

Metacercaria Lần lọc Số lượng metacercaria thu được ở thời gian lắng cặn

3 phút 2 phút 1 phút

P. westermani 1 đến 7 0 0 0 - 2 (1,0)

Cuối cùng 50 50 48-50 (49,0)

Tổng số 50 50 50

P. heterotremus 1 đến 7 0 3-4 (3,3)

Cuối cùng 50 46-47 (46,7)

Tổng số 50 50

Ghi chú: số trong ngoặc là giá trị trung bình.

Như vậy, thời gian lắng của metacercaria P. westermani nhanh hơn so với loài

P. heterotremus. Điều này được lý giải là kích thước metacercaria của P. westermani

41

khoảng 400 µm, lớn hơn so với P. heterotremus có kích thước nhỏ hơn 300 µm [27], vì

vậy thời gian lắng xuống nhanh hơn. Metacercaria của loài P. heterotremus nhỏ nhất so

với các loài sán lá phổi khác [23], vì vậy với phương pháp giã-lọc cua thì thời gian lắng

giữa các lần lọc 3 phút là thích hợp nhất để thu được metacercaria của tất cả các loài sán

lá phổi. Với cá thể cua có kích thước trung bình (chiều ngang mai cua 30 mm) thì lọc

khoảng 8 lần có thể xem dưới kính hiển vi để thu metacercaria.

So sá h hai phươ g pháp ét ghiệm cua

So sánh thời gia ét ghiệm bằ g phươ g pháp ép cua và giã-lọc cua.

Kết quả cho thấy thời gian xét nghiệm một cá thể cua b ng phương pháp ép cua

hết 76-85 phút (trung ình 80,3 phút), trong khi phương pháp giã-lọc cua mất 33-38 phút

(trung ình 35,3 phút) ( ảng 3.2). Thời gian xét nghiệm ng phương pháp giã-lọc cua

nhanh hơn so với phương pháp ép cua (P <0,005). Hơn nữa, khi xét nghiệm b ng phương

pháp giã-lọc thì dễ thu metacercaria hơn, vì metacercaria đã được tách khỏi thịt cua, có

thể hút b ng pipet, còn với phương pháp ép cua thì khó thu metacercaria vì chúng vẫn

còn lẫn trong thịt cua.

ả g So sánh thời gian xét nghiệm ng phương pháp ép và giã-lọc cua

Cá thể cua thứ Thời gian xét nghiệm (phút) b ng phương pháp Giá trị P

p cua Giã-lọc cua

1 80 35

2 85 38

3 76 33

Trung bình 80,3 35,3 P < 0,005

So sá h s ư g metacercaria thu đư c của phươ g pháp xét nghiệm cua

Kết quả so sánh 2 phương pháp xét nghiệm 10 con cua bắt tại xã An Lạc, huyện

Lục Yên, tỉnh Yên Bái được trình bày ở bảng 3.3. Kết quả cho thấy: phương pháp giã-lọc

cua thu được 902 metacercaria, phương pháp ép cua thu được 252 metacercaria. Số lượng

metacercaria thu được của phương pháp giã-lọc cao hơn nhiều so với phương pháp ép

cua, chỉ tương đương với 28,0% của phương pháp giã-lọc cua (P <0,0001).

42

ả g So sánh số lượng metacercaria thu được từ 2 phương pháp xét nghiệm cua

Các bộ phận

cơ thể cua

Metacercariae thu được theo hai phương pháp

Ép cua Giã-lọc cua Giá trị p

Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%)

Mang 97 38,5 84 9,3 P < 0,01

Gạch 52 20,6 82 9,1 P < 0,005

Cơ thân 64 25,4 358 39,7 P < 0,005

Cơ chân 39 15,5 378 41,9 P < 0,0001

Tổng số 252 100,0 902 100,0 P < 0,0001

Tính riêng từng bộ phận cơ thể cua thì thấy phương pháp ép cua thu được số lượng

metacercaria ở cơ và gạch thấp hơn so với phương pháp giã-lọc cua (P<0,005), ngược lại

số lượng metacercaria ở mang thì thu được nhiều hơn (P<0,01). Điều này có thể lý giải là

khi ép mang cua giữa 2 tấm kính có thể quan sát được toàn bộ metacercaria, không bị sót,

khi giã mang cua thì một số metacercaria có thể dính ở giữa mang sẽ bị mất đi khi lọc.

Trái lại, phần thịt cua khó nạo sạch khỏi phần vỏ cứng của thân và chân, đặc biệt là phần

chân cua. Gạch cua khó dàn mỏng trên tấm kính nên khó quan sát hết metacercaria. Đo

đó ở phương pháp ép cua thu được ít metacercaria hơn so với phương pháp giã-lọc cua.

Vì vậy, để thu được số lượng metacercaria chính xác nhất thì ép mang cua giữa 2 tấm

kính, còn phần cơ và gạch cua thì áp dụng phương pháp giã-lọc.

Với phương pháp ép cua thì số lượng metacercaria thu được nhiều nhất ở mang

(38,5%), sau đó đến cơ thân (25,4%), gạch (20,6%), thấp nhất ở cơ chân (15,5%). Kết

quả này cũng tương tự với công bố của Nguyễn Thị Lê và cs. (1997) [6]. Tác giả thu

được 34,6% metacercaria ở mang, tiếp đến là cơ thân (30,3%), gạch (22,5%) và chân

(11,3%).

Ngược lại, với phương pháp giã-lọc cua thì số lượng metacercaria thu được nhiều

nhất ở cơ chân (41,9%) và cơ thân (39,7%), tiếp theo là mang (9,3%) và gạch (9,1%). Kết

quả này tương tự với nghiên cứu của Habe et al. (1993) [39] về phân bố metacercria sán

lá phổi ở cơ thể cua thu tại Malaysia. Các tác giả thu được metacercaria nhiều nhất ở cơ

(hơn 60%), tiếp đến là mang (10-15%) và gạch cua (10%).

43

Tại Việt Nam, Hứa Văn Thước và cs. (2007) [102] phân tích số lượng

metacercaria ở cua suối thu tại Lương Sơn, tỉnh Lào Cai cũng thu được nhiều nhất ở cơ

chân (41,08%), tiếp đến cơ thân (35,34%) và nội tạng (23,57%). Tác giả không trình bày

xét nghiệm cua theo phương pháp nào, nhưng kết quả này cho thấy có thể tác giả đã sử

dụng phương pháp giã-lọc cua.

Tóm lại, phương pháp giã-lọc cua thu được số lượng metacercaria nhiều hơn và

chính xác hơn, phương pháp này cũng đơn giản, dễ thực hiện và nhanh hơn so với

phương pháp ép cua. Tùy vào mục đích mà sử dụng phương pháp xét nghiệm thích hợp.

Để xác định nhanh khi không có chày cối thì ép mang giữa 2 tấm kính để kiểm tra. Khi

cần xác định cường độ nhiễm và thu nhiều metacercaria thì kết hợp cả 2 phương pháp: ép

mang cua giữa 2 tấm kính và giã-lọc các bộ phận gạch cua, cơ thân và cơ chân. Chúng tôi

kết hợp 2 phương pháp: ép mang cua giữa 2 tấm kính và giã-lọc phần gạch cua, cơ thân

và cơ chân để điều tra tình hình nhiễm metacercaria SLP ở vật chủ trung gian thứ hai tại

các địa điểm nghiên cứu.

3.1.2. Tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria sán lá phổi ở cua suối

Tại các địa điểm nghiên cứu, chúng tôi thu được 3 loài cua suối: bao gồm 01 loài

Indochinamon tannanti (hình 3.1a) ở tỉnh Yên Bái và Lào Cai, và 02 loài Vietopotamon

aluoiense (hình 3.1b) và Donopotamon haii (hình 3.1c) ở tỉnh Quảng Trị.

Hình 3.1. Các loài cua suối bắt được ở các địa điểm nghiên cứu

a. Indochinamon tannanti bắt ở tỉnh Yên Bái và Lào Cai;

b. Vietopotamon aluoiense và c. Donopotamon haii bắt ở tỉnh Quảng Trị.

(ảnh trên: toàn bộ cơ thể, ảnh dưới: gai sinh dục (gonopods) của con đực).

44

Kết quả xét nghiệm thấy cả 3 loài cua suối đều bị nhiễm metacercaria SLP. Tỷ lệ

và cường độ nhiễm metacercaria ở cua suối được trình bày ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria sán lá phổi ở các địa điểm nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu Loài

cua

Số xét

nghiệm

(con)

Số con

nhiễm (%)

Cƣờng độ nhiễm

(nang sán/cua) Tỉnh Huyện Xã

Lào

Cai

Bảo

Yên

Lương

Sơn

I. tannanti 70 58 (82,8) 4-504 (63,8)

Yên

Bái

Lục

Yên

An Lạc I. tannanti 130 91 (70,0) 1-362 (19,7)

Quảng

Trị

Da

Krong

Da

Krong

V. aluoiense 50 39 (78,0) 1-78 (10,1)

Tà

Long

V. aluoiense 50 48 (96,0) 12-608 (80,0)

Hướng

Hóa

Hướng

Sơn

V. aluoiense 50 50 (100,0) 8-500 (140,8)

Tân

Thanh

V. aluoiense

50

5 (10,0) 1-6 (3,4)

D. haii 50 6 (12,0) 1-3 (2,2)

Ghi chú: s trong ngoặc đơ à s trung bình

Tại 2 xã (An Lạc và Lương Sơn) ở 2 tỉnh phía Bắc, tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm

ở cua suối I. tannanti ở xã Lương Sơn, huyện Bảo Sơn, tỉnh Lào là 82,8% và 4-504

metacercariae/cua, số liệu tương ứng ở xã An Lạc, huyện Lục Yên, tỉnh Yên Bái là

70,0% và 1-362 metacercariae/cua.

Ở tỉnh Quảng Trị, tỷ lệ và cường độ nhiễm ở cả 2 xã thuộc huyện Da Krong đều

cao: xã Tà Long có tỷ lệ và độ nhiễm là 96,0% và 12-608 metacercaria/cua, số liệu tương

ứng của xã Da Krong là 78,0% và 1-78 metacercaria/cua. Tại huyện Hướng Hóa, tỷ lệ và

cường độ nhiễm ở xã Hướng Sơn là 100% và 7-500 metacercariae/cua, cao hơn rất nhiều

so với xã Tân Thanh là 10,0-12,0% và 1-6 metacercariae/cua.

45

Kết quả định loại thu được metacercaria của 5 loài sán lá phổi: P. vietnamensis,

P. heterotremus, P. bangkokensis, P. wstermani và P. proliferus. Cua suối ở 2 xã của

miền Bắc bị nhiễm 4 loài: P. vietnamensis, P. heterotremus, P. bangkokensis và

P. wstermani (hình 3.2).

Hình 3.2. Metacercaria sán lá phổi tìm thấy ở cua suối thu tại Yên Bái và Lào Cai

a. P. heterotremus; b. P. vietnamensis; c. P. westermani; d. P. bangkokensis

(Scale bar chung cho các hình)

Cua suối ở các xã của tỉnh Quảng Trị cũng ị nhiễm 4 loài sán lá phổi:

P. westermani, P. bangkokensis, P. proliferus và P. heterotremus (hình 3.3).

Hình 3.3. Metacercaria sán lá phổi tìm thấy ở cua suối thu tại Quảng Trị

a. P. westermani; b. P. bangkokensis; c. P. heterotremus; d. P. proliferus


46

Tính riêng từng loài SLP cho thấy 2 xã của miền Bắc có tỷ lệ nhiễm

P. heterotremus là cao nhất, dao động từ 69,2 – 82,8%, tỷ lệ nhiễm loài P. vietnamensis

thấp hơn, từ 6,0 – 8,6%; 2 loài P. westermani và P. bangokensis mới chỉ tìm thấy ở xã An

Lạc với tỷ lệ nhiễm tương ứng là 13,8% và 1,5% (bảng 3.5).

Ở các xã của tỉnh Quảng Trị, tỷ lệ nhiễm P. westermani là cao nhất, tỷ lệ nhiễm

các loài khác thấp hơn, dao động từ 2,0-8,0% (bảng 3.5). Loài P. westermani và

P. bangkokensis tìm thấy ở cả 4 xã, trong khi P. proliferus mới tìm thấy ở xã Hướng Sơn,

và P. heterotremus mới tìm thấy ở xã Tà Long với tỷ lệ nhiễm thấp. Đồng nhiễm

metacercaria của 2 hoặc 3 loài sán lá phổi được tìm thấy ở cùng một cơ thể cua.

Bảng 3.5. Tỷ lệ và cường độ nhiễm các loài sán lá phổi ở cua suối

Địa điểm

nghiên cứu

Loài cua Tỷ lệ (%) và cƣờng độ nhiễm (metacercaria/cua) của các loài

P. vietnamensis P. heterotremus P. bangkokensis P. westermani P. proliferus

Lương Sơn I. tannanti 8,6

(1-4)

82,8

(4-504)

An Lạc I. tannanti 6,0

(1-2)

69,2

(1-360)

1,5

(2-2)

13,8

(1-33)

Da Krong V. aluoiense 4,0

(1)

6,0

(1-2)

78,0

(1-78)

Tà Long V. aluoiense 8,0

(1-4)

96,0

(12-608)

Hướng Sơn V. aluoiense 4,0

(1-3)

100,0

7-500

4,0

(1)

Tân Thanh V. aluoiense

2,0

(1)

10,0

(1-5)

D. haii 12,0

(1-3)

Ghi chú: s trong ngoặc đơ à dao độ g cườ g độ nhiễm

Trong nghiên cứu này chúng tôi thu được metacercaria của 5 loài sán lá phổi. Các

loài này đều đã được công bố ở Việt Nam [22]. Tuy nhiên, trước đây, loài

P. heterotremus mới chỉ phát hiện ở các tỉnh miền Bắc giới hạn đến Thanh Hóa và loài

P. wetsermani mới chỉ phát hiện ở các tỉnh miền Trung [22]. Đây là lần đầu tiên

47

metacercaria của P. heterotremus được phát hiện ở Quảng Trị (miền Trung) và

P. wetsermani được phát hiện ở Yên Bái (miền Bắc).

Như vậy, 2 loài P. heterotremus và P. wetsermani đều phân bố ở miền Bắc và

Trung Việt Nam. Tuy nhiên, loài P. heterotremus phổ biến ở miền Bắc, loài

P. westermani phổ biến ở miền Trung.

Về vật chủ trung gian thứ hai, tất cả 5 loài sán lá phổi đều tìm thấy ở các loài cua

suối thuộc họ cua suối Potamidae. Đối với loài P. heterotremus, nghiên cứu đầu tiên ở

Việt Nam xác định vật chủ trung gian thứ hai của loài này là loài cua suối Ranguna

luangprabanensis [5, 88]. Sau đó, loài cua này được định loại lại là Potamiscus mieni

[89]. Các nghiên cứu trước đây ở miền Bắc đã phát hiện metacercaria của loài

P. heterotremus ở 3 loài cua suối thuộc giống này, bao gồm Potamiscus mieni,

Potamiscus tannanti và Potamiscus kimboiense [14]. Năm 2012, các loài thuộc giống

Potamiscus được chuyển sang giống Indochinamon [99]. Trong nghiên cứu này, lần đầu

tiên chúng tôi tìm thấy metacercaria của P. heterotremus ở loài cua suối V. aluoiense tại

tỉnh Quảng Trị. Đây là vật chủ mới và vùng phân bố mới của loài P. heterotremus ở Việt

Nam.

Đối với loài P. westermani, trước đây vật chủ trung gian thứ hai được xác định là

cua suối Potamiscus sp. ở miền Trung, sau đó được định loài là Vietopotamon aluoiense

[19, 91]. Ngoài loài cua này, nghiên cứu này tìm thấy 2 loài cua khác, Donopotamon haii

và Indochinamon tannanti là vật chủ trung gian mới của loài P. westermani ở Quảng Trị

và ở vùng phân bố mới ở tỉnh Yên Bái.

3.2. Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử của sán lá phổi

3.2.1. Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử của loài P. westermani

Đa dạng hình thái P. westermani metacercaria

Metacercaria của loài P. westermani thu thập từ tỉnh Yên Bái tương đối đồng đều

về hình thái, có hình tròn hoặc hình cầu, kích thước trung bình 350,3 x 348,0 μm, với lớp

vỏ trong dày (hình 3.4).

Metacercaria từ tỉnh Quảng Trị khác nhau về kích thước, hình dạng và độ dày lớp

vỏ trong, được chia thành 5 dạng (hình 3.5 a-e). Kích thước metacercaria trình bày ở

bảng 3.6.

Dạng 1 (hình 3.5a) hình cầu, kích thước 282 × 278 μm, lớp vỏ trong mỏng.

48

Dạng 2 (hình 3.5 ) hình oval dài, kích thước 413,3 × 296,7 μm, lớp vỏ trong dày.

Dạng 3 (hình 3.5c) hình cầu, kích thước 380,4 × 376,8 μm, lớp vỏ trong dày.

Dạng 4 (hình 3.5d) tương tự như dạng 3, nhưng có lớp vỏ trong dày hơn.

Dạng 5 (hình 3.5d) hình cầu có kích thước (444,7 × 437,5 μm) với lớp vỏ trong

mỏng.

Kích thước các dạng metacercaria khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,001), trừ

dạng 3 và 4, nhưng chúng lại khác nhau về độ dày lớp vỏ (P<0,001). Metacercaria thu ở

tỉnh Yên Bái và dạng 4 từ Quảng Trị có hình thái giống với metacercaria điển hình thu ở

các nước Bắc Á (Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc và Đài Loan) và Đông Nam Á (Thái

Lan, Malaysia và Philippine).

