Biyosidal Ürünlerin Toksisite Değerlendirmesinde Standart Test Yöntemleri ve Alternatif Yaklaşımlar

Standard test methods and alternative approaches for toxicity assessment of biocidal products

Prof.Dr. N.Ülkü KARABAY YAVAŞOĞLU

EÜ Fen Fakültesi, Biyoloji BölümüEÜ İlaç Geliştirme ve Farmakokinetik Uygulama&Araştırma

Merkezi (ARGEFAR)

TC Sağlık Bakanlığı, Biyosidal Ürünler Yönetmeliği (Resmi Gazete Tarihi: 31.12.2009 Resmi Gazete Sayısı: 27449 4.)

MADDE 4 – (1)

c) Biyosidal ürün: Bir veya birden fazla aktif madde içeren, kullanıma hazır halde satışa sunulmuş, kimyasal veya biyolojik açıdan herhangi bir zararlı organizma üzerinde kontrol edici etki gösteren veya hareketini kısıtlayan, uzaklaştıran, zararsız kılan, yok eden aktif maddeleri ve müstahzarları,

Biyosidal Ürünler Yönetmeliği

Biyosidal ürünler yapılarından ötürü insanlar, hayvanlar ve çevreye karşı risk oluşturmaktadırlar

Ürünlerin piyasaya arz edilmeden önce insan, hayvan ve çevre sağlığı ile ilgili risklerin değerlendirilmesi gerekmektedir

Yasal düzenlemelerin yapılarak tüm ürünler ya da maddelerin test edilmesi ve ruhsatlanması gereklidir

Bir biyosidal ürünün ruhsatlandırılabilmesi için ürünün hedef zararlılar üzerinde yeterli etkinliğe sahip olması, hedef dışı organizmalar üzerinde de istenmeyen etkilerinin olmaması istenmektedir.

Biyosidal ürünlerde bulunan;

aktif maddelerinin özellikleri, miktarı

her türlü toksikolojik veya ekotoksikolojik olarak belirgin safsızlıkları

yardımcı formülleri ile ruhsatlı kullanımından kaynaklanan toksik veya çevre açısından önemli tortu özelliklerinin

ilgili yönetmeliğe uygun olması zorunludur.

Biyosidal Ürünler Yönetmeliği tek başına bağımsız bir yönetmelik değil, kimyasallar için halihazırda geçerli olan diğer yönetmelikler ve standartlar ile de bağlantılıdır.

Bu yönetmelikler:

İyi Laboratuvar Uygulamaları Prensipleri ve Test Laboratuvarlarının Belgelendirilmesine Dair Yönetmelik

TS EN ISO/IEC 17025 Deney ve Kalibrasyon Laboratuvarlarının Yeterliliği için Genel Şartlar Standardı

Biyolojik Etkenlere Maruziyet Risklerinin Önlenmesi Hakkında Yönetmelik

Tehlikeli Maddelerin ve Müstahzarların Sınıflandırılması, Ambalajlanması ve Etiketlenmesi Hakkında Yönetmelik

Bazı Tehlikeli Maddelerin, Müstahzarların ve Eşyaların Piyasaya Arzına ve Kullanımına İlişkin Kısıtlamalar Hakkında Yönetmelik

Tehlikeli Maddeler ve Müstahzarlara İlişkin Güvenlik Bilgi Formlarının Hazırlanması ve Dağıtılması Hakkında Yönetmelik

Deneysel ve Diğer Bilimsel Amaçlar için Kullanılan Hayvanların Refah ve Korunmasına Dair Yönetmelik

TC Sağlık Bakanlığı 22.06.2015 tarihli ve 5716 sayılı “Biyosidal Ürün Analiz Laboratuvarlarının Çalışma Usûl ve Esasları” doğrultusunda;

Biyosidal ürünün;

kimyasal içeriğinin doğrulması,

stabilitesi ve fiziksel özelliklerinin belirlenmesi,

biyolojik etkinlik testleri yapılması

halk sağlığı açısından güvenli kullanımının ortaya konmasına olanak sağlamaktadır.

Biyosidal Ürünler Yönetmeliği’ nde biyosidal ürünler;

4 kategori (Dezenfektanlar ve genel biyosidal ürünler, Koruyucular, Haşere Kontrolü için kullanılan biyosidal ürünler ve Diğer biyosidal ürünler) ve 23 ürün tipi altında toplanmıştır

1. Ana grup Ürün Tipi 1 olarak sınıflandırılan ve insan hijyeni için kullanılan biyosidal ürünlerin deri irritasyon testlerinin gerçekleştirilmesi gerekmektedir.

