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TRANSCRIPT
Moodle: Biologia Molecularbiomol
UC: Biologia Molecular
Farmácia Noturno- 4 Termo
Profa. ILEANA RUBIO
e-mail: [email protected]
SemináriosMoodle:
Biologia Molecularbiomol
1- Transgênicos (animais ou plantas)- Defensores
2- Transgênicos (animais ou plantas) - Contra
3- Terapia Gênica - Defensores
4- Terapia Gênica - Contra
Programa
• PURIFICAÇÃO DE DNA/RNA
• ENZIMAS DE RESTRIÇÃO E MODIFICAÇÃO
• DNA LIGASE
• ELETROFORESE
• SOUTHERN BLOT
Mutações, número de
cópias do gene”: DNA
Pergunta do projeto:
o que vou estudar?
Dogma Central da Biologia
Expressão gênica: RNAm – Proteína
Localização celular: proteína
Atividade biológica: proteína
• Cultura de células (bacteriana- células humanas-
levedura etc).
• Amostra tecidos fresco e congelado
• Amostra de tecidos em blocos de parafina
• Sangue periférico
Material a ser utilizado
Programa
• PURIFICAÇÃO DE DNA e RNA
• ENZIMAS DE RESTRIÇÃO E MODIFICAÇÃO
• DNA LIGASE
• ELETROFORESE
• SOUTHERN BLOT
Relevância • Geralmente, a extração de DNA é o primeiro
passo de uma análise molecular:
– Identificação de organismos
– Diagnóstico de doenças
– Sequenciamento
– Clonagem
– Testes forenses
• Extração de RNA:
- Determinar expressão gênica
Considerações Iniciais
• Natureza do ácido nucléico
– DNA ou RNA
– Procarioto ou eucarioto
– Nuclear ou de organela
– Genômico ou plasmidial
• Quantidade
• Pureza
DNA
Cromatina
RNAm
RNAr
RNAt
DNA
• O DNA e RNAs estão localizados no interior das células
• Envolto por “todas” as estruturas celulares
• É necessário isolá-lo do conteúdo celular
DNA
cromossômico-
plasmidial
RNAr
RNAm
RNAt
Membrana plasmática
Parede celular
Cápsula
Citoplasma
Procarionte
Eucarionte
Estratégias de extração de DNA
• 1- Desintegração dos tecidos
• 2- Extração e Solubilização do DNA
• 3- Processo de purificação
– Fracionamento celular
– Extração com Fenol
– Processos cromatográficos
• Troca iônica
• Filtração em gel
• Afinidade
– Precipitação
1-Desintegração dos tecidos• Aumento da superfície de contato
• Usar “forças mecânicas” para romper a integridade
do tecido e expor as células
• Quanto menor o tamanho dos fragmentos do
tecido, maior será a
superfície de contato
e a exposição ao
tampão de extração
• Logo, mais eficiente
será a extração
2- Extração do DNA
• Tampão de Extração
• Tem a função de solubilizar os ácidos nucléicos
• Pode auxiliar na lise das células, núcleos e organelas
• Pode ocorrer simultaneamente ou não a desintegração (adição de Tampão de Extração antes ou após a desintegração)
2- Extração do DNA
• Tampão de Extração
• Principais constituintes
– Detergentes
– Proteases
– Quelantes de metais pesados
– Inibidores de nucleases
– Substâncias tamponantes
2- Extração do DNA• Tampão de Extração
• Detergentes
– Dissolvem os lipídios das membranas (celular e nuclear)
– Dissociam as proteínas dos ácidos nucléicos
– Inibem ação das nucleases (desnaturação)
Triton X-100 ou Nonidet P-40
n = 9 - 10
CH -C-CH -C3 2
CH3|
CH3
|
CH3
|
| |
CH3|
O(CH -CH 0) H2 2 n
brometo de N-cetil-N,N,N-trimetilamônio
(cetil = hexadecil) CTAB
CH - (CH ) - 3 2 15 N - CH3
CH3
|
CH3|+
-Br
deoxicolato de sódio
CH3
CH3
HO
HO
O- Na+
O
-
=
dodecil sulfato de sódio
lauril sulfato de sódio
SDS
Na+CH -(CH )3 2 11-O-S-O-
O
=
O
=
lauril
CH - (CH ) - 3 2 10 C - N - CH - C2
CH3
|
O
|O- Na+
=
O
=
lauroil sarcosinato de sódio
sarcosil
lauroil sarcosina
aniónicoNão iónicoRegião hidrofóbica
2- Extração do DNA• Tampão de Extração
• DetergentesHidrofílica
Hidrofóbica
Hidrofóbica
2- Extração do DNA• Tampão de Extração
• Proteases
– Clivam as proteínas que se ligam ao DNA e enzimas que
degradam DNA e outras proteínas.