Hình 3.4. Paragonimus westermani metacercaria thu từ cua suối bắt tại Yên Bái

Hình 3.5. Các dạng P. westermani metacercaria thu từ cua suối tại tỉnh Quảng Trị.

a. dạng 1, b. dạng 2, c. dạng 3, d. dạng 4 và e. dạng 5.

49

Bảng 3.6. Hình dạng và kích thước các dạng metacercaria của loài P. westermani

Đặc

điểm

Metacercariae từ

Yên Bái (n=25)

Metacercaria từ Quảng Trị (mean±stdev (range))

Dạng 1 (n=30) Dạng 2 (n=30) Dạng 3 (n=25) Dạng 4 (n=50) Dạng 5 (n=25)

Hình

dạng

Tròn/cầu Tròn/cầu Oval dài Tròn/cầu Tròn/cầu Tròn/cầu

Kích

thước

336,8±12,8 x 321,7±9,7

(303-369 x 295-336) a

282,0±7,6 x 78,0±7,6

(270-290 x 270-290) b

413,3±12,7 x 96,7±12,7

(400-430 x 280-310) c

380,4±10,2 x 76,8±13,1

(370-400 x 360-400) d

386,3±22,7x76,9±25,9

(340-450 x 270-425) d

444,7±24,1x 37,5±24,4

(391-512 x 385-488) e

Độ dày

lớp vỏ

trong

12,5±1,7

(10,0-15,0) a

3,5±0,8

(2,5-5,0) b

7,0±1,5

(5-10) c

2,8±0,4

(2-4) b

13,7±3,5

(10-25) d

6,4±1,4

(4,5-9,0) c

Ghi chú: trong cùng một hàng, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê, chữ cái giống nhau thể hiện sự

khác nhau không có ý nghĩa thống kê.

50

Phân tích đa dạng di truyền phân tử

Tổng số 13 mẫu metacercaria được phân tích di truyền phần tử, bao gồm 3

mẫu ở Yên Bái (ký hiệu MC-YB) và 10 mẫu từ xã Hướng Sơn, Quảng Trị, mỗi

dạng 2 mẫu metacercaria (ký hiệu MC-QT type 1 đến MC-QT- Type 5). Trình tự

ITS2 và 16S thu được từ P. westermani metacercaria trong nghiên cứu này được

gửi trên ngân hàng gen Genbank với mã số truy cập LC144895-LC144910.

Trình tự ITS2 dài 464 bp, so sánh cho thấy 1-2 (0,2-0,4%) vị trí nucleotid

khác nhau giữa các mẫu P. westermani của Việt Nam. Ở cây tiến hóa (hình 3.6),

các mẫu của Việt Nam cùng nhánh với các trình tự từ Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung

Quốc và Đài Loan. Một trình tự của Thái Lan và Ấn Độ cũng thuộc nhánh này,

trong khi các trình tự khác của Thái Lan cùng nhánh với các trình tự của Malaysia

và Philippine, các trình tự khác của Ấn Độ làm thành một nhánh riêng biệt, chứng

tỏ sự đa dạng di truyền phân tử của P. westermani ở Thái Lan và Ấn Độ.

Trình tự gen 16S dài 803 bp. Kết quả so sánh cho thấy dạng diploid và

triploid được phân biệt ở 2 vị trí, A/G và C/T ở vị trí 238 và 523 (bảng 3.7). Theo

đó, tất cả các trình tự của Việt Nam từ Yên Bái và Quảng Trị đều thuộc dạng

diploid. Các mẫu thu từ Quảng Trị và Yên Bái khác nhau 1,1-1,4%. Trên cây phát

sinh loài (hình 3.7), các trình tự của Việt Nam làm thành một nhánh chung gần với

nhóm Đông Bắc Á.

Bảng 3.7. Sai khác vị trí nucleotide của trình tự gen 16S giữa dạng diploid và

triploid P. westermani

Mẫu Nucleotid vị trí 238 523

AY190066 P. westermani JPN 3n G T

AY190069 P. westermani CHN 3n G T



AY190052 P. westermani JPN 2n A C

AY190050 P. westermani JPN 2n A C

AY190058 P. westermani CHN 2n A C

AY190061 P. westermani TAW 2n A C

AY190064 P. westermani PHL 2n A C

AY190071 P. westermani MAY 2n A C

AY190072 P. westermani THA 2n A C

MC- Yên Bái (3 mẫu) A C

MC- Quảng Trị (10 mẫu) A C

51

Hình 3.6. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần thể P. westermani dựa trên

trình tự ITS2 được xây dựng b ng phương pháp Maximum Likelihood.

Giá trị Bootstrap được ghi ở mỗi nhánh. Các trình tự mới thu được trong nghiên

cứu này được chỉ rõ mã số và số lượng mẫu ở trong ngoặc, các trình tự khác từ

ngân hàng gen được chỉ rõ b ng mã số truy cập, tên loài, và mã quốc gia viết tắt 3

chữ cái (CHN = Trung Quốc, LAO = Lào, IND = Ấn Độ, MYS = Malaysia, PHL =

Phillippines, LKA = Sri Lanka, KOR = Hàn Quốc, JPN = Nhật Bản, TAW = Đài

Loan, THA = Thái Lan, VNM= Việt Nam)

52

Hình 3.7. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần thể P. westermani dựa trên

trình tự gen 16S được xây dựng b ng phương pháp Maximum Likelihood.

Các trình tự mới thu được trong nghiên cứu này được chỉ rõ mã số và số lượng mẫu

ở trong ngoặc, các trình tự khác từ ngân hàng gen được chỉ rõ b ng mã số truy cập,

tên loài, và mã quốc gia viết tắt 3 chữa cái (CHN = Trung Quốc, LAO = Lào, IND

= Ấn Độ, MYS = Malaysia, PHL = Phillippines, LKA = Sri Lanka, KOR = Hàn

Quốc, JPN = Nhật Bản, TAW = Đài Loan, THA = Thái Lan, VNM = Việt Nam).

53

Như đã trình bày ở phần tổng quan tài liệu, loài P. westermani rất đa dạng

về hình thái, di truyền, sinh học và khả năng gây ệnh [1]. Ở giai đoạn

metacercaria, sự khác biệt về kích thước và độ dày vỏ nang đã được thông báo [1,

25]. Metacercaria điển hình có dạng hình cầu với lớp vỏ nang bên trong rất dày

[25]. Các công bố trước đây cho r ng metacercaria dạng triploid ở vùng Đông Bắc

Á có kích thước lớn hơn dạng diploid [103, 104]. Những nghiên cứu sau đó ở các

khu vực khác cho thấy metacercaria loài P. westermani rất đa dạng về hình thái và

kích thước: P. westermani metacercaria ở Sri Lanka có kích thước 656 x 465 μm, ở

Ấn Độ có hình oval dài, kích thước là 420,6 - 1012,7 μm và có lớp vỏ mỏng [59,

107]. Sự khác nhau rõ ràng về kích thước metacercaria cũng đã được thông báo ở

Thái Lan [105].

Nghiên cứu của chúng tôi cũng thấy đa dạng về hình thái metacercaria của

P. westermani ở Quảng Trị. Phần lớn metacercaria có hình thái giống với

metacercaria điển hình ở Bắc Á và Đông Nam Á. Một số có kích thước nhỏ giống

với dạng metacercaria nhỏ ở Thái Lan, hoặc có hình oval dài giống hình thái

metacercaria ở Sri Lanka và Ấn Độ, nhưng nhỏ hơn về kích thước. Tất cả các trình

tự từ các nước Nam Á, Đông Nam Á ao gồm cả Việt Nam đều thuộc dạng 2n,

mặc dù rất khác nhau về kích thước và hình dạng. Vì vậy, dựa vào kích thước

không thể phân biệt metacercaria P. westermani ở dạng 2n hay 3n, nhưng có thể

phân biệt ở 2 vị trí nucleotide của trình tự gen 16S. Việc phân biệt dạng 2n và 3n có

ý nghĩa dịch tễ học, vì dạng 3n được cho là có khả năng gây bệnh cho người nặng

hơn so với dạng 2n [1].

Trái ngược với sự đa dạng về hình thái, các mẫu P. westermani của Việt

Nam có mức độ tương đồng cao về di truyền dựa trên dữ liệu trình tự ITS2 và 16S,

chỉ có sự khác biệt nhỏ về trình tự gen ty thể 16S giữa các quần thể từ các vùng

khác xa về địa lý từ Yên Bái và Quảng Trị.

Số liệu về di truyền phân tử trước đây cho r ng P. westermani được chia

thành 2 nhóm: Nam Á và Bắc Á [106]. Các nghiên cứu sau đó ( ao gồm cả nghiên

cứu này) thấy r ng P. westermani đa dạng hơn và được chia thành một số nhóm:

Bắc Á (gồm Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc và Đài Loan), Nam Á (Ấn Độ và

Sri Lanka) và Đông Nam Á (Malaysia, Philippines, Thái Lan và Việt Nam). Hai

54

nhóm sau lại chia thành một số phân nhóm theo các quốc gia với với giá trị bootrap

thấp.

Về phân loại, P. westermani đã từng được đề xuất chia thành 2 loài, một từ

Bắc Á (Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc và Nhật Bản) và một từ Đông Nam Á

(Philippines, Malaysia và Thái Lan) [106, 107]. Gần đây, Iwagami et al. (2008)

[108] cũng đề nghị P. westermani từ Sri Lanka tách thành một loài riêng biệt dựa

vào sự khác biệt về di truyền. Chúng tôi đồng ý r ng P. westermani từ Sri Lanka và

Ấn Độ khác xa về di truyền và hình thái metacercaria so với các nước khác. Tuy

nhiên, rất khó để tách chúng thành một loài riêng biệt vì thiếu sự khác biệt rõ ràng

về hình thái của sán trưởng thành và không có sự tách biệt rõ ràng của các nhánh ở

cây phát sinh chủng loại. Thậm chí, 2-3 nhánh khác xa về di truyền tìm thấy ở

trong cùng một quốc gia như Sri Lanka, Thái Lan và Ấn Độ. Để làm sáng tỏ hơn về

phân loại của P. westermani cần có sự hợp tác của các nhà khoa học ở các vùng địa

lý khác nhau để thu thập số liệu đầy đủ về hình thái và di truyền phân tử của loài

SLP này.

3.2.2. Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử của loài P. heterotremus

Trước đây, P. heterotremus mới chỉ phát hiện ở các tỉnh phía Bắc, giới hạn

đến Thanh Hóa ở khu vực vườn quốc gia Cúc Phương [22]. Nghiên cứu cũng đã chỉ

ra đa dạng hình thái metacercaria của P. heterotremus thu ở miền Bắc [23]. Tuy

nhiên hoàn toàn tương đồng về di truyền phân tử, hình thái sán trưởng thành và khả

năng phát triển ở vật chủ chính [24].

Trong nghiên cứu này, điều tra tại Yên Bái và Lào Cai, chúng tôi cũng thu

được sự đa dạng về kích thước của P. heterotremus metacercaria (hình 3.8) tương tự

như công ố trước, vì vậy nghiên cứu này không phân tích lặp lại, mà kế thừa kết quả

đã có để so sánh với các mẫu P. heterotremus lần đầu tiên thu được ở tỉnh Quảng Trị.

Về hình thái, metacercaria thu từ Quảng Trị có hình oval, kích thước 226-252 x

218-236 µm (hình 3.9).

55

Hình 3.8. Metacercaria của P. heterotremus thu từ Yên Bái và Lào Cai

Hình 3.9. Hai metacercaria của P. heterotremus thu từ Quảng Trị

Hai mẫu metacercaria P. heterotremus thu từ Quảng Trị đã được phân tích trình

tự ITS2 và CO1, và so sánh với các mẫu thu từ miền Bắc. Các trình tự gen ITS2 và

CO1 của loài P. heterotremus và P. pseudoheterotremus có trên ngân hàng gene

(Genbank) được sử dụng để phân tích mối quan hệ tiến hóa. Các trình tự gen tương

đồng của loài P. vietnamensis được sử dụng làm nhóm out-group.

Kết quả phân tích cho thấy trình tự ITS2 và CO1 của 2 mẫu P. heterotremus

từ Quảng Trị (ký hiệu MC-QT 1 và MC-QT 2) có độ dài tương ứng là 464 và 387

bp. Các trình tự của 2 mẫu hoàn toàn tương đồng (100%) với nhau và tương đồng

cao với các mẫu thu từ miền Bắc. Các trình tự của Việt Nam, Trung Quốc và Thái

Lan làm thành một nhóm chung ở cả 2 cây ITS2 (hình 3.10) và CO1 (hình 3.11).

Các mẫu P. heterotremus từ Ấn Độ khác đáng kể và thành lập một nhóm riêng.

Trình tự ITS2 của mẫu P. pseudoheterotremus tương đồng cao (99,7%) với

trình tự ITS2 của loài P. heterotremus của Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam và

56

n m trong nhóm này; tuy nhiên, trình tự CO1 của P. pseudoheterotremus khác

10,4% so với quần thể P. heterotremus của Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam và

khác 5,7% so với quần thể P. heterotremus của Ấn Độ.

Hình 3.10. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần thể P. heterotremus dựa trên

trình tự ITS2 được xây dựng b ng phương pháp Maximum Likelihood.

Giá trị Bootstrap được ghi ở mỗi nhánh. Các trình tự thu được trong nghiên cứu

này được chỉ rõ mã số (MC-QT 1 và MC-QT 2), các trình tự khác từ ngân hàng gen

được chỉ rõ b ng mã số truy cập, tên loài và mã quốc gia viết tắt 3 chữ cái (CHN =

Trung Quốc, IND = Ấn Độ, THA = Thái Lan, VNM – Việt Nam)

57

Hình 3.11. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần thể P. heterotremus dựa trên

trình tự CO1 được xây dựng b ng phương pháp Maximum Likelihood.

Giá trị Bootstrap được ghi ở mỗi nhánh. Các trình tự thu được trong nghiên cứu

này được chỉ rõ mã số (MC-QT 1 và MC-QT 2), các trình tự khác từ ngân hàng gen

được chỉ rõ b ng mã số truy cập, tên loài, và mã quốc gia viết tắt 3 chữ cái (CHN =

Trung Quốc, IND = Ấn Độ, THA = Thái Lan, VNM – Việt Nam)

58

Trong giống Paragonimus, loài P. heterotremus được đặc trưng ởi

metacercaria có kích thước nhỏ nhất, sán trưởng thành có giác miệng lớn gấp đôi

giác bụng [1]. Năm 2007, loài P. pseudoheterotremus được mô tả từ Thái Lan, mặc

dù loài này rất giống với loài P. heterotremus cả về hình thái và trình tự đoạn ITS2

[78, 109]. Theo mô tả gốc, sự khác biệt chính giữa 2 loài P. pseudoheterotremus và

P. heterotremus là kích thước metacercaria và gai cơ thể của sán trưởng thành:

metacercaria của P. pseudoheterotremus hơi nhỏ hơn P. heterotremus; ngược lại,

gai cơ thể sán trưởng thành của P. pseudoheterotremus hơi lớn hơn của loài

P. heterotremus [109].

Tuy nhiên, như đã trình ày ở phần Tổng quan tài liệu r ng kích thước gai

cơ thể và metacercaria ít được dùng để phân biệt loài vì gai cơ thể thay đổi trong

quá trình phát triển của sán trong cơ thể vật chủ chính và khác nhau giữa các vùng

của cơ thể sán [1]. Sự đa dạng về metacercaria của loài sán lá phổi cũng đã được

thông báo [60, 106]. Kích thước metacercaria của P. pseudoheterotremus hơi nhỏ

hơn metacercaria của P. heterotremus ở Thái Lan [109], nhưng khi so sánh với số

liệu từ các vùng địa lý khác nhau, Doanh et al. (2015) [23] thấy r ng kích thước

metacercaria của P. pseudoheterotremus tương đương với metacercaria của

P. heterotremus ở Trung Quốc [110], Ấn Độ [111] và Việt Nam [23]. Như vậy,

hình dạng và kích thước của metacercaria P. heterotremus có sự đa dạng theo các

quần thể địa lý khác nhau và thậm chí trong cùng một quần thể. Kích thước và đặc

điểm metacercaria của P. pseudoheterotremus n m trong khoảng dao động của

P. heterotremus. Vì vậy rất khó để tìm thấy sự khác biệt về hình thái rõ ràng giữa

P. heterotremus và P. pseudoheterotremus để tách chúng thành loài riêng biệt [23].

Về đặc điểm phân tử, P. pseudoheterotremus và P. heterotremus của Thái

Lan chỉ khác nhau 1 nucleotid (tương đương 0,3%) ở trình tự ITS2 và khác nhau

10,4% ở trình tự gen CO1 [78]. Như đã chỉ ra r ng trình tự ITS2 là chỉ thị tốt cho

phân biệt giữa các loài và trình tự CO1 là chỉ thị tốt để phân biệt các quần thể trong

loài [1]. Sự khác nhau 1 nucleotid trong trình tự ITS2 của P. pseudoheterotremus

và P. heterotremus không thích hợp để tách P. pseudoheterotremus thành một loài

độc lập.

