TÖÖ 2. FLUORESTSEERUVAD ÜHENDID JA SEKUNDAARAINEVAHETUS TAIMEDES

_____________________________________________________________________________

Fluorestseeruvad ühendid taimedes kuuluvad põhiliselt nn. sekundaarainevahetuse produktide ja fotosünteesi pigmentide hulka. Sekundaarainevahetusena mõistetakse ainevahetusradasid, mis ei ole iseloomulikud kõikidele organismidele, vaid ainult teatud organismide rühmadele. Taimedes on üheks oluliseks sekundaarainevahetuse valdkonnaks fenoolsete ühendite ainevahetus. Fenoolsete ühendite hulka kuuluvateks loetakse aineid, mis sisaldavad molekulis ühe või mitme hüdroksüülrühmaga seotud benseeniringi. Fenoolsete ühendite klassifitseerimise üheks võimaluseks on jaotus süsiniku aatomite arvu alusel molekulis. Taimedes enamlevinud fenoolsete ühendite rühmad on järgmised:

C6-C1 e. C7 ühendid (näit. p-hüdroksübensoehape); C6-C3 e. C9 ühendid ( enamasti kaneelhappe derivaadid, näit. feerulahape); C6-C3-C6 e. C15 ühendid e. flavonoidid (näit. kvertsetiin). (C6-C3)n ühendid (ligniinid)

OH

CO O H

OH

C

O CH3

H CH CO O H

O O

O

O

O

O

H

OH

H

H

H

p-hüdroksü- feerulahape kvertsetiin bensoehape (C9 ühend) (C15 ühend) (C7 ühend)

OH

C

OH

H CH COO H

OH

CH CH COO H

kohvhape p-kumaarhape (C9 ühend) (C9 ühend)

klorogeenhape (kohv- ja kiinahappe ester) Ligniin on taimede rakukestadesse ladestuv polümeerne puitaine, mis tekib p-kumaar-,

feerula- ja sinaaphappe redutseerumisel moodustunud p-kumarüül-, koniferüül- ja sinapüülalkoholide oksüdatiivsel polümeriseerumisel peroksüdaasi (EC 1.11.1.7) toimel. Lisaks suurele hulgale benseenituumadele kuuluvad ligniini koosseisu metoksüül- (-OCH3 ) ja hüdroksüülrühmad, vähesel määral esineb ka karbonüül- ja aldehüüdrühmi. Ligniin ei ladestu kõikide rakkude seintesse. Põhiliselt esineb ta sekundaarseina omavates juhtkudede ja tugikudede rakkudes

Ligniini monomeerid

OH

CH CH CH2OH

O

O

H

CH CH CH2OH

CH3

O

OO

H

CH CH CH2OH

CH3

CH3

p-kumarüülalkohol koniferüülalkohol sinapüülalkohol

Fenoolsete ühendite laialdase leviku põhjuseks taimedes on nende osalemine mitmesugustes erinevates biokeemilistes ja füsioloogilistes protsessides: • puitaine (ligniini) biosünteesis (kaneelhappe derivaadid); • õite ja teiste taimeosade värvuse määramisel (flavonoidid); • kasvu ja arengu regulatsioonis (näiteks auksiini oksüdaasi inhibiitorite ja aktivaatoritena); • kaitses haigustekitajate, hapniku aktiivühendite ja ultraviolettkiirguse vastu; • organismidevahelistes allelopaatilistes reaktsioonides jne.

Fenoolsete ühendite süntees taimedes

Üldises fenoolsete ühendite biosünteesi rajas võib eristada kolme etappi (vt järgnevat joonist): 1. Aromaatsete aminohapete süntees šikimaatses rajas; 2. Fenüülpropanoidide (kaneelhappe derivaatide) biosünteesi rada; 3. Fenüülpropanoidide raja lõpp- ja vaheproduktidest lähtuvad sünteesirajad: ligniini monomeeride, flavonoidide, kumariinide jt fenoolsete ühendite rühmade süntees.