(Pronase E ou Proteínase K)
• Inibidores de nucleases
– DNases
• A grande maioria depende de Mg2+ como cofator
• EDTA quelante Mg2+ e inibe ação das DNases
– RNases
• Muito estáveis
• Resistem a desnaturação térmica
• Não requerem cofatores
• Inibidores extremamente potentes DEPC (cancerígeno)
•Resultado: uma
“sopa” formada
pelos restos
celulares, ácidos
nucléicos e conteúdo
citoplasmático
3- Purificação do DNASolúvel (DNA) vs. Insolúvel
• O extrato é obtido separando-se
o material solúvel (DNA) do
material insolúvel (restos celulares)
– Centrifugação
– Filtração
3- Purificação de DNADNA vs. outros solutos
• Solventes orgânicos
• Fenol (pH8,0) / Clorofórmio
– Desnatura e extrai as proteínas
– DNA na fase aquosa
– Proteínas na fase orgânica
• Dificuldades
– Demorado
– Trabalhoso
– “Tóxico”
– Perde material
3- Purificação de DNA - Precipitação• Adição de sal (NaCl, NaOAc, NH4OAc, KOAc)
– Os cátions monovalentes se ligam aos grupamentos fosfato do
DNA, neutralizando suas cargas elétricas
– Evita a repulsão eletrostática entre as moléculas de DNA,
permitindo que elas se agreguem e precipitem
• Adição de álcool (etanol, isopropanol)
– O álcool promove a retirada das moléculas de água que revestem
os ácidos nucléicos, provocando a compactação das moléculas (grau de compactação: 9X)
– Maior compactação, maior agregação
• Incubação a -20ºC
– Diminui agitação das moléculas
– Facilita agregação
• Centrifugação (30 min, 10.000 rpm, 4°C) DNA pellet
3- Purificação de DNA
• Colunas de Troca Iônica(tipo aniônica - matriz com carga +)
• Sílica ou DEAE
• DNA se liga a sílica
• Lavagens sucessivas removem as “impurezas”
• DNA é eluído da coluna
• Comparação
– Mais rápido
– DNA mais puro
– Mais caro
Eluição
• O DNA (pellet ou coluna) deve ser dissolvido/eluído em
uma solução de baixa força iônica (água,TE)
• Esta solução pode conter RNase para destruir o
RNA presente
Plasmídios• Minipreparação Plasmidial
(MiniPrep)- bactérias
Solução I: TE (lavagem) +lisozima
digere certos carboidratos de alto peso
molecular da parede celular
Solução II: SDS+ NaOH quebra as
células e denatura todo o DNA
Solução III: AcK 3M pH~5 renaturação
diferencial dos plasmídios
Etanol Absoluto: Precipitação
Água + RNAse: resuspender o DNA
Sol I Sol II Sol III
Extração de RNA
• Controle da contaminação com RNases
– Exógena
• Manipulação: uso de luvas
• Soluções: tratamento com dietil-pirocarbonato (DEPC)
• Vidraria: queimar por 3 horas a 250°C
• Plásticos: descartáveis e livres de RNase
– Endógena
• Adição de Inibidores de Rnases
• H2O – DEPC
• Lise das células: Trizol
• Separação das fases: Cloroformio
• Precipitação: Isopropanol
Programa
• PURIFICAÇÃO DE DNA
• ENZIMAS DE RESTRIÇÃO E MODIFICAÇÃO
• DNA LIGASE
• ELETROFORESE
• SOUTHERN BLOT
Enzima de Restrição
• 1968: Arber descreve a presença das enzimas de restrição em extratos de E. coli
• 1970: Smith descreve a primeira enzimas de restrição que corta o DNA em um sítio específico
• 1971: Nathans obtém o primeiro mapa de restrição
“Smith, H. O. and K. W. Wilcox, “A restriction enzyme from Haemophilus influenzae: Purification and general properties” (1970) J. Mol. Biol. 51: 379-391.
