técnicas de laboratório de imunologia
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Técnicas de Laboratório Técnicas de Laboratório de Imunologiade Imunologia
Natalya Zaidan Maluf Natalya Zaidan Maluf Patologia Clínica/Medicina Patologia Clínica/Medicina
LaboratorialLaboratorialHSP-UnifespHSP-Unifesp
IMUNOENSAIOSIMUNOENSAIOS Podem ser utilizados na detecção de Podem ser utilizados na detecção de
antígenos ou de anticorposantígenos ou de anticorpos Atualmente podem detectar quantidades Atualmente podem detectar quantidades
ínfimas de antígenos presentes no sangue ínfimas de antígenos presentes no sangue da ordem de 0,1pg/mL ou até menosda ordem de 0,1pg/mL ou até menos
Antígenos: qualquer substância que Antígenos: qualquer substância que apresente sítio antigênico (epítopos) apresente sítio antigênico (epítopos) capazes de induzir a produção de capazes de induzir a produção de anticorpos correspondentes – haptenos, anticorpos correspondentes – haptenos, hormônios, proteínas, glicoproteínas, hormônios, proteínas, glicoproteínas, glicolipídeos, outros produtosglicolipídeos, outros produtos
Anticorpos: Imunoglobulinas – proteínas Anticorpos: Imunoglobulinas – proteínas plasmáticas – IgM, IgG, IgA, IgD e IgEplasmáticas – IgM, IgG, IgA, IgD e IgE
IMUNOENSAIOSIMUNOENSAIOS
Classificação de Imunoensaios:Classificação de Imunoensaios:1.1. Imunoensaios de precipitação – Imunoensaios de precipitação –
NefelometriaNefelometria2.2. Imunoensaios de PartículasImunoensaios de Partículas3.3. RadioImunoensaiosRadioImunoensaios4.4. Enzima imunoensaiosEnzima imunoensaios5.5. Imunoensaios fluorescentesImunoensaios fluorescentes6.6. Imunoensaios quimioluminescentesImunoensaios quimioluminescentes
Imunoensaios de PrecipitaçãoImunoensaios de Precipitação Complexos Ag-Ac grandes que formam Complexos Ag-Ac grandes que formam
partículas insolúveis (precipitados)partículas insolúveis (precipitados) Especificidade é boaEspecificidade é boa È uma técnica simplesÈ uma técnica simples Mas sensibilidade continuam inferiores a 0,1 Mas sensibilidade continuam inferiores a 0,1
a 0,5 mg/dLa 0,5 mg/dL Fatores de interferência: proporção relativas Fatores de interferência: proporção relativas
de reagentes, condições de temperatura, pH de reagentes, condições de temperatura, pH e força iônica do meio, afinidade e avidez e força iônica do meio, afinidade e avidez dos anticorposdos anticorpos
Leitura do imunoprecipitado pela dispersão Leitura do imunoprecipitado pela dispersão da luz na turbidimetria ou nefelometriada luz na turbidimetria ou nefelometria
NEFELOMETRIANEFELOMETRIA
Método direto de medida do espalhamento Método direto de medida do espalhamento de uma luz incidente, em um determinado de uma luz incidente, em um determinado ângulo, causado por partículas em ângulo, causado por partículas em suspensãosuspensão
Analisadores da BehringAnalisadores da Behring Analisadores da BeckmanAnalisadores da Beckman Imunoglobulinas, componentes do Imunoglobulinas, componentes do
complemento, fator reumatóide, fatores complemento, fator reumatóide, fatores da coagulação, proteína C reativa, da coagulação, proteína C reativa, imunocomplexos ou hormônios, drogas, imunocomplexos ou hormônios, drogas, entre outros.entre outros.
Imunoensaios de PrecipitaçãoImunoensaios de Precipitação
TurbidimetriaTurbidimetria Método de medida da diminuição da Método de medida da diminuição da
intensidade da luz transmitida através de intensidade da luz transmitida através de uma suspensão de partículasuma suspensão de partículas
Cobas Bio e Mira Plus, RocheCobas Bio e Mira Plus, Roche Dimension, Dade InternationalDimension, Dade International BM/Hitachi 911, BoehringerBM/Hitachi 911, Boehringer Utilizado para dosar antígenos, anticorpos, Utilizado para dosar antígenos, anticorpos,
lipoproteínas, proteína C reativa, lipoproteínas, proteína C reativa, albumina, pré-albumina, hemoglobina A, albumina, pré-albumina, hemoglobina A, teofilina, gentamicina, digoxina, teofilina, gentamicina, digoxina, tobramicina, entre outros.tobramicina, entre outros.