Juhtkudedega taimedel esineb unikaalne võime kasutada aromaatsete aminohapete süsikikskeletti suurte koguste erinevate fenüülpropanoidse struktuuriga (benseenirõngaga seotud kolmesüsinikulist karboksüülrühma sisaldavat külgahelat omavate) ühendite

CO

O

O

O

H OOH

H

H

C

O

CH C

OO

HH

H

sünteesiks. Taimede evolutsioonis kujunenud võime koloniseerida maismaa on seotud fenüülpropanoidsete ühendite ainevahetuse tekkimisega, eriti ligniini biosünteesi väljakujunemisega.

Fenüülpropanoidide biosünteesi rada on tihedalt seotud sahhariidide ja valkude ainevahetusega. Fenüülalaniini ja türosiini süntees saab alguse fosfoenoolpüruvaadist (glükolüüsi vaheprodukt) ja erütroos-4-fosfaadist (oksüdatiivse ja reduktiivse pentoosfosfaatide tsüklite vaheprodukt).

Valkude sünteesi intensiivsusest sõltub kui palju fenüülalaniini ja türosiini saab liikuda fenüülpropanoidide rajasse selle raja esimese ensüümi fenüülalaniini ammoniaak-lüaasi (PAL, EC 4.3.1.5) poolt katalüüsitavas reaktsioonis, mis eemaldab fenüülalaniini molekulist aminorühma kaneelhappe tekkega. Mida intensiivsem valgusüntees, seda vähem fenüülalaniini jääb fenoolsete ühendite sünteesiks. (Teatud taimedes võib PAL substraadiks olla ka türosiin, reaktsiooni produktiks on sellisel juhul p-kumaarhape.) Üldises fenüülpropanoidide rajas kaneelhappe struktuur modifitseerub mitmesugustes hüdroksüülumis- ja metüleerumisreaktsioonides, samuti moodustuvad erinevate fenüülpropanoidide CoA derivaadid.

Fenoolsete ühendite biosünteesi skeem

Fosfoenoolpüruvaat + erütroos 4-fosfaat DAHP (2-keto-3-desoksü-D-arabinoheptulosonaat-7-fosfaat) Korismaat Fenüülalaniin PAL (fenüülalaniini ammoniaak-lüaas)

O

R R

H

C

OHO

2 1

O

RR

H

CO

12

S - CoAH

Kaneelhape Kaneelhappe hüdroksüleeritud Kaneelhappe ja metüleeritud derivaadid CoA derivaadid Flavonoidid Ligniin Teised fenüülpropanoidid

C

OHO

Spetsiifilised hargnemisrajad

Šikimaatne rada

Fenüülpro- panoidide rada

Skeemil on esitatud šikimaatse raja ja fenüülpropanoidide raja olulisemad vahe- ja lõpp-produktid.

Koensüüm A seostumisega aktiveeritud fenüülpropanoidid võivad lülituda erinevatesse biosünteesiahelatesse. Kaneelhappe ja tema derivaatide redutseerumisel alkoholideks moodustuvad ligniini monomeerid. Kaneelhappe derivaatide seostumisel kolme malonüül-CoA molekuliga tekib flavonoididele iseloomulik täiendav benseenirõngas ja kolmetsükliline struktuur. Iga taime koostisesse kuulub tavaliselt kümneid erinevaid fenoolseid ühendeid.