Deri irritasyon testleri, dermal toksisite çalışmalarında lokal toksisitenin değerlendirilmesinde en yayın kullanılan testlerdir.

3. Ana grup Ürün tipi 14 olarak sınıflandırılan rodentisitler için rodentisit etkinlik testlerinin yapılması gerekmektedir.

Deri irritasyon ve Rodentisit etkinlik testleri

13.12.2011 tarih ve 28141 sayılı Resmi Gazetede yayınlanan “Deneysel ve Diğer Bilimsel Amaçlar için Kullanılan Hayvanların Refah ve Korunmasına Dair Yönetmelik” kapsamında alınmış çalışma izni bulunan laboratuvarlarda

Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurul (HADYEK) Onayı ile gerçekleştirilmektedir.

Deri İrritasyon Testi

Yaygın olarak in vivo koşullarda gerçekleştirilmektedir.

Draize Metodu (Draize et al., 1944), bu yöntemin prensibinde hazırlanan OECD Yönergesi No:404, veya uluslararası geçerliliği kabul edilen standartlar kullanılmaktadır.

Yöntem ürünlerin insanlar tarafından güvenle kullanımından önce hayvan modelleri üzerinde akut dermal toksisitesinin değerlendirilmesi amacı ile geliştirilmiştir.

Akut dermal çalışmalar, lokal etkiler (özellikle deri irritasyonu ve korozyonu) üzerine bilgi sağlamak üzere dizayn edilmiştir.

Bu prosedürde dermal irrtasyon, ödem (inflamasyon) ve eritem (kızarıklık) ile karakterize edilmiştir.

Draize, J.H., Woodward, G., Calvary, H.O., 1944. Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. J. Pharmacol. Exp. Ther. 82, 377–390.

Lokal toksisitenin değerlendirilmesinde test insan maruz kalım şekline benzer şekilde dizayn edilmekte ve deney hayvanı olarak tavşanlar kullanılmaktadır. Çünkü;

İnsan derisi ile karşılaştırıldığında kısmen duyarlı cilt tavşandadır ve insandaki irritasyon tahmin edilebilir

Bu tür ile daha büyük türlere göre daha kolay çalışılabilir

Tavşan derisi yüksek geçirgenliğe sahiptir

Hassastır

Hızlı cevap alınabilir

Draize etal.(1944), deri irritasyonunun kantitatif değerlendirilmesi için bir prosedür ortaya koymuştur

İnflamatuar dermal reaksiyon oluşturan bir maddenin aynı zamanda primer lokal irritant bir madde olduğu kabul edilmiştir

Çalışma Dizaynı ve Prosedürü;

24 h öncesinde abdomen bölgesi tıraşlanmış (6 cm2) 1 erkek ve 1 dişi hayvana test materyali uygulanır.

Maksimum uygulama dozu; sıvı maddeler için 0,5 mL; katı maddeler için 0,5 g’dır.

Her tavşan kendi grubunun kontrolü olur.

Hayvanlar 1, 24, 48 ve 72. saatler boyunca gözlem altında tutulurlar.

Uygulamadan sonra dermal korozyon meydana gelirse test sonlandırılır (madde korrozive olarak sınıflandırılır)

Süre sonunda Draize Dermal Skorlama Sistemi’ ne göre skorlama yapılır

Eritem ve ödem skorlarının ortalamalarının toplamı ile primer dermal irritasyon indeksi (PDII) hesaplanır

Uygulama sonrası herhangi bir kızarıklık, eritem, yara veya ödem gözlenmeme durumu (PDII = 0)

Deneysel ve Diğer Bilimsel Amaçlar İçin Kullanılan Hayvanların Refah ve Korunmasına Dair Yönetmelik, Sayı : 28141 Kabul Tarihi:13.12.2011 –MADDE 23: Hayvanların Tekrar Kullanımı

1. Prosedür şartlarının, üzerinde herhangi bir prosedür uygulanmamış olan farklı bir hayvanın kullanılmasına izin verdiği durumlarda, daha önce bir ya da birkaç prosedürde kullanılan bir hayvanın tekrar kullanılması aşağıdaki şartlara bağlıdır:• Daha önceki prosedürlerin gerçek şiddeti hafif veya orta ise,• Hayvanın genel sağlık durumu ve afiyeti tamamen eski haline dönmüşse,• Yeni prosedür hafif, orta veya düzelmez olarak sınıflandırılmışsa,• Hayvanın ömür boyu deneyimini de dikkate alan veteriner hekimin

uygun görüşü mevcutsa.

