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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN
TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO
MAESTRO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA
EN LA ESPECIALIDAD DE
PROCESOS AGROINDUSTRIALES
PRESENTA
Q. LIZZIE VIVIANA BAAS DZUL
OBTENCIÓN DE EXTRACTOS
POLIFENÓLICOS CON ACTIVIDAD
BIOLÓGICA A PARTIR DE HARINAS
ELABORADAS CON SUBPRODUCTOS DE
LIMON ITALIANO
ACADÉMICO DE
MÉRIDA, YUC. 26 DE FEBRERO 2014.
TÍTULO
I
TÍTULO
OBTENCIÓN DE EXTRACTOS POLIFENÓLICOS CON
ACTIVIDAD BIOLÓGICA A PARTIR DE HARINAS
ELABORADAS CON SUBPRODUCTOS DE LIMON
ITALIANO
Presenta: Q. Lizzie Viviana Baas Dzul
Tutor Académico: Dra. Neith Aracely Pacheco López
Tutor en planta: Dra. Ingrid Mayanín Rodríguez Buenfil
Asesor: Dr. Manuel Octavio Ramírez Sucre
RESUMEN
II
RESUMEN
Se estudió el método de extracción de compuestos polifenólicos que permitió la
conservación de la actividad biológica a partir de harinas elaboradas con subproductos de
limón italiano Citrus limón (L). Burns. Para ello, se realizaron secados de subproducto a
diferentes temperaturas y tiempos para la obtención de las harinas, a las cuales se les
determinó el porcentaje de humedad y la concentración de polifenoles totales, con
capacidad antimicrobiana y antioxidante. La temperaturas de 50⁰C a las 21 h presento una
concentración de polifenoles de 23.3 ± 4.1 mg EAG/g b.s con alta actividad biológica,
reportando una concentración mínima inhibitoria (CMI) contra S. typhimurium, S. aureus y
E. coli de 5.8±0.0, 11.7±0.0 y 17.5 ± 8,2 mg EAG/g b.s. respectivamente y un porcentaje de
inhibición del radical DPPH de 93.4±2.5 %. Estos valores determinaron que los
subproductos cítricos fueran secados a estas condiciones, aportando un rendimiento de 15.5
±0.8 g/ 100g de subproducto. Al evaluar la vida de anaquel de la harina de subproducto de
limón italiano, se observó que almacenarla a una temperatura de 25 ⁰C el tiempo de vida
útil seria de aproximadamente dos años y nueve meses y a 30 ⁰C un año y ocho meses. La
harina de subproducto de limón italiano que presento las mejores condiciones de secado,
fue empleada para la extracción de compuestos polifenólicos, esto mediante un diseño
experimental 34, los factores evaluados fueron: solventes (acetona, etanol y metanol),
concentración de solvente (50, 70 y 90%), tiempo (1, 2.5 y 4 h) y temperatura (15, 25 y 40
⁰C). Las variables de respuesta analizadas fueron: concentración de polifenoles y
flavonoides, actividad antioxidante y antimicrobiana. El mejor tratamiento para la
extracción de polifenoles fue favorables al emplear el solvente acetona a una concentración
de 70 % a una temperatura de 25 ⁰C hasta 40 ⁰C por un tiempo de una hora y el mismo
solvente con la misma concentración a una temperatura de 40 ⁰C por un tiempo de dos hora
y media favoreció la extracción de flavonoides. Al igual en este diseño experimental, se
obtuvo que el mejor método de extracción de compuestos polifenólicos con mayor
actividad inhibitoria del radical DPPH resultó ser utilizando el solvente acetona a una
concentración de 50 % hasta 70% a temperatura de 15ºC y tiempo de 1h. Para la CMI de E.
coli, S. typhimurium y S. aureus, se obtuvo que las mejores condiciones seria utilizando el
RESUMEN
II
solvente etanol a una concentración de 90 % a temperatura de 25⁰C hasta 40 ⁰C por un
tiempo de 4h. Al análisis por cromatografía en capa fina los extractos polifenólicos que
presentaron alta actividad biológica se pudo identificar la presencia del compuesto
neohesperidina como compuesto mayoritario y posible responsable de la actividad
biológica.
ÍNDICE DE CONTENIDO
III
ÍNDICE DE CONTENIDO
TÍTULO .................................................................................................................................. 2
RESUMEN ............................................................................................................................. 3
ÍNDICE DE CONTENIDO .................................................................................................... 5
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS ...................................................................................... 9
DEDICATORIAS ................................................................................................................. 14
AGRADECIMIENTO .......................................................................................................... 15
1. ANTECEDENTES ............................................................................................................. 1
2.-JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................. 3
3.-HIPÓTESIS ........................................................................................................................ 5
4.-OBJETIVOS ...................................................................................................................... 6
4.1.-Objetivo General ......................................................................................................... 6
4.2.- Objetivos Particulares ................................................................................................. 6
5.- FUNDAMENTACIÓN ..................................................................................................... 7
5.1. Frutos cítricos .............................................................................................................. 7
5.2 Limón (Citrus limon (L.) Burns) .................................................................................. 7
5.3. Estructura del limón ..................................................................................................... 9
5.4. Subproductos cítricos ................................................................................................. 10
5.5. Pretratamiento de subproductos cítricos. ................................................................... 11
5.6. Secado de alimentos ................................................................................................... 12
5.7. Polifenoles ................................................................................................................. 14
5.7.1. Clasificación de los compuestos polifenólicos.................................................... 15
5.7.2.Ácidos fenólicos ................................................................................................... 15
5.7.3. Estilbenos ............................................................................................................ 17
5.7.4. Lignanos .............................................................................................................. 18
5.7.5. Flavonoides ......................................................................................................... 19
5.7.6. Actividad antioxidante de polifenoles ................................................................. 25
5.7.7 Actividad antimicrobiana ..................................................................................... 27
5.7.8. Degradación no enzimática de polifenoles .......................................................... 29
ÍNDICE DE CONTENIDO
III
5.7.9. Extracción de polifenoles .................................................................................... 31
5.8. Vida de anaquel ......................................................................................................... 36
5.9. Color .......................................................................................................................... 37
6.- MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................... 39
6.1. ETAPA I. Elaboración de harina de subproducto de limón italiano ......................... 39
6.1.1. Colecta del material biológico............................................................................. 39
6.1.2. Secado del material biológico para la obtención de harinas de subproducto de
limón italiano................................................................................................................. 40
6.1.3. Determinación de humedad ................................................................................. 40
6.1.4. Extracción y cuantificación de polifenólicos de limón italiano .......................... 41
6.1.5. Determinación de la actividad antimicrobiana de extractos de polifenoles ........ 42
6.1.6. Determinación de la capacidad antioxidante de extractos polifenólicos de harina
de subproducto de limón italiano .................................................................................. 43
6.1.7. Color de la harina de subproducto de limón italiano .......................................... 43
6.1.8. Actividad del agua de harina de subproducto de limón italiano ......................... 44
6.1.9. pH de la harina de subproducto de limón italiano ............................................... 44
6.1.10. Acidez titulable total de harina de subproducto de limón italiano .................... 44
6.1.11. Análisis bromatológico de la harina de subproducto de limón italiano con las
mejores condiciones de secado ..................................................................................... 45
6.1.12. Determinación del tiempo de vida útil de harinas de subproducto de limón
italiano ........................................................................................................................... 45
6.2. ETAPA II. Evaluación de la extracción de compuestos polifenólicos en harinas de
subproducto de limón italiano ........................................................................................... 47
6.2.1. Evaluación de los solventes y sus concentraciones, temperaturas y tiempos de
extracción de harina de subproducto de limón italiano previamente seleccionada....... 47
6.2.2 Determinación del contenido total de flavonoides ............................................... 47
6.2.3. Cromatografía en capa fina (CCF) ...................................................................... 48
6.3. Análisis estadístico .................................................................................................... 49
7. RESULTADOS Y DISCUSIONES ................................................................................. 50
7.1. Secado de subproductos de limón italiano ................................................................. 50
7.2. Efecto de la temperatura y tiempo de secado en la reducción del porcentaje de
humedad de subproductos de limón italiano empleando el diseño experimental 4 x 8. ... 50
ÍNDICE DE CONTENIDO
III
7.2.1. Efecto de la temperatura y tiempo de secado en la concentración de compuestos
polifenólicos de los subproductos de limón italiano. .................................................... 55
7.2.2. Actividad antimicrobiana .................................................................................... 57
7.2.3. Actividad antioxidante ........................................................................................ 60
7.2.4. Color .................................................................................................................... 62
7.3. Evaluación del efecto de las temperaturas de 50°C y 110°C en la reducción de
humedad y concentración de polifenoles de subproductos de limón italiano. .................. 66
7.3.1 .Efecto de la temperatura y tiempo de secado en la concentración de compuestos
polifenólicos de los subproductos de limón italiano. .................................................... 69
7.3.2. Actividad antimicrobiana .................................................................................... 71
7.3.3. Actividad antioxidante ........................................................................................ 73
7.4. Propiedades fisicoquímicas de harina de subproducto de limón italiano secadas a 50
y 110 ⁰C a diferentes tiempos. .......................................................................................... 76
7.5. Análisis bromatológico de harina secada a 50 ⁰C por 21 h. ...................................... 78
7.6. Balance de materia y rendimiento.............................................................................. 79
7.7. Vida de anaquel de la harina de subproducto secado a 50 ⁰C por 21 h ..................... 82
7.7.1 Variable de respuesta ........................................................................................... 87
7.7.2 Estimación del tiempo de anaquel de harina de subproducto de limón italiano .. 90
7.8. Evaluación del mejor sistema de extracción de compuestos polifenólicos en harina
de subproducto de limón italiano mediante un diseño factorial 34. .................................. 92
7.8.1. Concentración de polifenoles .............................................................................. 92
7.8.2. Concentración de flavonoides totales .................................................................. 96
7.8.3. Actividad antioxidante de extractos de la mejor harina elaborada de subproducto
de limón italiano. ........................................................................................................... 98
7.8.4. Actividad anticrobiana expresada como la Concentración Mínima Inhibitoria
(CMI) de las bacterias E. coli, S. aureus, S. typhimurium, en los diferentes tratamientos
de extracción de polifenoles en harina de subproducto de limón italiano. ................. 101
7.8.5. Cromatografía en capa fina (CCF) .................................................................... 105
8. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 107
9. RECOMENDACIONES ................................................................................................ 109
10. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 110
11. ANEXO I. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL 4X8 .................................... 118
12. ANEXO II. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL 2X8 ................................... 119
ÍNDICE DE CONTENIDO
III
13. ANEXO III. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL34 ...................................... 120
14. ANEXO V. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS ................................................................... 123
15. ANEXO VI. PRESENTACIÓN EN CONGRESO ...................................................... 134
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
IV
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
Índice de tabla
Tabla 1. Clasificación científica de los cítricos ...................................................................... 7
Tabla 2. Composición de frutos cítricos (cifra indican montos por 100g) ............................. 8
Tabla 3. Ácidos hidroxibenzóicos más importantes ............................................................. 16
Tabla 4. Ácidos cinámicos más importantes ........................................................................ 17
Tabla 5. Concentración (mg/kg) de compuestos polifenólicos de subproducto de limón .... 24
Tabla 6. Estudios realizados en la extracción de polifenoles de cítricos .............................. 35
Tabla 7. Valores obtenidos de la ecuación de la recta en la cinética de secado ................... 54
Tabla 8. Concentración de compuestos polifenólicos en extractos de harinas de
subproductos del Limón italiano .......................................................................................... 56
Tabla 9. Actividad antimicrobiana de extractos de harina de subproducto de limón italiano
contra las bacterias 1) S. typhimurium, 2) S. aureus, 3) E. coli, a diferentes temperatura (T)
y tiempos (t) de secado ......................................................................................................... 59
Tabla 10. Valores obtenidos de la ecuación de la recta en la cinética de secado ................. 68
Tabla 11.Resultados de la concentración de polifenoles, concentración mínima inhibitoria y
actividad antimicrobiana (porcentaje de inhibición) de extractos de harina de subproducto
de limón italiano secados a 50 ⁰C y 110 ⁰C ......................................................................... 75
Tabla 12. Resultados de color, pH y porcentaje de acidez de harinas obtenidas a 50 ⁰C y
110 ⁰C ................................................................................................................................... 76
Tabla 13. Concentración proximal de harina de subproducto de limón italiano secada a 50
⁰C por 21 h ............................................................................................................................ 79
Tabla 14. Balance de materia y rendimiento de subproducto de limón italiano durante el
secado y el molido ................................................................................................................ 80
Tabla 15. Balance de materia de polifenoles extraídos de harina de limón italiano ............ 80
Tabla 16. Tiempo de vida de anaquel de harina de subproducto de limón italiano ............. 92
Tabla 17. Factor de retención de los compuestos polifenólicos ......................................... 106
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
IV
Índice de figuras
Figura 1. Sección transversal de un limón. ........................................................................... 10
Figura 2. Curve de secado para un sólido húmedo en aire caliente a temperatura y velocidad
constante (Brennan, J. 2008). ............................................................................................... 13
Figura 3. Clasificación de los compuestos polifenólicos ( D’ Archivio, M. y col., 2007) ... 15
Figura 4. Estructura química del ácido benzoico ................................................................. 16
Figura 5. Estructura química del ácido cinámico ................................................................. 17
Figura 6. Estructura química del a) Resveratrol y b) Piceido ............................................... 18
Figura 7. Estructura química de los lignanos ....................................................................... 19
Figura 8. Estructura química de las diferentes clases de flavonoide .................................... 20
Figura 9. Estructura de grupo funcional de flavonoides con alta capacidad antioxidante. a)
un grupo o-difenolico (estructura catecol), b) un 2-3 doble enlace conjugado con la función
4-oxo y c) grupo hidroxilo en la posición 3 y 5.................................................................... 26
Figura 10. Clasificación de métodos microbiológicos para la detección biológica ............. 28
Figura 11. a) Representación de hue h⁰, croma C* y la luminosidad L*. b) Espacios del
color L*, a*, b ....................................................................................................................... 38
Figura 12. Colecta y almacenamiento del material biológico .............................................. 39
Figura 13. Secado y prueba de humedad de subproductos de limón italiano ....................... 41
Figura 14. Vida de anaquel de harina de subproducto de limón italiano ............................. 46
Figura 15. Esquema de Cromatografía en capa fina de extractos polifenólicos de harina de
subproducto de limón italiano .............................................................................................. 49
Figura 16. Reducción del porcentaje de humedad de subproducto de limón italiano .......... 52
Figura 17. Grafica de Pareto para para el porcentaje de humedad del diseño 4x8 ............... 52
Figura 18. Curvas de secado de las harinas de subproducto de limón italiano .................... 53
Figura 19. Gráfico de medias de la velocidad de secado...................................................... 55
Figura 20. Gráfica de Pareto para a) concentración de polifenoles y b) grafica de
interacción de la concentración de polifenoles ..................................................................... 57
Figura 21. Porcentaje de inhibición de extractos de harina de subproducto de limón italiano
con respecto a las temperaturas a diferentes tiempos de secado .......................................... 61
Figura 22. Gráfica de Pareto para el porcentaje de inhibición del radical DPPH ................ 62
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
IV
Figura 23. Gráfica de parametros de color a) luminosidad (L*), b) cromaticidad (C*) y c)
de hue (h⁰) de las harinas de subproducto de limón italiano secadas a diferentes
temperaturas.......................................................................................................................... 64
Figura 24. Gráfica de Pareto para a) luminosidad (L*), b) Cromaticidad (C*) y c) hue (h⁰)
.............................................................................................................................................. 65
Figura 25. Reducción del porcentaje de humedad de harinas de subproducto de limón
italiano .................................................................................................................................. 66
Figura 26. Gráfica de Pareto para el porcentaje de humedad de muestras de harina de
subproductos de limón italiano ............................................................................................. 67
Figura 27. Velocidad de secado de las harinas de subproducto de limón italiano ............... 67
Figura 28. Gráfico de medias de la velocidad de secado...................................................... 68
Figura 29. Concentración de polifenoles de harinas de subproducto de limón italiano ....... 70
Figura 30. Grafica de Pareto a) concentración de polifenoles totales y b) interacción de
polifenoles totales ................................................................................................................. 71
Figura 31. Grafica de Parateo a) CMI de S.typhimurium, c) CMI de S. aureus y e) CMI de
E.coli y grafica de interacción para b) CMI de S.typhimurium, d) CMI de S. aureus y f)
CMI de E.coli ....................................................................................................................... 73
Figura 32. Gráfico de media para a) porcentaje de inhibición del radical DPPH y b) grafico
de interacción para el porcentaje de inhibición .................................................................... 74
Figura 33. Gráfica de media para a)luminosidad, b)cromaticidad,c) hue, d) pH y e)
porcentaje de acidez.............................................................................................................. 77
Figura 34. Balance de materia y rendimiento de subproducto de limón italiano durante el
secado ................................................................................................................................... 79
Figura 35. Balance de materia y rendimiento de subproducto de limón italiano durante el
secado y el molido ................................................................................................................ 81
Figura 36. Resultado de vida de anaquel de la harina de subproducto de limón italiano,
secada a 35 ⁰C por 106 días. a) concentración de polifenoles y porcentaje de inhibición del
radical DPPH ,b) porcentaje de humedad y actividad del agua (Aw), c) pH y porcentaje de
acidez, y d) CMI de S.typhimurium, S.aureus y E.coli ........................................................ 83
Figura 37. Resultado de vida de anaquel de la harina de subproducto de limón italiano,
secada a 60⁰C por 53 días. a) concentración de polifenoles y porcentaje de inhibición del
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
IV
radical DPPH ,b) porcentaje de humedad y actividad del agua (Aw), c) pH y porcentaje de
acidez, y d) CMI de S.typhimurium, S.aureus y E.coli. ....................................................... 85
Figura 38. Grafica de a) luminosidad, b) cromaticidad y c) hue de harina de subproducto de
limón secada a35 y 60 ⁰C ..................................................................................................... 86
Figura 39. Harina secada por un tiempo de 106 días a una temperatura de 35 ⁰C ............... 88
Figura 40. Harina secada por un tiempo de 53 días a una temperatura de 35 ⁰C ................. 89
Figura 41. Vectores en función del tiempo para las temperaturas de 35 y 60 ⁰C................. 90
Figura 42. Gráfico del ln k en función de 1/T ...................................................................... 90
Figura 43 . Gráfico del log vida útil en función de las temperaturas ................................... 91
Figura 44. Concentración de polifenoles totales con respecto al tiempo a diferentes
solventes y concentración de solvente, en muestras de harina de subproducto de limón
italiano. La figura a) presenta la concentración de polifenoles totales en extractos obtenidos
a temperatura de 15 ⁰C b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C. ........................................................................ 94
Figura 45. Analisis estadistico del diseño experimental 34, resumido en a) gráfica de pareto,
b) interacción concentración del solvente x tipo de solvente y grafica de media en la
concentración de polifenoles a diferente c) concentración de solvente, d) temperatura y e)
tiempo. .................................................................................................................................. 95
Figura 46. Concentración de flavonoides totales con respecto al tiempo a diferentes
solventes y concentración de solventes, en muestras de harina de subproducto de limón
italiano. La figura a) presenta la concentración de flavonoides totales en extractos obtenidos
a temperatura de 15 ⁰C b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C. ........................................................................ 97
Figura47. Analisis estadistico del diseño experimental 34, resumido en a) gráfica de pareto
y grafica de media para concentración de polifenoles a diferente b) temperatura, c)tiempo,
d)concentración de solvente y e) tipo de solvente ................................................................ 98
Figura 48. Porcentaje de inhibición del radical DPPH de extractos polifenólicos de harina
de subproducto de limón italiano con respecto al tiempo a diferentes solventes y
concentración de solventes. La figura a) presenta la concentración de polifenoles totales en
extractos obtenidos a temperatura de 15 ⁰C, b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C. ..................................... 100
Figura 49. Analisis estadistico del diseño experimental 34, resumido en a) diagrama de
pareto, b) grafica de interacción temperatura-concentración de solvente y grafica de media
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
IV
para el porcentaje de inhibición del radical DPPH de extractos polifenolicos obtenidos a
diferente c) concentración, d) solvente y e) tiempo............................................................ 101
Figura 50. CMI de extractos polifenólicos de harina de subproducto de limón italiano con
respecto al tiempo a diferentes solventes y concentración de solventes. La figura a) presenta
la concentración mínima inhibitoria (mg/g b.s) de E.coli a temperatura de a) 15 ⁰C, b) 25
⁰C y c) 40 ⁰C. ..................................................................................................................... 102
Figura 51. CMI de extractos polifenólicos de harina de subproducto de limón italiano con
respecto al tiempo a diferentes solventes y concentración de solventes. La figura a) presenta
la concentración mínima inhibitoria (mg/g b.s) de S.aureus a temperatura de a) 15 ⁰C, b) 25
⁰C y c) 40 ⁰C. ..................................................................................................................... 103
Figura 52. CMI de extractos polifenólicos de harina de subproducto de limón italiano con
respecto al tiempo a diferentes solventes y concentración de solventes. La figura a) presenta
la concentración mínima inhibitoria (mg/g b.s) de S.typhimurium a temperatura de a) 15 ⁰C,
b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C. ............................................................................................................ 104
Figura 53. Cromatofolio de extractos polifenólicos de harina de subproducto de limón
italiano. Bajo luz ultravioleta (UV). 1 y 4) extracto con acetona, 2 y 5) extracto con etanol,
3 y 6) extracto control, 7) Neohesperidina, 8) Hesperidina, 9) Naringina y 10) Ácido
elágico ................................................................................................................................. 106
DEDICATORIAS
V
DEDICATORIAS
A Dios por regalarme esta vida y darme la oportunidad de poder culminar una
etapa más en mi vida profesional.