Hơn nữa, phân tích phân tử dựa trên số lượng lớn mẫu P. heterotremus và

P. pseudoheterotremus từ các nước khác nhau cho thấy r ng sự khác biệt giữa các

59

quần thể địa lý của P. heterotremus thậm chí lớn hơn sự khác biệt giữa

P. heterotremus và P. pseudoheterotremus ở Thái Lan. Ở cây phát sinh loài dựa

trên trình tự ITS2, P. pseudoheterotremus được nhóm với P. heterotremus từ Trung

Quốc, Thái Lan và Việt Nam làm thành một nhánh tách biệt với quần thể

P. heterotremus từ Ấn Độ. Tuy nhiên, ở cây phát sinh loài dựa trên trình tự CO1,

P. pseudoheterotremus lập thành một nhóm riêng gần hơn với quần thể

P. heterotremus từ Ấn Độ. Ở đây, 3 nhóm: P. heterotremus của Ấn Độ;

P. heterotremus của Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam; và P. pseudoheterotremus

của Thái Lan tách biệt nhau rõ ràng. Mặc dù, sự sai khác về trình tự CO1 của chúng

tương đối lớn (5,7 – 10,4%), khoảng cách di truyền này vẫn nhỏ hơn hoặc tương

đương với khoảng cách di truyền giữa các quần thể trong các phức hợp loài

P. skrjabini từ 9,5 – 11,5% [112] hoặc của P. westermani là 29,5% [105, 107, 113].

Vì vậy, 3 nhóm của P. heterotremus và P. pseudoheterotremus đã được xếp là các

quần thể của một phức hợp loài P. heterotremus [23].

Cho đến nay, loài P. heterotremus đã phát hiện ở đông ắc Ấn Độ, Trung

Quốc (3 tỉnh phía nam: Vân Nam, Quảng Châu, Quảng Tây), Việt Nam, Lào, Thái

Lan và gần đây được phát hiện ở Myanma [76]. Ở Việt Nam, các nghiên cứu trước

đây phát hiện P. heterotremus ở các tỉnh phía Bắc, giới hạn đến Thanh Hóa. Nghiên

cứu này bổ sung vùng phân bố mới của loài này ở tỉnh Quảng Trị.

3.3. Một số đặc điểm sinh học của sán lá phổi Paragonimus heterotremus và


3.3.1. Vật chủ trung gian thứ nhất

3.3.1.1. Định loại cercaria sán lá phổi và vật chủ trung gian thứ nhất của chúng

Kết quả điều tra metacercaria ở vật chủ trung gian 2 đã xác định các địa

điểm có tỷ lệ nhiễm sán lá phổi cao nhất ở các xã Lương Sơn (Lào Cai), An Lạc

(Yên Bái), Hướng Sơn và Da Krong (tỉnh Quảng Trị). Vì vậy, điều tra vật chủ

trung gian thứ nhất được thực hiện ở các địa điểm này.

Tại các địa điểm nghiên cứu thu được các loài ốc có kích thước nhỏ 3-4 mm

thuộc phân họ Triculinae, có thể là giống Vietricula [99], loài ốc có kích thước lớn

(4 cm) ở thuộc giống Sulcospira, và loài ốc vặn Menaloides tuberculatus cũng thu

được ở các địa điểm nghiên cứu với số lượng ít, vì loài ốc này ưa sống ở môi

trường nước tĩnh. Phổ biến nhất là ốc thuộc giống Sulcospira với số lượng lớn.

60

Cercaria thuộc nhóm microcercaria đặc trưng của giống SLP tìm thấy ở ốc

Triculinae gen sp.1 bắt ở xã An Lạc, Lương Sơn (hình 3.12a) và ốc Triculinae gen

sp.2 ở xã Hướng Sơn (hình 3.12 ) và ốc Sulcospira sp. ở xã Hướng Sơn (hình

3.12c), nhưng không tìm thấy ở ốc Sulcospira sp. ở xã An Lạc và ốc M.

tuberculatus ở các địa điểm nghiên cứu.

Hình 3.12. Ốc nhiễm ấu trùng microcercaria của sán lá phổi

a. Triculinae gen sp.1 thu từ Lào Cai và Yên Bái; b, Triculinae gen sp.2 và

c, Sulcospira sp. thu từ Quảng Trị

Các mẫu ốc nhiễm ấu trùng microcercaria được phân tích trình tự gen CO1

để thẩm định loài. Kết quả phân tích trình tự CO1 và tìm kiếm trình độ tương đồng

trên GenBank b ng chương trình BLAST cho thấy trình tự CO1 của mẫu ốc

Sulcospira sp. ở Quảng Trị có độ dài 658 bp, tương đồng cao nhất (99%) với loài

Sulcospira quangtriensis (hình 3.13). Vì vậy, có thể khẳng định đây là loài S.

quangtriensis thuộc họ ốc Pachychilidae, liên họ Cerithioidea.

Hình 3.13. Trình tự CO1 của loài ốc nhiễm microcercaria thu từ Quảng Trị tương

đồng cao nhất (99%) với loài S. quangtriensis.

61

Trình tự CO1 của các mẫu ốc nhỏ về hình thái được xác định thuộc phân họ

Triculinae có độ dài 658 bp tương đồng cao nhất với trình tự loài Gammatricula

fujiansis (AF213342), nhưng với tỷ lệ không cao 90-91% (hình 3.14, 3.15).

Hình 3.14. Trình tự CO1 của loài ốc nhiễm microcercaria thu từ Yên Bái và Lào

Cai tương đồng cao nhất (91%) với loài G. fujiansis.

Hình 3.15. Trình tự CO1 của loài ốc nhiễm microcercaria thu từ Quảng Trị tương

đồng cao nhất (91%) với loài G. fujiansis.

Phân tích so sánh với trình tự các loài thuộc giống Gammatricula và các loài

có quan hệ gần trong phân họ Triculinae, họ Pomatiopsidae cho thấy mẫu ốc ở Yên

Bái và Lào Cai hoàn toàn tương đồng với nhau, khác 12,6% so với với trình tự mẫu

ốc ở Quảng Trị. Khoảng cách giữa các loài thuộc giống Gammatricula dao động từ

6,4%-12,5% (bảng 3.8). Vì vậy, có thể khẳng định mẫu ốc ở Quảng Trị khác loài

với mẫu ốc thu từ Yên Bái và Lào Cai.

Bảng 3.8. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu ốc thu từ Việt Nam so với các loài

thuộc giống Gammatricula dựa vào trình tự gen CO1.


62

Trên cây phát sinh chủng loại, các mẫu ốc thu được ở các địa điểm nghiên

cứu làm thành các nhánh khác nhau trong phân họ Triculinae, có quan hệ gần với

các loài thuộc giống Gammatricula và Tricula, tuy nhiên với giá trị bootrap rất thấp

(hình 3.16). Vì vậy, để xác định chính xác vị trí phân loại của các loài ốc này cần

kết hợp phân tích hình thái và giải phẫu được thực hiện bởi các nhà nhuyễn thể học.

Hiện tại chúng tôi tạm xác định loài ốc ở Lào Cai và Yên Bái là Triculinae gen sp.1

và ở Quảng Trị là Triculinae gen sp.2.

Hình 3.16. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các loài ốc thuộc họ Pomatiopsidae.


63

Năm 2006, một giống ốc mới thuộc phân họ Triculinae ở Việt Nam được mô

tả và đặt tên là Pseudotricula [97]. Sau đó đổi tên là Vietricula [98]. Liu et al.

(2014) [36] cho r ng các mẫu ốc này có đặc điểm của giống Gammatricula. Kết

quả phân tích phân tử cho thấy loài ốc thu từ Quảng Trị có quan hệ gần với giống

Gammatricula, nhưng loài ốc thu từ Lào Cai và Yên Bái có quan hệ gần với giống

Tricula. Phân loại của phân họ ốc này ở Việt Nam cần được nghiên cứu kỹ hơn.

Định loại phân tử ấu trùng sán lá phổi ở vật chủ trung gian thứ nhất

Các trình tự ITS2 có độ dài 464 bp. Trình tự ITS2 của ấu trùng thu từ 6 cá

thể ốc Triculinae gen sp.1 tại xã Lương Sơn và An Lạc 100% tương đồng với loài

P. heterotremus (hình 3.17), từ ốc Triculinae gen sp.2 ở xã Hướng Sơn tương đồng

100% với loài P. proliferus (hình 3.18) và từ 5 cá thể ốc S. quangtriensis ở xã

Hướng Sơn tương đồng 100% với loài P. westermani (hình 3.19).

Hình 3.17. Trình tự ITS2 của cercaria thu từ ốc Triculinae gen sp.1 tại Lương Sơn

và An Lạc 100% tương đồng với loài P. heterotremus.

Hình 3.18. Trình tự ITS2 của cercaria thu từ ốc Triculinae gen sp.2 tại xã Hướng

Sơn, Quảng Trị 100% tương đồng với loài P. proliferus.

Hình 3.19. Trình tự ITS2 của cercaria thu từ ốc S. quangtriensis tại xã Hướng Sơn,

Quảng Trị 100% tương đồng với loài P. westermani.

64

Đặc điểm hình thái ấu trùng sán lá phổi trong c vật chủ trung gian

Cercaria của 3 loài SLP thu được trong nghiên cứu này rất giống nhau về

hình dạng và kích thước (hình 3.20, bảng 3.9). Cercaria gồm 2 phần thân và đuôi.

Giác miệng ở mút đầu, có stylet (gai), giác bụng ở sau phần giữa thân, nhỏ hơn giác

miệng. Mỗi bên giác bụng có 7 tế bào xâm nhập xếp thành 2 chùm (3 và 4 tế bào).

Túi bài tiết hình chữ I ở cuối thân. Đuôi ngắn hình nắm tay, có lông (hình 3.20).

Kích thước cercaria của 3 loài sán lá phổi tương tự nhau (bảng 3.9).

Redia con của 3 loài cũng có kích thước tương tự nhau, nhưng có thể phân

biệt b ng chiều dài ruột và số lượng cercaria trong mỗi redia. Redia của loài

P. westermani chứa 6-8 cercaria và ruột dài đến gần mút cuối, chiếm 75% chiều dài

cơ thể, dài hơn ruột redia của 2 loài P. heterotremus và P. proliferus chỉ chiếm 20%

chiều dài cơ thể (P<0,001). Hai loài này đều nhiễm ở ốc thuộc giống

Gammatricula, có cercaria giống nhau và redia có ruột ngắn như nhau, tuy nhiên

chúng có thể phân biệt b ng số lượng cercaria/redia. Loài P. heterotremus 10-12

cercaria/redia, nhiều hơn so với loài P. proliferus (5-6 cercaria/redia) (P < 0,0001).

Bảng 3.9. Kích thước ấu trùng sán lá phổi trong cơ thể ốc

Đặc điểm Kích thước (µm) của các loài sán lá phổi

P. heterotremus P. proliferus P. westermani

Cercaria

Cơ thể 240-300 x 80-110 280-316 x 100-160 256-306 x 104-120

Giác miệng 50-70 x 50-60 60-75 x 60-75 64-80 x 64-80

Giác bụng 28-30 x 28-30 35-50 x 35-50 40-48 x 40-48

Stylet dài 20-25 25-30 20-24

Đuôi dài 40-50 40-50 40-48

Redia

Cơ thể 900-980x200-260 1000-1100x220-300 600-960 x 200-256

Hầu 70-86 x 70-86 80-100 x 80-100 64-80 x 64-80

Ruột dài 180-240a 200-300

a 620-640

b

Tỷ lệ chiều dài

ruột/ cơ thể (%)

20 20 75

Số cercaria/redia 10-12a 5-6

b 6-8

c

Ghi chú: trong cùng một hàng, chữ cái giống nhau thể hiện sự khác nhau không có

ý nghĩa thống kê (P>0,05), các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa

thống kê (P<0,05).

65

a b c

Hình 3.20. Cercaria (trên) và redia (dưới) của các loài sán lá phổi

a. P. heterotremus; b. P. proliferus; c. P. westermani


Mặc dù giống Paragonimus có khoảng 50 loài đã được mô tả, nhưng số liệu

về ấu trùng sán lá phổi còn tương đối ít [1]. Mô tả ấu trùng của một số loài SLP

được công bố ở các bài báo riêng lẻ, chưa có tài liệu nào so sánh phân biệt ấu trùng

66

giữa các loài SLP trong cơ thể vật chủ trung gian thứ nhất. Đây là lần đầu tiên

chúng tôi thu được ấu trùng cercaria/redia của 3 loài ở vật chủ ốc ngoài tự nhiên,

phân tích phân tử đã định loại chính xác loài và so sánh hình thái cho thấy đặc điểm

redia (chiều dài ruột và số lượng cercaria/redia) có ý nghĩa trong việc phân biệt ấu

trùng giữa các loài SLP.

Ở Việt Nam, Nguyễn Văn Đề và cs. [8, 9] công bố vật chủ trung gian của

loài P. heterotremus là ốc vặn M. tuberculatus. Tuy nhiên, tác giả không cung cấp

hình vẽ và mô tả cercaria. Phạm Ngọc Doanh và cs. (2002) [14] đã tìm thấy

cercaria thuộc nhóm microcercaria đặc trưng của SLP. Vào thời điểm đó ở Việt

Nam mới chỉ phát hiện một loài SLP phổ biến là P. heterotremus, nên các tác giả

cho r ng cercaria thu được thuộc loài P. heterotremus. Cho đến nay đã phát hiện 7

loài SLP, trong đó nhiều loài phân bố ở cùng địa điểm [22]. Vì vậy, chỉ dựa vào

hình thái cercaria thì khó kết luận chính xác loài SLP. Trong nghiên cứu này, kết

hợp phân tích hình thái của cercaria/redia và phân tử của cả ấu trùng và vật chủ ốc

đã xác định chính xác vật chủ trung gian thứ nhất của 3 loài SLP (hình 3.21).

Hình 3.21. Ốc vật chủ trung gian của các loài sán lá phổi

a. Triculinae gen sp.1 vật chủ trung gian của P. heterotremus;

b. Triculinae gen sp.2 vật chủ trung gian của P. proliferus;

c. Sulcospira quangtriensis vật chủ trung gian của P. westermani

67

3.3.1.2. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá phổi ở vật chủ trung gian thứ nhất

Tỷ lệ nhiễm ấu trùng SLP ở vật chủ ốc tại các địa điểm nghiên cứu trình bày

ở bảng 3.10. Ốc Triculinae gen sp.1 ở xã Lương Sơn và An Lạc bị nhiễm ấu trùng

SLP với tỷ lệ tương ứng là 1,0 và 0,3%. Tại xã Hướng Sơn, Quảng Trị ốc

Triculinae gen sp.2 có tỷ lệ là 0,07%, ốc S. quangtriensis bắt ở suối lớn không bị

nhiễm ấu trùng SLP, ốc bắt ở khe suối nhỏ bị nhiễm với tỷ lệ 1,0%. Ốc

S. quangtriensis bắt tại suối lớn ở xã Da Krong và ốc Sulcospira sp. thu tại xã An

Lạc chưa thấy bị nhiễm ấu trùng SLP.

Bảng 3.10. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá phổi ở ốc tại các địa điểm nghiên cứu

TT Địa điểm Loài ốc Số mổ Số nhiễm

(%)

Loài sán lá phổi

1 Lương Sơn

(LC)

Triculinae gen sp.1 200 2 (1,0) P. heterotremus

M. tuberculatus 50 0

2 An Lạc (YB) Triculinae gen sp.1 1200 4 (0,3) P. heterotremus


Sulcospira sp. 1000 0

3 Hướng Sơn

(QT)

Triculinae gen sp.2 1.520 1 (0,07) P. proliferus

S. quangtriensis 500

5.000*

5 (1,0)

0

P. westermani


4 Da Krong (QT) S. quangtriensis 5.000 0


Ghi chú: * Ốc bắt ở suối lớn

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm ấu trùng cercaria sán lá phổi ở vật

chủ trung gian ốc tương đối thấp, tương tự như tỷ lệ nhiễm ở các nơi khác của vùng

Tây Bắc dao động từ 0,2-0,75% [14], ở Malaysia là 0,033-0,108% [32], ở Quảng

Tây, Trung Quốc có tỷ lệ nhiễm ở ốc là 0,11% [34] và ở ổ bệnh tại Ecuador cũng

chỉ là 0,04% [33].

68

Ở xã Hướng Sơn, tại con suối lớn có mật độ ốc S. quangtriensis dày đặc bám

ở các tảng đá. Tuy nhiên, ốc ở đây chưa phát hiện nhiễm ấu trùng SLP. Có thể do ở

suối lớn mực nước luôn cao, chảy xiết, miracidium khó xâm nhập vào ốc. Ngược

lại, loài ốc này bắt ở các khe suối nhỏ bị nhiễm ấu trùng P. westermani.

Như đã đề cập ở trên, số liệu về vật chủ trung gian thứ nhất ngoài tự nhiên

của SLP còn rất ít, chủ yếu được xác định qua gây nhiễm thực nghiệm, trừ một vài

loài rất phổ biến đã phát hiện vật chủ trung gian thứ nhất ngoài tự nhiên [1]. Đây là

lần đầu tiên vật chủ trung gian thứ nhất ngoài tự nhiên của 3 loài SLP được xác

định ở Việt Nam, trong đó có cả loài P. proliferus là loài hiếm gặp [22].