Imunoensaio de PartículasImunoensaio de Partículas Detecção de anticorpos nas amostras com Detecção de anticorpos nas amostras com
antígenos específicos sensibilizados com uma antígenos específicos sensibilizados com uma partícula (aglutinação passiva ou indireta)partícula (aglutinação passiva ou indireta)
Aglutinação reversa – detecção do antígeno na Aglutinação reversa – detecção do antígeno na amostra com anticorpos correspondente amostra com anticorpos correspondente sensibilizado com partículassensibilizado com partículas
Hemaglutinação – execução simples e não Hemaglutinação – execução simples e não exigem equipamenos especiais; ex: lues, tireóide, exigem equipamenos especiais; ex: lues, tireóide, globulina, etcglobulina, etc
Aglutinação em látexAglutinação em látex Teste de aglutinação de cristais de colesterol - Teste de aglutinação de cristais de colesterol -
VDRLVDRL
RadioimunoensaioRadioimunoensaio
1.1. Ensaios diretos de competição Ensaios diretos de competição (excesso de antígeno) – exigem (excesso de antígeno) – exigem menores quantidades de Ac ou Agmenores quantidades de Ac ou Ag
2.2. Ensaios não competitivos – utilizam Ensaios não competitivos – utilizam excesso de Ac e é mais sensívelexcesso de Ac e é mais sensível
Há emissões radioativas com raios Há emissões radioativas com raios gama de marcadores de I¹²gama de marcadores de I¹²55, que são , que são mensurados em contagem por mensurados em contagem por minutominuto
Podem ser usados I¹³¹, HPodem ser usados I¹³¹, H33, C, C1414, P, P3232
Radioimunoensaio competitivo Radioimunoensaio competitivo 1º método1º método
Radioimunoensaio Competitivo Radioimunoensaio Competitivo 2º método2º método
RIA não competitivoRIA não competitivo
RadioimunoensaioRadioimunoensaio
VantagensVantagens
1.1. Precisão e alta Precisão e alta sensibilidadesensibilidade
2.2. Facilidade de Facilidade de conjugação do conjugação do isótopoisótopo
3.3. Detecção dos sinais Detecção dos sinais sem otimizaçãosem otimização
4.4. Estabilidade contra Estabilidade contra interferência do interferência do ambiente do ensaioambiente do ensaio
DesvantagensDesvantagens
1.1. Vida média curta dos Vida média curta dos reagentesreagentes
2.2. Necessidade de Necessidade de proteção contra os proteção contra os efeitos da efeitos da radioatividade radioatividade
Imunoensaios enzimáticosImunoensaios enzimáticos
Usam enzimas como marcadoresUsam enzimas como marcadores
Mais utilizados: ensaios Mais utilizados: ensaios imunosorventes enzima-ligados imunosorventes enzima-ligados (ELISA), enzimaimunoensaios (ELISA), enzimaimunoensaios (EIA), técnica de imunoensaio (EIA), técnica de imunoensaio enzimático multiplicado (EMIT) enzimático multiplicado (EMIT)
Imunoensaios enzimáticosImunoensaios enzimáticos
EIAs HeterogêneosEIAs Heterogêneos Peroxidase do rábano silvestre, fosfatase alcalina, Peroxidase do rábano silvestre, fosfatase alcalina,
beta galactosidase, glicose oxidase, urease, beta galactosidase, glicose oxidase, urease, catalasecatalase
Podem ser competitivos e não competitivosPodem ser competitivos e não competitivos Utilizados para determinação de antígenos de Utilizados para determinação de antígenos de
hormônios, marcadores tumorais, proteínas hormônios, marcadores tumorais, proteínas plasmáticas e agentes infecciososplasmáticas e agentes infecciosos
Ensaios indiretos são utilizados para mensuração Ensaios indiretos são utilizados para mensuração de anticorpos de agentes infecciosos e para auto-de anticorpos de agentes infecciosos e para auto-anticorposanticorpos
Medidos por imunoensaio colorimétrico, Medidos por imunoensaio colorimétrico, imunoensaio enzimático fluorescente, imunoensaio enzimático fluorescente, imunoensaio enzimáticos quimioluminescentes imunoensaio enzimáticos quimioluminescentes
Imunoensaios enzimáticosImunoensaios enzimáticos
Imunoensaios enzimáticos homogêneosImunoensaios enzimáticos homogêneos Sensibilidade um pouco inferior às dos Sensibilidade um pouco inferior às dos
RIAsRIAs Sistemas de ensaios são rápidos e simples Sistemas de ensaios são rápidos e simples Interação entre Ag-Ac modula a atividade Interação entre Ag-Ac modula a atividade