A mis padres por el amor, esfuerzo y paciencia que me han tenido a lo largo
de mi vida.
A Manuel, Oscar, Susana, Davidcito y Cesar por estar a mi lado en los
momentos de estrés y sobre todo por sus consejos y muestras de cariño.
Aquellas personas que creyeron en mí, y me brindaron su tiempo y apoyo
incondicional.
AGRADECIMIENTO
VI
AGRADECIMIENTO
Al Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C.
(CIATEJ) Unidad Sureste, por facilitarme las instalaciones y equipos para la realización de
esta tesis.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por la beca otorgada con
número de apoyo 290733
Al Fondo Mixto de Fomento a la Investigación Científica y Tecnológica CONACYT-
Gobierno del Estado de Yucatán, por el apoyo a través del proyecto, “Aprovechamiento
integral de los subproductos de la industria citrícola del Estado de Yucatán para la
obtención de metabolitos de alto valor agregado”, con clave: Yuc-2011-C09-69165.
A la Dra. Ingrid Mayanin Rodríguez Buenfil por su paciencia, conocimientos transmitidos
y sabios consejos durante la realización de este trabajo.
A la Dra.Neith Aracely Pacheco López por su amistad, conocimientos invaluables que me
brindo para llevar a cabo esta investigación, y sobretodo su gran paciencia para esperar a
que este trabajo pudiera llegar a su fin.
A la Dra. María de los Ángeles Sánchez Contreras y el Dr. Manuel Octavio Ramírez Sucre,
por su contante apoyo y colaboración en la realización de la tesis.
A los miembros del jurado Dra. Teresa del Rosario Ayora Talavera, M. en C Tania
Gonzáles Flores y el Dr. Ulises García Cruz por las valiosas contribuciones que hicieron al
trabajo final y por el tiempo que dedicaron para revisarlo, aun a pesar de tantas actividades
que los ocupan
A los investigadores del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del
Estado de Jalisco, A.C. (CIATEJ) Unidad Sureste, por sus correcciones y recomendaciones
para este trabajo.
AGRADECIMIENTO
VI
A mis amigos y compañeros por su colaboración desinteresada.
A todas esas personas que de una u otra manera contribuyeron a la realización de este
trabajo.
ANTECEDENTES
1
1. ANTECEDENTES
En México la citricultura representa una actividad de gran importancia dentro de la
fruticultura nacional. Con una producción anual de 7.1millones de toneladas de fruta, y un
valor estimado de 8,050 millones de pesos, lo que sitúa a nuestro país en el quinto lugar en
producción de cítricos a nivel mundial. De esta producción la gran mayoría es de naranja y
limón, seguido de mandarina, tangerina, toronja, lima y limón real (SIAP 2014).
En la región sureste del país, Yucatán es el principal productor y proveedor de cítricos con
una alta demanda que se ve reflejada en el mercado interno, en la industria y la exportación.
El empleo de estos frutos cítricos en la industria procesadora genera diversos productos
como jugos embotellados y los aceites esenciales que son utilizados principalmente como
potenciadores del sabor de alimentos (refrescos, helados y golosinas), así como en la
fabricación de perfumes. Así mismo genera subproductos como cascara, semilla y bagazo
que no son aprovechados industrialmente y son desechados a los alrededores (SAGARPA
2014).
Estos productos y subproductos obtenidos de la industria citrícola son conocidos por su alto
contenido de moléculas bioactivas. En particular la cáscara y pulpa son una fuente de fibra
dietética ya que proporcionan una cantidad equilibrada de la fracción soluble en agua
(Russo, M. y col., 2014). Además contienen compuestos de interés industrial como los
polifenoles, flavonoides, limonoides, ácidos fenólicos, cumarinas, polimetoxiflavonas y
carotenoides, los cuales pueden presentar actividad biológica. Es por ello, que el
aprovechamiento de los subproductos generados a partir del procesamiento de cítricos es de
gran importancia comercial ya que las propiedades biológicas que pudieran presentar tales
como la capacidad antimicrobiana, antioxidante y antifúngica, los hacen excelentes
prospectos para ser usados como aditivos en la industria alimentaria para el desarrollo de
productos funcionales (Giovanna, C. y col., 2014) e incluso pueden ser empleados como
base para forraje o alimento para ganado (SAGARPA 2014).
ANTECEDENTES
2
Por lo anterior, el estudio del aprovechamiento de los subproductos generados de la
industria citrícola , para la obtención de harinas que permitan un mejor almacenamiento de
los mismos, así como la evaluación de métodos de extracción que permitan la recuperación
de polifenoles que conserven la mayor actividad biológica es de gran interés.
JUSTIFICACIÓN
3
2.-JUSTIFICACIÓN
En Yucatán, el principal centro de industrialización de cítricos es la Juguera de Akil, la cual
pertenece a la Unión de ejidos citricultores del sur del estado; los subproductos generados
en forma de cáscaras, bagazo y semillas son cercanos al 65 % del peso total del fruto
procesado y solo cerca del 10 % se comercializa a pequeños productores para la
elaboración de compostas y alimento para ganado, el resto se acumula a los alrededores de
la juguera generando severo daño ambiental. Con base a lo anterior, y considerando que en
el estado de Yucatán la citricultura forma parte fundamental de la economía, la producción
y el procesamiento industrial, se ha decidido estudiar los subproductos del limón italiano
(cascara, bagazo y semilla) sabiendo que este fruto ocupa el primero lugar en producción
con respecto a su clasificación como limón. Así mismo, los subproductos de limón italiano
son una fuente de fibra alterna a otros productos como los cereales, con el beneficio de
presentar un alto contenido de compuestos bioactivos tales como: polifenoles, carotenoides
y vitamina C, ausentes en otras fuentes de fibra y que presentan propiedades funcionales
como capacidad antimicrobiana y antioxidante que pueden tener efecto beneficioso sobre la
salud, por esto que el estudio de estos desechos es de gran interés.
Derivado de lo anterior, en este trabajo se busca transformar los subproductos de la
industria citrícola de limón italiano a una harina que presente humedad similar o inferior al
15 % tal como lo indica la CODEX para elaboración de harinas, con alto valor nutricional
que podría ser útil para la industria alimentaria o como base para la elaboración de alimento
para ganado, y que particularmente facilite la conservación del residuo y la extracción de
compuestos polifenólicos con actividad biológica.
Si bien existen diversos métodos de extracción de compuestos polifenólicos en los que se
incluyen la extracción con solventes, extracción por microondas y aplicación de fluidos
supercríticos entre otros, el empleo de estos métodos depende de las propiedades físicas y
estructurales de la molécula que se pretende separar, de las características de la matriz en la
que se encuentra, así como el costo, rendimiento y conservación de propiedades funcionales
durante la extracción. Por lo tanto en este trabajo se propone el estudio de la extracción de
los compuestos polifenólicos mediante extracción solido- liquido con solventes orgánicos,
JUSTIFICACIÓN
4
que por su bajo costo y fácil manejo permita la recuperación de extractos polifenólicos con
actividad antimicrobiana y antioxidante que puedan ser utilizados en la industria
alimentaria.
.
HIPÓTESIS
5
3.-HIPÓTESIS
El estudio de las condiciones de secado de los subproductos gastados del limón italiano
Citrus limón (L). Burns provenientes de la industria citrícola del estado de Yucatán
permitirá la obtención de harinas de subproductos que favorezcan la recuperación de
compuestos polifenólicos con actividad biológica. Así mismo el estudio de las condiciones
de extracción sólido-liquido de los compuestos polifenólicos presentes en las harinas,
permitirá la obtención de compuestos que conserven elevada actividad antimicrobiana y
antioxidante para poder ser aplicadas en la industria alimentaria.
OBJETIVOS
6
4.-OBJETIVOS
4.1.-Objetivo General
Determinar el método de extracción de compuestos polifenólicos que permita la mayor
conservación de la actividad biológica a partir de harinas elaboradas con subproductos de
limón italiano Citrus limón (L). Burns.
4.2.- Objetivos Particulares
Determinar las condiciones de secado, para la elaboración de harinas de
subproducto de limón italiano con base en el estudio del porcentaje de humedad,
concentración de polifenoles, actividad antimicrobiana y antioxidante.
Evaluar la vida de anaquel acelerado de las harinas de subproducto de limón
italiano.
Establecer las condiciones de extracción de polifenoles totales en función de la
actividad antioxidante y antimicrobiana de los extractos polifenólicos obtenidos.
Determinar el perfil preliminar de compuestos polifenólicos presentes en los
extractos de harina de subproducto de limón italiano con actividad antimicrobiana.
FUNDAMENTACIÓN
7
5.- FUNDAMENTACIÓN
5.1. Frutos cítricos
El fruto de los cítricos se encuentra dentro de la familia Rutceae dividida en el género:
Citrus, Fortunella y Poncirus, los dos últimos no tienen valor comercial, por lo que el
género Citrus es el que presenta mayor importancia económica. En la tabla 1 se muestra la
clasificación científica (Dugo, G. y col., 2010).
Tabla 1. Clasificación científica de los cítricos
Reino Familia Género
Plantae Rutaceae Citrus
(Dugo, G. y col., 2010).
Por otro parte, el contenido de nutrientes en cítricos es diverso y dispensables en la dieta
humana, es por ello que la tabla 2 se presentan otros componentes importantes como la
humedad, caloría, proteína, lípido, elementos minerales y contenido de vitaminas de cinco
cítricos diferentes (lima, mandarina, naranja dulce, toronja y limón) (Dugo, G. y col.,
2002).
5.2 Limón (Citrus limon (L.) Burns)
Botánicamente el limón es una baya de color verde o amarillo pálido con 5-10 semillas, se
emplea en la cocina para dar un sabor ácido a los alimentos y se produce principalmente
para el mercado, en jugo y como saborizante en bebidas. De manera general, los limones se
cultivan en climas más fríos, como el oeste de Estados Unidos, España, Italia y Argentina.
Sin embargo, también puede adaptarse a climas secos, como Egipto, Irán y la India ((Dugo
y col., 2002). A nivel mundial, México ocupa el primer lugar en producción de limón,
seguido por la Unión Europea, Estados Unidos y Turquía (USDA. 2014). En México, según
el servicio de información y estadísticas Agroalimentaria y Pesquera (SIAP) de la
SAGARPA (Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y
Alimentación), se reportan 4 tipos de limón: agrío o mexicano, persa, italiano y real en este
FUNDAMENTACIÓN
8
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0g)
FUNDAMENTACIÓN
9
orden de importancia. A la fecha a nivel nacional, Yucatán ocupa el quinto lugar en
producción con 124 mil toneladas de limón, que equivalen en porcentaje de producción al
0.110 % de limón mexicano, 42.69 % de limón persa y 57.14 % de limón italiano (SIAP
2014).
Estudios realizados han reportado que el limón contienen compuestos químicos naturales,
como los polifenoles (principalmente flavonoides) con capacidad antioxidante y
antimicrobiana (González-Molina, E. y col., 2010), así como otros componentes (vitaminas,
minerales, fibra dietética, aceite esencial y carotenoides). Entre los flavonoides presentes en
el limón se encuentran las flavanonas y flavonas (O´Shea, N. y col., 2012), importantes
para la prevención de enfermedades tal como la obesidad, diabetes, enfermedad
cardiovascular y cáncer (González-Molina, E. y col., 2010).
5.3. Estructura del limón
La estructura del limón es similar a otros frutos cítricos y por lo tanto recibe un nombre
especial: “hesperidio”. Un hesperidio es un fruto carnoso de cubierta endurecida y
compuesto de un pericarpio, el cual comprende tres capas distintas: (ver figura 1):
Exocarpio o flavedo, es la capa más externa del pericarpio y forma la piel exterior
dura de la fruta, en ella se encuentran presentes las glándulas de aceite y pigmentos.