2. Hayvanın veteriner hekim tarafından muayene edilmesinden sonra, şiddetli ağrı, eziyet veya eşdeğerini içeren bir prosedürde birden fazla kullanılmaması koşuluyla birinci fıkranın (a) bendindeki hayvanların tekrar kullanılmasına yerel etik kurullarca izin verilebilir.

Dünya genelinde her yıl milyonlarca deney hayvanı çeşitli araştırmalarda kullanılmaktadır.

Bu yüksek rakamlar;

gerek bilimsel araştırmalarda, gerekse ruhsatlandırma çalışmalarında deney hayvanlarının kullanımının azaltılması,

hayvan refahının dikkate alınması,

mümkün ise in vivo yöntemler yerine deney hayvanlarının kullanılmadığı in vitro yöntemlerin tercih edilmesi,

görüşünün yaygınlaşmasını desteklemektedir.

Russell ve Burch Kuralları (1959)

Hayvanlar Üzerinde Yapılan Bilimsel Çalışmalarda 3R Kuralı

1.Replacement (Alternatif yöntemler kullanılması)

2.Reduction (Sayının azaltılması)

3.Refinement (Ağrı, acı vb. den arındırılması)

4.Responsibility (Sorumlulukların bilinmesi)

Russell, WMS and Burch, RL (1959) The Principles of Humane Experimental Technique. Methuen, London. Reprinted by UFAW, 1992: 8 Hamilton Close, South Mimms, Potters Bar, Herts EN6 3QD England.

Replacement yani “Deney hayvanlarının yerine alternatif yöntemler tercih edilmesi” kavramı iki kısımda incelenir;

1. “Full Replacement” hiçbir koşulda deney hayvanı kullanılmaması durumudur (insan gönüllüleri, in vitro hücre kültürleri, matematik ve bilgisayar modellemeler vb)

2. “Partial Replacement” kapsamında (Drosophila, nematodlar, amipler gibi omurgasız canlılar vb)

In vivo testlere alternatif yöntemlerin geliştirilmesi ve validasyonunun değerlendirilmesi için;

ICCVAM (The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) 1997 de oluşturulmuştur

In vivo deri irrirasyon testlerine alternatif yöntemlerin geliştirilmesi ve validasyonu Avrupa Birliği direktifleri doğrultusunda ECVAM (European Center for the Validation of Alternative Methods) tarafından yürütülmektedir.

Kullanılan yöntemlerden bir kısmı ECVAM tarafından valide edilmiştir.

Hayvanlara daha az bağımlılığın olması,

objektif son noktaların ortaya konması,

toksikolojik mekanizmaların daha iyi anlaşılması,

kısa sürede daha fazla test imkanı sağlaması,

uzun vadede daha az gider oluşması,

yeni alternatif yöntemlerin geliştirilmesi için avantaj sağlamaktadır.

In vitro ve Ex vivo Deri İrritasyon & Korozyon Testleri

Deri irritasyon testi için kullanılan alternatif yöntemler;

1. insan derisi esas alınarak gerçekleştirilen testler

2. hayvan derisi kullanılan testler

olmak üzere 2 kısımda incelenebilmektedir.

1. İnsan deri modeli esas alınarak gerçekleştirilen testler

In vitro deri irritasyon test sistemi, insan derisinin fizyolojik ve biyokimyasal yapıları esas alınarak oluşturulan bir prototiptir.

Model, histolojik yapı bakımından in vivo insan epidermisi ile aynı yapıya sahip ve in vitro çalışmalara imkan veren transformeolmamış keratinositlerden oluşmuştur.

Bu modellerin ECVAM tarafından valide edilmiş kitleri ile yapılan analizlerde hayvan kullanımının azalması ve daha kısa sürede kesin sonuçlar elde edilmesi hedeflenmiştir.

İnsan derisi kullanılan yöntemler olan EpiDerm TM SIT, EpiSkin TM, SkinEthic TM RHE vb. model olarak insan epidermal keratinositlerinden elde edilen 3 boyutlu dokular kullanılır.

In vivo ve in vitro RhE Modeli

Bu modeller, stratum corneum tabakasının altında stratum lucidum, stratum granulosum, stratum spinosum ve en altta stratum bazale epitel hücre katmanlarını içerecek şekilde üç boyutlu (multilayers) insan epidermal (RhE, Reconstructed Human Epidermis) yapılarından oluşmaktadır.

OECD Guidelines No: 439, (2013). In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method.

Test prosedürleri kapsamında insan derisinin kit içeriğinde yer alan ve valide olması gereken parametreler;

Canlılık: Çalışma sonucunda canlı hücre miktarı MTT testi ile belirlenmektedir (OECD No:439’da negatif kontrol için OD limit değerleri verilmiştir).