Werner Arber1929
Daniel Nathans1928 - 1999
Hamilton O. Smith1931
“pela descoberta
das enzimas de
restrição e suas
aplicações nos
problemas de
genética
molecular“
Nobel de Fisiologia ou
Medicina - 1978
A Guerra Natural
• Bactérias vs. Fagos (bacteriófagos)
– Durante a infecção viral, para se defender, as bactérias
precisam destruir o DNA “invasor” dos fagos sem
afetar o seu próprio DNA
A Guerra Natural
• As bactérias desenvolveram um sistema de defesa
contra DNAs “invasores”
• Duas poderosas “Armas”
– As Enzimas de Restrição
– As Enzimas de Modificação
Enzimas de Restrição
• Enzimas que se ligam ao DNA e o cortam em sítios
específicos (sítios de restrição)
• Também chamadas de endonucleases porque
cortam o DNA internamente
Enzimas de Restrição• Cada espécie de bactéria tem a sua enzima de
restrição que reconhece um sítio específico
• Mais de 3.000 enzimas de restrição já foram identificadas EcoR1 enzima da Escherichia coli corta em
5’--- G-A-A-T-T-C ---3’
3’--- C-T-T-A-A-G ---5’
BglII enzima da Bacillus globiggi corta em
5’--- A-G-A-T-C-T ---3’
3’--- T-C-T-A-G-A ---5’
HindIII enzima da Haemophilus influenzae corta em
5’--- A-A-G-A-T-T ---3’
3’--- T-T-C-G-A-A ---5’
Exemplo: EcoRI
Gênero: Escherichia
Espécie: coli
Cepa: R
Enzimas de Modificação
• Para garantir que apenas
o DNA viral (“invasor”) será
degradado, a bactéria
modifica o seu próprio
DNA nos sítios que
serão atacados pela
enzima de restrição
• Sistema de Metilação
(A ou C)
Enzimas de Modificação• A bactéria destrói o DNA não-modificado com as enzimas de.
Restrição,
• enquanto o seu próprio DNA esta protegido por ação de
enzimas de modificação
Sequência de reconhecimento das Enzimas de Restrição
Só cortam
Corte na sequência de reconhecimento (4-6pb)
(palíndromo)
ou muito próximo
Disponíveis comercialmente
Cortam e metilam, Corte a 24-26 pb.
Reconhecem sítios não palindrômicos.
Não disponíveis comercialmente
Reconhece sítios bipartidos e corta a distância
Cortam e metilam
Não disponíveis comercialmente
Sítios de Restrição
• Tamanho: 4 a 8 pares de base
4
5
6
7
8
Recombinant DNA, Watson e col.
Sítios de Restrição
• Freqüência em que ocorrem:
onde n é o número de pares de base no sítio de restrição
4-base cutter: 44 = 256 bp
6-base cutter: 46 = 4,096 bp
8-base cutter: 48 = 65,536 bp
4n
Sítios de Restrição
• São “repetições invertidas” (Palíndromes- Maioria)
(comerciais)
– “socorram me em marrocos”
– “subi no onibus”
5’----- G - A - A - T - T - C ----3’
3’----- C - T – T - A - A - G ----5’
Sítios de Restrição
• Por que um palíndrome ?