Compuesta principalmente de material celulósico, pero también contiene otros
componentes, tales como aceites esenciales, ceras de parafina, esteroides y
triterpenoides, ácidos grasos, pigmentos (carotenoides, clorofilas y flavonoides),
principios amargos (limoneno), y enzimas. Cuando el fruto cítrico está maduro, las
células del flavedo contienen carotenoides (principalmente xantofila), y en la etapa
de desarrollo, se encuentra la mayor cantidad de clorofila. La región interna del
flavedo es rica en organismos multicelulares con formas esféricas o piriformes, que
están llenos de aceites esenciales (Ahmed y col., 2012).
Mesocarpio o albedo, es la capa media del pericarpio, contiene celulosas,
carbohidratos solubles, pectina y protopectina, flavonoides, aminoácidos y
vitaminas (Ahmed y col., 2012).
Endocarpio es la capa interior del pericarpio (o fruto), que rodea las semillas
directamente y es la parte comestible, dividido en 10-14 segmentos (carpelos)
FUNDAMENTACIÓN
10
separados por finos septos. Cada segmento está compuesto de hasta varios cientos
de unidades llamadas bolsas de zumo o vesículas que contienen el jugo de limón.
Las paredes de las vesículas están compuestas de celulosas, hemicelulosas, pectina,
protopectina, azúcares, flavonoides, y otros componentes menores, tales como
aminoácidos y vitamina C (Ahmed y col., 2012).
5.4. Subproductos cítricos
En la industria citrícola los productos resultantes de la transformación de los frutos (como
el limón italiano) son el jugo, aceite esencial y la cascara. Este último junto con el bagazo y
las semillas, son los residuos industriales y representan el 40-60 por ciento del peso de la
materia cruda (Dugo, G. y col., 2002). La utilización de este residuo es un requisito
fundamental de la industria de procesamiento de frutas, no sólo por razones económicas,
sino también para maximizar los recursos disponibles y producir diversos alimentos nuevos
(Lima, B. y col.2014), evidentemente reduciendo el impacto ambiental grave que esto
podría producir (Dugo, G. y col., 2002).
España es uno de los principales productores y exportadores de frutas cítricas y desde hace
algún tiempo la industria alimentaria ha mostrado un especial interés en la revalorización
de subproductos cítricos, utilizándolos principalmente para alimento animal, debido a su
alto contenido de fibra (Garau, M. y col., 2007). La cual puede ser empleada como buena
fuente de fibra dietética (FD) y el consumirla ayudaría a la prevención de enfermedades
como el estreñimiento, hemorroides e hipercolesterolemia (Lario, Y. y col., 2004).
Exocarpio (Flavedo)
Mesocarpio
(Albedo)
Centro de la columna o
medula
Endocarpio
Semilla
Septas
Figura 1. Sección transversal de un limón.
FUNDAMENTACIÓN
11
La fibra dietética no solo es deseable por sus propiedades nutricionales sino también por
sus propiedades funcionales y tecnológicas (Lario, Y. y col., 2004). O´She, N. y col.,
(2012) mencionan que los valores encontrados de fibra dietética en cascaras de limón fue
de 14 g / 100 g base seca (b.s), en comparación a 7.34 g/100 g b.s. de la fruta pelada en sí.
Del contenido total de la fibra dietética (obtenida de la cascara de limón), 4.93 g/ 100 g b.s
pertenecen a la fibra soluble y 9.04 g/ 100 g b.s pertenecen a la fibra insoluble.
Otros estudios han demostraron que los subproductos cítricos son buena fuente de
compuestos bioactivos; las cáscaras son ricas en metabolitos secundarios tales como aceite
esencial y compuestos fenólicos. Al igual, se ha informado que los residuos cítricos
contienen antioxidantes naturales tales como ácidos fenólicos y flavonoides. Sin embargo,
la composición química y la actividad antioxidante de la fruta entera y subproductos
cítricos pueden variar dependiendo del cultivo y estado de maduración (Moulehi, I. y col.
2012).
González-Molina, E. y col., (2010) mencionan que las semillas del limón contienen mayor
cantidad de eriocitrina, hesperidina y menos cantidad de naringina, mientras que las
cascaras contienen neoriocitrina, neohesperidina, naringina y menor cantidad de narirutina.
5.5. Pretratamiento de subproductos cítricos.
El pretratamiento es un paso importante que se requiere para la conservación de frutas o
para potencializar los subproductos cítricos, esto con la creación de un ingrediente o
producto microbiológicamente estable que permita minimizar la perdida de compuestos
bioactivos (polifenoles, ácidos fenólicos, flavonoides y carotenoides) o al igual que
contribuya a mejoran la salud humana. Algunos métodos de pretratamiento involucrados
para el desarrollo de estos ingredientes o productos son: molienda en húmedo (moler los
subproductos hasta un tamaño de partícula determinado), lavada (lavar los subproductos
para eliminar las sustancias no deseadas) (O´Shea, N. y col., 2012), escaldado (cocción de
los alimentos en agua o liquido hirviendo durante un periodo de tiempo de 10 y 30
segundos), tratamientos químicos (Kuljarachanan, T y col., 2009), y secado (al sol, horno o
liofilizado). Los pretratamientos por escaldado y tratamiento químicos inactivan las
enzimas responsables de la degradación de muchos compuestos activos (Kuljarachanan, T.
y col., 2009). Es por ello que el empleo de estos pretratamientos o la combinación de ellos
FUNDAMENTACIÓN
12
dependerá de los metabolitos y nutrientes disponibles en los subproducto y así poder
elaborar un ingrediente alimentario alto en nutrientes (O´Shea, N. y col., 2012).
5.6. Secado de alimentos
El secado es el método más antiguo de conservación de los alimentos que consiste en
eliminar la mayor parte del agua, lo que inhibe la proliferación de microorganismos y
dificulta la putrefacción. Al igual reduce el peso del alimento y facilita la concentración de
los compuestos presentes en ellos. La razón principal del secado es aumentar la vida útil del
alimento más allá que la del material en fresco, sin la necesidad de un almacenamiento en
refrigeración (Brennan, J. 2008).
Cuando el alimento o subproducto cítrico húmedo se coloca en el seno de una corriente de
aire caliente, el calor se transfiere a la superficie, principalmente por convección. El vapor
de agua formado se lleva desde la superficie de secado a la corriente de aire (Montes, E. y
col. 2008 y Brennan, J. 2008). En un sistema modelo es necesita un material húmedo que
consiste en un sólido inerte humidificado con agua pura, el cual es colocado en una
corriente de aire caliente, flujo paralelo a una de sus caras, donde la temperatura, humedad
y velocidad del aire se mantienen constantes. Se supone que el calor se transfiere al sólido
desde el aire por convección y que el secado tiene lugar solamente por una cara. Si la
velocidad de cambio del contenido en humedad se representa frente al tiempo, como en la
figura 2 puede apreciarse que la curva de secado consistirá en etapas o períodos (Pineda-
Castro, M. y col., 2009 y Brennan, J. 2008).
El la figura 2 se presenta un sistema modelo de secado, representado por A-B, periodo de
adaptación o equilibrio. En este periodo la superficie del sólido húmedo va hacia el
equilibrio con el aire. Por lo general este periodo es corto comparado con el tiempo total del
secado. El periodo B-C es conocido como periodo de velocidad constante, donde la
superficie del sólido está saturada con agua. Como el agua se evapora en la superficie, esta
se mueve desde el interior del solido hacia la superficie, manteniendo el estado de
saturación, en esta etapa la velocidad de secado permanece constante. Esto hace que la
temperatura de la superficie corresponda a la temperatura del bulbo húmedo del aire
(Pineda-Castro, M. y col., 2009 y Brennan, J. 2008). Conforme avanza el secado, el
movimiento del agua hacia la superficie no es lo suficiente para mantenerse en condiciones
FUNDAMENTACIÓN
13
de saturación por lo que el estado de equilibrio de la superficie no se mantiene y la
velocidad de secado empieza a disminuir. El punto C se conoce como el punto crítico. En
este punto, la temperatura de la superficie del sólido sube y se aproxima a la temperatura
del bulbo seco del aire conforme el secado se acerca al final. Para el periodo C-D llamado
velocidad de decrecimiento, la velocidad de secado es gobernada por factores externos que
afectan el movimiento de la humedad del interior del sólido y lo cual provoca la
disminución de la velocidad de secado (Brennan, J. 2008).
Para el estudio de la velocidad de secado se han estudiado numerosos modelos matemáticos
(Pineda-Castro, M. y col., 2009 y Brennan, J. 2008). Que no solo permiten predecir el
mejor proceso, sino que también ofrecen herramientas para predecir las condiciones de
almacenamiento y empaque; además, ayudan a establecer el contenido final de humedad de
los productos agrícolas y los requisitos del proceso de secado (Montes, E. y col. 2008).
Para tener un mejor manejo de los subproductos o alimentos secos es necesario reducir el
tamaño de partícula y esto se logra moliendo el material seco hasta obtener una harina (o
polvo seco) estable con porcentaje de humedad tal como lo indica la norma del CODEX
para harina de trigo (15 por ciento de humedad) y con actividad del agua (aw) de 0.3 y 0.5;
que corresponde a la humedad de la monocapa y permite su conservación a condiciones
ambientales (Schimidt, S. y col., 2013, Ríos, E. y col., 2007).
Garau, C. y col., (2007) estudiaron la cinética de secado de la cascara y el bagazo de la
naranja (Citrus aurantium v. Canoneta). Los cuales fueron secados en un horno
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Figura 2. Curve de secado para un sólido húmedo en aire caliente a temperatura y velocidad
constante (Brennan, J. 2008).
FUNDAMENTACIÓN
14
convencional a temperaturas de 30, 40, 50, 60, 70, 80 y 90 ⁰C con una velocidad de secado
de 2 m/s. El secado de los subproductos se llevó a cabo hasta obtener una humedad
constante de 0.12 y 0.11 g H2O/ 100 g b.s. para las cascaras y bagazo respectivamente. En
este trabajo, se obtuvo como resultado que la temperatura de aire de secado tuvo una
importante influencia en la velocidad de secado. Observando que a mayor tiempos de
secado se obtiene bajas velocidad de secado mientras que a temperaturas más altas de
secado se necesita tiempos de secados cortos. Al igual se reportó que el bagazo presento
mayor tiempo de secado que la cáscara. Curiosamente, las muestras de bagazo mostraron
similares tasas de secado cuando el proceso de secado se realizó por arriba de 80 ºC. Por lo
tanto, la cinética de secado a la temperatura de 80 y 90 ºC fue prácticamente superponible,
lo que sugiere que a mayor temperatura de secado no aumento significativamente la
velocidad. Este fenómeno se conoce como efecto de cementación. Ya que impide la
liberación de agua y ralentiza la velocidad de secado, en consecuencia, el secado a mayor
temperatura no promueve ningún aumento adicional a la velocidad de secado.
5.7. Polifenoles
Los compuestos polifenólicos, representan uno de los grupos más numerosos y complejos
metabolitos secundarios de las plantas (Naveda, G. F. 2010 y Romero y col., 2003). Estos
compuestos están conformados por un anillo aromático rodeado de uno o más grupos
hidroxilos y estructuralmente varían desde una simple molécula fenólica a la de una
molécula polimérica compleja (Ignat y col., 2011). Entre sus propiedades podemos
encontrar que son potencialmente saludables en el organismo humano, principalmente
como antioxidante, antialergénico, antinflamatorio, anticancerígeno y como agente
antimicrobiano (Dagnilia, M. 2012). Desde el punto de vista químico la presencia de sus
anillos tipo benceno, se relacionan directamente con algunas características de los
alimentos como son el sabor, color, la palatabilidad y el valor nutricional (Padilla, F. y col.,
2008). La principal fuente de obtención de los compuestos polifenólicos son los alimentos
de origen vegetal como las frutas, verduras, determinadas bebidas (vino, té, zumo de fruta),
cereales y legumbres (Festy, D. 2007).
FUNDAMENTACIÓN
15
5.7.1. Clasificación de los compuestos polifenólicos
Existen varias clases y subclases de polifenoles que se definen en función del número de
anillos fenólicos que poseen y de los elementos estructurales que presentan estos anillos.
Entre los principales grupos se encuentran: flavonoides, ácidos fenólicos estilbenos y
lignanos ver figura 3 (Ignacio y col., 2011).
A continuación se describe cada clase de compuesto polifenolico:
5.7.2.Ácidos fenólicos
Los ácido fenólicos, constituyen alrededor de un tercio de los fenoles dietéticos, y se
encuentran presentes en las plantas en forma libre y unida. Los fenoles unidos pueden estar
vinculados con varios componentes de las plantas a través de éster, éter, o enlace acetal. La
clasificación de este grupo se divide en dos: ácido hidroxibenzóico y ácido
hidroxicinámicos los cuales serán descritos a continuación (Ignat y col., 2011).
a) Ácido hidroxibenzóico
El ácidos hidroxibenzóico tiene una estructura básica C6-C1, como el ácido gálico, p-
hidroxibenzoico, protocatecúlico, vaníllico y siríngico. Al igual es un compuesto de
estructura compleja como los taninos condensados e hidrolizables (Ahmed.y col., 2012).
POLIFENOLES
1.-Ácido fenólicos
2.-Flavonoides
3.-Estilbenos
4.-Lignanos
a) Hidroxibenzóico
b) Hidroxicinámico
a) Flavonas
b) Flavanonas
c) Isoflavonas
d) Flavonoles
e) Antocianinas
f) Flavanoles
Figura 3. Clasificación de los compuestos polifenólicos ( D’ Archivio, M. y col., 2007)
FUNDAMENTACIÓN
16
El contenido de este compuesto en la planta comestible por lo general es bajo salvo en
ciertas frutas rojas, la cebolla o el rábano negro. (Manach, C.y col., 2004). En la figura 4 se
muestra la estructura del ácido benzoico y en la tabla 3, se presentan los grupos que
contienen para la formación de estos compuestos.
Figura 4. Estructura química del ácido benzoico
Tabla 3. Ácidos hidroxibenzóicos más importantes
Nombre del ácido
benzoico
R2 R3 R4 R5
p-hidroxibenzoico H H OH H
protocatéquico H OH OH H
Vaníllico H OCH3 OH H
gálico OH OH OH OH
siríngico H OCH3 OH OCH3
Salicilico OH H H H
gentisico OH H H OH
(Robbins, R. 2003)
b) Ácido hidroxicinámico
El ácido hidroxicinámico es un grupo de compuesto presente en la pared celular del limón,
cuyo principal representante se encuentra el clorogénico, ácido ferúlico, p-cumárico,
cafeico y sinápico (Gonzales-molina, E. y col., 2010), de los cuales el ácido ferúlico y p-
cumárico son los de mayor abundancia en la naturaleza (Martínez M, A. 2005).
Químicamente su esqueleto está formado por un anillo aromático, un grupo alifático y un
ácido carboxílico en el extremo. Es nombrado como ácido hidroxicinámico por la
sustitución del grupo OH en el anillo aromático. Por lo general, este tipo de compuesto se
encuentra esterificado en la pared celular vegetal, por lo tanto, posee una baja solubilidad y
se destaca por ser buen agente antioxidante (Martínez M, A. 2005).
FUNDAMENTACIÓN
17
El grupo de los ácidos hidroxicinámicos se han asociado consistentemente para reducir el
riesgo de enfermedad cardiovascular, cáncer y otras enfermedades crónicas (Dalbem, L. y
col., 2012).
En la figura 5 se muestra la estructura del ácido cinámico y en la tabla 4 se presentan los
grupos que contienen para formar los ácidos hidroxicinámicos.
Figura 5. Estructura química del ácido cinámico
Tabla 4. Ácidos cinámicos más importantes
Nombre del ácido
cinámico
R2 R3 R4 R5
p-cumárico H H OH H
Cafeico H OH OH H
Ferúlico H OCH3 OH H
Sinápico H OCH3 OH OCH3
(Robbins, R. 2003)
5.7.3. Estilbenos
Los estilbenos están constituidos por dos anillos fenilos conectados por un puente de
metileno de dos carbonos (C6-C2-C6). La variación estructural dependerá de la
configuración del doble enlace carbono-carbono, el número de hidroxilos y a medida que el
grupo fenol es sustituido con azúcar, metoxilo, u otros grupos alcoxi (Ferré-Filmon, K. y
col., 2004). Su distribución en los alimentos vegetales no es muy amplia. Sin embargo entre
las principales fuentes dietéticas se encuentran la uva ( D’ Archivio, M. y col., 2007), zumo
de la uva y vino.
Los estilbenos son compuestos con propiedades biológicas, tal como la actividad
antioxidante y la actividad antimicrobiana (Arraki, K. y col., 2013). Entre los compuesto
que presenta mayor interés nutricional se encuentra el resveratrol (3, 5, 4’-
FUNDAMENTACIÓN
18
trihidroxiestilbeno) y el piceido glucósido (resveratrol-3-O-ß-D-glucósido) ambos
estilbenos se pueden encontrar en su forma cis y trans (De la rosa, L. y col., 2010) (figura
6). El resveratrol destaca por ser un compuesto con actividad antitumoral e inhibe
reacciones que incrementan el riesgo de enfermedades coronarias (Manach, C. y col.,
2004).
a) Resveratrol b) Piceido
Figura 6. Estructura química del a) Resveratrol y b) Piceido
5.7.4. Lignanos
Los lignanos nombrados por primera vez por Harworth en 1941, son metabolitos
secundarios encontrados en una gran variedad de plantas que incluyen semillas de lino,
calabaza, ajonjolí, centeno, y en algunas bayas (Collado, J. 2011).Por definición y en
sentido estricto son dímeros de unidades de fenilpropano (C6-C3) enlazadas por el átomo
central de sus cadenas laterales (unión C8-C8´) tal como se muestra en la figura 7 (Boluda,
C y col., 2005).