Bariyer fonksiyonu: Stratum corneum ve lipit kompozisyonu kimyasalların penetrasyon hızına karşı yeterli olmalıdır.

Morfoloji: RhE modeli, multilayered stratum corneum tabakası dahil olmak üzere insan epidermisiyle aynı yapıya sahip olmalıdır.

Tekrarlanabilirlik: RhE modelinde pozitif ve negatif kontrol sonuçları validasyon kriteleri açısından tekrarlanabilir olmalıdır.

Kalite kontrol: Kullanılan her deri modelinde yukarıda verilen parametrelerin ve IC50 değerlerinin tanımlanmış olması gerekmektedir.

Bu modellerden EPISKINTM ve EPIDERMTM (EPI-200) validasyon çalışmalarında kimyasal ve kimyasal karışımları denenmiş ve elde edilen sonuçlar;

doğruluk %83 (50/60) %92 (22/24)

duyarlılık %82 (23/28) %92 (11/12)

spesifiklik %84 (27/32) %83 (10/12)

hatalı pozitif oranı %16 (5/32) %17 (2/12)

hatalı negatif oranı %18 (5/28) %8 (1/12)

ICCVAM Evaluation of EPISKIN™, EpiDerm™ (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals, 2002

EPISKIN TM Model

Hayvan testlerine alternatif olarak kullanılan en geçerli yöntemdir. Test kapsamında;

Dokuların uygun koşullarda laboratuvara getirilmesi

Test maddesinin, pozitif ve negatif kontrollerin uygulanması

Dokulardan test maddesinin 15 dk sonra uzaklaştırılması

Epidermal örneklerin post-inkübasyonu

MTT testinin gerçekleştirilmesi

Sonuçların değerlendirilmesi

Statement on the validity of in vitro tests for skin irritation, (2007). ESAC, ECVAM. The In Vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model within the Framework of the ECVAMValidation Process, (2005). Cotovio, Grandidier, Roguet ATLA 33, 329-349.

In vivo çalışmalara en yakın sonuçlar bu modeller ile sağlanmakta olup sonuçlar MTT testi ile değerlendirilir.

CORROSITEX® Assay

Kimyasalların korrozivitesinin belirleyen in vitro test sistemidir. Yöntem, bir Patentli bir biyo-membranın korrozif kimyasal maddelere maruz kaldığında meydana gelen renk değişiminin kimyasal belirlenmesi üzerine kuruludur.

2. Hayvan derisi kullanılarak gerçekleştirilen testler

Transcutaneous Electrical Resistance Assay (TER)

TER testi deride meydana gelen irritant veya korroziv etkiyi belirlemek için kullanılan ex vivo bir yöntemdir.

Test prosedüründe hayvanların seçimi ve hazırlanması sonrasında deri parçalarının çıkarılarak in vitro sistemin hazırlanması yer almaktadır.

• OECD Guidelines No: 430, (2013). In vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test Method (TER).

• Protocol for Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance: an In vitro Assay for Assessing Dermal Corrosivity, ECVAM, (2002).

Skin Integrity Function Testi (SIFT)

Maddelerin deri irritasyon potansiyelinin değerlendirilmesine yönelik bir ön tarama sistemi olarak geliştirilmiştir.

Fare derisinde gerçekleştirilen ve irritasyonu ölçen bir metottur.

Kimyasal maddeye maruziyeti takiben fare derisinin bütünlüğünün değerlendirilmesi esasına dayanır.

Trans-epidermal su kaybı (TEWL) ve elektrik direnci (ERA) ölçülerek değerlendirme yapılmaktadır.

TEWL ya da ERA için, uygulama öncesi ve sonrası değerlerin oranı beş kattan daha büyük ya da daha küçükse, bu durumda kimyasal “irritant” ya da “irritant değildir” olarak değerlendirilmektedir.

Heylingsa JR, et al (2003). A prevalidation study on the in vitro skin irritation function test (SIFT) for prediction of acute skin irritation in vivo: results and evaluation of ECVAM Phase III, Toxicology in Vitro, 17, 123–138.

Rodentisit Etkinlik Testleri

Testlerde kullanılan tür seçimi değişkenlik göstermekle birlikte ülke faunasına spesifik seçimlerde yapılabilir.

Laboratuvar ya da semi-natural çalışmaları sırasında kolay elde edilebilirliği ve kullanılabilirliği bakımından laboratuvar suşları kullanılabilir.