• As enzimas de restrição
são dímeros formados por
2 subunidades idênticas
• O eixo de simetria da
enzima é o mesmo da
seqüência do DNA
Sítios de Restrição
• As enzimas de restrição cortam cada fita do DNA na
mesma posição do palíndrome
Sítios de Restrição• Os cortes das enzimas de restrição podem produzir
– Extremidades abruptas (bunt-ends)
– Extremidades coesivas (stick-ends)
Sítios de Restrição
• As extremidades coesivas podem ser– 5’- protuberantes (5’- overhangs)
– 3’- protuberantes (3’- overhangs)
5’- protuberante 3’- protuberante
Extremidades Compatíveis
5’….ACTGTACG GATCCGCTA….3’
3’….TGACATGCCTAG GCGAT….5’BamHI
5’….TGCTAGCG GATCCAATC….3’
3’….ACGATCGCCTAG GTTAG….5’BamHI
5’….ACTGTACGGATCCAATC….3’
3’….TGACATGCCTAGGTTAG….5’BamHI
Extremidades Compatíveis
5’….ACTGTACG GATCCGCTA….3’
3’….TGACATGCCTAG GCGAT….5’BamHI
5’….TGCTAGCA GATCTAATC….3’
3’….ACGATCGTCTAG ATTAG….5’BglII
5’….ACTGTACGGATCTAATC….3’
3’….TGACATGCCTAGATTAG….5’BamHI
BglIIx
EcoRV
5’….ACTGTACGATATCGCTA….3’
3’….TGACATGCTATAGCGAT….5’
Extremidades Abruptas
5’….ACTGTACGAT ATCGCTA….3’
3’….TGACATGCTA TAGCGAT….5’
EcoRV
Extremidades Abruptas
5’….ACTGTACGAT ATCGCTA….3’
3’….TGACATGCTA TAGCGAT….5’
“extremidades abruptas”(Podem se ligar com outras moléculas
de DNA com extremidades abruptas)
EcoRV
Extremidades Abruptas
Extremidades Abruptas
5’….ACTGTACGAT ATCGCTA….3’
3’….TGACATGCTA TAGCGAT….5’EcoRV
5’….TGCTAGCCCC GGGAATC….3’
3’….ACGATCGGGG CCCTTAG….5’SmaI
5’….ACTGTACGATGGGAATC….3’
3’….TGACATGCTACCCTTAG….5’EcoRV
SmaIx
1- DNA
2-Tampão ou Buffer específico da enzima
3- Enzima de restrição
1ul DNA (1ug)
2ul Tampão2 (10X)
1uL EcoRI (1U/uL)
16ul H2O
20uL
Incubar 2hs 37oC
Reação com enzima de Restrição
Concentração final na reação
Tampão= 1X
Enzima= máximo 10%
Programa
• PURIFICAÇÃO DE DNA
• ENZIMAS DE RESTRIÇÃO E MODIFICAÇÃO
• DNA LIGASE
• ELETROFORESE
• SOUTHERN BLOT
DNA Ligase (enzima de modificação)
• Quando moléculas de DNA com extremidades
coesivas se unem, apenas pontes de hidrogênio
são formadas entre os nucleotídeos
complementares
• Estas pontes de hidrogênio não são estáveis o
suficiente para serem permanentes
• A DNA Ligase une as extremidades das moléculas
de DNA e re-estabelece a ligação fosfodiester
Ligação Fosfodiester• 3´-hidroxila da desoxirribose (nt 1) + grupo fosfato (nt 2)
Base nitrogenadaFosfato
DesoxiriboseC3
C5
Programa
• PURIFICAÇÃO DE DNA
• ENZIMAS DE RESTRIÇÃO E MODIFICAÇÃO
• DNA LIGASE
• ELETROFORESE
• SOUTHERN BLOT
Eletroforese
• Definição
– Um método usado para separar macromoléculascomo ácidos nucléicos (DNA e RNA) e proteínas
– Método baseado na migração destas moléculas através de um “suporte” sob influência de um campo elétrico
– a velocidade de migração depende do tamanho, daforma e da carga elétrica total da molécula
Eletroforese
• A corrente elétrica ao passar
através do suporte cria um campo
elétrico
• O DNA tem carga negativa
(fosfatos) e por isso é repelido do
polo negativo (anodo) e atraído
pelo polo positivo (catodo)
• A corrente elétrica aplicada
força os fragmentos de ácidos
nucléicos a se mover através do
suporte
Biologia Molecular, Turner e col.