Los lignanos están siendo estudiados para su posible uso en la prevención del cáncer,
particularmente cáncer de seno. Al igual que otros fitoestrógenos (tales como isoflavonas
de soya), estos se aferran de los mismos puntos de las células donde se sujeta el estrógeno.
Si hay poco estrógeno en el cuerpo (después de la menopausia, por ejemplo), los lignanos
pueden actuar como estrógeno débil; pero cuando el estrógeno natural es abundante en el
cuerpo, los lignanos pueden en su lugar reducir los efectos del estrógeno al desplazarlos de
las células. Este desplazamiento de la hormona puede ayudar a prevenir tales tipos de
cáncer, como cáncer de seno, eso depende de que el estrógeno inicie y se desarrolle.
Además, al menos un estudio de laboratorio sugiere que los lignanos pueden ayudar a
prevenir el cáncer de formas que no están ligadas al estrógeno (Collado, J. 2011).
FUNDAMENTACIÓN
19
Figura 7. Estructura química de los lignanos
5.7.5. Flavonoides
Los flavonoides son compuestos naturales distribuidos en las hojas, semillas, cortezas,
flores y fruto de las plantas, hasta la fecha se han identificado más de 4.000 flavonoides.
Por lo general ayudan a proteger a las plantas contra la luz UV, parásitos fúngicos,
herbívoros, patógenos y daño celular oxidativo. Al igual, son responsables de las
características del color rojo y azul de las frutas, vinos y ciertas verduras (Medic-Ṧaric . M. y
col., 2004).
Estructuralmente los flavonoides están compuestos por quince carbonos arreglados en una
configuración C6-C3-C6. Principalmente la estructura consiste en dos anillos fenilo (A y B)
ligados a través de un anillo C de pirano heterocíclico (figura 8) (Daglia, M. 2012). Los
átomos de carbono individuales de los anillos A, B y C se numeran mediante un sistema
que utiliza números ordinarios para los anillos A y C, y números primos para el anillo B.
De los tres anillos, el A se biosintetiza a través de la ruta de los poliacetatos, y el anillo B
junto con la unidad C3 proceden de la ruta del ácido Shikímico. (Martinez -Flores, S. y col.,
2002).
En su mayoría los flavonoides cítricos se encuentran como glucósidos, pero también
pueden aparecer en forma libre (agliconas flavonoides). Además, se pueden presentar como
sulfatos, dímeros ó polímeros. Los glucósidos de los cítricos pueden encontrarse de dos
formas: como O-glucósidos con los carbohidratos ligados a través de átomos de oxígeno
(enlace hemiacetal), o como C-glucósidos con los carbohidratos ligados a través de enlaces
carbono-carbono. De todas estas formas naturales, los O-glucósidos son los de mayor
presencia (Martinez – Flores, S. y col., 2002). Los carbohidratos presentes en los cítricos
afectan el sabor. Por ejemplo en la toronja el neohesperidósido da el sabor intensamente
FUNDAMENTACIÓN
20
amargo, mientras que en el limón la presencia del rutinosido da el sabor insípido
(Gonzáles-Molina., 2010).
La clasificación de estos compuestos se hace en función del estado de oxidación del anillo
heterocíclico (anillo C) y de la posición del anillo B. Dentro de cada familia existen una
gran variedad de compuestos, que se diferencian entre sí por el número y la posición de los
grupos hidroxilos, y por los distintos grupos funcionales que pueden presentar (metilos,
azúcares, ácidos orgánicos).
Entre los principales subgrupos de compuestos flavonoides se encuentran: flavonas,
flavanonas (dihidroflavonas), isoflavonas, antocianidinas y flavanoles (figura 8) (Martinez
-Flores, S. y col., 2002).
d) Flavanoles
f) Flavonoles
e) Antocianinas
a) Flavonas
b) Flavanonas
c) Isoflavonas
Flavonoide
Figura 8. Estructura química de las diferentes clases de flavonoide
FUNDAMENTACIÓN
21
a) Flavonas
Poseen un grupo ceto en el carbono C4 y una insaturación entre los carbonos C2 y C3. Son
los flavonoides menos abundantes en los alimentos. Sin embargo, podemos encontrarlos
con gran abundancia en el perejil y apio (Ignat, I. y col., 2011). Miyake. Y. col., (1997)
aislaron dos compuestos de C-glucosilflavonas de frutas de limón: Diosmetina 6,8-di-C-
glucosido y Diosmetina 6-C-D-glucosido.
b) Flavanonas
Son análogos de las flavonas con el anillo C saturado y se glucosilan principalmente por la
unión de un disacárido en el carbono C7. Las flavanonas se encuentran presentes en su gran
mayoría en los cítricos. Estos compuestos son localizados en las partes sólidas de las frutas,
en particular en el albedo. Por ello, su concentración es hasta cinco veces mayor en la fruta
que en los zumos.
Las flavanonas presentes en cítricos se encuentran en forma de agliconas y glucosido.
Para las agliconas se encuentra: Naringenina y hesperetina, y como glucosidos:
neohesperidósido (naringenina y neohesperidina) (,Xu, G. y col., 2007) y rutinósido
(narirutina y hesperidina) (Tripoli, E. y col., 2007).
Ignat, I. y col., (2011) reportaron la presencia de eriodictiol en el limón. Compuesto con
mayor actividad antioxidante que todos los glucósidos de flavonoide presentes en el fruto
(Rio, J.A. y col., 2004).
c) Isoflavonas
Poseen un anillo bencénico lateral en posición C3. Su estructura es parecida a la de los
estrógenos. Las isoflavonas poseen grupos hidroxilos en los carbonos C7 y C4’, al igual
que sucede en la estructura molecular de la hormona estriol (uno de los tres estrógenos
mayoritarios junto al estradiol y la estrona). En realidad, las isoflavonas se pueden unir a
receptores de estrógenos, y por ello se clasifican como fitoestrógenos. Se pueden presentar
como agliconas, o a menudo conjugadas con glucosa, pero son termosensibles y pueden
hidrolizarse durante su procesamiento industrial y durante su conservación. Se presentan
casi exclusivamente en plantas leguminosas, siendo la soja y sus derivados la principal
fuente de isoflavonas (Quiñones, M. 2012). En los alimentos la Isoflavonas se presentan en
FUNDAMENTACIÓN
22
cuatro formas: aglicona, 7-O-glucosido, 6´´-O-acetyl-7-Oglucosido y 6´´-O-malonyl-7-O-
glucosido (De la Rosa, L y col., 2010).
d) Flavonoles
Se caracterizan por poseer un grupo ceto en el carbono C4 y una insaturación entre los
carbonos C2 y C3. Poseen además un grupo hidroxilo adicional en el carbono C3.
Representan el grupo más ubicuo de polifenoles presente en los alimentos. La quercetina es
el compuesto más representativo. Las principales fuentes de flavonoles son las verduras y
las frutas. El té y el vino son también alimentos ricos en flavonoles. La biosíntesis de
flavonoles es un proceso fotosintético. Por ello, estos compuestos se localizan
principalmente en el tejido externo y aéreo de la planta. La distribución y la concentración
de los flavonoles puede ser distinta incluso en frutas procedentes de la misma planta; esto
se debe a que la localización de los frutos condiciona la exposición al sol (Quiñones, M.
2012).
Rutina y miricitina son los flavanoles con mayor presencia en el jugo de limón, mientras
que la quercetina y kaempferol se encuentran tanto en cascaras y jugo (Gonzáles- Molina,
E. y col., 2010).
e) Antocianidinas
Químicamente las antocianinas son glicósidos de las antocianidinas, es decir, están
constituidas por una molécula de antocianidina, que es la aglicona, a la que se le une un
azúcar por medio de un enlace glucosídico. La estructura química básica de estas agliconas
es el ion flavilio, también llamado 2-fenil-benzopirilio que consta de dos grupos
aromáticos: un benzopirilio y un anillo fenólico; el flavilio normalmente funciona como un
catión ( Ioana, I. y col., 2011).
De todas las antocianidinas que actualmente se conocen (aproximadamente 20), las más
importantes son la pelargonidina, la delfinidina, la cianidina, la petunidina, la peonidina y
la malvidina, nombres que derivan de la fuente vegetal de donde se aislaron por primera
vez; la combinación de éstas con los diferentes azúcares genera aproximadamente 150
antocianinas. Los hidratos de carbono que comúnmente se encuentran son la glucosa y la
ramnosa, seguidos de la galactosa, la xilosa y la arabinosa y, ocasionalmente, la
FUNDAMENTACIÓN
23
gentiobiosa, la rutinosa y la sacarosa. Habitualmente unidos en las posiciones 3 y también
5, formando 3-O-glucósidos y 3,5-di-O-glucósidos. Son compuestos hidrosolubles, y
constituyen uno de los grupos más importantes de pigmentos vegetales. Se encuentran
principalmente como heterósidos con los tres anillos de su estructura conjugados. La
glucosilación ocurre principalmente en la posición 3 del anillo C ó en las posiciones 5 y 7
del anillo A. También es posible la glucosilación de las posiciones 3’, 4’ y 5’ del anillo B,
aunque esta glucosilación aparece con menos frecuencia (Collado, G. 2011).
Las antocianidinas están ampliamente distribuidas en la dieta humana. Se pueden encontrar
en ciertas variedades de cereales, en el vino tinto y en algunos vegetales, aunque aparecen
mayoritariamente en las frutas (De la Rosa, L., 2010).
f) Flavanoles
Poseen el anillo C saturado y un grupo hidroxilo en el carbono C3. Pueden aparecer como
monómeros o como polímeros con distintos grados de polimerización. A diferencia de otros
grupos de flavonoides, sus combinaciones de tipo heterosídico (entre el grupo reductor del
azúcar y un grupo tiol) son poco habituales. Los flavanoles más representativos en los
alimentos son de tipo flavan-3-ol (Daglia, M. 2012), y estos pueden aparecer como
monómeros (catequinas), como dímeros condensados entre sí y como oligómeros
(procianidinas), o bien pueden aparecer como polímeros (proantocianidinas o taninos
condensados). Epicatequina y catequina son los compuestos mayoritarios en frutas. Las
catequinas también se encuentran en el vino y en el chocolate (Wiswedel, I. y col., 2004),
que son las fuentes mayoritarias. En cambio, galocatequina, epigalocatequina y
epigalocatequina galato aparecen principalmente en el té. Es bastante complejo valorar el
contenido de proantocianidinas en los alimentos, debido a que poseen un amplio rango
estructural y pesos moleculares muy variables. Los datos mayoritarios disponibles, en
cuanto a la caracterización de estos compuestos, hacen referencia principalmente a dímeros
y trímeros de catequinas, que representan las formas mayoritarias (Quiñones, M y col.,
2012).
En la tabla 5 se presenta la concentración y estructura de compuestos polifenólicos en
subproducto (cascara, semilla y bagazo) de limón.
FUNDAMENTACIÓN
24
Tabla 5. Concentración (mg/kg) de compuestos polifenólicos de subproducto de limón
Compuesto Clase Estructura Cascara Semilla Pulpa
ácido p-
hidroxibenzoico
(ácido 4-
hidroxibenzoico)
Derivado
del ácido
benzoico
54 ±1.6
65±0.9
53±0.9
Ácido cafeico
3-(3,4-
dihidroxifenilo)-2-
ácido propenoico
Derivado
del ácido
cinnamico
31±0.9
98±6.2
25±0.7
Apigenina 6,8-di-C-
glucosido
(5,7,4´-
trihidroxiflavona-6,8-
di-C-β-glucosido)
Flavona-
C
glucosido
273±3.8
323±4.9
231±4.1
Diosmetina 6,8-di-C-
glucosido
(5,7,3´-trihidroxi-4´-
flavona metoxi 6,8-
C-β-glucosido)
Flavona-
C
glucosido
399±6.5
350±7.8
305±6.2
Eriocitrina
(5,7,3´,4´-
tetrahidroxiflavanona
-7-β-rutinosido)
Flavavona
β-
rutinosido
2,670±80.3
2,612±78.9
2,657±72.6
Hesperidina
(5,7,3′- Trihdroxi-4′-
methoxi flavona7- β-
rutinosido)
Flavanona
-O-
glucosido
2,198±56.4
1,443±11.9
2,912±47.3
FUNDAMENTACIÓN
25
Narirutina
(5,7,4′-
trihidroxiflavanona7-
β-rutinosido)
Flavanona
-O-
glucosido
85±2.9
152±1.6
124±2.8
Rutina
(3,5,7,3′,4′-
tetrahidroxiflavanone
3- β-rutinosido)
Flavonol
glicosido
52±1.6 61±4.3 44±2.9
(Russo, M y col., 2014)
5.7.6. Actividad antioxidante de polifenoles
Los compuestos polifenólicos actúan como antioxidantes, por ser capaces de prevenir la
oxidación. Esta propiedad del compuesto dependerá de la oxido-reducción del grupo
hidroxifenólico y la estructura química, sin embargo, en una fruta, la capacidad
antioxidante no está dada simplemente por la suma de las capacidades antioxidantes de
cada uno de sus componentes, sino también por la interacción entre ellos, lo que puede
producir efectos sinérgicos o antagónicos (Abeysinghe D. y col., 2007).
Los antioxidantes protegen el organismo de los radicales libres, moléculas que en su
estructura atómica presentan un electrón no apareado, altamente reactivo y que genera una
reacción REDOX. Son altamente inestables y generan reacciones en cadena. (Cano, A. y
col., 2004).
Algunos ejemplos de tipos de radicales libres son los siguientes:
a)Superóxido (O2.-)
b)Radical hidroxilo (HO.)
c)Radical alcoxilo (R-O2.)
d) Peróxido de hidrógeno (H2O2)
e)Hidroperoxilo (HO2.)
f)Peroxinitritos (ONOO-)
FUNDAMENTACIÓN
26
Estos radicales libres son moléculas altamente reactivas responsables por el daño a lípidos,
proteínas y ácidos nucleicos en la célula. Al igual los radicales libres pueden aumentar el
riesgo al desarrollo de cáncer, enfermedades cardiovasculares y otras enfermedades
degenerativas (Alothman, M. y col., 2009). Entre las enfermedades asociadas a los
radicales libres son: arterioesclerosis, diabetes melllitus, envejecimiento, cáncer,
enfermedades respiratorias, hepatopatías, artritis, enfermedades inflamatorias crónicas del
intestino, entre muchas otras más (Abeysinghe, D. y col., 2007).
La función de los antioxidantes es desactivar los radicales libres, minimizando el daño y
protegiendo el organismo de este tipo de enfermedades. En efecto, los grupos fenólicos de
los polifenoles sirven como una fuente fácilmente disponible de "H" tales átomos pueden
reaccionar con los radicales libres y así deslocalizarlos sobre la estructura de los polifenoles
(Tripoli, E. y col., 2007).
La eficiencia de los polifenoles como antioxidantes depende en gran parte de su afinidad
por los radicales y por tanto de su estructura química. Dentro de la estructura existen tres
grupos importantes para la evaluación de su capacidad antioxidante (figura 9):
a) Presencia de estructura O-dihidroxi en el anillo B; que confiere una mayor estabilidad a
la forma radical y participa en la deslocalización de los electrones.
b) El doble enlace en los carbonos 2,3, en conjunción con la función 4-oxo son los
responsables de una deslocalización del electrón en el anillo B.
c) Grupos 3- y 5-OH con función 4-oxo en los anillos A y C son necesarios para ejercer el
máximo potencial antioxidante (Tripoli, E. y col., 2007).
Siguiendo estos criterios, el flavonoide quercetina es el que mejor reúne los requisitos para
ejercer una efectiva función antioxidante (Martínez -Flórez. S. y col., 2002).
b)
c) a)
Figura 9. Estructura de grupo funcional de flavonoides con alta capacidad antioxidante. a) un grupo o-
difenolico (estructura catecol), b) un 2-3 doble enlace conjugado con la función 4-oxo y c) grupo hidroxilo
en la posición 3 y 5
FUNDAMENTACIÓN
27
Algunos compuestos polifenólicos con actividad antioxidante presentes en el limón se
encuentran: la hesperidina, Diosmina y eriocitrina (Del Río, J. y col., 2004). Siendo la
Eriocitrina el compuesto con mayor actividad antioxidante de todos los flavonoides
glucósidos presentes en la fruta.