Tổng kết các nghiên cứu cho thấy SLP thích nghi với vật chủ ốc ở mức liên

họ. Thành viên trong phức hợp loài P. westermani chỉ tìm thấy ở ốc thuộc liên họ

Ceritheoidea, mà không ở liên họ Rissooidea là vật chủ trung gian của các loài SLP

khác, như P. skrjabini, P. ohirai, P.miyazaki, P. fukienesis, P. kellikotti,

P. proliferus, P. heterotremus, P. calienesis và P. mexicanus [35].

Sự thích nghi với vật chủ ốc còn phụ thuộc vào vùng địa lý: P. westermani ở

Philippines và Malaysia sử dụng ốc thuộc họ Thiaridae, trong khi loài này ở Nhật

Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc và Đài Loan sử dụng ốc thuộc họ Pleurocercidae là

vật chủ trung gian thứ nhất [1, 115]. Gần đây ở Srilanka, Iwagami et al. (2009)

[116] tìm thấy P. westermani cercaria ở ốc Paludomus sp. của họ Paludomidae

cũng thuộc liên họ Ceritheoidea.

Nghiên cứu này tìm thấy cercaria của P. westermani ở ốc thuộc họ

Pachychilidae, liên họ Ceritheoidea. Kết quả này cung cấp thêm b ng chứng ủng hộ

kết luận r ng SLP thích nghi với vật chủ ốc ở mức liên họ. Hai loài ốc Triculinae

gen sp.2 và S. quangtriensis bắt ở cùng một khe suối, nhưng ấu trùng loài

P. westermani tìm thấy ở ốc S. quangtriensis (liên họ Ceritheoidea), còn loài

P. proliferus thấy ở ốc Triculinae gen sp.2 (liên họ Rissoodea). Loài ốc Triculinae

gen sp.1 nhiễm loài sán lá phổi P. heterotremus. Như vậy, ấu trùng của mỗi loài

SLP tìm thấy ở các loài ốc vật chủ khác nhau. So với các nước trong khu vực, vật

chủ trung gian thứ nhất của 3 loài SLP ở Việt Nam được xác định trong nghiên cứu

này mang tính đặc trưng riêng (bảng 3.11).

69

Bảng 3.11. Vật chủ ốc của 3loài sán lá phổi ở các nước và Việt Nam

TT Loài sán lá Vật chủ ốc

Các nước khác Việt Nam

1 P. heterotremus Assiminea sp.

Neotricula aperta*

Oncomelania hupensis*

Tricula sp.

Triculinae gen sp.1

2 P. proliferus Tricula gregoriana*

Tricula cristella*

Triculinae gen sp.2

3 P. westermani Semisulcospira amurensis

S. calculus

S. cancellata

S. extensa

S. gottchei

S. libertina

S. mandarina

S. multicincta

S. nodiperda

S. peregrinorum

Brotia asperata,

B. costula

Juga buettneri

J. tegulata

Sulcospira quangtriensis

Nguồn tài liệu [1] Nghiên cứu này

*Vật chủ thí nghiệm

3.3.2. Vật chủ chính ngoài tự nhiên của sán lá phổi

Kết quả xét nghiệm 30 mẫu phân chó nhà tại 2 xã Hướng Sơn và Da Krong

đều âm tính với trứng SLP. Điều tra thu thập mẫu phân động vật hoang ở cả 2

huyện, thu được 120 mẫu phân động vật hoang ở khu vực Khu bảo tồn thiên nhiên

Da Krong, huyện Da Krong. Kết quả xét nghiệm đã thu được trứng SLP (hình

70

3.22a-c) ở 7 mẫu. Ngoài ra, một dạng trứng sán lá khác có kích thước (105-110 x

65-70 µm, hình 3.22d) cũng được tìm thấy ở một số mẫu phân dương tính với SLP.

Hình 3.22. Trứng sán lá phổi Paragonimus sp. (a-c) và trứng sán lá (d) thu từ mẫu

phân động vật hoang tại Quảng Trị


Các mẫu trứng được định loài b ng phân tích trình tự ITS2. Các trình tự

ITS2 thu từ các mẫu trứng sán có độ dài 464 p được lưu trữ trên GenBank với mã

số truy cập LC025641-LC025648. Kết quả Blast cho thấy các trình tự ITS2 100%

tương đồng với các trình tự của các loài trên GenBank, bao gồm P. westermani (3

mẫu, hình 3.23), P. heterotremus (2 mẫu, hình 3.24) và P. skrjabini (2 mẫu, hình

3.25), và mẫu trứng sán (hình 3.22d) thuộc loài Pharyngostomum cordatum (hình

3.26), đây là loài sán lá đặc trưng của mèo rừng.

Hình 3.23 . Trình tự ITS2 của trứng sán lá phổi tương đồng với loài P. westermani.

Hình 3.24 . Trình tự ITS2 của trứng sán lá phổi tương đồng với P. heterotremus.

71

Hình 3.25 . Trình tự ITS2 của trứng sán lá phổi tương đồng với loài P. skrjabini.

Hình 3.26 . Trình tự ITS2 của trứng sán lá tương đồng với loài Pharyngostomum

cordatum.

Các mẫu phân dương tính với trứng SLP được phân tích trình tự D-Loop của

gen ty thể để xác định loài vật chủ. Các trình tự D-Loop từ 7 mẫu phân dương tính

SLP có độ dài 728 bp, được lưu trữ trên Genbank với mã số truy cập LC025634-

LC025640. Kết quả BLAST cho thấy các trình tự có độ tương đồng cao nhất (99%)

với trình tự D-Loop (KP202260) của mèo rừng Prionailurus bengalensis (hình

3.27).

Hình 3.27 . Trình tự D-Loop từ các mẫu phân dương tính sán lá phổi tương đồng

cao với trình tự của mèo rừng Prionailurus bengalensis.

Trong số 7 loài SLP được phát hiện ở Việt Nam, chỉ có sán trưởng thành của

loài P. heterotremus thu được từ vật chủ chính trong tự nhiên là chó nhà, cầy móc

cua và người, các loài SLP khác thu được từ vật chủ gây nhiễm thực nghiệm [22].

72

Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật phân tử để định loài SLP và vật chủ của chúng

ngoài tự nhiên qua mẫu phân động vật hoang. Kết quả đã phát hiện ba loài SLP

(P. westermani, P. heterotremus và P. skrjabini) ở mẫu phân động vật hoang thu tại

huyện Da Krong, tỉnh Quảng Trị. Mèo rừng được xác định là vật chủ của cả 3 loài

SLP này.

Cùng với trứng SLP, trứng của loài sán lá Pharyngostomum cordatum cũng

được phát hiện ở một số mẫu phân. Đây là loài sán lá ký sinh phổ biến ở ruột mèo

rừng và mèo nhà [116]. Sự hiện diện đồng thời trứng của loài sán này với loài SLP

cung cấp thêm b ng chứng khẳng định mèo rừng là vật chủ ngoài tự nhiên của 3

loài SLP trong khu vực nghiên cứu.

Ở khu bảo tồn thiên nhiên Da Krong, các nghiên cứu trước đây ghi nhận 24

loài thú ăn thịt. Tuy nhiền, một điều tra gần đây chỉ quan sát thấy 2 loài, đó là m o

rừng (P. bengalensis) và cầy lỏn (Herpestes javanicus) trong thời gian nghiên cứu

100 ngày tại khu vực này [117]. Mèo rừng P. bengalensis ơi tốt, chủ yếu ăn cá và

động vật thủy sinh, bao gồm cua suối, nên dễ bị nhiễm SLP. Thức ăn của cầy lỏn

chủ yếu là côn trùng, tuy nhiên nếu thức ăn khan hiếm chúng cũng có thể ăn cua,

ếch nhái… Vì vậy, cầy lỏn cũng được cho là vật chủ tiềm năng của sán lá phổi [1].

Nghiên cứu của chúng tôi chưa tìm thấy cầy lỏn bị nhiễm SLP. Có thể cầy lỏn tồn

tại ở khu vực này, nhưng với số lượng cá thể ít, nên chưa thu được mẫu phân của

chúng, hoặc có thể trong số 120 mẫu phân động vật hoang có mẫu phân của cầy

lỏn, nhưng không ị nhiễm SLP. Từ kết quả nghiên cứu này thấy r ng cần có điều

tra nghiên cứu rộng hơn để xác định các loài vật chủ khác tham gia vào duy trì

vòng đời phát triển của loài P. westermani ở khu vực này.

3.3.3. Sự phát triển của sán lá phổi ở vật chủ chứa và vật chủ chính

3.3.3.1. Sự phát triển của loài Paragonimus westermani ở vật chủ chứa và vật chủ chính

Kết quả gây nhiễm cho chuột nhắt trắng BALB/c

Kết quả thí nghiệm cho thấy: ở tất cả chuột nhắt trắng gây nhiễm đều thu

được sán non ở cơ và gan. Tỷ lệ phát triển từ 25-75% (trung ình 50,5%), trong đó

sán thu được ở cơ chiếm tỷ lệ 65,3% và ở gan là 34,7% (bảng 3.12).

73

ả g 3.12. Kết quả gây nhiễm metacercaria P. westermani cho chuột nhắt trắng

STT Số nang

sán cho

ăn

Mổ

khám

sau gây

nhiễm

(ngày)

Số cá thể sán thu được ở Tỷ lệ

phát

triển

(%)

Cơ Gan Phổi Tổng số

Chuột 1 20 30 10 2 0 12 60,0

Chuột 2 20 30 8 7 0 15 75,0

Chuột 3 20 30 4 6 0 10 50,0

Chuột 4 20 30 5 0 0 5 25,0

Chuột 5 20 30 8 2 0 10 50,0

Chuột 6 20 60 5 3 0 8 40,0

Chuột 7 20 60 8 5 0 13 65,0

Chuột 8 20 60 5 0 0 5 25,0

Chuột 9 20 60 6 4 0 10 50,0

Chuột 10 20 60 7 6 0 13 65,0

Tổng/trung ình 66

(65,3%)

35

(34,7%)

0 101 50,5

Sán non ở cơ và gan chỉ hơi lớn hơn về kích thước so với metacercaria khi

mới thoát khỏi nang ( ảng 3.13, hình 3.28).

ả g 3.13. Kích thước metacercaria mới thoát nang và sán non thu từ chuột

Kích thước (mm) Metacercaria thoát nang

(n=25)

Sán non thu từ cơ chuột

(n=25)

Cơ thể 0,650-0,990 x 0,300-0,380

(0,807 x 0,327)

0,750-1,050 x 0,350-0,400

(0,915 x 0,378)

Giác miệng 0,070-0,110 x 0,060-0,100

(0,092 x 0,082)

0,090-0,100 x 0,080-0,090

(0,095 x 0,085)

Giác ụng 0,100-0,110 x 0,100-0,110

(0,105 x 0,105)

0,100-0,110 x 0,100-0,110

(0,105 x 0,105)

74

Kết quả gây nhiễm cho động vật u i ch m o

Kết quả gây nhiễm cho 4 chó và 8 m o nhà ( ảng 3.14) cho thấy sán không

phát triển ở chó cả khi gây nhiễm trực tiếp hoặc gây nhiễm chuyển tiếp qua chuột.

Ngược lại, tất cả m o đều ị nhiễm. Tỷ lệ phát triển của sán khi gây nhiễm trực tiếp

ng metacercaria là 13,3-54,3% và khi gây nhiễm ng sán non thu từ chuột là

43,3-48,9%. Các cá thể sán thường sống từng đôi tạo thành ổ apxe ở phổi, một số

cá thể sán thu được ở xoang phổi sau gây nhiễm trên 150 ngày. Đa số sán chưa

trưởng thành, tỷ lệ sán trưởng thành thấp. Thời gian thải trứng từ 140-145 ngày sau

gây nhiễm (bảng 3.14).

Bảng 3.14. Kết quả gây nhiễm P. westermani cho động vật nuôi thí nghiệm

Động

vật thí

nghiệm

Mầm ệnh

gây nhiễm

Thải trứng

sau GN

(ngày)

Mổ khám

sau GN

(ngày)

Số sán thu được ở Tỷ lệ

phát triển

(%)

Phổi Xoang

màng

phổi

Chó 1 50 mc - 150 0 0 0

Chó 2 50 mc - 200 0 0 0

Chó 3 50 mc - 200 0 0 0

Chó 4 50 mc - 200 0 0 0

M o 1 50 mc - 40 17 0 34,0

M o 2 50 mc - 45 18 0 36,0

M o 3 50 mc - 90 8 0 16,0

M o 4 30 mc - 120 4 0 13,3

M o 5 50 mc - 150 2 20 44,0

M o 6 30 mc 145 170 12 (2*) 7 54,3

M o 7 47 sán non 140 180 18 (5*) 5 48,9

M o 8 30 sán non - 100 13 0 43,3

* Số cá thể sán trưởng thành; mc: metacercaria; GN: gây nhiễm

Nghiên cứu hình thái của sán cho thấy: cơ thể sán giống hạt lạc, có màu nâu

đỏ, toàn ộ cơ thể sán phủ gai đơn, một số cá thể có gai xếp thành từng đôi ở vùng

75

giữa cơ thể. Giác miệng và giác ụng gần ng nhau. Buồng trứng chia thành 6

thùy n m ở vùng giác ụng. Hai tinh hoàn chia thành 4-5 thùy, n m sau uồng

trứng. Túi nhận tinh chứa đầy tinh trùng, cho thấy P. westermani ở Việt Nam thuộc

dạng 2n, phù hợp với kết quả phân tích phân tử. Kích thước của sán thu từ phổi và

xoang phổi của m o thí nghiệm sau 170-180 ngày dao động lớn ( ảng 3.15). Sán

trưởng thành (hình 3.28) có tuyến noãn hoàng phát triển phủ đầy 2 ên cơ thể, kích

thước cơ thể 7,2-11,8 x 3,9-5,0 mm, tỷ lệ chiều dài/rộng từ 1,7-2,4; lớn hơn so với

các cá thể sán chưa trưởng thành có kích thước 3,8-6,6 x 2,1-3,5 mm, tỷ lệ chiều

dài/rộng là 1,4-2,0 (hình 3.28).

Hình 3.28 . Sự phát triển của sán lá phổi P. westermani ở động vật thí nghiệm

a. Metacercaria mới thoát khỏi nang sán; b. Sán non thu từ cơ chuột sau gây nhiễm

30 ngày; c. Sán trưởng thành thu từ phổi m o nhà sau gây nhiễm 180 ngày; d. Sán

chưa trưởng thành thu từ phổi m o nhà sau gây nhiễm 180 ngày.

76

Bảng 3.15. Kích thước sán thu từ phổi m o sau 170-180 ngày gây nhiễm

Kích thước (mm) Sán chưa trưởng thành (n=15) Sán trưởng thành (n=7)

Cơ thể 3,8-6,6 x 2,1-3,5 7,2-11,8 x 3,9-5,0

Tỷ lệ dài/rộng 1,4 - 2,0 1,7 - 2,4

Giác miệng 0,350-0,650 x 0,425-0,725 0,425-0,625 x 0,700-0,925

Giác ụng 0,500-0,625 x 0,525-0,700 0,525-0,625 x 0,575-0,770

Tinh hoàn trái 0,275-0,675 x 0,250-0,725 0,525-1,000 x 0,700-1,175

Tinh hoàn phải 0,300-0,750 x 0,275-0,900 0,575-1,000 x 0,650-1,250

Buồng trứng 0,400-0,925 x 0,525-1,000 0,900-1,250 x 0,750-1,250

Ở m o thí nghiệm mổ khám sau 120 ngày gây nhiễm, sán có kích thước dao

động rất lớn. Trong số 4 cá thể sán thu được, một cá thể có kích thước rất nhỏ (0,6

x 0,3 mm), như metacercaria mới thoát nang hoặc sán non thu ở chuột sau gây

nhiễm 30 ngày. Các cá thể khác lớn hơn, kích thước 3,0-5,5 x 1,5-2,7 mm. Tinh

hoàn và uồng trứng còn nhỏ. Tuyến noãn hoàng chưa phát triển (hình 3.29).

Hình 3.29. Paragonimus westermani thu ở m o thí nghiệm sau gây nhiễm 120 ngày

77

Triệu chứ g âm sà g và bệ h t ch ở độ g vật th ghiệm

Động vật thí nghiệm ăn uống ình thường, biểu hiện kém hoạt động, hay

n m và ho khạc từng cơn. Khi mổ khám thấy một số ổ apxe nhỏ khoảng 1 cm (hình

3.30), mổ ra thường có 2 cá thể sán, đôi khi 3, tổ chức phổi ị viêm có dịch viêm

nhày, màu nâu đỏ. Phần phổi còn lại có ề ngoài ình thường, nhưng khi dùng tay

nắn nhẹ thấy một số u cứng nhỏ ở phía sâu trong tổ chức phổi, mổ khám thu được

các cá thể sán còn non.

h . Bệnh tích phổi m o nhiễm sán lá phổi P. westermani (mũi tên chỉ ổ

apxe, ên trong thường chứa 2 cá thể sán, tổ chức phổi ị viêm)

Như đã trình ày ở phần Tổng quan tài liệu, loài P. westermani rất đa dạng

về hình thái, sinh học và khả năng gây ệnh. Loài này tồn tại ở 2 dạng diploid (2n)

và triploid (3n). Dạng diploid phân bố rộng rãi ở châu Á; trong khi dạng triploid chỉ

tìm thấy ở các nước Đông Bắc Á (Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc và Đài Loan).

Bệnh lý ở vật chủ do 2 dạng này gây ra cũng khác nhau: dạng triploid chủ yếu hình

thành ổ apxe ở phổi, nhưng dạng diploid chủ yếu gây bệnh lý ở màng phổi [1, 2].

Khả năng phát triển và gây bệnh ở vật chủ chính của các quần thể địa lý

cũng khác nhau. Habe, 1978 [118] thông báo chó nhà là vật chủ không thích hợp,

trong khi mèo là vật chủ thích hợp của P. westermani ở Malaysia, nhưng cần thời

gian dài hơn 4 tháng để phát triển đến trưởng thành. Ngược lại, chó và mèo là vật

chủ thích hợp của loài này ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc với thời gian

phát triển 2,5 tháng [118, 119].