Eletroforese
• Aparato
– Cuba de eletroforese
– Fonte
– Rack do gel (barquinha)
– Pentes
Rack Pentes
Fonte
Cuba
Eletroforese
• Suporte
– Gel para separação dos
ácidos nucléicos
– Agarose ou Acrilamida
• Funcionam como
“esponjas” (polímero),
retardando a passagem
das moléculas conforme
seus tamanhos
Agarose
• Polissacarídeo linear
extraído de algas
• Repetições de Agarobiose
– D-galactose
– 3,6-anhydro L-galactose
• Substância gelatinosa, sólida
a temperatura ambiente
• Precisa ser aquecida para
gelificar
– Temp. fusão: 66°C
– Temp. gelificação: 30°C
D-galactose 3,6-anhydro L-galactose
Agarose
• Agarose solidificada é
porosa, permitindo a
migração dos ácidos
nucléicos
Scanning Electron Micrograph of Agarose Gel (1×1 µm)
Poli-Acrilamida• Poli-Acrilamida
– Acrilamida (linear)
– Bis-acrilamida (cross-linker)
• Possui poros menores
que a agarose
• Ideal par separação de
fragmentos pequenos
de DNA e proteínas
Eletroforese
• Tampão de Corrida
– Fornece a força iônica para passagem da
corrente elétrica
• Composição
– Agente Tamponante (Tris-HCl)
– Sal (Borato, Acetato, Glicina)
– Quelante (EDTA)
• Tampão TAE (Tris - Acetato - EDTA)
• Tampão TBE (Tris - Borato - EDTA)
• Tampão SB (Sódio - Borato)
Velocidade de migração
• A migração dos ácidos nucléicos
depende apenas do seu tamanho
• Moléculas menores migram mais
rápido que as moléculas grandes
• Vai depender também
– Intensidade do campo elétrico (voltagem)
– da força iônica do tampão de corrida
– da concentração do gel
(-)
(+)
Fazendo um gel de agarose
• O gel de agarose é preparado combinando-se
agarose (pó) e tampão
• O tampão é o mesmo que será utilizado na
eletroforese (tampão de corrida)
• Normalmente se usa concentrações de 1 a 3%
– p.e. gel 1% (1g de agarose + 100mL de tampão)
Agarose
Tampão
Fazendo um gel de agarose
• Agarose é insolúvel a temperatura
ambiente
• Precisa ser aquecida (>70°C) para ser
dissolvida (2min. microndas)
Fazendo um gel de agarose
• Esfriar o gel (~45°C)
• Derramá-lo no rack (“barquinha”)
• Evitar a formação de bolhas
• Colocar os pentes
– Os pentes devem ficar
submersos no gel
– Os pentes vão formar os
“poços” onde o DNA será
aplicado
Fazendo um gel de agarose
• Quando fria, a agarose
polimeriza (“gelificação”)
• 30-40 minutos
• Os pentes devem ser
retirados
Fazendo um gel de agarose
• Transferir o gel para a cuba de eletroforese
• Cobrir o gel com o Tampão de Corrida
Preparando as amostras
• Tampão de Amostra
– Glicerol (aumenta a densidade)
• permite que o DNA permaneça no
“poço”
– Corante (Azul de bromofenol ou Xileno Cianol)
• Permite a visualização das amostras
• Permite avaliar o tempo de corrida
Correndo a eletroforese
• Ao aplicar um campo
elétrico, as amostras irão
migrar em direção ao pólo
positivo
Correndo a eletroforese
• O corante migra junto com as amostras, permitindo a
visualização da corrida
(-)
(+)
DNA (-)
Corando o Gel
• Radiação
• Brometo de Etídio
– Corante fluorescente
visualizado quando excitado
por luz UV
– Intercalante de DNA
– Permite visualização do DNA
• Pode ser adicionado ao gel
(antes da gelificação) ou o gel pode
ser corado após a corrida
• Mutagênico
Alternativas para o Brometo de Etídio
• SYBR Gold
• SYBR Safe
• Gel Ready
• Ward’s - QUIKView DNA
Stain
• Carolina BLU Stain
• Vantagens
– Baratos
– Menos tóxicos
• Desvantagens
– Menos sensíveis