Fluorestsentsmikroskoopia

Fluorestsentsiks nimetatakse neeldunud valguse väljakiirgumist. Fluorestsentsvalguse lainepikkus on alati suurem kui neeldunud valgusel, sest molekulis liikumisel läheb osa valgusenergiast kaotsi. Enamik fenoolsetest ühenditest fluorestseerub ultravioletse valguse toimel, sest benseenituuma neeldumismaksimum paikneb ultravioletses piirkonnas (~280 nm). Seetõttu kasutatakse rakkudes esinevate fenoolsete ühendite lokalisatsiooni ja kontsentratsiooni määramisel sageli fluorestsentsmikroskoopiat. Fluorestsentsmikroskoobi ehitus on samasugune kui tavalisel valgusmikroskoobil (vt töö 1), kuid valgusallikana kasutatakse ultravioletsete kiirte allikat, tavaliselt elavhõbedalampi või ksenoonlampi, ja läätsed peavad olema valmistatud ultravioletti läbilaskvast kvartsist. Et preparaadile langeks teatud konkreetse ühendi poolt absorbeeritav ultraviolettvalgus, asetatakse ergastusvalguse kiirte teele ainult teatud lainepikkust läbilaskev filter (nn ergastus- e eksitatsioonifilter). Fluorestsentsvalguse lainepikkus (värv), nagu neelduva valguse lainepikkuski, sõltub valgust neelava ühendi keemilisest ehitusest. Et mikroskoobis näha ainult teatud konkreetse ühendi fluorestsentsi, asetatakse fluorestsentsvalguse kiirte teele emissioonifilter, mis laseb läbi ainult kindla lainepikkusega fluorestsentsvalgust. Seega erinevaid eksitatsiooni- ja emissioonifiltreid kombineerides on võimalik jälgida ainult konkreetse ühendi (ühendite rühma) fluorestsentsi ja selle alusel ühendi lokalisatsiooni ja kontsentratsiooni määrata. Fluorestsentsi intensiivsus on proportsionaalne ergastusvalguse intensiivsusega ja fluorestseeruva aine hulgaga. Ultravioletne ergastusvalgus kõrvaldatakse filtrite abil, nii et silmani jõuab ainult preparaadist lähtuv pikemalainelisem fluorestsentsvalgus.

Ergastusvalguse ja fluorestsentsvalguse kiirte tee fluorestsentsmikroskoobis on näidatud joonisel 2.

Joonis 2. Ergastusvalguse ja fluorestsentsvalguse kiirte tee fluorestsentsmikroskoobis.

Mikroskoopimisel kasutatakse primaarset ja sekundaarset fluorestsentsi. Primaarne, looduslik fluorestsents ultravioletsete kiirte toimel esineb suhteliselt vähestel taimedes esinevatel ühenditel. Enamiku fenoolsete ühendite fluorestsents on lillakassinine (aga esineb ka kollaselt, roheliselt ja punaselt fluorestseeruvaid ühendeid). Ka rakukestadesse ladestuva puitaine e. ligniini fluorestsents on lilla ligniini koostises olevate kaneelhappe derivaatide tõttu. Klorofüll fluorestseerub punaselt, vitamiin A roheliselt, varuainetena rasvu sisaldavad rakud kollakalt jne.

Paljud ühendeid taimsetes rakkudes ei fluorestseeru UV kiirte toimel, sest ultravioletne kiirgus ei neeldu. Et oleks võimalik selliseid ühendeid ja neist moodustunud rakustruktuure jälgida fluorestsentsmikroskoobi vahendusel, kasutatakse nn. sekundaarset fluorestsentsi. Preparaat värvitakse fluorestseeruvate värvidega (fluorokroomide e fluorofooridega), mis antud ühendeid sisaldavatel struktuuridel absorbeeruvad. Fluorokroomi valik sõltub uuritava ühendi iseloomust ja uurimiseesmärgist. Üheks sageli kasutatavaks fluorokroomiks on akridiinoranž.