78

Ở chuột, quần thể P. westermani ở Philippines phát triển nhanh chóng đến

trưởng thành, trong khi chuột là vật chủ chứa của P. westermani ở Nhật Bản, Trung

Quốc và Malaysia [40, 119, 120].

Nghiên cứu này cho thấy quần thể P. westermani ở Việt Nam không phát

triển ở chó nhà thí nghiệm, nhưng phát triển được ở m o nhà với tỷ lệ phát triển

thấp và thời gian trưởng thành tương đối dài. Những đặc điểm này tương tự với

quần thể P. westermani ở Malaysia [118]. Như vậy, chó nhà không phải là vật chủ

thích hợp của P. westermani ở Việt Nam, m o nhà có thể ị nhiễm nhưng mức độ

mẫn cảm với loài P. westermani thấp hơn so với loài P. heterotremus [13]. Điều

này gợi ý r ng động vật hoang đóng vai trò là vật chủ quan trọng hơn so với động

vật nuôi. Vì vậy, trong công tác cứu hộ động vật tại Vườn Quốc gia Bắc Hướng

Hóa và Da Krong cần chú ý đến ệnh SLP do nhiễm P. westermani vì tỷ lệ nhiễm

metacercaria ở cua suối khu vực này là rất cao [19, 22].

Khi gây nhiễm chuyển tiếp sán non thu từ chuột cho m o thì chúng cũng

phát triển đến sán trưởng thành. Điều này khẳng định vai trò của vật chủ chứa trong

vòng đời phát triển của P. westermani ở Việt Nam, từ đó cảnh báo r ng các loài thú

lớn (như hổ, áo… ) và người không ăn cua suối vẫn có thể ị nhiễm ệnh do ăn

phải vật chủ chứa nhiễm sán non.

Về khả năng gây ệnh cho con người ở Việt Nam, mặc dù các tài liệu trước

đây công ố duy nhất chỉ có loài P. westermani và được cho là nguyên nhân gây

ệnh SLP ở người, nhưng không có ng chứng cụ thể như mẫu vật hoặc kết quả

định loại b ng phân tử [83, 121]. Cho đến năm 1995 thì loài P. heterotremus được

tìm thấy phổ biến ở các tỉnh miền Bắc và được khẳng định là tác nhân gây bệnh ở

người và động vật b ng định loại hình thái và phân tử [12, 84, 85].

Gần đây, metacercaria của loài P. westermani được phát hiện ở một số tỉnh

miền Trung, đặc biệt là ở tỉnh Quảng Trị với tỷ lệ nhiễm ở cua núi rất cao (96%)

[19, 22]. Tuy nhiên, chưa có thông áo nào về ca ệnh SLP ở khu vực này [20, 22].

Vì vậy, khả năng gây ệnh cho người của P. westermani ở Việt Nam vẫn chưa

được khẳng định chắc chắn. Kết quả định loại hình thái và phân tử trong nghiên

cứu này xác định loài P. westermani ở Việt Nam thuộc dạng 2n, dạng này có khả

năng gây ệnh ở người yếu hơn dạng 3n và thường không tạo thành ổ apxe ở phổi.

79

Tuy nhiên, chúng vẫn có thể gây ệnh ở thể ngoài phổi (cơ, xoang màng phổi,

não…). Vì vậy, người dân không nên ăn sống cua suối hoặc thịt các động vật khác

để tránh nhiễm SLP P. westermani.

3.3.3.2. Gây nhiễm chuyển tiếp sán non Paragonimus heterotremus từ vật chủ chứa

cho vật chủ chính.

Sự phát triển của loài P. heterotremus ở vật chủ chính đã được nghiên cứu

[13]. Vai trò của chuột nhắt trắng là vật chủ chứa trong vòng đời phát triển của

P. heterotremus cũng đã được xác định trong nghiên cứu thí nghiệm [24]. Các tác

giả cho thấy ở vật chủ chứa, sán non ở gan tương đối lớn, nhưng sán ở cơ thì kích

thước nhỏ giống như metacercaria mới thoát khỏi nang. Các tác giả gây nhiễm

chuyển tiếp cho mèo b ng cách cho m o ăn chuột, nên không biết những sán non

có kích thước lớn ở gan có phát triển được ở mèo không.

Nghiên cứu này gây nhiễm cho chuột nhắt trắng dòng BALB/c cũng cho thấy

sán ở cơ chưa phát triển gì thêm so với metacercaria mới thoát khỏi nang, kích

thước 650-940 x 300-480 µm; sán non ở gan có kích thước 2,2-4,5 x 1,2-2,4 mm,

lớn hơn so với sán ở cơ (P < 0,001), đã hình thành cơ quan sinh dục (hình 3.31).

Tách riêng sán non thu ở cơ và sán non thu ở gan chuột để gây nhiễm cho 2

cá thể mèo. Kết quả cho thấy m o ăn sán non thu từ gan chuột không bị nhiễm sán

lá phổi, ngược lại m o ăn sán non thu từ cơ chuột bị nhiễm sán lá phổi, tỷ lệ phát

triển đến trưởng thành là 45%. Sự phát triển của sán lá phổi P. heterotremus ở vật

chủ chứa và vật chủ chính được minh họa ở hình 3.32.

Hình 3.31. Khác nhau về kích thước sán non thu ở cơ (a) và gan ( ) của chuột sau

gây nhiễm 1 tháng

80

Hình 3.32. Sự phát triển của P. heterotremus ở động vật thí nghiệm

a. Metacercaria mới thoát khỏi nang; b. Sán non thu ở cơ chuột bạch sau 1

tháng gây nhiễm; c. Sán non thu ở gan chuột bạch sau 1 tháng gây nhiễm;

d. Sán trưởng thành thu ở phổi mèo thí nghiệm.

Vai trò của chuột là vật chủ chứa trong vòng đời phát triển của sán lá phổi

P. heterotremus đã được xác định ở Thái Lan và Trung Quốc [1]. Tuy nhiên, các

nghiên cứu chưa cho thấy sự khác biệt về kích thước sán non ở cơ và gan chuột, và

chưa gây nhiễm riêng các nhóm sán non này cho vật chủ chính. Nghiên cứu này

xác định sán non ở cơ chuột phát triển tiếp đến trưởng thành ở vật chủ chính, còn

sán ở gan thì không phát triển tiếp đến trưởng thành. Có thể do kích thước sán non

ở gan quá lớn không chui qua được thành ruột của vật chủ và bị vật chủ tiêu hóa.

Triệu chứng, bệnh tích do P. heterotremus gây ra ở động vật thí nghiệm

Mèo và chuột thí nghiệm đều thấy biểu hiện kém ăn, niêm mạc miệng, mắt

nhợt nhạt, lông xơ xác. Con vật không muốn hoạt động, hay n m. Biểu hiện khó

thở và ho khạc từng cơn.

Mổ khám m o thí nghiệm thấy phổi có những ổ áp xe trông như các khối u,

đường kính 2-3cm, mỗi ổ thường có 2 sán (hình 3.33). Xung quanh các u sán thấy

xuất huyết và viêm. Do sán tạo nang ở tổ chức ngay dưới ề mặt phổi nên màng

phổi ị viêm, hoại tử, nhiều vùng phổi dính chặt vào thành lồng ngực.

81

Hình 3.33. Bệnh tích đại thể phổi m o nhiễm sán lá phổi P. heterotremus

Như vậy, so sánh bệnh tích của sán lá phổi P. westermani và P. heterotremus

gây ra ở động vật thí nghiệm cho thấy loài P. heterotremus gây tổn thương nặng

hơn so với loài P. westermani. Điều này gợi ý r ng mèo nhà là vật chủ thích hợp

của loài P. heterotremus hơn so với loài P. westermani.

3.3.4. Sức sống của metacercaria sán lá phổi ở các điều kiện khác nhau

Metacercaria của loài P. heterotremus và P. westermani rất phổ biến ở cua

suối tại một số tỉnh miền núi phía Bắc và miền Trung. Việc đi đến các địa điểm này

để thu mẫu rất khó khăn, không phải lúc nào cũng thực hiện được, đặc biệt vào mùa

mưa lũ hoặc mùa đông. Vì vậy, nghiên cứu sức sống của metacercaria ở các điều

kiện khác nhau cung cấp cơ sở cho việc bảo quản metacercaria phục vụ cho công

tác nghiên cứu và giảng dạy là cần thiết.

Thử nghiệm an đầu cho thấy bảo quản metacercaria b ng nước cất thì

metacercaria nhanh thoát ra khỏi nang sán so với bảo quản b ng nước muối sinh lý.

Vì vậy chúng tôi tiến hành theo dõi bảo quản metacercaria trong nước muối sinh lý

ở điều kiện nhiệt độ khác nhau (nhiệt độ phòng 25°C-30

°C và ở tủ lạnh 4

°C) với

mật độ metacercaria khác nhau (5, 50, 100 và 200 metacercaria/2 ml).

Kết quả nghiên cứu cho thấy bảo quản ở nhiệt độ phòng 25°C-30

°C thì

metacercaria sống được tối đa 16-17 ngày, bắt đầu từ ngày thứ 2 đã có metacercaria

thoát khỏi nang và chết, số lượng metacercaria thoát khỏi nang và chết nhiều nhất

vào ngày thứ 7-8 (bảng 3.16, hình 3.34). Không có sự khác biệt về sức sống

metacercaria của 2 loài (P > 0,05).

82

Bảng 3.16. Sức sống của metacercaria ở điều kiện nhiệt độ phòng (25-30°C) trong

nước muối sinh lý

Ngày

thứ

P. westermani P. heterotremus

Số mc sống Tỷ lệ (%) mc sống Số mc sống Tỷ lệ (%) mc sống

1 50 100,0 50 100,0

2 46,0 92,0 49,0 98,0

3 42,7 85,3 46,0 92,0

4 38,3 76,7 42,0 84,0

5 33,3 66,7 37,3 74,7

6 27,3 54,7 32,0 64,0

7 10,7 21,3 27,0 54,0

8 8,0 16,0 11,0 22,0

9 6,0 12,0 9,0 18,0

10 5,3 10,7 7,7 15,3

11 4,7 9,3 6,0 12,0

12 3,7 7,3 5,0 10,0

13 2,3 4,7 3,7 7,3

14 1,3 2,7 2,7 5,3

15 0,3 0,7 1,7 3,3

16 0,0 0,0 1,0 2,0

17 0,0 0,0 0,0 0,0

Hình 3.34. Sức sống của metacercaria ở điều kiện nhiệt độ phòng (25-30°C)

83

Bảo quản ở tủ lạnh 4°C với mật độ metacercaria khác nhau (5, 50, 100 và

200 metacercaria/2 ml) cho thấy metacercaria có thể sống tới 12 tháng phụ thuộc

vào mật độ metacercaria. Ở các mật độ khác nhau, sức sống của metacercaria khác

nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Ở mật độ metacercaria thấp (5

metacercaria/2ml) thời gian sống kéo dài hơn so với các mật độ cao hơn. Với mật

độ 200 metacercaria/2 ml tỷ lệ metacercaria thoát nang và chết nhiều sau 2 tháng và

chỉ sống tới 7-8 tháng. Ở mật độ 50 và 100 metacercaria/2 ml thì metacercaria có

thể sống tới 10-11 tháng, tỷ lệ thoát nang và chết nhiều vào tháng thứ 6-7. Không

có sự khác biệt về sức sống của metacercaria của 2 loài P. westermani và

P. heterotremus (P>0.05) (bảng 3.17, hình 3.35 và 3.36).

Bảng 3.17. Sức sống của metacercaria của P. westermani và P. heterotremus trong

dung dịch nước muối sinh lý tại 4°C ở các mật độ khác nhau

Tháng

thứ

P. westermani MC còn sống (%)

theo thời gian ở các mật độ

(metacercaria/2 ml)

P. heterotremus MC còn sống (%)

theo thời gian ở các mật độ

(metacercaria/2 ml)

5 50 100 200 5 50 100 200

1 100,0a 100,0

a 97,3

b 94

c 100

a 100

a 98,3

b 94,9

c

2 100,0a 98,6

a 91,7

b 24,4

c 100

a 99,4

a 94,3

b 24,2

c

3 100,0a 94,0

b 89,0

c 14,4

d 100

a 96,6

b 90,0

c 15,2

d

4 100,0a 89,4

b 82,0

c 6,7

d 100

a 95,4

b 83,7

c 7,0

d

5 100,0a 80,6

b 67,7

c 1,5

d 100

a 92,0

b 69,7

c 2,4

d

6 94,0a 72,0

b 12,0

c 1,2

d 94,0

a 81,4

b 14,0

c 1,5

d

7 80,0a 17,4

b 10,7

b 0,0

d 80,0

a 29,4

b 9,7

c 0,4

d

8 66,7a 12,0

b 5,3

b 0,0

c 66,0

a 20,0

b 1,7

c 0,0

d

9 60,0a 6,0

b 1,7

c 0,0 60,0

a 16,6

b 1,0

c 0,0

10 33,3a 2,0

b 0,0

b 0,0 46,0

a 9,4

b 0,0

c 0,0

11 13,3a 0,0

b 0,0 0,0 26,0

a 0,0

b 0,0 0,0

12 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Ghi chú: trong cùng một hàng, chữ cái giống nhau thể hiện sự khác nhau không có

ý nghĩa thống kê (P>0,05), các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa

thống kê (P<0,05).

84

Hình 3.35. Sức sống của P. westermani metacercaria theo thời gian bảo quản ở 4°C

ở các mật độ khác nhau

Hình 3.36. Sức sống của P. heterotremus metacercaria theo thời gian bảo quản ở

4°C ở các mật độ khác nhau

85

Nghiên cứu trước đây thông áo metacercaria của P. westermani có thể sống

ở 4°C tới 234 - 560 ngày [122]. Tuy nhiên, các tác giả chưa cho iết tỷ lệ sống của

metacercaria theo thời gian và mật độ metacercaria. Nghiên cứu này cho thấy r ng

ngoài phụ thuộc vào môi trường nước cất hay nước muối sinh lý, nhiệt độ, thì sức

sống của metacercaria còn phụ thuộc vào mật độ metacercaria. Mật độ càng cao thì

sức sống càng giảm, metacercraria nhanh thoát khỏi nang và chết. Giải thích vấn đề

này có lẽ do sự thoát nang của metacercaria phụ thuộc vào men Cysteine protease ở

sản phẩm tiết [123], hoạt động của enzym phụ thuộc vào nhiệt độ, nhiệt độ càng

cao thì metacercaria hoạt động càng mạnh và enzym hoạt động mạnh làm phá vỡ

nang. Ngoài ra, sự thoát nang cũng phụ thuộc vào mật độ metacercaria, mật độ

càng cao metacercaria càng nhanh thoát khỏi nang (hình 3.37).

Nghiên cứu này cũng cho thấy sức sống của metacercaria của 2 loài

P. heterotremus và P. westermani tương tự nhau (P>0,05) vì metacercaria của 2

loài này đều có lớp vỏ dày. Từ kết quả này khuyên r ng khi bảo quản metacercaria

nên bảo quản trong nước muối sinh lý, ở nhiệt độ 4°C với mật độ càng thấp thì sức

sống của metacercaria càng lâu hơn.

Hình 3.37. Metacercariae thoát khỏi nang ở nhiệt độ 4°C sau 2 tháng ở mật độ 200

metacercaria/2 ml

3.4. Thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh sán lá phổi

3.4.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng

Kết quả nghiên cứu cho thấy phản ứng hoạt động rất tốt. Các ô nhỏ huyết

thanh đối chứng đều hiện màu rất rõ. Các mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm

86

P. heterotremus đều hiện màu đậm ở ô nhỏ kháng nguyên P. heterotremus và

P. westermani, nhưng ô nhỏ kháng nguyên P. westermani hơi nhạt hơn so với ô

nhỏ kháng nguyên P. heterotremus.

Các mẫu huyết thanh người bình thường, huyết thanh bệnh nhân nhiễm sán lá

gan lớn, sán lá gan nhỏ, lao phổi đều cho kết quả âm tính, trừ 1 mẫu huyết thanh

bệnh nhân sán lá gan lớn dương tính, tuy nhiên màu nhạt hơn so với huyết thanh

bệnh nhân nhiễm SLP P. heterotremus (hình 3.38).

Hình 3.38. Kết quả phản ứng dot-ELISA với huyết thanh

Hai loài P. heterotremus và P. westermani cùng giống, nên thành phần kháng

nguyên tương đối giống nhau, vì vậy huyết thanh bệnh nhân thể hiện dương tính

với kháng nguyên của cả 2 loài, tuy nhiên với độ đậm khác nhau. Kết quả này

tương tự với công bố trước đây về huyết thanh bệnh nhân nhiễm loài P. westermani

ở Nhật Bản thể hiện dương tính với kháng nguyên của P. westermani và P. miyzaki

[30].

Kết quả tính toán cho thấy độ nhạy của phản ứng là 100%, độ đặc hiệu của

phản ứng là 96,7%, giá trị tiên đoán dương tính 96,7%, giá trị tiên đoán âm tính là

100% (bảng 3.18). Kết quả nghiên cứu này cũng tương tự công bố của Maleewong

et al. (1997) [124] có độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng là 100 và 97%. Các tác giả

cũng phát hiện phản ứng chéo với huyết thanh bệnh nhân sán lá gan lớn, nhưng

không chéo với huyết thanh bệnh nhân lao phổi hoặc nhiễm sán lá gan nhỏ.