5.7.7 Actividad antimicrobiana
Los compuestos polifenolicos actúan como agentes antimicrobianos es decir, matan o
inhiben el crecimiento de microorganismos, esto dependerá de la estructura y contenido del
grupo hidroxilo (Tripoli y col., 2007). Los que presentan actividad antimicrobiana podrían
causar la lisis celular de los microorganismos, por diferentes mecanismos de acción como:
el bloqueo de la síntesis de la pared celular o el transporte de sus precursores; afectando a la
membrana citoplásmica; bloqueando las fases de la síntesis protéica como la activación,
iniciación, fijación del complejo aminoácido-ARNt al ribosoma, incluso podrían afectar el
metabolismo de los ácidos nucleicos (Calvo, J. y col., 2009).
Rodríguez, E. (2011) menciona que los compuestos fenólicos sensibilizan la membrana
celular, y al saturarse los sitios de acción, la célula sufre un daño grave, provocando que se
colapse la membrana. Entre los compuestos con actividad antimicrobiana se encuentra el
ácidos cafeico, ferúlico y p-cumárico, por ejemplo, inhiben a los microorganismos E. coli,
S. aureus y B. cereus. Otros compuestos fenólicos que han demostrado tener actividad
antimicrobiana son los taninos y el ácido tánico. Este último por ejemplo inhibe los
microorganismos L.monocytogenes, E. coli, S. Enteritidis, S. aureus, A.hydrophila y S.
faecalis.
Tripoli, E. y col., (2007) mencionan que la hesperetina, y la aglicona de hesperetina tienen
actividad antimicrobiana contra S. typhimurium.
5.7.7.1. Metodologías para evaluar la actividad antimicrobiana
Existen diferentes métodos de laboratorio empleados para determinar In vitro la
susceptibilidad de bacterias ante agentes antimicrobianos, estos métodos no poseen la
misma sensibilidad ni se basan en los mismos principios, debido a que los resultados son
influenciados por el método seleccionado, los microorganismos usados y el grado de
solubilidad de cada compuesto evaluado (Stella, L. y col., 2009). Entre los métodos
FUNDAMENTACIÓN
28
empleados se encuentran tres grupos: métodos de difusión, métodos de dilución y
bioautografía (ver figura 10) (Choma, I. y col., 2011).
a) Método de difusión
Se basa fundamentalmente en incorporar en la superficie del agar inoculado previamente
con el microorganismo de prueba el compuesto de ensayo, para posteriormente observar la
inhibición de crecimiento o halo de inhibición. Este método se divide en tres técnicas:
disco, cilindro y pozo. La primera, consiste en incorporar una concentración conocida de
extracto polifenólico a un discos de papel, la cual es colocada sobre la superficie de una
caja de agar inoculado con el microorganismos de estudio. La caja es incubada a una
temperatura y tiempo adecuado hasta finalmente observa el halos de inhibición de
crecimiento. Para el método del cilindro, se emplea cilindro de acero inoxidable o
porcelana de tamaño uniforme (usualmente de 8 mm x 6mm x 10 mm) es colocado sobre la
superficie de la caja de agar inoculado y lleno del extracto de muestras o estándar. Después
de la incubación, los cilindros son retirados y la zona de inhibición es medida (Choma, I. y
col., 2011). En el ensayo de pozo, algunos agujeros con milímetros de diámetro son
cortados en la superficie del agar inoculado y son llenados con la muestra de estudio. La
solución del compuesto ensayado es difundida en medio del agar causando la inhibición del
Clasificación de
métodos
microbiológicos
para la detección
biológica
Método de difusión
Método de dilución
Bioautografía
Disco
Cilindro
Pozo
Contacto
Inmersión
Directo
Tubo de ensayo
Dilución en agar
Figura 10. Clasificación de métodos microbiológicos para la detección biológica
FUNDAMENTACIÓN
29
crecimiento de los microorganismos. Las placas de Petri se dejan a temperatura ambiente,
antes de la incubación. Entonces, las zonas de inhibición de crecimiento son medidas. La
concentración mínima inhibitoria (CIM) se determina visualmente, como la concentración
de compuesto de ensayo más baja, lo que provoca zonas reconocibles de inhibición del
crecimiento. Sin embargo, los métodos de difusión son menos adecuados para determinar el
valor de la CIM que los de dilución, ya que es imposible medir la cantidad del compuesto
de prueba utilizado en el medio de agar (Stella, L. y col., 2009).
b) Método de dilución
La principal ventaja de los métodos de dilución es la posibilidad de estimar la
concentración del compuesto de ensayo en el medio de agar o en la suspensión de caldo;
por esta razón, son comúnmente utilizadas para la determinación de los valores de
concentración mínima inhibitoria (CIM). En el procedimiento de dilución en agar, diversas
concentraciones del compuesto ensayado se mezclan con un agar nutriente. Las placas de
agar son inoculadas y luego incubadas. En el tubo de ensayo consiste en hacer diluciones
seriadas del extracto en ensayo en caldo de cultivo y un tubo como control de crecimiento
de microorganismos, los tubos se inoculan con una suspensión calibrada del
microorganismo y se incuban a temperatura y tiempo determinado, finalizado el período de
incubación, los tubos se examinan visualmente para comprobar la existencia o no de
turbidez en esta prueba se pueden emplear microplacas de 96 pocillos (Jougenssen, J. y
col., 2009).
5.7.8. Degradación no enzimática de polifenoles
La reacción de degradación que involucran a los polifenoles en la transformación y
almacenamiento de alimentos incluyen procesos bioquímicos y químicos. Aunque el más
importante mecanismo bioquímico para la degradación de polifenoles es la oxidación
enzimática, otros factores tales como las reacciones químicas, fermentación, cocción,
manufactura o almacenamiento también puede catalizar transformaciones y la degradación
de compuestos polifenólicos (De la Rosa y col., 2010).
La reacción de pardeamiento, la cual es una de las más importantes que ocurre durante el
procesamiento y almacenamiento de los alimentos, representa un área de investigación
FUNDAMENTACIÓN
30
interesante para la estabilidad y tecnología de los alimentos, así como para la nutrición y
salud. La reacción de pardeamiento puede involucrar diferentes compuestos y proceder a
través de diferentes caminos químicos. El mayor grupo de reacciones importantes para el
pardeamiento es la enzima de oxidación de fenoles o llamada no enzimática de
pardeamiento. La última es favorecida por un tratamiento térmico e incluye un amplio
número de reacciones como la reacción de Maillard, caramelización, oxidación química de
fenoles y maderización (De la Rosa y col., 2010).
La reacción de Maillard, se refiere originalmente a la reacción de pardeamiento que se
produce entre el aminoácido y azúcar durante la cocción y procesamiento de alimentos. Sin
embargo en años recientes diferentes compuestos como los polifenoles han sido
relacionados con la reacción de Maillard. Esta reacción contribuye a propiedades
sensoriales, nutriciales y toxicológicas en diferentes alimentos. Aunque en sus primeras
etapas la reacción de Maillard conduce a la formación de los productos conocidos como
Amadori y Heyn´s, poca información está disponible en la estructura química de los cientos
de productos pardos que son formados por una serie de consecutivos y reacciones paralelas,
incluyendo oxidaciones, reducciones y condensación aldólica (De la Rosa y col., 2010).
La reacción de Maillard es también conocida por contribuir al envejecimiento natural y
normal de proteínas del tejido y otras biomoléculas tales como los polifenoles. Recientes
publicaciones han reportado que los polifenoles pueden reaccionar con un grupo amino
complicando la vía de las reacción de pardeamiento y modificando las propiedades
saludables de los polifenoles. En lo que respecta al efecto de la degradación química de
polifenoles por la reacción de Maillard en su actividad antioxidante. La oxidación química
de este compuesto es responsable de la perdida de la capacidad antioxidante. Sin embargo
observaciones recientes indican que polifenoles parcialmente oxidados puedan presentar
alta actividad antioxidante que los fenoles no oxidados. Por esta razón, investigaciones
futuras se requieren en este campo (De la Rosa y col., 2010).
Por otra parte, el empleo de calor durante la fabricación de diversos productos, puede
cambiar la composición enantiomérica de los polifenoles. Además la epimerización de
polifenoles podría ser causada por la condición aplicada durante los procedimientos de
extracción (De la Rosa y col., 2010).
FUNDAMENTACIÓN
31
5.7.9. Extracción de polifenoles
La extracción es un paso muy importante para el aislamiento, la identificación y uso de
compuestos polifenólicos. Esta dependerá de la naturaleza química y del grado de
polimerización de los propios compuestos, (Arranz, S.M. 2010) así como el efecto de la
extracción repetida, la concentración y polaridad de los diferentes solvente, temperatura de
extracción (Li, B. y col., 2006) y el tamaño de partícula de la muestra (Arranz, S.M. 2010).
Existen diferentes métodos de extracción para la obtención de compuestos bioactivos como
por ejemplo:
a) Extracción líquido- líquido
Es una operación de transferencia de masa en que una solución líquida que contiene
inicialmente uno o más solutos es mezclado con un líquido inmiscible (disolvente). El
disolvente exhibe afinidad preferente o selectividad hacia uno o más compuestos en la
alimentación y tiene diferente densidad.
Dos corrientes son el resultado de este contacto: el extracto, que es la solución rica que
contiene el soluto extraído que se desea, y el refinado, la solución de alimentación residual
que contiene poco soluto.
La extracción es una herramienta muy útil si se elige un disolvente de extracción adecuado
para la separación de compuestos fenólicos, la extracción líquido-líquido se utiliza con
frecuencia en líquidos de subproductos industriales, tales como los resultantes de la
industria de bebidas (Ignat, I. y col, 2011).
.
b) Extracción solido- líquido
La extracción sólido-líquido, o la lixiviación, se pueden definir como una masa fenómeno
de transporte en el que los sólidos contenidos en una matriz sólida migra en un disolvente
puesto en contacto con la matriz. La masa fenómenos de transporte se pueden mejorar
mediante cambios en la concentración de gradientes, los coeficientes de difusión o capa
límite (Ignat, I. y col, 2011).
Los disolventes más utilizados en los métodos de extracción con disolvente son el metanol
acidificado o etanol. De estos disolventes, la extracción con metanol es la más eficiente.
Estudios han reportado que emplear metanol para la extracción de pulpa de uva se obtuvo
FUNDAMENTACIÓN
32
un rendimiento del 20% más eficaz que el etanol y 73 % más eficaz que la extracción con
agua, sin embargo, en la industria alimentaria se prefiere etanol debido a la toxicidad de
metanol (Li, B. y col., 2006).
El empleo de extracción con solvente implica la co-extracción de compuestos no fenólicos,
tal como azucares, ácidos orgánicos y proteínas, que requieren procesos posteriores de
purificación (Ignat, I. y col, 2011).
Hasta ahora, no se recomienda un disolvente específico o apropiado de extracción para la
recuperación de contenido polifenolico total en muestra fresca, debido a las diversas
estructuras químicas de los polifenoles que van desde formas simples y polimerizadas
(lipófilo) que podrían afectar la solubilidad (Fariza, S.y col., 2011)
c) Fluidos supercrítico
El método de fluidos supercríticos (FSC) es rápido, automatizable, selectivo y evita el uso
de grandes cantidades de disolventes tóxicos. Además, la ausencia de la luz y el aire
durante la extracción reduce los procesos de degradación de los compuestos que pueden
ocurrir durante las técnicas tradicionales. La extracción con FSC se basa en el hecho de
que, cerca del punto crítico, el disolvente cambia sus propiedades rápidamente con
variaciones de presión. Los fluidos supercríticos están reemplazando cada vez más los
disolventes orgánicos tal como n- hexano, diclorometano, cloroformo, y otros que se
utilizan convencionalmente en la extracción industrial, purificación, y las operaciones de
recristalización a causa de regulador y presiones ambientales sobre hidrocarburos y
sustancias que agotan emisiones. La extracción con FSC se solvata por lo cual lo hace
similar a los disolventes orgánicos líquidos, pero con mayor difusividad y viscosidad más
baja (Ignat, I. y col, 2011).
El líquido esencial más utilizado en los FSC es el dióxido de carbono (CO2), debido a su
efecto benigno sobre el medio ambiente, baja toxicidad, inflamabilidad y compatibilidad
con los productos alimenticios procesados. Además, cuenta con condiciones críticas
modestas, puede separarse fácilmente a partir de solutos. Modernas tecnologías sofisticadas
permiten la regulación precisa de los cambios en la temperatura y la presión, y por tanto, la
manipulación de la propiedad de solvatación del FSC, ayudan a la extracción de productos
naturales.
FUNDAMENTACIÓN
33
Bocco y col., (1998), estudiaron el poder antioxidante (PAO) de la semilla y cáscara de
algunos cítricos de Francia, realizaron la extracción con metanol a reflujo durante 30
minutos. Las fases utilizadas para la identificación y cuantificación por HPLC fueron agua
y acetonitrilo. La actividad antioxidante la determinaron mediante la oxidación acelerada de
citronelal en clorobenceno. En la cáscara de limón reportaron un contenido fenólico de 1.65
g/100g b.s., de los cuales, 606 mg / 100g b.s fueron de naringina, sin embargo, no
encontraron hesperidina. En la cáscara de naranja agria reportaron un contenido fenólico de
2.23 g/100g b.s., de los cuales 1097 mg/100g b.s. fueron de naringina y 66 mg/100g b.s. de
hesperidina, y en la lima reportaron 19 mg/100g b.s. de naringina.
Li y col., (2006), determinaron el contenido fenólico de cáscaras de cítricos en Nueva
Zelanda. Realizaron extracciones con etanol, metanol y agua, observando que el agua es
menos efectiva que los otros dos disolventes, y no observaron diferencias significativas en
la extracción de fenoles utilizando metanol o etanol. Analizaron el efecto de utilizar la
cáscara fresca, o con un pretratamiento secando en un horno, reportaron un mayor
contenido fenólico en las cáscaras frescas, esto se debió a la influencia de la temperatura y
el tiempo del proceso de secado en la degradación de los polifenoles; además, el agua
contenida en las células de los frutos ayuda a la extracción de los fenoles y en ausencia de
agua, todos los componentes en las células se adhieren, lo que probablemente hace la
extracción más difícil, y por lo tanto la obtención de fenoles es menor. En la cáscara de
limón extraído con etanol al 80% reportaron 0.31 g/100g b.s. de fenólicos. Los resultados
que obtuvieron realizando una extracción con etanol al 72% fueron los siguientes: La
toronja presentó el mayor contenido fenólico (161.6 ± 17.36 mg/100g), seguida de la
mandarina (121.14 ± 11.89 mg 100g), el limón Yen Ben (118.95 ± 9.35 mg /100g), la
naranja dulce (73.59 ± 5.43 mg /100g), y el limón Meyer (59.77 ± 4.31 mg /100g). Los
datos están expresados en 100 g de cáscara fresca, con un contenido de humedad promedio
del 80%. Estos estudios reportaron que el contenido fenólico está directamente relacionado
con la actividad antioxidante, sin embargo, esto no siempre ocurre, pues los compuestos
fenólicos tienen diferente capacidad antioxidante unos de otros, porque si una fruta tiene un
alto contenido fenólico, pero estos compuestos poseen una baja actividad antioxidante,
entonces la capacidad antioxidante de esta fruta no será muy alta. El poder antioxidante lo
FUNDAMENTACIÓN
34
determinaron por el método de reducción de fierro (FRAP), la cáscara de toronja presentó
la mayor actividad antioxidante, seguida del limón Yen Ben, la mandarina, naranja y
finalmente el limón Meyer.
Xu y col., (2007) analizaron la cáscara de una variedad de toronja China, (C. pardisi
Changshanhuyou), para la cuantificación con la técnica de HPLC utilizaron como fase
móvil metanol/agua/ácido acético (37:59:4 v/v). Realizaron un pre tratamiento calentando
las cáscaras a diferentes temperaturas y tiempos, realizando la extracción con metanol 80%.
Calentando a 120ºC durante 90 minutos, reportaron un contenido fenólico de 4.7 g/100g
b.s., de los cuales 2782 mg/100g b.s. fueron de naringina y 149 mg/100g b.s. de
hesperidina. Estos estudios revelaron que la capacidad antioxidante aumentó con el tiempo
y temperatura de extracción, al igual que el contenido de fenoles totales.
Wang y col., (2008), analizaron cáscaras de algunos cítricos de Taiwan, realizando la
extracción con metanol a 85ºC durante 12 horas. Para la identificación por HPLC utilizaron
dos fases: ácido acético acuoso 2% (Fase A), y 0.5% ácido acético acuosoacetonitrilo (Fase
B). En la cáscara de mandarina reportaron un contenido fenólico de 4.92 g/100g b.s., con
54 mg/100g b.s. de naringina y 11.39 mg/100g b.s. de carotenoides. En la cáscara de
naranja dulce reportaron un contenido fenólico de 3.55 g/100g b.s., con 36mg/100g b.s. de
naringina y 10.81 mg/100g b.s. de carotenos. En la cáscara de limón reportaron un
contenido fenólico de 3.27 g/100g b.s. con 151 mg/100g b.s. de naringina y 1.49 mg/100g
b.s. de carotenos.