Tööülesanded

1. Fluorestsentsmikroskoopi kasutades määrata fluorestseeruvate ühendite lokalisatsioon. Õunapuu (Malus domestica Borkh.) võrse ristlõikudel määrata valgusmikroskoopi kasutades klorofülli ja vastavate värvimisreaktsioonide abil varuaineid (tärklist) ja ligniini sisaldavad anatoomilised struktuurid. Fluorestsentsmikroskoopi kasutades määrata klorofülli, tärklise ja ligniini primaarne fluorestsentsvärvus värvimata lõikudel ja sekundaarne fluorestsents akridiinoranžiga värvitud lõikudel. 2. Taimelehtedes esinevad fenoolsed ühendite paberkromatograafiline eraldamine. Kromatograafiat kasutades eraldada üksteisest fenoolsed ühendid ning testainete ja UV neeldumisspektrite abil teha kindlaks, millised konkreetsed ühendid taimede lehtedes esinevad. Töövahendid: fluorestsents- ja valgusmikroskoop, mikrotoom, prepareerimisvahendid, 0.01% akridiinoranži vesilahus, Lygoli lahus (2.0 g KJ ja 1 g J lahustatakse 5 ml vees ja viiakse 300 ml-ni), 5%-line floroglutsiini lahus etanoolis, 25%-line H2SO4, õunapuuvõrsed, ultrakemiskoop, kromatografeerimispaber, voolutuskamber, kapillaarpipetid, vooluti, fenoolsete ühendite 0.01%-lised etanoolilahused (p-kumaarhape, klorogeenhape, kohvhape, gentisiinhape, kvertsetiin), kartuli, tomati ja õunapuu lehtede etanooliekstraktid. Töö läbiviimine 1. Fluorestseeruvate ühendite lokalisatsiooni määramine fluorestsentsmikroskoobiga.

Mikrotoomiga lõigatakse õunapuu võrsest 20 - 60 µm paksused ristlõigud ja nendest valmistatakse 4 preparaati: a) värvitud 5 min Lygoli lahusega; b) värvitud 5 min akridiinoranžiga; c) värvimata preparaat vees; d) floroglutsiiniga värvitud preparaat.

Floroglutsiinireaktsiooni teostamiseks asetatakse alusklaasil paiknevale lõigule viieks

minutiks 2-3 tilka 5%-list floroglutsiini lahust etanoolis. Seejärel lisatakse 3-4 tilka 25%-list

väävelhapet ja lõigud kaetakse katteklaasiga. Oodata kuni moodustub intensiivne värvus. Puitunud rakukestad värvuvad vaarikapunaseks, sest floroglutsiin annab happelises keskkonnas ligniini koostises olevate aromaatsete aldehüüdidega purpurpunase värvusega kompleksühendi.

Preparaati a) vaadelda valgusmikroskoobis ja fikseerida varutärklise lokalisatsiooni piirkonnad. Preparaati d) vaadelda valgusmikroskoobis ja fikseerida, milliste kudede rakukestad on lignifitseerunud ja millistel mitte. Preparaate b) ja c) vaadelda fluorestsentsmikroskoobis. Värvimata preparaadis puitunud rakkude seinad ksüleemis ja niinekiudude kimbud floeemis fluorestseeruvad siniselt nendes lokaliseerunud fenoolsete ühendite tõttu, varuaineid sisaldavad rakud säsis (nn. tärklistupp) on kollase fluorestsentsiga, klorofülli sisaldavad rakud kooreosas fluorestseeruvad punaselt. (Klorofüllile iseloomulikku punast fluorestsentsi vaadata ka veetilka asetatud vesikatku lehel. Kasutada võib 40x objektiivi.)

Floroglutsiinireaktsioon

Koniferüülaldehüüd Floroglutsiin Koniferüülaldehüüdi ja floroglutsiini reageerimisel tekkinud punase värvusega ühend

O

OH

CH

+

O O

O

H H

H

CH CH CHO

+ HCl

CH

CH CH C+

O

OH

O

OOH

H

HH

Cl-

Joonis 3. Õunapuu (Malus domestica Borkh.) oksa ristlõik. 1-periderm; 2-kollenhüüm; 3- esikoore põhikude; 4-endoderm; 5-niinekiud; 6-floeem; 7-kambium; 8-teisksüleem; 9-säsikiir; 10-esiksüleem; 11-säsi (Kukk, 1996).