87

Bảng 3.18. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng dot-ELISA

Kết quả

dot-ELISA

Huyết thanh

Số mẫu

kiểm tra

Kết quả xét nghiệm dot-ELISA

Số mẫu

dương tính

Số mẫu

âm tính

Tổng

số

Nhiễm sán lá phổi 30 30 0 30

Không nhiễm sán lá phổi 30 1 29 30

Tổng số 31 29

Độ nhạy (%) 30/(30 + 0) x 100 = 100

Độ đặc hiệu (%) 29/(29+ 1) x 100 = 96,7

Giá trị tiên đoán dương tính (%) 30/ (30 + 1) x 100 = 96,7

Giá trị tiên đoán âm tính (%) 29/(29 + 0) x 100 = 100

3.4.2. Xác định nồng độ kháng nguyên và thời gian phản ứng ở 37°C

Ở nồng độ kháng nguyên 0.25 mg/ml, các mẫu đều có màu nhạt, khó phát

hiện. Ở nồng độ kháng nguyên 1 mg/ml và 0.5 mg/ml các màu đều hiện màu. Nồng

độ 0.5 mg/ml có màu hơi nhạt hơn nồng độ 1 mg/ml, nhưng có thể quan sát rõ

(hình 3.39).

88

Hình 3.39. Phản ứng dot-ELISA với các nồng độ kháng nguyên và thời gian ủ khác

nhau ở điều kiện 37°C

Hình 3.39 cũng cho thấy độ đậm của các ô tỷ lệ thuận với thời gian ủ với

huyết thanh và kháng thể 2. Thời gian ủ 10 phút thì màu hiện không rõ; ủ 20 và 30

phút màu hiện rõ hơn. Mặc dù ủ ở 30 phút màu đậm hơn ủ 20 phút, tuy nhiên cả 2

thời gian ủ này đều dễ dàng xác định phản ứng dương tính. Như vậy, phản ứng có

thể hoạt động ở nồng độ kháng nguyên 0,5 mg/ml, thời gian ủ 20-30 phút ở điều

kiện 37°C. Thử nghiệm các mẫu huyết thanh kiểm tra với nồng độ kháng nguyên

0,5 mg/ml cho kết quả tương tự khi sử dụng nồng độ kháng nguyên 1 mg/ml. Kết

quả tính độ nhạy và độ đặc hiệu tương tự.

Sau khi xác định nồng độ kháng nguyên và thời gian ủ với huyết thanh thích

hợp ở điều kiện 37°C, chúng tôi xác định thời gian hiện màu. Kết quả cho thấy ở tất

cả các thời gian hiện màu từ 1-15 phút đều thấy màu, tuy nhiên màu hiện rõ hơn ở

các thời gian từ 5 phút trở lên (hình 3.40).

Hình 3.40. Thời gian hiện màu của phản ứng dot-ELISA ở 37°C

3.4.3. Xác định thời gian phản ứng ở điều kiện nhiệt độ 20°C

Kết quả thí nghiệm cho thấy ở 20°C với thời gian ủ với huyết thanh và kháng thể

2 ở 10 phút rất mờ, ở 20 và 30 phút rõ hơn, rõ nhất là thời gian ủ 60 phút (hình 3.41)

89

Hình 3.41. Phản ứng dot-ELISA ủ với huyết thanh ở thời gian khác nhau ở 20°C.

Sau khi ủ với huyết thanh là 60 phút, xác định thời gian hiện màu cho thấy

phản ứng đều hiện màu sau thời gian ủ với chất hiện màu 5, 10 và 15 phút. Tuy

nhiên có thể đọc kết quả rõ hơn sau 10-15 phút (hình 3.42).

Hình 3.42. Thời gian hiện màu của phản ứng ở 20°C.

3.4.4. Xác định thời gian phản ứng ở điều kiện nhiệt độ 10°C

Kết quả thí nghiệm ở 10°C với thời gian ủ với huyết thanh và kháng thể 2 ở

30 và 60 phút rất mờ, ở 90 phút rõ nhất (hình 3.43)

90

Hình 3.43. Phản ứng dot-ELISA với huyết thanh ở các thời gian khác nhau ở 10°C.

Sau khi ủ với huyết thanh 90 phút, kết quả xác định thời gian hiện màu cho

thấy phản ứng hiện màu rõ sau 10 và 15 phút (hình 3.44).


3.4.5. Xác định thời gian phản ứng ở điều kiện nhiệt độ 4oC

Kết quả thí nghiệm cho thấy ở 4°C với thời gian ủ với huyết thanh và kháng

thể 2 ở 60 và 90 phút tương đối mờ, màu hiện rõ nhất khi ủ 120 phút (hình 3.45)

91

Hình 3.45. Phản ứng dot-ELISA ủ với huyết thanh ở các thời gian khác nhau ở 4°C.

Sau khi ủ với huyết 120 phút, kết quả xác định thời gian hiện màu cho thấy

phản ứng hiện màu rõ sau 10 và 15 phút (hình 3.46).


Với những ưu điểm của kỹ thuật dot-ELISA, như dễ thực hiện, không cần

máy đọc quang phổ, thời gian phản ứng nhanh, giá thành thấp, kỹ thuật này đã

được sử dụng để chẩn đoán nhiều bệnh, trong đó có nhiều bệnh ký sinh trùng [125-

129]. Với bệnh SLP, dot-ELISA được sử dụng chủ yếu ở Nhật Bản, Thái Lan,

Trung Quốc [30, 65, 124, 130]. Các tác giả thực hiện phản ứng ở điều kiện 37°C

trong 1h [65] hoặc điều kiện phòng thí nghiệm trong 2h [124], nhưng không ghi rõ

nhiệt độ phòng thí nghiệm.

92

Ở Việt Nam, kỹ thuật dot-ELISA còn ít được sử dụng. Bùi Khánh Linh và cs.

(2005) [131] thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhiễm sán lá gan lớn ở động

vật thí nghiệm. Tác giả thực hiện theo quy trình ủ huyết thanh ở 37°C trong 30 phút

và hiện màu trong 5 phút. Đối với sán lá phổi, kỹ thuật dot-ELISA cũng đã được

ứng dụng để chẩn đoán ệnh ở người [20]. Tuy nhiên, các tác giả mới chỉ áp dụng

theo quy trình đã được công bố [30]. Điều đáng chú ý là, bệnh SLP chủ yếu xuất

hiện ở các vùng miền núi, những nơi còn nhiều điều kiện khó khăn, các cơ sở y tế

chưa có tủ ấm. Điều kiện này gây khó khăn cho thực hiện phản ứng dot-ELISA ở

thực địa, đặc biệt trong điều kiện mùa đông, khi nhiệt độ xuống thấp có thể đến 4-

5°C. Trong kỹ thuật ELISA thông thường trên đĩa nhựa, ước ủ với mẫu huyết

thanh có thể thực hiện ở 4°C, nhưng với thời gian ủ qua đêm [132]. Trên cơ sở đó,

chúng tôi đã thử nghiệm phản ứng dot-ELISA ở những điều kiện nhiệt độ khác

nhau tương ứng với nhiệt độ các mùa trong năm ở miền núi phía Bắc với thời gian

ủ khác nhau để xác định thời gian thực hiện phản ứng phù hợp với các điều kiện

nhiệt độ khác nhau.

Kết quả nghiên cứu đã xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng tương

ứng là 100% và 96,7%, có thể sử dụng nồng độ kháng nguyên 0,5 mg/ml, giảm ½

so với các công bố trước đây. Thời gian ủ với huyết thanh, kháng thể 2 và thời gian

ủ với chất hiện màu phụ thuộc vào nhiệt độ: nhiệt độ càng thấp thì thời gian phản

ứng cần lâu hơn. Thời gian phản ứng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau tóm tắt ở

bảng 3.19.

Bảng 3.19. Thời gian phản ứng ELISA ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau

Nhiệt độ Thời gian (phút) ủ với

Huyết thanh Conjugate Rửa Hiện màu Tổng (giờ)

37°C 20 20 6 5 51 (0h51’)

20°C 60 60 6 5 131 (2h11’)

10°C 90 90 6 10 206 (3h26’)

4°C 120 120 6 15 261 (4h21’)

93

Các khoảng thời gian 37°C, 20

°C, 10

°C và 4

°C tương ứng với nhiệt độ các

mùa hè, xuân-thu và mùa đông ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam. Dựa vào điều kiện

nhiệt độ thực tế để lựa chọn thời gian ủ với huyết thanh và thời gian hiện màu phù

hợp ở bảng 3.19 để có kết quả tốt nhất.

Tổng thời gian của phản ứng chỉ cần từ 51 phút đến 4h21 phút. Phản ứng

dot-ELISA có thể thực hiện ở 4°C với thời gian ủ với huyết thanh chỉ trong 2h,

không cần phải ủ qua đêm. Thời gian bảo quản mẫu giấy đã nhỏ kháng nguyên ở

4°C có thể được 6 tháng [124]. Vì vậy, kỹ thuật này có thể thực hiện vào những

ngày đông lạnh ở miền núi thậm chí khi nhiệt độ xuống tới 4°C, người dân có thể

chờ lấy kết quả trong ngày để được phát thuốc điều trị, khắc phục được các hạn chế

của ELISA thông thường, các ác sĩ phải lấy máu bệnh nhân đưa về Hà Nội hoặc

các bệnh viện lớn để chẩn đoán sau đó gửi kết quả lên cơ sở y tế, từ đó cán ộ y tế

mới xuống bản phát thuốc cho bệnh nhân.

94

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Phƣơng pháp xét nghiệm cua và tình hình nhiễm metacercaria của sán lá

phổi ở cua suối

- Với phương pháp giã-lọc cua, thời gian để lắng giữa các lần lọc 3 phút là

thích hợp để thu metacercaria của sán lá phổi.

- Xét nghiệm b ng phương pháp giã lọc-cua dễ thu metacercaria và chính xác

hơn so với phương pháp ép cua.

- Tỷ lệ và cường độ nhiễm ở cua suối tại xã Lương Sơn, huyện Bảo Sơn, tỉnh

Lào Cai là 82,8% và 4-504 metacercariae/cua, ở xã An Lạc, huyện Lục Yên,

tỉnh Yên Bái là 70,0% và 1-362 metacercariae/cua. Ở tỉnh Quảng Trị, tỷ lệ

và cường độ nhiễm ở xã Tà Long là 96,0% và 12-608 metacercaria/cua; ở xã

Da Krong là 78,0% và 1-78 metacercaria/cua, ở xã Hướng Sơn là 100% và

7-500 metacercariae/cua, ở xã Tân Thanh là 10,0-12,0% và 1-6

metacercariae/cua.

- Cua suối ở Lào Cai và Yên Bái bị nhiễm 4 loài SLP, cua suối ở Quảng Trị bị

nhiễm 4 loài SLP.

- Trong số các loài SLP, tỷ lệ nhiễm Paragonimus heterotremus cao nhất ở

Lào Cai và Yên Bái, tỷ lệ nhiễm P. westermani cao nhất ở Quảng Trị.

2. Đa dạng hình thái và di truyền của Paragonimus heterotremus và


- Metacercaria của 2 loài P. heterotremus và P. westermani đều có sự đa dạng

về hình thái và kích thước. Tuy nhiên, có sự tương đồng cao về di truyền

phân tử. Chỉ có sự khác biệt nhỏ về gen 16S giữa các mẫu P. westermani ở

miền Trung và miền Bắc Việt Nam.

- Phân tích phân tử và hình thái xác định P. westermani ở Việt Nam thuộc

nhóm 2n.

3. Một số đặc điểm sinh học của Paragonimus heterotremus và Paragonimus

westermani

95

- Vật chủ trung gian thứ nhất của loài P. westermani là ốc S. quangtriensis,

của loài P. heterotremus là ốc Triculinae gen sp.1. Ngoài ra, đề tài xác định

được vật chủ của loài P. proliferus là ốc Triculinae gen sp.2.

- Cercaria của 3 loài sán lá phổi giống nhau về hình thái, tuy nhiên chúng có thể

phân biệt qua chiều dài ruột và số lượng cercaria của redia.

- Mèo rừng (Prionailurus bengalensis) là vật chủ chính ngoài tự nhiên của 3

loài SLP P. westermani, P. heterotremus và P. skrjabini.

- Trong gây nhiễm thực nghiệm, chó nhà không bị nhiễm loài P. westermani.

Mèo nhà bị nhiễm loài SLP này với tỷ lệ trưởng thành thấp và thời gian phát

triển dài.

- Chuột nhắt trắng đóng vai trò là vật chủ chứa trong vòng đời phát triển của 2

loài sán lá phổi P. heterotremus và P. westermani. Sán non ở cơ chuột có thể

phát triển tiếp đến trưởng thành ở vật chủ chính, sán non ở gan có kích

thước lớn hơn và không phát triển đến trưởng thành ở vật chủ chính.

- Sức sống của metacercaria SLP phụ thuộc vào dung dịch nuôi, nhiệt độ và

mật độ metacercaria. Ở điều kiện nước muối sinh lý, ở nhiệt độ 4°C có thể

sống tới 12 tháng. Mật độ metacercaria càng thấp thì metacercaria càng sống

lâu hơn.

4. Kỹ thuật dot-ELISA chẩn đoán miễn dịch

- Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng dot-ELISA với kháng nguyên chất tiết

của SLP là 100% và 96,7%.

- Nồng độ kháng nguyên thấp nhất có thể sử dụng là 0,5 mg/ml.

- Thời gian ủ với huyết thanh, kháng thể 2 và thời gian hiện màu phụ thuộc

vào nhiệt độ. Nhiệt độ càng thấp thì cần thời gian lâu hơn. Tổng thời gian

của phản ứng có thể từ 51 phút ở 37°C đến 4h21 phút ở 4

°C.

KIẾN NGHỊ

1. Mở rộng điều tra nghiên cứu SLP ở các tỉnh phía Nam.

2. Kỹ thuật dot-ELISA dễ thực hiện, cho kết quả nhanh, không cần máy đọc

quang phổ, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể thực hiện ở thực địa kể cả vào

96

thời tiết lạnh, không cần tủ ấm, vì vậy cần thử nghiệm áp dụng kỹ thuật này

trong chẩn đoán bệnh SLP tại các địa phương.

3. Loài P. heterotremus và P. westermani có vùng phân bố trùng nhau, vì vậy cần

nghiên cứu thử nghiệm kỹ thuật ELISA ức chế để chẩn đoán phân iệt nhiễm

hai loài sán lá phổi này.

97

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Đề tài luận án lần đầu tiên thực hiện các nội dung nghiên cứu và đóng góp

mới các kết quả sau:

1. Phát hiện loài P. heterotremus ở miền Trung và P. westermani ở miền Bắc.

2. Xác định sự đa dạng hình thái và kích thước metacercaria của loài P. westermani

và P. heterotremus. Tuy nhiên, các quần thể của các loài này ở miền Bắc và

miền Trung có độ tương đồng cao về di truyền. Xác định quần thể P. westermani

ở Việt Nam thuộc nhóm 2n.

3. Xác định chính xác vật chủ trung gian thứ nhất của 3 loài SLP P. westermani,

P. heterotremus và P. proliferus là ốc S. quangtriensis, Triculinae gen sp.1, và

Triculinae gen sp.2, tương ứng. Ấu trùng của 3 loài SLP có thể phân biệt b ng

chiều dài ruột và số lượng cercaria của redia.

4. Xác định mèo rừng (Prionailurus bengalensis) đóng vai trò là vật chủ chính

ngoài tự nhiên của 3 loài sán lá phổi P. westermani, P. heterotremus và

P. skrjabini ở Da Krong, Quảng Trị.

5. Gây nhiễm thí nghiệm xác định chó nhà không bị nhiễm P. westermani. Mèo

nhà bị nhiễm nhưng mức độ mẫn cảm thấp hơn so với P. heterotremus.

6. Xác định chuột nhắt trắng đóng vai trò là vật chủ chứa trong vòng đời phát triển

của loài P. westermani và P. heterotremus ở Việt Nam, và xác định sán non ở cơ

vật chủ chứa có thể phát triển tiếp đến trưởng thành ở vật chủ chính.

7. Xác định sức sống của metacercaria sán lá phổi không chỉ phụ thuộc vào dung

dịch nuôi, nhiệt độ, mà còn phụ thuộc vào mật độ metacercaria. Mật độ

metacercaria càng thấp thì metacercaria sống được lâu hơn. Trong nước muối

sinh lý ở nhiệt độ 4oC, metacercaria có thể sống tới 12 tháng.

8. Đã xác định được độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật dot-ELISA, đồng thời xác

định thời gian phản ứng ở điều kiện nhiệt độ khác nhau, có thể sử dụng để chẩn

đoán nhanh bệnh SLP ngoài thực địa, kể cả thời tiết lạnh.

98

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Lƣu Anh Tú, Hoàng Văn Hiền, Bùi Khánh Linh, Phạm Ngọc Doanh, 2017. So

sánh phương pháp ép và giã-lọc cua tìm ấu trùng sán lá phổi. Hội nghị Sinh thái

và tài nguyên sinh vật lần thứ 7, tr. 2000-2004.

2. Lƣu Anh Tú, Phạm Ngọc Doanh, Hoàng Văn Hiền, Đỗ Trung Dũng, Nguyễn

Thị Hợp, 2016. Sự phát triển và khả năng gây bệnh của loài sán lá phổi

Paragonimus westermani ở động vật thí nghiệm. Tạp chí Sinh học, 38(2):133-

139.