Kuljarachanan y col., (2009), en Tailandia, analizaron la cáscara de lima. Realizaron la
extracción con agua-acetona (1:1 v/v) durante 15 horas a 30ºC; reportaron un contenido
fenólico de 811±77.6 mg/100g b.s.
Chen, M. y col., (2011), analizaron cáscaras de cítricos por diversos métodos. Este estudio
investigó los efectos de las diferentes temperaturas de secado (50, 60, 70, 80, 90 y 100 ⁰C)
sobre los cambios en el flavonoide, ácidos fenólicos y actividad antioxidante de las cascaras
de los cítricos (Citrus sinensis (L.) Osbeck). Los fenoles totales y el contenido de
FUNDAMENTACIÓN
35
flavonoides de cascaras de naranja secadas se redujeron en menor temperatura de secado
(50 y 60 ° C) y a mayor temperatura de secado aumento (70, 80, 90 y 100 ° C). Las
cantidades de los compuestos fenólicos en el 100 ⁰C extracto de la muestra tratada fueron
significativamente mayores que las cantidades en las muestras calentadas a otra
temperaturas (P < 0,05). Los valores de CE50 de los extractos de cáscara de naranja del
DPPH efectos radicales barrido y ABTS+ efectos de barrido aumentaron con menor
temperatura de secado y la disminución de secado a más altas temperatura y los valores de
del extracto de la muestra tratada a 100 ⁰C fueron significativamente menores que las
muestras calentadas a otras temperaturas (P < 0,05). Sin embargo, las actividades de Fe2 +
quelantes de las muestras mostro una tendencia opuesta.
En la tabla 6 se presentan algunos disolventes empleados para la extracción de polifenoles
en cítricos.
Tabla 6. Estudios realizados en la extracción de polifenoles de cítricos
Cítrico Polifenoles
(g/100g B.S)
Temperatura
(⁰C)
Tiempo
(min)
Disolvente y
concentración
Autor
Limón 1.65 80 30 Metanol Bocco y col., 1998
Naranja agria 2.23
Limón 0.306 NR NR Etanol 80% Li y col., 2006
Toronja 0.161 Etanol 76%
Toronja 4.7 120 90 Metanol 80 % Xu y col, 2007
Mandarina 4.92 80 12h Metanol Wang y col., 2008
Naranja dulce 3.55
limón 3.27
Lima 0.811 30 15h Agua-acetona
(1:1 v/v)
Kuljarachanan y
col., 2009
Citrus sinensis
(L.) Osbeck
3.94-6.27 50-100 48h Metanol Chen M. y col.,
2011
Como se puede observar, las variables más empleadas indistintamente en la extracción de
polifenoles son la concentración y tipo de disolvente, la temperatura y el tiempo de
FUNDAMENTACIÓN
36
extracción y al realizar alguna modificación en estas variables, se extraen cantidades muy
diferentes de polifenoles. El metanol y etanol son los disolventes mayormente empleados,
sin embargo, el etanol será más aceptado para la extracción de los compuestos debido a que
el metanol es un compuesto tóxico.
5.8. Vida de anaquel
Los productos alimenticios, están permanentemente sujetos a cambios desfavorables que lo
hacen notorio en su aspecto físico o fisicoquímico. Esencialmente, estos cambios afectan la
vida de anaquel de un producto que depende de factores ambientales, como la humedad,
temperatura de exposición, proceso térmico al que se somete y la calidad de las materias
primas, entre otros. El efecto de estos factores se manifiesta en el cambio de las cualidades
del alimento que evitan su venta: cambios de sabor, color, textura o pérdida de nutrientes lo
que provoca que al final de la vida de anaquel de un producto se alcance cuando ya no
mantienen las cualidades requeridas para que el consumidor final lo utilice (García, B.C
2008).
Para determinar la vida útil de un alimento o producto, primero se debe identificar las
reacciones químicas o biológicas que influyen en la calidad y seguridad del mismo,
considerando la composición del alimento y el proceso a que es sometido para poder
proceder a establecer las reacciones más críticas en la calidad (García, B.C y col., 2008).
Por ello el tiempo de vida de anaquel se puede estimar mediante varios métodos: pueden
tomarse valores reportados en la literatura especializada de alimentos similares y bajo
condiciones similares al producto de nuestro interés; se pueden monitorear las quejas de los
consumidores para orientar los posibles valores de vida de anaquel; se pueden evaluar
atributos de calidad del alimento que varían durante la vida de anaquel o mediante pruebas
aceleradas (García, B.C y col., 2008). Las cuales son métodos acelerados de estimación de
la vida de anaquel de alimentos que se basan en la aplicación de los principios de la cinética
química sobre el efecto que las condiciones ambientales como temperatura, presión,
humedad, gases de la atmósfera y luz, tienen sobre la velocidad de la reacción. La
determinación rápida de la caducidad (Acelerated shelf life determination, ASLD) es
utilizada para disminuir el tiempo necesario para estimar la caducidad, de otro modo sería
excesivamente largo. Debido a la globalización del comercio alimentario y del aumento de
FUNDAMENTACIÓN
37
la competencia tanto nacional como internacional, ha aumentado la necesidad de establecer
rápidamente la caducidad de un producto. Esta situación se hace más urgente cuando la
caducidad de un producto se prevé que va a ser larga, de meses a varios años. Son bien
conocidos los efectos que causa aumentar la temperatura en muchas reacciones químicas,
junto con los cambios negativos que tiene durante el almacenamiento. Por tanto, la manera
más común de realizar la determinación rápida de la caducidad consiste en almacenar el
producto a temperaturas elevadas (Man, D. 2002). Por lo tanto los métodos que aceleran el
deterioro por efecto de ésta se basan en el cumplimento de la ley de Arrhenius; la ecuación
1 para calcular el efecto de la temperatura sobre la vida media es (Palazón, M.A. ei al.,
2009)
𝑡𝑠 = 𝑡0 ∗ 𝑒𝐸𝐴𝑅 ⌊
1
𝑇0−
1
𝑇𝑠⌋ Ec.1
Dónde: tS es el tiempo de vida de anaquel a la temperatura TS, t0 es el tiempo a la
temperatura T0, R es la constante de los gases ideales, y EA es la energía de activación para
la reacción de deterioro.
Cabe mencionar que las pruebas de laboratorio simulan las condiciones reales, pero existen
variables como las condiciones de transporte, cambios de presión, fluctuaciones de
temperatura, entre otras, que son difíciles de duplicar. Por lo tanto, los resultados obtenidos
estiman la vida de anaquel de los alimentos (García, B.C y col., 2008).
5.9. Color
El color se define como la sensación resultante de estimular la retina por las ondas
luminosas comprendidas en la región visible del espectro. Otros atributos relacionados con
el color son el tono y la saturación de un color, y la luminosidad. El tono es la propiedad de
color definida por el estado químico del pigmento. La saturación se refiere a la cantidad de
polifenoles presente, y la luminosidad es función del estado físico de la superficie de la
harina, y se define como el grado de luminosidad de un color con relación a un gris neutro
en una escala que se extiende del negro absoluto al blanco absoluto (Brazal, 1975; Warris y
col., 1990).
El sistema de representación del color más adecuado es el CIELAB (CIE, 1986), ya que se
presenta más uniforme en la zona de los rojos (Hernández, 1994). Este sistema emplea las
FUNDAMENTACIÓN
38
coordenadas tricromáticas L* (luminosidad), a* (índice rojo) y b* (índice de amarillo), de
manera que a partir de relaciones entre ellas se pueden obtener las coordenadas
colorimétricas, la intensidad de color o saturación y el tono. La coordenada L* es la más
relacionada con la valoración visual del consumidor. Depende de varios factores como el
pH, la capacidad de retención de agua y la humedad.
a) El CIE LCH espacio de color o modelo Color
Este modelo es fácil de comprender que el espacio de color Lab, con el que comparte varias
características. Es conocido más correctamente como L* C* h⁰. Esencialmente, es en la
forma de una esfera. Hay tres ejes, L* y C* y hº. El eje L* representa la luminosidad. Esta
es vertical; desde 0, que no tiene luminosidad (es decir, negro absoluto), en la parte inferior,
a través de 50 en el medio, a 100 que es la máxima ligereza (es decir, blanco absoluto) en la
parte superior .
El eje C * representa Chroma o "saturación". Esto va desde 0 en el centro del círculo, el
cual es completamente insaturado (es decir, un gris neutro, negro o blanco) a 100 o más en
el borde del círculo de muy alta Croma (saturación) o " pureza de color”.
Si realizamos un corte horizontal a través del centro, vemos un círculo de color. Alrededor
del borde del círculo que vemos todos los colores saturados posible, o Hue. Este eje circular
es conocido como H ° de Hue. Las unidades son en forma de grados ° (o ángulos), que van
desde 0 ° ( rojo) 90 º (amarillo), 180 º (verde ) , 270 º ( azul) y de nuevo a 0 ° .
En la figura 11 se presenta hue h⁰, croma C* y la luminosidad L* (espacios del color L*,
a*, b).
Figura 11. a) Representación de hue h⁰, croma C* y la luminosidad L*. b) Espacios del color L*, a*, b
MATERIALES Y MÉTODOS
39
6.- MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. ETAPA I. Elaboración de harina de subproducto de limón italiano
6.1.1. Colecta del material biológico
El material biológico, subproductos de limón italiano Citrus limón (L). Burns (cáscara,
bagazo y semilla) fue colectado en la Juguera de Akil, perteneciente a la Unión de Ejidos
Citricultores del Sur del Estado, localizado en el municipio de Akil Yucatán a una distancia
de 80 kilómetros en dirección sureste de la ciudad de Mérida.
Los subproductos de limón italiano con el que se realizó la primera etapa del trabajo, se
colectaron en el mes de septiembre del 2012, los residuos colectados fueron los obtenidos
después de extraerle al fruto cítrico los aceites esenciales por el método de prensado en frío
el cual consistió en aplicar presión a las cáscaras para romper las glándulas de aceite,
anterior a la obtención del jugo, realizado por parte de la Juguera. La muestra colectada, fue
dividida en lotes de 2 kilos, los cuales se depositaron en bolsas de plástico debidamente
etiquetadas y se transportaron al Laboratorio de Tecnología de Alimentos de la Unidad
Sureste del CIATEJ donde se almacenaron a una temperatura de -2 ⁰C (figura 12).
Figura 12. Colecta y almacenamiento del material biológico
MATERIALES Y MÉTODOS
40
6.1.2. Secado del material biológico para la obtención de harinas de subproducto de
limón italiano.
Para el secado de subproductos de limón italiano se emplearon las muestras almacenadas a
-2 ⁰C, para ello se plantearon dos diseños factoriales, en los que se evaluaron los factores
tiempo y temperatura teniendo como variable de respuesta el porcentaje de humedad,
contenido de polifenoles totales, actividad antioxidante y antimicrobiana. En el primer
diseño factorial 4x8 se emplearon para el factor tiempo, niveles de 12, 24, 36 y 48 h y para
el factor temperatura niveles de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 y 110 ⁰C. Para esta prueba se
emplearon treinta y dos lotes de subproducto de limón italiano (anexo1), los cuales fueron
secados en un horno convencional de la marca Shellab. Las muestras secas fueron molidas
y tamizadas a un tamaño de partícula de 500 micras para la obtención de harina (figura
13).Las muestras obtenidos a los diferentes tiempos fueron analizados por triplicado para
determinar al porcentaje de humedad, así como las variables de respuesta correspondientes.
En el segundo diseño factorial 2 x 8, se emplearon los factores temperatura y tiempo, el
primero fue a niveles de 50 y 110 ⁰C y el tiempo fue evaluado a diferentes niveles para
cada temperatura, lo anterior con la finalidad de obtener intervalos más cortos. Para 50°C
los niveles de 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 h y 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16 h para la temperatura
de 110 ⁰C (anexo 2). El procedimiento para la obtención de las harinas fue similar a lo
establecido en el primer diseño factorial. Evaluando como variable de respuesta el
porcentaje de humedad, contenido de polifenoles totales, actividad antioxidante y
antimicrobiana.
Al igual que el primer diseño las mediciones correspondientes para cada tiempo y
temperatura se realizaron por triplicado.
6.1.3. Determinación de humedad
La humedad se determinó mediante termobalanza MB45mediante la utilización de, 2 g de
harina que fueron colocados en el platillo del equipo, las mediciones fueron realizadas de
acuerdo al principio termogravimétrico, es decir, la humedad fue determinada a partir de la
pérdida de peso de la muestra desecada por calentamiento de acuerdo a lo reportado como
programa de determinación de humedad en harinas del equipo (figura 13).
MATERIALES Y MÉTODOS
41
Figura 13. Secado y prueba de humedad de subproductos de limón italiano
6.1.4. Extracción y cuantificación de polifenólicos de limón italiano
La extracción de polifenoles de harinas de subproducto de limón italiano se realizó de
acuerdo a la metodología reportada por Sánchez-Contreras y col., (2012). El contenido de
polifenoles totales se determinó por espectrofotometría siguiendo la metodología propuesta
por Vasco y col., (2008) con algunas modificaciones. 20 L de extracto, se mezclaron con
250 μL de Folin Ciocalteu a temperatura ambiente durante 3 min, posteriormente 1250 l
de una solución de carbonato de sodio (Na2CO3) (20 % en agua) fueron adicionados,
posteriormente se realizó una agitación de la mezcla para ser llevado a un volumen de 2 mL
con agua destilada. Adicionalmente la muestra se dejó en reposo durante 2 h a temperatura
ambiente en condiciones de oscuridad para su posterior análisis de absorbancia a 760 nm
mediante la utilización de un l espectrofotómetro ultravioleta-visible de la marca Perkin
Elmer Lambda 40. Para el análisis cuantitativo se construyó una curva de calibración con
ácido gálico a concentraciones de 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.125, 0.15, 0.175, 0.2 mg/ mL.
Lo anterior con el fin de expresar los resultados en términos de equivalentes de ácido gálico
(EAG)/ g de harina base seca. Cabe mencionar que todas las determinaciones se realizaron
por triplicado.
MATERIALES Y MÉTODOS
42
6.1.5. Determinación de la actividad antimicrobiana de extractos de polifenoles
6.1.5a. Microorganismos
Con los extractos obtenidos de las harinas de subproducto de limón italiano se evaluó la
actividad biológica sobre los microorganismos Escherichia coli ATCC 25922,
Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Salmonella typhimurium ATCC 14028, los cuales
fueron adquirido del cepario del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y
Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ) Unidad Sureste. Las cepas fueron reactivadas en
caldo nutritivo y resembradas en placa para la evaluación de su viabilidad y pureza.
6.1.5b. Actividad antimicrobiana cualitativa de extractos polifenólicos
Para esta prueba se tomaron extractos polifenólicos que fueron estandarizados a
concentración de 27 mg/g base seca (b.s) y se colocaron individualmente en microplacas de
96 pozos. Posteriormente medio de cultivo Mueller-Hinton (M-H) fue adicionó al sistema
hasta obtener un volumen final de 150 μl. Finalmente se adicionó 50 μl de inóculo de cada
bacteria ajustado al tubo 0.5 de MacFarland que contenía alrededor de 106 UFC/ml como
concentración final de cada microorganismo. Las microplacas fueron incubadas a 37 ⁰C por
24 h, pasado el tiempo de incubación las muestras diluidas fueron sembradas en cajas de
agar M-H, e incubadas a las mismas condiciones. Para esta prueba solo se observó
cualitativamente el crecimiento microbiano mediante la presencia o ausencia del
microorganismo como indicativo de inhibición por el extracto.
6.1.5c. Concentración mínima inhibitoria (CMI)
La prueba de CMI contra las cepas S. typhimurium, E. coli, S. aureus, fue calculada solo
para los extractos de polifenoles de harinas con humedades del 15 por ciento o inferiores,
valor establecido por la norma del CODEX para harina de trigo (Codex Standard 152-1985)
y que fueron obtenidas del segundo diseño factorial 2 x 8. Para esta prueba se empleó la
metodología propuesta por Lagnika y col., (2011) con ligeras modificaciones. Para ello se
empleó una microplaca de 96 pozos donde se realizó microensayos de siete diluciones
seriadas, y se usó el indicador redox violeta p-yodonitrotetrazolio como indicador del
crecimiento. Los extractos polifenólicos fueron ajustados a concentraciones conocidas
iniciando con 25, 23.3, 11.7, 5.8, 2.9, 1.5, 0.75mg de polifenoles/g base seca Lo anterior se
realizó en pozos de 200 μL, obteniendo 100 μL de cada dilución a las concentraciones
finales previamente indicadas. Para obtener este volumen el extracto polifenólico fue
MATERIALES Y MÉTODOS
43
ajustado con solución salina (NaCl 0.9 N). Posteriormente se adicionaron 50 μL de
solución salina y 50 μL del inóculo de bacterias con concentración final de106 UFC/mL en
cada pozo. Se utilizó amikacina como antibiótico de referencia como control positivo y se
utilizó solución salina como control negativo. Las microplacas fueron incubada a 37 ⁰C por
24 h, después de este tiempo 30 μL de 0.2 mg / mL de solución de p-iodonitrotetrazolio fue
adicionado en cada pozo y posteriormente la microplaca fue incubada a 37 ⁰C. Después de
una hora de incubación se verificó la presencia de cambio de color rosado como indicador
de crecimiento, el valor de la primera concentración de polifenoles en donde no se presentó
cambio de coloración fue registrado como valor de CMI.