da enzima ou do marcadorda enzima ou do marcador Podem ser ensaios de ligação competitiva Podem ser ensaios de ligação competitiva
(antígenos enzima marcados) e não (antígenos enzima marcados) e não competitiva (anticorpo marcado com a competitiva (anticorpo marcado com a enzima)enzima)
Imunoensaios enzimáticosImunoensaios enzimáticosVantagensVantagens1.1. Os reagentes são Os reagentes são
relativamente baratos e relativamente baratos e podem ter uma meia vida podem ter uma meia vida longalonga
2.2. Múltiplos ensaios podem Múltiplos ensaios podem ser realizados ser realizados simultaneamentesimultaneamente
3.3. O equipamento pode ser O equipamento pode ser de baixo custo e é de baixo custo e é amplamente disponívelamplamente disponível
4.4. Não há riscos de radiação Não há riscos de radiação durante a marcação ou durante a marcação ou eliminação dos detritoseliminação dos detritos
5.5. Adaptação à automação Adaptação à automação de um EIA é rápida e de um EIA é rápida e simplessimples
6.6. EIA homogêneo pode ser EIA homogêneo pode ser desenvolvido para desenvolvido para haptenos e proteínashaptenos e proteínas
DesvantagensDesvantagens1.1. A mensuração da atividade A mensuração da atividade
enzimática pode ser mais enzimática pode ser mais complexa do que a complexa do que a mensuração da atividade mensuração da atividade de alguns tipos de de alguns tipos de radioisótoposradioisótopos
2.2. A atividade da enzima A atividade da enzima pode ser afetada pelos pode ser afetada pelos constituintes plasmáticosconstituintes plasmáticos
3.3. EIAs homogêneos foram EIAs homogêneos foram desenvolvidos para desenvolvidos para grandes moléculas de grandes moléculas de proteínas mas exigem proteínas mas exigem reagentes imunoquímicos reagentes imunoquímicos complexoscomplexos
Imunoensaios FluorescentesImunoensaios Fluorescentes Emprego de compostos fluorescentes como Emprego de compostos fluorescentes como
marcadores imunoquímicos para detecção de marcadores imunoquímicos para detecção de antígenosantígenos
O marcador fluorescente deve ser estável e O marcador fluorescente deve ser estável e apresentar uma alta capacidade absortiva e um apresentar uma alta capacidade absortiva e um bom rendimento quântico, emissão de bom rendimento quântico, emissão de comprimentos de onda adequados além de não comprimentos de onda adequados além de não interferir com as reações ligante-anticorposinterferir com as reações ligante-anticorpos
Marcador padrão: isotiocianato de fluoresceínaMarcador padrão: isotiocianato de fluoresceína Vários FIAs podem ser classificados: 1) Vários FIAs podem ser classificados: 1)
heterogêneos e homogêneos; 2) ligante ou heterogêneos e homogêneos; 2) ligante ou anticorpo marcado; 3) competitivo ou não anticorpo marcado; 3) competitivo ou não competitivo; 4) fase sólida ou não sólida competitivo; 4) fase sólida ou não sólida
Imunoensaios FluorescentesImunoensaios Fluorescentes
Método:Método:
O analito reage com o excesso de O analito reage com o excesso de anticorpos marcados na solução na anticorpos marcados na solução na solução solução
Usados para mensuração de proteínas Usados para mensuração de proteínas séricas e hormônios, incluindo séricas e hormônios, incluindo imunoglobulinas, cortisol, imunoglobulinas, cortisol, progesterona e tiroxinaprogesterona e tiroxina
Imunoensaio QuimioluminescenteImunoensaio Quimioluminescente
Utilizam moléculas geradoras de Utilizam moléculas geradoras de quimioluminescências como marcadores quimioluminescências como marcadores
Ex:derivados do luminol, ésteres acridina ou Ex:derivados do luminol, ésteres acridina ou derivados do nitrofenil oxalato e rutênio derivados do nitrofenil oxalato e rutênio tri-bipridiltri-bipridil
A geração de luz exige OH- e HA geração de luz exige OH- e H22OO2 2 como como ativador químico ou Hativador químico ou H22OO2 2 com peroxidase com peroxidase como ativadores da quimioluminescênciacomo ativadores da quimioluminescência
IMMULITEIMMULITE PRISMPRISM AXSYMAXSYM