2. Fluorestseeruvate fenoolsete ühendite paberkromatograafiline lahutamine ja identifitseerimine.

Fenoolsete ühendite eraldamiseks taimsest materjalist ekstraheeritakse koonilistes kolbides 10 g tomati-, kartuli- ja õunapuulehti (värske materjal) 50 ml 96% etanooliga keeval vesivannil 20 minutit deflegmaatorit kasutades. Ekstrakt filtreeritakse ja säilitatakse külmkapis tihedalt suletud pudelites. Kromatografeerimispaberi lehe (19 x 27 cm) alumisest servast 2.5 cm kaugusele tõmmatakse hariliku pliiatsiga joon. Joon jaotatakse kaheksaks 1 cm pikkuseks lõiguks, mis paiknevad üksteisest võimalikult kaugel. Kromatografeerimislauda kasutades kantakse kapillaarpipettidega sellele joonele 1 cm pikkuste ribadena testainetena kasutatavad fenoolsed ühendid (p-kumaar-, klorogeen-, kohv-, gentisiinhape ja kvertsetiin). Igat testainet kantakse kromatogrammile individuaalse laiguna tõmmates kromatogrammil tähistatud kohta 15 triipu alglahust üksteise peale. Tomati, kartuli ja õunapuu lehtede etanooliekstrakti kantakse kromatogrammile eraldi laikudena kogus, mis vastaks 0.05g taimsele materjalile (~100µl). Alati enne järjekordse koguse pealekandmist lastakse laikudel kuivada. Ainete segu lahutuvus voolutis on seda parem mida kitsama ribana on laik peale kantud. Tuleb jälgida, et paber pealekandmise kohal ei saaks vigastada, sest see takistab vooluti ja ainete liikumist. Äärmiste laikude kaugus paberilehe servast peab olema vähemalt 1 cm.

Voolutuskambrisse valatakse 2 cm kiht voolutit ja lastakse kamber vooluti aurudega küllastuda. Fenoolsete ühendite paberkromatograafia jaoks sobiv vooluti on n-butanool-äädikhape-vesi (4:1:5 V/V). Vooluti komponentide kokku segamisel tuleb hästi loksutada ja voolutamiseks kasutada segu ülemist orgaanilist faasi. Faasid eraldatakse üksteisest jaotuslehtris tõmbekapi all.

Pärast testainete ja taimeekstraktide paberile kandmist asetatakse paberileht voolutisse vertikaalasendis, nii et ühendite laigud oleksid vooluti tasemest natuke kõrgemal. Voolutamine

lõpetatakse, kui vooluti front on paberi ülemisest äärest mõne cm kaugusel. Pärast voolutamist paber kuivatatakse tõmbekapi all ja vaadeldakse ultraviolettvalguses ultrakemiskoobiga. Pliiatsiga tähistatakse laikude piirjooned ja värvus, samuti vooluti liikumise kõrgus. Seejärel vaadeldakse kromatogrammi ammoniaagi aurudes ja registreeritakse, kas ainete fluorestsentsvärvus muutus või mitte. Värvuse muutus on põhjustatud benseenituumaga seotud hüdroksüülrühmade dissotsiatsiooniastme muutumisest aluselises keskkonnas. Taime ekstraktis esinev, oletatavalt teatud testainega identse ühendi laik lõigatakse välja, peenestatakse kääridega väikesteks tükkideks ja elueeritakse 1,5 ml 50% etanooliga 30 min lihvkaanega tihedalt suletud kaaluklaasides. Spektrofotomeetriga registreeritakse eluaadi neeldumisspekter lainepikkuste vahemikus 240 – 400 nm. Kontrollküvetis peab neeldumisspektri registreerimisel olema lahus, mis on saadud kromatogrammi ilma laikudeta piirkonnast väljalõigatud paberitüki elueerimisel 50% etanooliga.