6.1.6. Determinación de la capacidad antioxidante de extractos polifenólicos de harina
de subproducto de limón italiano
La actividad antioxidante de los extractos polifenólicos fue evaluada mediante la
determinación del porcentaje de inhibición de la formación de radicales libres DPPH• (2,2-
difenil-1-picril-hidracilo) de acuerdo a la ecuación 2, siguiendo el método propuesto por
Chen, M. y col., (2011) con algunas modificaciones. A 2.9 mL de una solución de DPPH•
(0.1mM) se le adicionó un volumen de extracto de polifenoles con una concentración
conocida, posteriormente se llevó a un volumen final de 3 mL con la solución de DPPH•.
Finalmente a los 30 minutos de reacción, se realizaron las mediciones espectrofotométricas
correspondientes a una longitud de onda de 517 nm.
𝑝𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑗𝑒 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 (%) =⌊𝐴𝑎−(𝐴𝑏−𝐴𝑐)⌋
𝐴𝑎𝑥 100 Ec. 2
Dónde:
Aa: Absorbancia del blanco de la solución de DPPH•
Ab: Absorbancia de la mezcla que contiene DPPH• y la muestra
Ac: Absorbancia de la solución en blanco sin DPPH•
6.1.7. Color de la harina de subproducto de limón italiano
La determinación del cambio de color de las harinas secadas a diferentes temperaturas, se
realizó de acuerdo a la metodología de Kumar, J.A. y col., (2013), mediante la aplicación
de un colorímetro MiniScan Ez. El valor del color se expresó usando los parámetros
MATERIALES Y MÉTODOS
44
L*(luminosidad), a* (+ rojo, - verde), b*(+ amarillo, -azul), croma o saturación (C*) de
acuerdo a la ecuación 3 y hue (h⁰) de acuerdo a la ecuación 4.
C∗ = √𝑎∗2 + 𝑏∗2 Ec.3 h⁰=tan−1 b∗
a∗ Ec.4
6.1.8. Actividad del agua de harina de subproducto de limón italiano
La actividad de agua de las muestras obtenidas se realizó mediante la utilización de un
equipo higroPalm HP 23-Aw-A, 10 g de harina fueron utilizados para la medición la cual se
llevó a cabo por triplicado.
6.1.9. pH de la harina de subproducto de limón italiano
El pH fue calculado de acuerdo a la metodología propuesta por la AOAC 943.02, se pesó
1g de harina de subproducto de limón Italiano y se diluyó en 10 mL de agua,
posteriormente se agitó vigorosamente y con ayuda de un potenciómetro de la marca
OAKLON se determinó el pH el cual fue registrado por triplicado para cada una de las
muestras analizadas.
6.1.10. Acidez titulable total de harina de subproducto de limón italiano
Para esta prueba, se utilizó la metodología de la AOAC 935.57 Se pesó 1 g de harina de
subproducto de limón italiano y se disolvió en 20 mL de agua destilada, posteriormente la
mezcla fue filtrada al vacío. La muestra filtrada se colocó en un matraz Erlenmeyer de 25
mL y se tituló con una solución de NaOH 0.1M. Se empleó fenolftaleína como indicador.
El resultado se expresó como porcentaje de ácido cítrico de acuerdo a la ecuación 5.
𝑃𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑗𝑒 𝑑𝑒 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 (𝑔 á𝑐𝑖𝑑𝑜𝑐í𝑡𝑟𝑖𝑐𝑜
100𝑚𝐿) = [
(𝑉𝑚𝑥)(𝐶𝑚𝑥)(𝐹á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑐í𝑡𝑟𝑖𝑐𝑜)(100)
(𝐶𝑁𝑎𝑂𝐻 0.1𝑀)(𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑔)] Ec. 5
Donde
Vmx= Volumen de gasto de la solución de NaOH estandarizado
Cmx= Concentración de la solución de NaOH estandarizado
CNaOH 0.1M = Concentración ideal de la solución de NaOH 0.1 M
MATERIALES Y MÉTODOS
45
Fácido cítrico = Factor de conversión de equivalencia de 1 mL de NaOH 0.1M a ácido cítrico
anhidro (0.006404)
6.1.11. Análisis bromatológico de la harina de subproducto de limón italiano con las
mejores condiciones de secado.
Para la determinación de la humedad, proteínas (N x 6.25), cenizas, grasas (extracto
etéreo), carbohidratos totales, fibra cruda, vitamina C, calcio y potasio de la harina de
subproducto de limón italiano obtenida con las mejores condiciones de secado, se
emplearon las siguientes normas:
Métodos oficiales de análisis, Asociación de los químicos analíticos oficiales. 15ª
Edición, 1990. Volumen I.A.O.A.C. Método 986.25 Carbohidratos, determinación
para diferenciar el análisis inmediato.NMX-F-083-1986. Determinación de
humedad en productos alimenticios.NMX-F-608-NORMEX-2011 Determinación
de proteínas en alimentos – método de prueba.NMX-F-607-NORMEX-2002
Determinación de cenizas en alimentos – método de prueba.NMX-F-615-
NORMEX-2004 Determinación de extracto etéreo (método soxhlet) en alimentos-
Método de prueba.NMX-F-613-NORMEX-2003 Determinación de fibra cruda en
alimentos-Método de prueba oficial método de análisis, Asociación de los químicos
analíticos oficial, 18ª Edición. 1990. Volumen I.A.O.A.C. 967.21 Vitamina C. EPA
6010B Espectrometría de emisión atómica por plasma de acoplamiento inductivo-
empleando la norma; Nom-117-SSA1-1994 punto 7.3.1 Método para la
determinación de cadmio, arsénico, plomo, estaño, cobre, fierro, zinc y mercurio en
alimentos, agua potable y purificada por espectrofotometría de absorción atómica.
6.1.12. Determinación del tiempo de vida útil de harinas de subproducto de limón
italiano
La determinación del tiempo de vida útil de las harinas de subproducto de limón italiano se
realizó con la harina que presentó las mejores condiciones de secado obtenidas del diseño
factorial 2 x 8. Para el análisis se emplearon pruebas aceleradas descritas por Gamboa y
col., (2008) y López-Duarte y col., (2009) con algunas modificaciones. Los valores críticos
que se evaluaron fueron el porcentaje de humedad, la concentración de polifenoles totales,
actividad antimicrobiana y antioxidante, pH, acidez, color y actividad del agua (Aw), dando
MATERIALES Y MÉTODOS
46
mayor importancia al cambio de color debido a la naturaleza de la muestra que se considera
como poco perecedera. Para el análisis se prepararon muestras conteniendo 10 g de harina y
se almaceno en bolsas negras de polipropileno a dos temperaturas diferentes de incubación
35 y 60 ⁰C. Las muestras incubadas a la temperatura de 35 ⁰C, se le realizaron las pruebas
mencionadas anteriormente cada siete días por un periodo de tres meses y medio. Y las
muestras incubadas a 60 ⁰C cada tres días, durante un periodo aproximado de mes y medio.
Cabe mencionar que el porcentaje de humedad, la concentración de polifenoles totales,
actividad antimicrobiana y antioxidante, pH, acidez, color y actividad del agua (Aw) se
realizaron por duplicado y de acuerdo a las metodologías mencionadas en apartados
anteriores (figura 14).
Figura 14. Vida de anaquel de harina de subproducto de limón italiano
.
MATERIALES Y MÉTODOS
47
6.2. ETAPA II. Evaluación de la extracción de compuestos polifenólicos en harinas de
subproducto de limón italiano
6.2.1. Evaluación de los solventes y sus concentraciones, temperaturas y tiempos de
extracción de harina de subproducto de limón italiano previamente seleccionada.
Para determinar el mejor método de extracción de los compuestos polifenólicos totales en
harina de subproducto de limón italiano a las condiciones establecidas en la primera etapa (
secada a 50 ⁰C por 21h), así como el contenido de flavonoide totales, actividad
antimicrobiana y antioxidante, se planteó un diseño factorial 34 en el que se evaluaron 4
factores a tres niveles que se describen a continuación: solvente (etanol, acetona, metanol),
concentración de solvente (50, 70 y 90 %), temperatura (15, 25, 40 ⁰C) y tiempo (1, 2.5 y 4
horas), y como variables de respuesta: contenido de polifenoles totales, flavonoides totales,
actividad antioxidante y antimicrobiana. En el Anexo 3 se muestra el modelo empleado. De
igual forma se realizó una extracción control de acuerdo a la metodología reportada por
Sánchez-Contreras y col., (2012). Para el estudio, se pesó un gramo de harina de limón
italiano, y se introdujo en un matraz de 250 mL posteriormente se agregó el disolvente
(etanol, acetona, metanol) a las distintas concentraciones, en una proporción
harina/disolvente 1:10 (50% V/V de disolvente). Solo para los tratamientos realizados a la
temperatura de 15 ⁰C, los matraces fueron colocados a baño con hielo manteniendo
agitación y temperatura constante. Posteriormente los extractos se centrifugaron a 4500 rpm
durante 25 minutos a temperatura de 4 ⁰C. Finalmente los extractos obtenidos fueron
filtrados con papel Whatman # 1 y colocados en botellas de color ámbar a una temperatura
de 4 ⁰C hasta su posterior análisis. Cabe mencionar que los tratamientos se hicieron por
duplicado. La determinación del contenido de polifenoles, actividad antioxidante y
antimicrobiana se realizó de acuerdo a las metodologías mencionadas en los apartados
anteriores.
6.2.2 Determinación del contenido total de flavonoides
El contenido total de flavonoides se determinó usando la metodología descrita por Lira y
col., (2002) con algunas modificaciones. 100 μL de extracto polifenólico fueron colocados
en un vial de color ámbar y posteriormente se agregó el disolvente metanol (50% V/V), en
una proporción extracto/disolvente 1:10. De igual forma se adiciono 1 mL de AlCl3 al 2%
en metanol. Las muestras se mantuvieron en reposo por un tiempo de 30 minutos en el que
MATERIALES Y MÉTODOS
48
se llevó a cabo la reacción y se leyó la absorbancia a 420 nm. Para determinar el contenido
de flavonoides totales como equivalente de quercetina, se preparó una curva estándar de
quercetina (0.1, 0. 3, 0.5, 0.7, 1.0, 1.3 y 1.6 mg/ mL). El análisis se realizó por duplicado
para cada muestra y se reportó el promedio de las dos lecturas como equivalentes de
quercetina (EQ)/ g de harina base seca.
6.2.3. Cromatografía en capa fina (CCF)
Esta prueba solo se realizó a los extractos polifenólicos que presentaron las mejores
condiciones de extracción en el diseño 34. Para ello se empleó la metodología de Valgas y
col., (2007) con algunas modificaciones. Se empleó un cromatofolio de cromatografía de
capa fina (CCF) de silica gel con un tamaño de 20 x 20 cm, ha dicho cromatofolio se le
trazo una línea de 1 cm en la parte superior y otra en la parte inferior con marcas de
referencia. Posteriormente, con ayuda de un capilar de vidrio se depositaron en el borde
inferior 3 μL de extracto polifenólico a una concentración de 5 mg/g b.s. Así mismo se
aplicaron 3μL de las muestras de referencias comerciales de neohesperidina, hesperidina,
naringina, ácido elagico y quercetina a concentraciones de 1mg/ mL y por ultimo una
muestra control (extracto obtenido por la metodología de Sánchez-Contreras y col., 2012).
Previo a la preparación de las placas cromatográficas la cámara fue saturada con los
vapores de la fase móvil (mezcla de acetato de etilo, ácido fórmico y agua 11:2:7), para
favorecer la saturación, se introdujo en la cámara un papel filtro cuya parte inferior se
sumergió en la fase móvil. Se dejó una franja de la pared de la cámara al descubierto, para
poder dar seguimiento al proceso cromatográfico sin necesidad de destapar la cámara. Una
vez seco el cromatofolio de silica gel se depositó en la cámara saturada cuidando que la
fase móvil no tuviera contacto directo con las muestras depositadas en la cromatoplaca,
quedando su nivel por debajo de la línea de aplicación de la muestra.
La placa fue extraída de la cámara cuando el frente del disolvente se encontraba en el borde
superior trazado. Luego se dejó secar el solvente y posteriormente la cromatoplaca fue
revelada con tricloruro de aluminio (AlCl3) al 5%. Después de dejar reposar la placa para la
evaporación de la fase móvil, se observó bajo la lámpara UV-visible lo descrito
anteriormente se puede observar en la figura 15. Mediante fotodocumentación se indicaron
MATERIALES Y MÉTODOS
49
los valores de distancia recorrida de cada compuesto y se calculó los correspondientes
valores de Rf (factor de retención) (ecuación 5).
𝑅𝐹(𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑐𝑖ó𝑛) =(𝐷𝑀)𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜
(𝐷𝐹)𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 Ec. 5
Figura 15. Esquema de Cromatografía en capa fina de extractos polifenólicos de harina de subproducto de
limón italiano
6.3. Análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron por duplicado o triplicado y se registraron los valores
medios con desviaciones estándar. Los datos experimentales se analizaron mediante un
análisis de varianza (ANOVA) para determinar si existe diferencia significativa entre los
factores. Se utilizó la prueba de rangos múltiples de Duncan para establecer las
comparaciones múltiples de los valores medios, valores medios fueron considerados en el
nivel de confianza del 95% (p< 0.05). Se empleó el programa estadístico SPSS
STATGRAPHICS Centurion XVI.I (versión 14) para realizar todos los cálculos
estadísticos.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
50
7. RESULTADOS Y DISCUSIONES
7.1. Secado de subproductos de limón italiano
Debido a que uno de los principales métodos de conservación de productos alimenticios es
el secado, en la primera etapa del presente trabajo se realizó el secado de los subproductos
de limón italiano con la finalidad de poder conservar la materia en almacenamiento por
periodos de tiempo más largos, reducir el volumen y facilitar la extracción de compuestos
de interés, sin embargo los procesos de secado con aire caliente presentan efectos en las
características de los compuestos de interés que estos pudieran contener, tal es el caso de
los polifenoles y en particular los flavonoides. De acuerdo a lo anterior en esta etapa del
trabajo experimental se evaluó el efecto de la temperatura y el tiempo de secado de
subproductos de limón italiano sobre la concentración de polifenoles totales presentes en
las harinas resultantes. Para ello se plantearon dos diseños experimentales. En el primero,
se estableció un diseño 4x8 en el cual se analizaron dos factores, siendo el primero el
tiempo estableciendo cuatro niveles de 12, 24, 36 y 48 h, el otro factor a evaluar fue la
temperatura a niveles de: 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 y 110⁰C. El segundo diseño
experimental evaluado fue un 2 x 8, empleando para el factor temperatura niveles de 50 y
110 ⁰C y para el factor tiempo ocho niveles que para la temperatura de 50 ⁰C fueron 3, 6, 9,
12, 15, 18, 21 y 24 h y para la temperatura de 110 ⁰C los niveles de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16
h. Para la elección de la mejor temperatura y tiempo de secado de los subproductos de
limón italiano se empleó como variable de respuesta la humedad de los subproductos la
cual debería ser inferior a lo establecido por la CODEX para harinas (15%), posteriormente
se tomó en cuenta la concentración de polifenoles, buscando obtener las condiciones
adecuadas para la mayor recuperación, sin embargo también se tomó en cuenta que los
extractos polifenólicos obtenidos presentaran actividad antimicrobiana y antioxidante. Los
resultados obtenidos a partir de los diseños evaluados se presentan a continuación.
7.2. Efecto de la temperatura y tiempo de secado en la reducción del porcentaje de
humedad de subproductos de limón italiano empleando el diseño experimental 4 x 8.