Dişi ve erkek hayvanlar birlikte kullanılmalıdır.

Mus musculus L. (House mouse)

Rattus norvegicus B. (Brown rat)

Rattus rattus L. (Roof rat)

Rodentisit Etkinlik Testleri 2 ana gruba ayrılır;

I. Mortalite Testi (Mortality test, No Choice)

II. Tercihli Yemleme Testi (Choice feeding test)

1. Mortalite Testi (No choice):

Çalışmanın amacı ürünün, öldürücü etkisinin (letal etki) ortaya konmasıdır.

Tek 1 hayvana seçim şansı olmadan ürün uygulanır ve hayvanlar bireysel olarak ayrı ayrı kafeslerde tutulurlar.

Çalışma süresi 10 ile 21 gün arasındadırGenellikle 7 günden önce etkinlik gözlendiği için 24 saatten

başlayarak hayvanda mortalitenin tespit edildiği zaman dikkate alınmalıdır.

Deneme süresince, Hayvanların ağırlık ölçümleri Genel sağlık durumları Gözlemlenen diğer semptomlar (zehirlenmeye bağlı) Yem ve ürün tüketimi Ölüm zamanı kayıt altına alınmalıdır.

Çalışma mekanizmalarına göre 3 gruba ayrılırlar;

Akut Etki: Uygulamadan 24 saat sonra gözlenen letal etkidir.

Multi Doz Etkisi: Birkaç kez ürün uygulamasından sonra 3-21 gün arasında görülen letal etkidir.

Tek Doz ile Gecikmiş Etki: 1 ya da 2 gün uygulamanın ardından 3-14 gün içinde görülen letal etkidir.

Ölüm periyodu 24 saatten başlayarak 21 güne kadar sürebilir.

2. Tercihli Yemleme Testi:

Amaç ürünün lezzetliliğinin (palatability) ortaya konmasıdır. Ürün geliştirme safhasında tercih edilen test metodudur.Eğer hem taze hem de eskimiş ürün ile çalışma yapılırsa ürüne

ilişkin depolama kalitesi ve stabilitesi hakkında da önemli veriler elde edilir

Bu çalışmanın tercihen yaban tipi hayvanlarla gerçekleştirilmesi önerilmektedir.

Test prosedüründe hayvana aktif madde içermeyen yem ile (nonpoisoned challenge diet) aktif madde içeren ürün verilir ve hayvanın seçim süreci takip altına alınır.

Hayvanların ağırlık ölçümleri Genel sağlık durumları ve gözlemlenen semptomlar Yem ve ürün tüketimi Lezzetlilik oranı (amount of product:amount of challenge diet)

kayıt altına alınmalıdır.

Deneysel Dizayn

Çalışmalarda sağlıklı, yetişkin ve 25 gr’dan az olmayan fare ve 180 gr’dan az olmayan sıçan farklı eşeylerden (5 dişi – 5 erkek) kullanılmaktadır.

Hayvanlar minimum 3 gün boyunca yaşadıkları ortama alıştırılırlar ve günlük standart pellet yem ile beslenirler.

3. günün sonunda her hayvanın normal şekilde beslendiği ve ne kadar yem tükettiği kayıt altına alınır.

Eğer düzgün beslenmeyen hayvan var ise denemeden çıkartılır.

Test periodunun başında hayvanların günlük yemi uzaklaştırılır ve biyosidal ürün (rodentisit) verilir.

Test boyunca her 24 saatte dökülen ürünler toplanır ve dışkı gibi artıklar ortamdan uzaklaştırılır (Kullanılan altlıklar önemlidir).

Tüketilen ürün miktarı kayıt altına alınır.

Eğer çalışma 1 günlük ise, gözlem periyodu boyunca ürün kaldırılır ve yerine pellet (laboratuvar yemi) koyulur.

Uzun süreli etkinlik çalışmalarında ise, ilk verilen ürün kaldırılır ve yerine aynı miktarda taze ürün eklenir.

Son gün (var ise) tüketilmemiş yem kaldırılır ve yerine gözlem periyodu boyunca pellet (laboratuvar yemi) koyulur.

Gözlem periyodu boyunca rodentler en az günde 1 (ideal 2 gün) kere kontrol edilirler.

Karşılaşılan bütün toksik semptomlar ve mortalite oranları kayıt altına alınır.

Gözlem periyodu boyunca kayıt altına alınan mortalite yüzdesi değerlendirilir.

Hayvanları % 90‘nından fazlasının ölmesi durumu göz önünde bulundurularak ürün etkinliği kayıt altına alınır.

TEŞEKKÜRLER…