– Necessita maior quantidade
de DNA no gel
– Maior tempo de
coloração / descoloração
QuikVIEW stainSYBR Gold
Corando o Gel
• Submergir o gel na solução de
coloração
• Aguardar alguns minutos (20-30)
• Remover o excesso de
corante com água
Tamanho dos fragmentos de DNA
• Padrão de peso molecular (DNA Ladder )
– Fragmentos de DNA com
tamanhos conhecidos
• Permite a determinação do
tamanho dos fragmentos
de DNA submetidos a
eletroforese
100
200
300
1.650
1.000
500
850
650
400
12.000 bp
5.000
2.000
(-)
(+)
bromophenol blue
DNA
migration
3.000
4.000
Eletroforese
• É uma importante ferramenta da Biologia Molecular
• Pode ser usada para:
– identificar moléculas específicas de DNA obtidas após digestão
com enzimas de restrição
– Comparar genomas
– Ciência forense
Eletroforese
• Pode ser útil para a avaliação da
integridade de uma amostra de DNA
• DNA genômico de alta qualidade
– >95% alto peso molecular
– Banda intacta próxima ao topo do gel
– Pouca evidência de fragmentos
pequenos (smear)
Avaliar se a reação funcionou
Programa
• PURIFICAÇÃO DE DNA
• ENZIMAS DE RESTRIÇÃO E MODIFICAÇÃO
• DNA LIGASE
• ELETROFORESE
• SOUTHERN BLOT
Como?
Como saber se uma determinada
seqüência de DNA esta presente
no genoma de um organismo?
Como determinar o número de
cópias de um dado gene no
genoma de um organismo?
Southern Blot
• 1975: Edwin M. Southern
– Eletroforese em Gel + hibridização
• Southern Blot
– Para análise de DNA
– Geralmente utilizada para determinar presença, tamanho e
numero de cópias
Hibridização de DNA
Por: 1-Aumento de temperatura; 2- PH extremo de pH (pH alcalino)
Renaturação: ocorre quando se volta às condições físico químicas
iniciais (lentamente)
Quanto maior a
porcentagem de pares
GC, mais difícil é a
desnaturação
Temperatura de melting
Temperatura na qual 50% do DNA está denaturado
TM = 2°C(A+T) + 4°C(G+C)
Moléculas pequenas
Southern Blot – Parte I (Gel)
• Extrair o DNA do organismo
• Digerir o DNA com uma Enzima de
Restrição
– Corte freqüente (sítio de restrição = 4nt)
• Sau3A1 - a cada 256 nt
• Genoma humano – 3.3 bilhões de nt
• ~12 milhões de fragmentos gerados
• Eletroforese em gel de agarose
– “Smear” (arrasto)
Southern Blot – Parte II (Transferência)
• Os fragmentos de DNA devem ser transferidos para uma
membrana (nylon ou nitrocelulose) com afinidade pelo DNA (carga +)
• O gel é imerso em uma solução alcalina para desnaturar as
moléculas de DNA
• Recoberto pela membrana e por papel absorvente (sanduíche)
• A solução de transferencia passa através do gel (capilaridade) e
“arrasta” o DNA para a membrana
Southern Blot – Parte III (Hibridização)
• Para identificar um fragmento específico é necessário usar
uma sonda que o reconheça
• Sonda – pequeno fragmento simples-fita de DNA
complementar a região de interesse
• A sonda deve ser marcada com radiação (32P)
CAGTATACACAAGTACCGTACCTGGCTCAGTTATACGCCGA
GTCATATGTGTTCATGGCATGGACCGAGTCAATATGCGGCT:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::
ATGGCATGGACC::::::::::::
Sonda marcada*
Southern Blot – Parte III (Hibridização)
• A membrana contendo o DNA é
incubada com a sonda
• A sonda irá parear com a região
complementar a sua seqüência (região de interesse)
• O excesso de sonda é removido
através de lavagens sucessivas
• A membrana é exposta com um
filme de Raio X (Auto-radiografia)