3. Doanh PN, Hien HV, Tu LA, Nonaka N, Horii Y, Nawa Y., 2016. Molecular

identification of the trematode Paragonimus in faecal samples from the wild cat

Prionailurus bengalensis in the Da Krong Nature Reserve, Vietnam. Journal of

Helminthology 90(6):658-662.

4. Doanh PN, Tu LA, Bui TD, Loan TH, Nonaka N, Horii Y, Blair D, Nawa Y.,

2016. Molecular and morphological variation of Paragonimus westermani in

Vietnam with records of new second intermediate crab hosts and a new locality

in a northern province. Parasitology 143(12):1639-46.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26388560






99

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Blair D, Xu XB and Agatsuma T, Paragonimiasis and the genus

Paragonimus, Advance in Parasitology, 1999, 42:113–222.

2. Blair D, Agatsuma T, and Wang W, Paragonimiasis, In World class parasites,

volum 11 Food-borne parasitic zoonoses: Fish and plant-borne parasites, ed, K,

D, Murrell and B, Fried, Springer, New York, 2007, 117-150.

3. Cao Văn Viên, Lê Minh Tuấn, Nguyễn Công Phúc, Tẩn Cù Páo, Lê Trung

Thỏa và CTV, Một s kết quả nghiên cứu bước đầu bệnh sán lá phổi

(Paragonimiasis) ở Sìn Hồ - Lai Châu, Tạp chí Y học thực hành, 1994, 2:4-6.

4. Cao Văn Viên, Một s kết quả nghiên cứu về dịch tễ, ký sinh trùng, bệnh học và

phòng ch ng bệnh sán lá phổi ở Sìn Hồ - Lai Châu, Kỷ yếu Hội nghị khoa học -

công nghệ - môi trường lần thứ V các tỉnh miền núi phía Bắc, 1997, 81-84.

5. Nguyễn Thị Lê, Lê Đăng Hà, Cao Văn Viên, Phát hiện hai loài sán lá phổi thuộc

gi ng Paragonimus Braun, 1899 (Paragonimidae Dolfus, 1939) ở huyện Sìn Hồ -

Lai Châu", Tạp chí Sinh học, 1997, 19(1):5-7.

6. Nguyễn Thị Lê, Đặng Tất Thế, Phạm Ngọc Doanh, Tình hình nhiễm

metacercaria của sán lá phổi ở cua su i thuộc huyện Sìn Hồ - Lai Châu, Y

học Việt Nam, 1997, 2:35- 40.

7. Nguyễn Văn Đề, Kiều Tùng Lâm, Lê Văn Châu và cs., Nghiên cứu bệnh sán

lá và sán dây. Tạp chí Phòng chống bệnh ký sinh trùng sốt rét, 1998a, 2:29-

33.

8. Nguyễn Văn Đề, Lê Đình Công, Đặng Thanh Sơn và cs., Nghiên cứu bước

đầu dịch tễ học, bệnh học và điều trị bệnh sán lá phổi ở Sìn Hồ (tỉnh Lai

Châu). Tạp chí Y học phòng dịch, 1998b, 8:66.

9. Nguyễn Văn Đề, Đặng Thanh Sơn, Lê Thị Chuyên et al., Tình hình nhiễm

giun sán ở một xã miền núi của tỉnh Lào Cai. Tạp chí Phòng chống bệnh ký

sinh trùng sốt rét, 1999, 2:73-76.

10. Nguyễn Văn Đề, Đặng Thanh Sơn, Lê Thị Chuyền và cs., Thông báo một s ổ

bệnh sán lá phổi mới phát hiện ở các tỉnh miền núi phía Bắc, Thông tin phòng

chống Sốt rét và các bệnh Ký sinh trùng, 2000a, 2:32.

11. Nguyễn Văn Đề, Lê Văn Châu, Đặng Thanh Sơn và cs., Nghiên cứu dịch tễ,

bệnh học, chẩ đoá và điều trị bệnh sán lá phổi ở các tỉnh phía bắc Việt

100

Nam. Thông tin nghiên cứu khoa học 1996-2000. Viện Sốt rét, ký sinh trùng

và côn trùng Trung ương, 2000 : 560-594.

12. De NV, Murrell KD, Cong LD, Cam PD, Chau LV, Toan ND, Dalsgaard A,

The food-borne trematodes zoonoses of Vietnam. Southeast Asian J Trop Med

Publ Health, 2003, 34(1): 12-34.

13. Phạm Ngọc Doanh, Nguyễn Thị Lê, Đặng Tất Thế, Sự phát triển của sán lá

phổi Parago imus heterotremus tro g cơ thể động vật và tác hại của chúng.

Tạp chí Sinh học, 1999, 21 (2b):76 - 82.

14. Phạm Ngọc Doanh, Nguyễn Thị Lê, Đặng Tất Thế, Sự phân b của sán lá phổi và

vật chủ trung gian của nó ở các tỉnh Tây Bắc, Tạp chí Sinh học, 2002, 24(1):14-

22.

15. Doanh PN, Shinohara A, Horii Y, Habe S, Nawa Y, The DT, Le NT,

Morphological and molecular identification of two Paragonimus spp., of

which metacercariae concurrently found in a land crab, Potamiscus tannanti,

collected in Yenbai Province, Vietnam, Parasitol Res, 2007,100:1075–1082.

16. Doanh PN, Shinohara A, Horii Y, Habe S, Nawa Y & Le NT, Description of

a new lung fluke species, Paragonimus vietnamensis sp. nov, (Trematoda:

Paragonimidae), found in Central Viet Nam, Parasitology Research, 2007,

101:1495-1501.

17. Doanh PN, Shinohara A, Horii Y, Habe S, Nawa Y & Le NT, Discovery of

Paragonimus proliferus in Central Viet Nam and their molecular

phylogenetic status among genus Paragonimus, Parasitology Research, 2008,

102:677-683.

18. Doanh PN, Shinohara A, Horii Y, Habe S, Nawa Y, Discovery of

Paragonimus westermani in Viet Nam and its molecular phylogenetic status

in P. westermani complex, Parasitol Res, 2009,104:1149–1155.

19. Doanh PN, Shinohara A, Horii Y, Yahiro S, Habe S, Vannavong N, Strobel

M, Nakamura S & Nawa Y, Morphological differences and molecular

similarities between Paragonimus bangkokensis and P. harinasutai,

Parasitology Research, 2009b, 105:429-439.

20. Doanh PN, Dung DT, Thach DT, Horii Y, Shinohara A, Nawa Y, Human

paragonimiasis in Viet Nam: epidemiological survey and identification of the

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Doanh%20PN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21946337

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dung%20do%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21946337

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Thach%20DT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21946337

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Horii%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21946337

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shinohara%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21946337

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nawa%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21946337

101

responsible species by DNA sequencing of eggs in patients' sputum, Parasitol

Int, 2011;60(4):534-537.

21. Doanh PN, Hien HV, Nonaka N, Horii Y, Nawa Y. Co-existence of

Paragonimus harinasutai and Paragonimus bangkokensis metacercariae in

fresh water crab hosts in central Viet Nam with special emphasis on their

close phylogenetic relationship. Parasitol Int. 2012, 61(3):399-404.

22. Doanh PN, Horii Y, Nawa Y, Paragonimus and paragonimiasis in Vietnam:

an update, Korean J Parasitol, 2013,51:621-627.

23. Doanh PN, Thaenkham U, An PT et al., Metacercarial polymorphism and

genetic variation of Paragonimus heterotremus (Digenea: Paragonimidae),

and a re-appraisal of the taxonomic status of Paragonimus

pseudoheterotremus, Journal of Helminthology, 2015, 89(2):182-188.

24. Doanh PN, Hien HV, An PT, Tu LA, Development of lung fluke,

Paragonimus heterotremus, in rat and mice, and the role of paratenic host in

its life cycle, Tạp chí sinh học, 2015, 37(3): 265-271.

25. Miyazaki I, An illustrated book of helminthic zoonoses, Tokyo : International

Medical Foundation of Japan, 1991, 494pp.

26. Blair D, Paragonimiasis, In Digenetic trematodes, ed, R, Toledo and B, Fried,

Springer, New York, 2014, 115-152.

27. Kong Y, Doanh PN, Nawa Y, Paragonimus, In Biology of Foodborne

Parasites, ed, L, Xiao, U, Ryan and Y, Feng, CRC Press, 2015.

28. Agatsuma T, Iwagami M, Sato Y, Iwashita J, Hong SJ, Kang SY, Ho LY, Su

KE, Kawashima K, Abe T, The origin of the triploid

in Paragonimus westermani on the basis of variable regions in the

mitochondrial DNA. J Helminthol, 2003, 77(4):279-285.

29. Blair D, Nawa Y, Mitreva M, Gene diversity and genetic variation in lung

flukes(genus Paragonimus), Transactions of the

Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 2016, 10(1):6-12.

30. Nakamura-Uchiyama F, Mukae H, Yukifumi N, 2002. Paragonimiasis: a Japanese

perspective. Clin Chest Med, 23:409– 420.

31. Nonaka N, Sano T, Inoue T, Armua MT, Fukui D, Katakura K & Oku Y,

Multiplex PCR system for identifying the carnivore origins of feces for an

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21946337






http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Doanh%20PN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24516264



https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Thaenkham%20U%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24229574

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=An%20PT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24229574

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Metacercarial+polymorphism+and+genetic+variation+of+Paragonimus+heterotremus+(Digenea%3A+Paragonimidae)%2C+and+a+re-appraisal+of+the+taxonomic+status+of+Paragonimus+pseudoheterotremus






102

epidemiological study on Echinococcus multilocularis in Hokkaido, Japan,

Parasitology Research, 2009, 106:75–83.

32. Kim JS. An ecological study of Paragonimus in Malaysia. Kisaengchunghak

Chapchi. 1978, 16(1):47-53.

33. Amunarriz M, Intermediate host of Paragonimus in the eastern Amazonic

region of Ecuador. Tropical Medicine Parasitology, 1991, 42(3):164 - 166.

34. Hu WQ, Zhou SH, Long ZP, Discovery of the first intermediate host of

Paragonimus heterotremus. Chinese Journal of Parasitology & Parasitic

Diseases, 1994, 12(1):34 - 36.

35. Wilke T, Davis GM, Gong X, Liu HX. Erhaia (Gastropoda: Rissooidea):

phylogenetic relationships and the question of Paragonimus coevolution in

Asia. Am J Trop Med Hyg, 2000, 62(4):453-459.

36. Liu L, Huo GN, He HB, Zhou B, Attwood SW, A phylogeny for the

pomatiopsidae (Gastropoda: Rissooidea): a resource for taxonomic,

parasitological and biodiversity studies. BMC Evol Biol, 2014, 14(1):29.

37. Odermatt P, Habe S, Maichanh S, Tran DS, Duong V & Zhang W,

Paragonimiasis and its intermediate hosts in a transmission focus in Laos

peop e’s Democratic Repub ic Acta Tropica, 2007, 103:108-115.

38. Habe S, Doanh PN, Yahiro S, Vannavong N, Barennes H, Odermatt

P, Dreyfuss G, Horii Y, Nawa Y, Paragonimus paishuihoensis metacercariae

in freshwater crabs, Potamon lipkei, in Vientiane Province, Lao PDR. Korean

J Parasitol, 2013, 51(6):683-687.

39. Habe S, Lai KPF, Agatsuma T, Yang CKO and Kawashima K, Crab hosts for

Paragonimus westermani (kerbert, 1878) in Malaysia. Jpn. J. Trop. Med.

Hyg., 1993, 21(3):137-142.

40. Habe S, Lai KPF, Agatsuma T, Growth of Malaysian Paragonimus

westermani (Kerbert, 1878) in mammals and the mode of transmission of the

fluke among mammals, Japanese Journal of Tropical Medicine and Hygiene,

1996, 24:225-232.

41. Miyazaki I and Habe S, A newly recognised mode of human infection with

lung flukes, Paragonimus westermani (Kerbert, 1878), Journal of

Parasitology, 1976, 62:646-648.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20JS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12902783

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim+1978+Paragonimus

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim+1978+Paragonimus

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/journals/zhongguo-ji-sheng-chong-xue-yu-ji-sheng-chong-bing-za-zhi/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/journals/zhongguo-ji-sheng-chong-xue-yu-ji-sheng-chong-bing-za-zhi/




https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liu%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24548800

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Huo%20GN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24548800

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=He%20HB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24548800

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhou%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24548800

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Attwood%20SW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24548800

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liu+2014+Gammatricula

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Habe%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24516274

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Doanh%20PN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24516274

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yahiro%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24516274

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vannavong%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24516274

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Barennes%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24516274

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Odermatt%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24516274

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Odermatt%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24516274

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dreyfuss%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24516274

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Horii%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24516274

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nawa%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24516274

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Habe+2013%2C+paragonimus

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Habe+2013%2C+paragonimus

103

42. Yoshida A, Matsuo K , Moribe J, Venison, another source of Paragonimus

westermani infection, Parasitology International, 2016, 65(6): 607–612.

43. Singh TS, Sugiyama H, Umehara A, Hiese S & Khalo K, Paragonimus

heterotremus infection in Nagaland: A new focus of Paragonimiasis in India,

Indian Journal of Medical Microbiology, 2009, 27:123-127.

44. Singh TS, Devi KR, Singh SR, A case of cutaneous paragonimiasis presented

with minimal pleuritis, Tropical Parasitology, 2012, 2(2):142-144.

45. Singh TS, Mutum SS, Razaque MA, Pulmonary paragonimiasis: clinical

features, diagnosis and treatment of 39 cases in Manipur. Trans R Soc Trop

Med Hyg, 1986, 80(6):967-971.

46. Singh TS, Mutum S, Razaque MA, Singh YI, Singh EY, Paragonimiasis in

Manipur. Indian J Med Res, 1993, 97:247-252.

47. Devi KR, Narain K, Bhattacharya S, Negmu K, Agatsuma T, Blair

D, Wickramashinghe S, Mahanta J, Pleuropulmonary paragonimiasis due

to Paragonimus heterotremus: molecular diagnosis, prevalence of infection

and clinicoradiological features in an endemic area of northeastern India.

Trans R Soc Trop Med Hyg, 2007, 101(8):786-92.

48. Singh TS, Hiromu S, Devi KR, Singh WA, First case of Paragonimus

westermani infection in a female patient in India, Indian J Med

Microbiol, 2015, 33(l):156-159.

49. Zhang XL, Wang Y, Wang GX, Distribution and clinical features of

Paragonimiasis skrjabini in three Gorges Reservoir Region, Parasitology

International, 2012, 61(4):645-649.

50. Lane MA, Marcos LA, Onen NF, Paragonimus kellicotti flukes in Missouri,

USA, Emerging Infectious Diseases, 2012, 18(8):1263-1267.

51. Nawa Y and Nakamura-Uchiyama F, Paragonimus and paragonimiasis in

Japan. In Asian Parasitology, vol.1. Food-borne helminthiasis in Asia. FAP

journal, Japan, 2005, 125-131.

52. Zhou P, Chen N, Zhang RL, Food-borne parasitic zoonoses in China:

perspective for control. Trends Parasitol, 2008, 24:190–196.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1383576916302677



http://www.sciencedirect.com/science/journal/13835769

http://www.sciencedirect.com/science/journal/13835769/65/6/supp/PA

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Singh%20TS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19384034

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sugiyama%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19384034

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Umehara%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19384034

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hiese%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19384034




https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Singh%20TS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8144207

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mutum%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8144207

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Razaque%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8144207

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Singh%20YI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8144207

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Singh%20EY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8144207

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Singh+1993+paragonimus

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Devi%20KR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17467757

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Narain%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17467757

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bhattacharya%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17467757

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Negmu%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17467757

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Agatsuma%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17467757

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Blair%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17467757

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Blair%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17467757

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wickramashinghe%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17467757

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mahanta%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17467757

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Devi+2007+paragonimus







104

53. Boland JM, Vaszar LT, Jones JL, Pleuropulmonary infection by Paragonimus

westermani in the United States: a rare cause of eosinophilic pneumonia after

ingestion of live crabs. Am J Surg Pathol, 2011, 35(5):707–713.

54. Diaz JH, Paragonimiasis acquired in the United States: native and nonnative

species. Clin Microbiol Rev, 2013, 26:493–504.

55. Nkouawa A, Okamoto M, Mabou AK, Paragonimiasis in Cameroon:

mo ecu ar ide tificatio serodiag osis a d c i ica ma ifestatio s Trans R

Soc Tropical Med Hyg, 2009, 103:255–261.

56. Zhong HL, He LY, Xu ZB, Recent progress in studies of Paragonimus and

paragonimiasis control in China. Chinese Med J, 1981, 94:483–494.

57. Xu ZB, Studies on clinical manifestations, diagnosis and control of

paragonimiasis in China. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 1991,

22:345–348.

58. Eke RA, Nwosu UM, Enwereji EE, Paragonimiasis reemergence in Nigeria:

predisposing factors and recommendations for early intervention and

everlasting eradication. ISRN Infect Dis 2013, doi: 10.5402/2013/257810.

59. Devi KR, Narain K, Mahanta J, Nirmolia T, Blair D, Saikia SP, Agatsuma T,

Presence of three distinct genotypes within the Paragonimus westermani

complex in northeastern India, Parasitology, 2013,140:76–86.

60. Odermatt P, Veasna D, Zhang W, Vannavong N, Phrommala S, Habe S,

Barennes H, Strobel M. Rapid identification of paragonimiasis foci by lay

informants in Lao People's Democratic Republic. PLoS Negl Trop Dis. 2009,

3(9):e521. doi: 10.1371/journal.pntd.0000521.