Tulemused ja vormistus

Tööülesande 1 vormistamiseks pildistada kõik neli preparaati. Preparaadid a) ja d) pildistatakse nähtavas valguses, preparaadid b) ja c) ultraviolettvalguses. Pildistamiseks leitakse mikroskoobi vaateväljas, mis on nähtav arvutiekraanil, sobiv võrse ristlõigu piirkond. Kõik joonisel 4 kirjeldatud anatoomilised struktuurid peavad olema jälgitavad. Fotoaparaadi mälukaardi abil kantakse saadud fotod arvutisse kausta Praksipildid. Praktikumitööde vastamisel võib fotod esitada mälupulgal, värvilise väljatrükina või fotona. Joonise 4 abil jäetakse meelde oksa anatoomiline ehitus. Floroglutsiiniga värvitud lõigu alusel osatakse kirjeldada, millised anatoomilised struktuurid on lignifitseerunud ja millist fluorestsentsvärvust need struktuurid omavad värvimata preparaadis. Lygoli lahusega värvitud lõigu alusel osatakse kirjeldada, millistes kudedes on ladestunud varutärklis. Osatakse kirjeldada erinevusi primaarse (värvimata lõik) ja sekundaarse (akridiinoranžiga värvitud lõik) fluorestsentsi vahel näiteks klorofülli fluorestsentsi osas.

Tööülesande 2 tulemused esitada järgnevas tabelis.

Testaine või ühend taime ekstraktist

Rf Värvus UV-s

- NH3 + NH3 Kohvhape p – Kumaarhape Klorogeenhape Kvertsetiin Gentisiinhape

Kartuli (tomati, õuna) lehtede ühendid: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Tabeli andmete alusel (kokkulangev Rf, värvus, värvuse muutus ammoniaagi aurudes)

otsustatakse, milline kartuli, tomati või õunapuu lehtedes esinev ainelaik on üks testainetest. See laik viiakse uuesti etanoolilahusesse nagu on kirjeldatud eespool töö läbiviimise osas ja spektrofotomeetril registreeritakse neeldumisspekter. Spektrofotometreeritakse ka testaine neeldumisspekter. Taimeekstrakti ja testaine neeldumisspektritel fikseeritakse maksimumide ja miinimumide asukohad ja jälgitakse nende kokkulangevust. Testaine ja oletatava aine neeldumisspektrite kokkulangevus on täiendavaks kinnituseks aine identifitseerimisel.

Vastamisel esitatakse taimelehtedest saadud identifitseeritud ühendi

neeldumisspektri ja vastava testaine neeldumisspektri väljatrükid. Kasutades identifitseeritud ühendi ekstinktsioonikoefitsienti, arvutatakse ühendi

sisaldus 1g lehtede kohta (vt töö 4 fotomeetria alused), arvestades lahjendusi mis tekivad lehtedest homogeniseerimisest kuni spektri võtmise lahuse saamiseni. Ekstinktsioonikoefitsiendi väärtuse leidmiseks kasutatakse internetis olevat informatsiooni.

Küsimused 1. Mis on fluorestsents? 2. Millest sõltub fluorestsentsi intensiivsus ja värvus? 3. Miks on fluorestsentsmikroskoobi lahutusvõime suurem ja kui palju võrreldes

valgusmikroskoobiga? 4. Millised funktsioonid on fenoolsetel ühenditel taimedes? 5. Millised keemilise struktuuri iseärasused on iseloomulikud fenoolsetele ühenditele? 6. Kirjeldada fenoolsete ühendite sünteesiraja etapid.

7. Millist reaktsiooni fenoolsete ühendite sünteesis katalüüsib ensüüm fenüülalaniini ammoniaak-lüaas?

8. Millistest monomeeridest sünteesitakse ligniin? 9. Millel põhineb paberkromatograafiline ainete segu lahutamine üksikkomponentideks? 10. Mis on Rf ja miks seda kasutatakse? 11. Kui voolutamisel taimse ekstrakti teatud komponendid ei liigu stardipunktist edasi, kuidas

modifitseerida vooluti koostist, et tagada nende liikuvus? 12. Defineerige aine ekstinktsioonikoefitsient.