Southern Blot – Parte IV (resultado)
DNA corado com
brometo de etídio
Auto-radiografia da
membrana hibridizada
Digestão com Enzimas
de RestriçãoEletroforese Transferência
Remover excesso
de sonda
Membrana
Filme
Solução
alcalina
Esponja
Gel
Membrana
Solução
contendo a
sonda
Hibridização com sonda radioativa Auto-radiografia
DNA +
enzima de restrição
Fragmentos
de restrição
Expor com Filme
de Raio X
Southern Blot
Northern Blot
• “Não foi inventado por uma pessoa chamada Northern”
• Semelhante ao southern blot, só que no gel são submetidas a eletroforese amostras de RNA e não de DNA
• Utilizado na análise de RNAs
• Geralmente utilizada para determinar
– o tamanho de um transcrito
– a presença de um transcrito (tecido-especificidade ou distribuição temporal)
– a quantidade de transcrito produzido (nível de expressão gênica)
• Sonda: fragmento de DNA (sem íntrons) ou de RNA
• O RNA deve ser desnaturado (evitar estrutura secundária)
• A eletroforese deve ser em condições desnaturantes
Northern BlotGel de agarose corado com brometo de etídio
Auto-radiografia após hibridização com sonda redioativa
• Avaliando a presença de
um transcrito em
diferentes tecidos de
um organismo (expressão
gênica espacial)
Northern Blot
• Avaliando a quantidade
de transcrito produzido
em um determinado
tecido ao longo do
tempo (expressão gênica
temporal)
após tratamento com fator
de diferenciação celular
12 h 48 h 96 h
Westhern Blot
• “Não foi inventado por uma pessoa chamada Westhern”
• Semelhante aos Southern e Northern blots, só que no gel são
submetidas a eletroforese amostras de proteínas e não de
DNA ou RNA
• Utilizado na análise de PROTEÍNAS
• Geralmente utilizada para determinar
– o tamanho de uma proteína
– a presença de uma proteína
– a quantidade uma proteína produzida
– A integridade de uma determinada proteína
• Sonda: anti-corpo
Westhern Blot
• Avaliando a presença de
uma proteína em diferentes
tecidos e a sua integridade
tum
or 1
norm
al
tum
or 2
tum
or 3
p53
tubulin
Exercícios1- Você gostaria de analisar os níveis de expressão do gene que
codifica a proteína A de um fungo em resposta ao estresse
hipertérmico. Que metodologias poderia utilizar?
2- Escreva como prepararia as soluções para extrair DNA de
plasmídio de bactéria (miniprep).
As soluções pedidas no protocolo são as seguintes:
Sol I: 50mM de Glicose (PM 180,16g/mol), 10mM EDTA (PM 372.24),
25mM TRIS pH 8.
Sol II: 0,2M NaOH, 1% SDS
Sol III: NaAc 3M pH4.8, ajustar com ácido acético glacial.
O laboratório possui as seguintes soluções em stock: TRIS pH8 1M;
SDS 0,5M; os outros reagentes estão em pó.
3- Você fez uma digestão com BamHI e outra com BamHI e SspI
(ambos sítios únicos) do plasmídio pUC18.
Quantas bandas você espera após uma eletrofores em gel de
agarose, qual é o tamanho de cada uma delas
1- Inócular a bacteria contendo o plamídio em 3mL de meio de cultura
2- No dia seguinte tranferir 1,5mL para tubo epp
Centrifugar 30 seg 12000rpm
Descarta o sobrenadante
3- Adicionar 300ul sol 1 (TE) (resuspender)
4- Adicionar 300ul sol 2 (NAOH)
Inverter 4 X
Incubar 5 min Temp Amb
5- 300ul sol 3 (KAc 3M pH=5)
Inverter 4 X
Incubar 5 min gelo
6- Centrifugar 10 min 12000rpm 4oC
7- Transferir o sobrenadante para tubo limpo
8- Purificar por coluna, precipitação
Plasmídios Minipreparação Plasmidial (MiniPrep)
3mL
1,5mL