61. Mukae H, Taniguchi H, Matsumoto N, Clinicoradiologic features of

pleuropulmonary Paragonimus westermani on Kyusyu Island, Japan. Chest ,

2001,120:514–520.

62. Slesak G, Inthalad S, Basy P, Ziehl-Neelsen staining technique can diagnose

paragonimiasis. PLoS Negl Trop Dis, 2011, 5:e1048.

63. Kim TS, Han J, Shim SS, Pleuropu mo ary parago imiasis: CT fi di gs i

31 patients. Am J Roentgenol, 2005, 185:616–62.



105

64. Sadun EH, Buck AA, Paragonimiasis in South Korea—immunodiagnostic,

epidemiologic, clinical roentgenologic and therapeutic studies. Am J Trop

Med Hyg, 1960, 9:562–599.

65. Itoh M and Sato S, Multi-dot enzyme-linked immunosorbent assay for

serodiagnosis of trematodiasis. Southeast Asian J Trop Med Public Health,

1990, 21:471–474.

66. Chen JX, Chen M, Ai L, A protein microarray for the rapid screening of

patients suspected of infection with various food-borne helminthiases. PLoS

Negl Trop Dis, 2012, 6:e1899.

67. Qiu XG, Nakamura-Uchiyama F, Nawa Y, Itoh M, A tool for mass-screening

of paragonimiasis: an enzyme-linked immunosorbent assay with urine

samples. Trop Med Health. 2016, 44:19. doi: 10.1186/s41182-016-0019-4.

eCollection 2016.

68. Chang ZS, Wu B, Blair D, Gene sequences for identification of Paragonimus

eggs from a human case, Chinese Journal of Parasitology and Parasitic

Diseases, 2000, 18:213–215.

69. Fischer PU, Curtis KC, Marcos LA, Molecular characterization of the North

America u g fluke Parago imus ke icotti i Missouri a d its deve opme t

in Mongolian gerbils. Am J Trop Med Hyg, 2011, 84:1005–1011.

70. Maleewong W, Intapan PM, Wongkham C, Detection of Paragonimus

heterotremus in experimentally infected cat feces by antigen-capture ELISA

and by DNA hybridization, Journal of Parasitology, 1997, 83:1075–1078.

71. Chen MX, Ai L, Zhang RL, Sensitive and rapid detection of Paragonimus

westermani infection in humans and animals by loop-mediated isothermal

amplification LAMP. Parasitology Research, 2011, 108:1193–1198.

72. Zhao GH, Li J, Blair D, Biotechnological advances in the diagnosis, species

differentiation and phylogenetic analysis of Schistosoma species.

Biotechnol Adv, 2012, 30:1381–1389.

73. Zhang J, Zhang XL, Huang FS, Systematic teaching method to enhance the

effectiveness of training for paragonimiasis. Pathog Glob Health, 2013,

107:11–14.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Qiu%20XG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27433138

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nakamura-Uchiyama%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27433138

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nawa%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27433138

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Itoh%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27433138

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Qiu+2016%2C+paragonimus

106

74. Patrick SL, Turabelidze G, Marx H, Human paragonimiasis after eating raw

or undercooked crayfish—Missouri, July 2006-September 2010, Morbidity

and Mortality Weekly Report, 2010, 59:1573–1576.

75. Arias SM, Salazar LM, Casas E, Paragonimus sP. in crabs and awareness of

the educational community to aquatic ecosystems in La Miel and La Clara,

Caldas, Antioquia, Biomedica, 2011, 31(2):209-215.

76. Sanpool O, Intapan PM, Thanchomnang T, Janwan P, Nawa Y, Blair D,

Maleewong W, Molecular variation in the Paragonimus heterotremus

complex in Thailand and Myanmar. Korean J Parasitol. 2013, 51(6):677-681.

77. Nawa Y, Thaenkham U, Doanh PN, Paragonimus westermani and

Paragonimus species, In Encyclopedia of Food Safety, Volume 2: Hazards

and Diseases, 1st edition, ed, Y, Motarjemi, Elsevier, 2014, 179-188.

78. Thaenkham U & Waikagul J, Molecular phylogenetic relationship of

Paragonimus pseudoheterotremus. Southeast Asian Journal of Tropical

Medicine and Public Health, 2008, 39: 217–221.

79. Miyazaki I, Two types of the lung fluke which has been called Paragonimus

westermani (Kerbert, 1878), Med, Bull, Fukuoka Univ, 1978, 5:251-63.

80. Tabuchi KT, Takahashi S, Adachi A, family case of paragonimiasis

westermani following ingestion of raw deer meat, Shonika Rinsho, 2010,

63:1798-1802.

81. Sugiyama H, Shibata M, Arakawa K, Risk for paragonimiasis westermani

infection through venison, Infectious Agents Surveillance Report, 2016,

37:36.

82. Monzel R. Une observation de distomiase pulmonaire en Cochinchine.

Quelque notes sur les accident toxques dus a de parasites animaux de

l'intestin. Ann Hyg et Med Colon. 1906;9:258–262.

83. Nguyễn Thị Lê, Danh mục các loài sán lá ký sinh ở chim và thú Việt Nam.

Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 1995, 250 tr.

84. Kino H, De NV, Vien HV, Chuyen LT & Sano M, Paragonimus heterotremus

Chen et Hsia,1964 found from a dog in Vietnam, Japanese Journal of

Parasitology, 1995,44:470-472.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Arias%20SM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22159537

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Arias+Paragonimus



107

85. Le TH, De NV, Blair D, McManus DP, Kino H, Agatsuma T, Paragonimus

heterotremus Chen et Hsia, 1964 in Vietnam: A molecular identification and

relationships of isolates from different hosts and geographical origins, Acta

Trop, 2006, 98:25-33.

86. Sohn WM, Ryu JS, Min DY, Song HO, Rim HJ, Vonghachack Y, Ouakhasith

D, Banouvong V, Indochinamon ou (Crustacea: Potamidae) as a new second

intermediate host for Paragonimusharinasutai in Luang Prabang Province,

Lao PDR. Korean J Parasitol., 2009, 47(1):25-29.

87. Sugiyama H, Shibata K, Morishima Y, Muto M, Yamasaki H, Kawakami Y,

Current status of lung fluke metacercarial infection in freshwater crabs in the

Kawane area of Shizuoka Prefecture, Japan. J Vet Med Sci., 2013, 75(3):249-53.

88. Đặng Ngọc Thanh, Thái Trần Bái, Phạm Văn Miên, Định loại động vật không

ươ g s g ước ngọt Bắc Việt Nam, Nxb. KHKT, Hà Nội, 1980.

89. Đặng Ngọc Thanh và Hồ Thanh Hải, Giáp ác ước ngọt Động vật chí Việt

Nam. Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2001.

90. Đặng Ngọc Thanh, Hồ Thanh Hải, Động vật chí Việt Nam tập 5, Giáp xác

ước ngọt, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2006.

91. Đặng Ngọc Thanh, Hồ Thanh Hải, T m cua ước ngọt Việt Nam. Nhà xuất

bản Khoc học tự nhiên và công nghệ, 2012, 166-246.

92. Bowles J, Blair D, McManus DP, A molecular phylogeny of the human

schistosomes, Mol Phylogenet Evol, 1995, 4:103-109.

93. Bowles J, McManus DP, Rapid discrimination of Echinococcus species and

strains using a polymerase chain reaction-based RFLP method, Mol Biochem

Parasitol, 1993, 57:231–240.

94. Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S, MEGA6: Molecular

Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Mol Biol Evol. 2013,

30(12):2725–2729

95. Nguyễn Thị Lê, Phạm Văn Lực, Hà Duy Ngọ, Nguyễn Văn Đức, Nguyễn Thị

Minh. Giun sán ký sinh ở gia súc Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật,

Hà Nội, 1996, 296tr.




https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sugiyama%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23076034

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shibata%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23076034

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Morishima%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23076034

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Muto%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23076034

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yamasaki%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23076034

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kawakami%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23076034

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sugiyama+2012+metacercariae

108

96. Sadaow L, Intapan PM, Boonmars T, Morakote N, Maleewong W.

Susceptibility of laboratory rodents to Trichinella papuae. Korean J Parasitol,

2013, 51(6): 629-632.

97. Đặng Ngọc Thanh, Hồ Thanh Hải, Phân loại phân họ c Triculinae (Hydrobiidae

- Prosobranchia) ở Việt Nam. Tạp chí Sinh học, 2006, 28(1):8–18.

98. Ho Thanh Hai and Dang Ngoc Thanh, Contribution to the study on Triculinae

snail group (Pomatiopsidae - mollusca) in Tay nguyen highland, Vietnam

Journal of Biology, 2010, 32(4):14-18.

99. Hồ Thanh Hải, Đặng Ngọc Thanh, Hai loài c thuộc nhóm Triculinae

(Pomatiopsidae - Prosobranchia) ở miền bắc Việt Nam. Tạp chí Sinh học,

2012, 33:17–23.

100. Islam Z, Alam MZ, Akter S, Roy BC and Mondal MMH. Distribution

patterns of vector snails and trematode cercaria in their vectors in some

selected areas of Mymensingh. J. Environ. Sci. & Natural Resources, 2012,

5(2): 37- 46.

101. Folmer O, Black M, Hoeh W, Lutz RA, Vrijenhoek RC. DNA primers for

amp ificatio of mitocho dria cytochrome c o idase subunit I from diverse

metazoan invertebrates. Molecular Mar Biol Biotech. 1994;3:294–299

102. Hứa Văn Thước và cộng sự. Nghiên cứu một s đặc điểm dịch tễ, sinh thái,

hình thái của ấu trùng sán lá phổi trong trung gian truyền bệnh (cua su i) tại

một s tỉnh phía bắc giáp trung qu c. Tạp chí Y học thực hành TP. HCM,

2007, 11(2):136.

103. Agatsuma T, Habe S & Ho LY, Genetic variability of the diploid and triploid of

Paragonimus westermani in China and their differentiation, pp. 33–59 in

Kawashima, K, (Ed,) Paragonimus in Asia: biology, genetic variation and

speciation (II), Fukuoka, Shunpposha Photographic Printing Co, Ltd, 1989, 33-59.

104. Park GM, Lee KJ, Im KI, Park H, Yong TS, Occurrence of a diploid type and

a new first intermediate host of a human lung fluke, Paragonimus

westermani, in Korea, Experimental Parasitology, 2001, 99:206–12.

105. Sugiyama H, Morishima Y, Binchai S, Rangsiruji A and Ketudat P, New form

of Paragonimus westermani discovered in Thailand: morphological

http://www.yds.edu.vn/tcyh/?Content=ChiTietBai&idBai=4332



109

characteristics and host susceptibility. Southeast Asian J Trop Med Public

Health, 2007, 38(1), 87-91.

106. Blair D, Agatsuma T, Watanobe T, Okamoto M, Ito A, Geographical genetic

structure within the human lung fluke, Paragonimus westermani, detected

from DNA sequences, Parasitology, 1997, 115 (4):411-417.

107. Iwagami M, Ho LY, Su K, Lai PF, Fukushima M, Nakano M, Blair D,

Kawashima K, Agatsuma T, Molecular phylogeographic studies on

Paragonimus westermani in Asia, J Helminthol, 2000, 74:315-22.

108. Iwagami M, Rajapakse RPVJ, Paranagama W, Okada T, Kano S, Agatsuma

T, Ancient divergence of Paragonimus westermani in Sri Lanka, Parasitol

Res, 2008, 102:845–52.

109. Waikagul J, A new species of Paragonimus (Trematoda: Troglotrematidae)

from a cat infected with metacercariae from mountain crabs Larnaudia

larnaudii, Journal of Parasitology, 2007, 93(6):1496-1500.

110. Hu W, Study on the life cycle of Paragonimus heterotremus, Chinese Journal

of Parasitology and Parasitic Diseases, 1998, 16:347–352 (in Chinese with

English abstract).

111. Singh TS, Sugiyama H, Rangsiruji A & Devi KR, Morphological and

molecular characterizations of Paragonimus heterotremus, the causative

agent of human paragonimiasis in India. Southeast Asian Journal of Tropical

Medicine and Public Health, 2007, 38:82–86.

112. Blair D, Chang Z, Chen M, Cui A, Wu B, Agatsuma T, Iwagami M, Corrlis

D, Fu C & Zhan X, Paragonimus skrjabini Chen, 1959 (Digenea:

Paragonimidae) and related species in eastern Asia: a combined molecular

a d morpho ogica approach to ide tificatio a d ta o omy. Systematic

Parasitology, 2005, 60:1–21.

113. Binchai S, Rangsiruji A, Ketudat P, Morishima Y, Sugiyama H, Molecular

systematic of a new form of Paragonimus westermani discovered in Thái Lan,

Southeast Asian J Trop Med Public Health, 2007, 38(1):92-96.

114. Davis GM, Chen CE, Kang ZB et al., Snail hosts of Paragonimus in Asia and

the Americas, Biomedical and Environmental Sciences, 1994, 7:369-382.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Blair%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9364568

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Agatsuma%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9364568

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Watanobe%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9364568

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Okamoto%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9364568

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ito%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9364568

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Blair+et+al.+1997%2C+paragonimus+westermani

110

115. Iwagami M, Rajapakse RP, Yatawara L, Kano S, Agatsuma T, The first

intermediate host of Paragonimus westermani in Sri Lanka. Acta Trop, 2009,

109(1):27-29.

116. Chai JY, Sohn WM, Chung HL, Hong ST & Lee SH, Metacercariae of

Pharyngostomum cordatum found from the European grass snake,

Rhabdophis tigrina, and its experimental infection to cats, Korean Journal of

Parasitology, 1990, 28:175-81.

117. Manh ND, Dang NX & Nghia NX, Conservation importance of mammal

fauna in Da Krong Nature Reserve, Quang Tri province, Vietnam, Vietnam

Journal of Biology, 2009, 31:42-50.

118. Habe S, Experimental studies on the mode of human infection with the lung

fluke, Paragonimus westermani (in Japanese with English abstract). Jpn. J.

Parasitol, 1978, 27(3): 261-292.

119. Shibahara T, Studies on the lung fluke, Paragonimus westermani - diploid

type - in northern part of Hyogo prefecture, Japan. II. Experimental oral

infection with metacercariae to dogs and cats, with reference to

morphological characteristics of adult worms and eggs. Jpn. J. Parasitol.,

1983, 32(4): 293-304.

120. Habe S, A newly recognized paratenic host of Paragonimus spp. Jpn. J. Trop.

Med. Hyg., 1983, 11(1): 1-6.

121. Landmann H, Ngu DV and Thai DD, Paragonimiasis in Vietnam (in

German), Wochenschrqt fur die Gesumre Medizin, 1961,16:1355-64.

122. Fan PC, Lu H, Lin LH, Experimental infection of Paragonimus westermani in

mice and rats. Korean J Parasitol, 1993, 31(2):91-7.

123. Saxton T and Fried B, An update on metacercarial excystment of trematodes.

Parasitol Res, 2009, 105(5):1185-1191.

124. Maleewong W, Intapan PM, Wongkham C, Pajongthanasaris M, Morakote N,

Tapchaisri P, Chaicumpa W. A dot-ELISA test using monoclonal antibody-

purified antigens for the diagnosis of paragonimiasis caused

by Paragonimus heterotremus. Southeast Asian J Trop Med Public Health.

1997, 28(3):621-3.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Iwagami%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18851937

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rajapakse%20RP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18851937

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yatawara%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18851937

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kano%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18851937

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Agatsuma%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18851937


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chai%20JY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2095199

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sohn%20WM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2095199

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chung%20HL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2095199

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hong%20ST%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2095199



https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Saxton%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19609562

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fried%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19609562





111

125. Pappas MG, Hajkowski R, Hockmeyer WT, Standardization of the dot

enzyme linked immunosorbent asay (dot-ELISA) for human visceral

leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg, 1984, 33:1005-1011.

126. Kumar S, Band AH, Samantaray JC. A dot enzyme linked immunosorbent

asay for detection of antibodies against Entamoeba histolytica. J Immunol

Methods, 1985, 83:125-133.

127. Londner MV, Rosen G, Sintov A, Spina DT. The feasibility of a dot enzyme linked

immunosorbent asay (dot-ELISA) for the diagnosis of Plasmodium falciparum

antigens and antibodies. Am J Trop Med Hyg, 1987, 36:240-245.

128. Shaheen HI, Kamal KA, Farid Z., Dot enzyme linked immunosorbent asay

(dot-ELISA) for the rapid diagnosis of human fascioliasis. J Parasitol, 1989,

75:549-552.

129. Su X, Prestwood AK. A dot-ELISA mimicry Western blot test for the detection

of swine trichinellosis. J Parasitol, 1991, 77:76-82.

130. Zhang YQ, Hou LP, Gui SH, The significance of dot-ELISA in the diagnosis

of paragonimiasis. Chinese journal of internal medicine, 1986, 25(11):679-81.

131. Bùi Khánh Linh, Nguyễn Công Thịnh, Đoàn Hữu Hoàn, Nghiên cứu thiết lập

phươ g pháp dot-ELISA để chẩ đoá bệnh sán lá gan lớn ở động vật nuôi.

Tạp chí Sinh học, 2005, 27(3A):37-40.

132. Crowther JR.. The ELISA guidebook. Methods Mol Biol, .2000, 149:III-IV, 1-413.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20YQ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3568857

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hou%20LP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3568857

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gui%20SH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3568857

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Crowther%20JR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11028258


sÁn lÁ phỔi paragonimus heterotremus vÀ...

Documents