Los resultados de la evaluación del tiempo y la temperatura de secado en la reducción del
porcentaje de humedad del análisis experimental 4x8 se presentan en la figura 16, en esta
gráfica se puede apreciar la disminución del porcentaje de humedad para cada una de las
RESULTADOS Y DISCUSIONES
51
temperaturas de secado evaluadas de los subproductos de limón italiano con respecto al
tiempo a. Para el tiempo cero (muestra fresca) el porcentaje de humedad obtenido fue de
84.5 ± 0.9 % de humedad, durante las primeras 12 h de secado (figura 16) se observó la
máxima reducción del porcentaje de humedad para las temperaturas de 60 a 110°C,
alcanzando valores alrededor del 10%, los cuales se encuentran dentro de lo reportado por
la norma CODEX para harina. La temperatura de 50°C alcanzó el valor aceptado por la
norma a las 24h y la temperatura de 40°C hasta las 36h. Si bien las muestras secadas en el
intervalo de 60 a 110°C no presentaron una diferencia significativa en la reducción de
humedad después de las 12 h, las muestras secadas a 110 ⁰C presentarón el menor valor de
% de humedad a las 36 h siendo este de 1.7 ±0.1 % de humedad. Como se puede observar
en la figura 16, como era de suponerse al incrementar el tiempo de secado de los
subproductos de limón italiano se disminuye el porcentaje de humedad, de igual forma que
conforme se incrementa la temperatura de secado. Sin embargo la evaporación del agua
también favorece el incremento de la concentración de los solutos en la superficie.
El análisis de varianza indicó que los factores principales tiempo y temperatura a los
niveles evaluados, así como su interacción se observó un efecto significativo sobre el
porcentaje de humedad ya que el valor P fue menor al nivel de significancia (α= 0.05)
establecido tal y como se presenta en el diagrama de Pareto (figura 17), mostrando que la
temperatura presentó el mayor efecto sobre el porcentaje de humedad,
Los resultados obtenidos del porcentaje de humedad en este primer diseño experimental
indicaron que el cambio de humedad cada doce horas fue muy rápido (ver figura 16), a
temperaturas de 60 hasta 110 ⁰C la reducción de humedad fue muy drástica con respecto a
las temperaturas de 40 y 50 ⁰C. Por lo cual, se propuso para el segundo diseño factorías 2 x
8 intervalos menores de tiempo de muestreo tomando como máximo de 24 h debido a que
los subproductos de limón italiano a partir de este tiempo alcanzaron la humedad (15 %)
establecida por la CODEX para harina. Sin embargo, la evaluación de las velocidades de
pérdida de humedad, cuantificación de polifenoles y la evaluación de la actividad biológica
también fue determinada a todas las muestras obtenidas de este primer diseño experimental
con la finalidad de identificar las temperaturas a evaluar en el siguiente diseño.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
52
Figura 16. Reducción del porcentaje de humedad de subproducto de limón italiano
7.2. a. Velocidad de secado de harinas de subproducto de limón italiano
Para la determinación de la velocidad de secado de los subproductos de limón italiano, fue
necesario graficar el porcentaje de perdida de H2O de los subproductos con respecto al
tiempo de secado tal como lo muestra la figura 18, con ayuda del programa OriginPro 8 en
función de la ecuación de SGompertz (Anexo) se calculó el valor de la velocidad de secado
(k) Para cada temperatura evaluada. Obteniendo como resultado los datos indicados en la
tabla 7.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Porc
enta
je d
e H
um
edad
(%
)
Tiempo (h)
40⁰C
50⁰C
60⁰C
70⁰C
80⁰C
90⁰C
100⁰C
110⁰C
Efectos estandarizados
0 1 2 3 4 5
AB
B:Temperatura
A:Tiempo
+-
Figura 17. Grafica de Pareto para para el porcentaje de humedad del diseño 4x8
RESULTADOS Y DISCUSIONES
53
En la figura 18 se ilustra la correlación de la perdida de H2O de subproducto de limón
italiano a diferentes temperaturas evaluadas, observando que las temperaturas de 60,70 80,
90, 100 y 110 ⁰C son superponibles, lo que indica que a mayor temperatura de secado no
hay un aumento en la velocidad, por el fenómeno denomina “acortezamiento” (“case
hardening”), este efecto impide la liberación de agua en el alimento debido a la formación
de una capa superficial dura e impenetrable que ralentiza la velocidad de secado (Garau, M.
y col., 2007). Diferentes autores han observado este fenómeno durante la deshidratación de
diferentes productos alimenticios (Cañizares, A. y col., 2007). En la tabla 7 se presentan
los resultados de la velocidad de secado (k), la mayor pérdida de H20 de los subproductos
durante el secado (a) y el coeficiente de correlación (r) que se obtuvo al emplear la
ecuación de SGompertz (Anexo 4).
Figura 18. Curvas de secado de las harinas de subproducto de limón italiano
Los resultados indicaron que la temperatura de 60 ⁰C presento mayor velocidad de secado
sin embargo la desviación estándar es muy grande y la menor a 40 ⁰C con un valor de
0.55±0.25 y 0.09 ±0.01 porcentaje de H2O / h. respectivamente. De igual forma, se reportó
que al ir aumentando la temperatura de secado la velocidad aumentaba hasta obtener una
velocidad contante, sin embargo se observó que a partir de la temperatura de 70 ⁰C la
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
dw
po
rcen
taje
de
H2O
Tiempo (h)
40⁰C
50⁰C
60⁰C
70⁰C
80⁰C
90⁰C
100⁰C
110⁰C
RESULTADOS Y DISCUSIONES
54
velocidad se mantuvo constante, debido a que a estas temperaturas la deshidratación de los
subproductos fueron muy similares en los tiempos evaluados. Este efecto puede ser
explicado con base a la disminución de la transferencia de calor de la pared al solido que se
está secando (Brennan, J. 2008) al haber ya alcanzado su máxima deshidratación a las 12h
o como se mencionó anteriormente al acortezamiento de los subproductos.
Tabla 7. Valores obtenidos de la ecuación de la recta en la cinética de secado
Temperatura
(⁰C)
Perdida máxima de H2O (a) Velocidad
(k)
Coeficiente de
correlación
(r)
40 94.56±2.0 0.09±0.01a 0.9895
50 90.33±0.18 0.21±0.00ab 0.99971
60 91.08±0.31 0.55±0.25c 0.99913
70 91.81±0.38 0.35±0.03abc 0.9987
80 91.21±0.12 0.46±0.03bc 0.99987
90 95.09±0.10 0.34±0.01abc 0.99991
100 94.32±0.21 0.39±0.02bc 0.99962
110 97.16±0.48 0.36±0.04abc 0.99821
Diferentes letras (a, b, c) de subíndice en la misma columna significan que hay diferencia significativa
(p≤0.05)
Se realizó un análisis de varianza para conocer si existe diferencia significativa entre las
velocidad de secado a las temperaturas evaluadas. La figura 19 presenta el gráfico de
medias de las velocidades de secado con respecto a las temperaturas, los resultados indican
que sólo presentaron diferencias significativas, la velocidad de secado de la temperatura de
secado de 40 y 50°C con respecto a 600 ⁰ C. En la tabla 7 también es posible apreciar que
la máxima pérdida de agua posible a alcanzar a las temperaturas evaluadas fue en un
intervalo de 90 a 95 % e indicando que sólo para la temperatura de 110°C fue superior a
95%.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
55
Temperatura (C)Velo
cid
ad
de s
ecad
o (
dw
po
rcen
taje
de h
um
ed
ad
/dt)
40 50 60 70 80 90 100 110
-0.06
0.14
0.34
0.54
0.74
7.2.1. Efecto de la temperatura y tiempo de secado en la concentración de compuestos
polifenólicos de los subproductos de limón italiano.
La tabla 8 presenta los valores de las concentraciones de polifenoles obtenidos a partir de
la extracción de las harinas de subproductos de limón italiano con respecto a los diferentes
tiempos de secado para cada una de las temperaturas evaluadas. La muestra fresca mostró
una concentración de polifenoles de 73.7±7.0 mg EAG/g b.s. De las temperaturas
evaluadas, la temperatura de 40 ⁰C presentó a las 12 horas la mayor concentración de
polifenoles totales 43.7 ±1.2 mg EAG/g b.s. y a 50 ⁰C a las 48h la menor concentración
28.9±10 mg EAG/g b.s. Los resultados obtenidos indicaron concentraciones de polifenoles
totales superiores a 28 mg EAG/g b.s. en todos los extractos analizados. Los resultados
obtenidos también indicaron que cuando los subproductos fueron secados a temperaturas
mayores de 40 ⁰C el contenido de compuestos polifenólicos fue significativamente (P<
0.05) inferior al obtenido en los subproductos en fresco. Li, B y col., (2006), mencionaron
que durante el proceso de secado tanto la temperatura como el tiempo largos de secado
podrían afectar algunos de los compuestos polifenólicos, reduciendo la presencia de los
mismos; adicionalmente sugieren que el agua presente en las células vegetales pudieran
tener un efecto benéfico en la extracción de polifenoles; por lo tanto, al tener una mayor
reducción de agua en los subproductos, todo los componentes tales como, membranas y
orgánulos presentes en las células se adhirieron por la ausencia de agua, haciendo la
extracción más difícil, como resultado, la recuperación global fue menor. Lo anterior
concuerda a lo obtenido en el presente trabajo ya que al ser secados los subproductos y
Figura 19. Gráfico de medias de la velocidad de secado
RESULTADOS Y DISCUSIONES
56
posteriormente utilizados para la extracción, la recuperación fue más baja, que en el
material fresco.
Chen M-L. y col., (2011), quienes estudiaron la concentración de compuestos polifenólicos
en cascara de naranja (C. sinensis (L.) Osbeck) secada a 50, 60, 70, 80, 90 y 100 ⁰C,
reportaron que la concentración de polifenoles totales en los extractos incrementaba
conforme aumentaba la temperatura de secado. Reportando para la muestra en fresco
39.4±5.1 mg EAG/g b.s de compuestos polifenólicos y para la temperatura de 50 y 60 ⁰C
concentraciones significativamente inferiores al de la cáscara en fresco (P <0.05). Al igual
observaron que el contenido de compuestos fenólicos aumentaba gradualmente a medida
que las temperaturas de secado incrementaban. La concentración más alta de compuestos
fenólicos fue de 65.72 ± 3.42 mg EAG /g b.s. para las cáscaras secadas a 100 ⁰C. Este
contenido incrementó alrededor de dos veces en comparación con el de la cáscara fresca.
Los autores mencionan que la formación de sustancias fenólicas se produjo durante el
secado a 70 ⁰C y el incremento de estos compuestos fenólicos pudo deberse a la
disponibilidad de precursores de moléculas fenólicas o por la interconversión no enzimática
entre las moléculas fenólicas.
Tabla 8. Concentración de compuestos polifenólicos en extractos de harinas de subproductos del Limón
italiano
Concentración de polifenoles mg EAG /g (base seca)
Temperatura
⁰ C
12h 24h 36h 48h
40 43.7±1.2a 36.0±2.5
a 32.4±1.4
b 30.1±0.6
dc
50 38.0±3.7b 30.6 ±2.0
c 29.7±0.8
c 28.9±10
d
60 30.5±2.5d 32.1±1.5
bc 30.0±1.8
c 32.8±2.0
b
70 30.9 ±1.6dc
30.4±0.9c 32.1±0.2
bc 34.9±0.2
cb
80 31.8±2.3dc
33.0±1.1b 29.7±1.7
c 32.7±0.9
b
90 29.6±4.4d 32.1±1.7
bc 31.8±1.7
bc 29.5±0.9
d
100 35.0±1.3cb
37.6±1.2a 36.2±1.7
a 35.8±1.1
a
110 37.3±1.3b 37.0 ±1.3
a 32.9±2.9
b 33.7±2.1
ab
Cada valor es el promedio ± desviación estándar
EAG; equivalente de ácido gálico
Diferentes letras (a, b, c, d) de subíndice en la misma columna significan que hay diferencia significativa
(p≤0.05)
RESULTADOS Y DISCUSIONES
57
Con los resultados de la concentración de polifenoles totales, se realizó un análisis de
varianza (ANOVA) obteniendo como resultado que el tiempo y la interacción temperatura
y tiempo tuvieron un efecto significativo sobre la concentración de polifenoles, resultado
que se puede corroborar en el diagrama de Pareto (figura 20a) ya que el valor P es menor
al nivel de significancia (α= 0.05) establecido. Con el grafico de interacción (figura 20b) se
obtuvo que los extractos que presentaron mayor concentración de polifenoles fueron los de
harinas de subproducto de limón italiano secados a temperatura de 40 y 50⁰C a un tiempo
de 12 h (43.7±1.2 y 38.0±3.7mg EAG /g b.s.). Sin embargo las harinas secadas a estas
condiciones no presentaron la humedad establecida por la CODEX para harina por lo cual
estas condiciones no son recomendadas para secado de estos productos en cuanto a
concentraciones de polifenoles se refiere. Por otro lado, se obtuvo que los extractos de
harinas de subproductos secados a temperaturas de 100 y 110 ⁰C presentaron mayor
concentración de compuestos polifenólicos en comparación con las temperaturas de 50,
60,70, 80 y 90 ⁰ C, obteniendo valores aproximados de 35.9±2.9 a 37.6±1.2 mg EAG/ g b.s
y con una humedad inferior al 15 por ciento tal como lo establece la CODEX. Estas
temperaturas en función del contenido de polifenoles totales son las recomendadas.
7.2.2. Actividad antimicrobiana
Una vez obtenidos los extractos polifenólicos, se prosiguió con la determinación de la
actividad antimicrobiana. En la tabla 9 se muestra de manera cualitativa la presencia de
actividad antimicrobiana de los extractos de harinas de subproducto de limón italiano
secados a las diferentes temperaturas y tiempos. Para esta prueba el análisis fue cualitativo
Co
ncen
tració
n d
e p
olife
no
les
(mg
/g)
Temperatura (C)
28
32
36
40
44
40 50 60 70 80 90 100 110
Tiempo (h)
12
2436
48
Efectos estandarizados
0 1 2 3 4
A:Temperatura
AB
B:Tiempo
+
-
a) Gráfica de Pareto de la
concentración de polifenoles
b) Gráfica de interacción de la
concentración de polifenoles
Figura 20. Gráfica de Pareto para a) concentración de polifenoles y b) grafica de interacción de la concentración
de polifenoles
RESULTADOS Y DISCUSIONES
58
y se usó como referencia una escala de mayor a menor actividad, de acuerdo a los
resultados, tres cruces indicaron una mayor presencia de actividad antimicrobiana es decir
ausencia de unidades formadoras de colonias, dos cruces indicaron actividad
antimicrobiana media (2 a 12 Unidades Formadoras de Colonias “UFC”) y el signo menos
significo que no hubo actividad antimicrobiana (12 o más UFC), éste último valor obtenido
a partir del control. Para proceder con el análisis y fuera comparativo, los extractos se
ajustaron a una concentración de 28 mg EAG/g b.s de polifenoles (mínima concentración
de polifenoles obtenida a partir de los extractos de harina de subproducto). Los resultados
indicaron que todos los extractos polifenólicos obtenidos presentaron actividad
antimicrobiana contra S. aureus, sin embargo sólo los extractos de subproductos secados a
50 y 110 °C presentaron actividad contra E. coli y S. typhimurium (Ver tabla 9), esto pudo
deberse a la presencia de compuestos bioactivos en las muestras. Estudios realizados por
Yi, Z y col., (2008), reportaron que extractos de hesperedina, nobiletina y tangerina
presentados en Pericarpium Citri Reticulatae inhibieron el crecimiento de las cepas E. coli,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Salmonella
typhi y Enterobacter cloacae. Para demostrar lo anterior los autores determinaron la
concentración mínima inhibitoria (CMI) de las seis cepas, obteniendo como resultado que
la hesperedina reporto una CMI de 200 μg /mL b.s. contra la cepa Staphylococcus aureus;
400 μg /mL b.s. contra las cepas Enterococcus faecalis y Staphylococcus epidermidis; y
800 μg /mL b.s contra las cepas E. coli y Salmonella typhi. Solo para las bacterias E. coli y
Staphylococcus aureus los extractos de nobiletina y tangerina presentaron una CMI de 1600
μg /mL b.s. Los autores a su vez indican que ha razón de la baja actividad antimicrobiana
de la tangeretina y nobiletina pudo ser debido a su estructura polimetoxilada, aunque esta
estructura puede ser ventajosa como antiproliferativos, antiinflamatorios y antimetastásico.
Mandalari, G. y col., (2007), quienes determinaron la actividad antimicrobiana de extractos
polifenólicos de cascara de bergamota (Citrus bergamia Risso), indicaron que los extractos
conteniendo neohesperedina, hesperetina, neoeriocitrina, naringina y naringenina
presentaron inhibición contra las bacterias Escherichia coli, Salmonella entérica,
Pseudomonas putida, bacillus subtilis, listeria innocua, lactococcus lactis, Staphylococcus
aureus y saccharomyces cerevisiae. Al igual, reportaron que el extracto de erioditiol
también presentó una alta inhibición para estos microorganismos. La actividad
RESULTADOS Y DISCUSIONES
59
antimicrobiana de acuerdo a los estudios previamente mencionados se asocia a la
interacción entre las diferentes agliconas o por el sinergismo entre los compuestos debido a
su reacción combinada con la membrana celular como un posible sitio de diana primaria,
pero con diferente modo de acción inhibitoria.
Tabla 9. Actividad antimicrobiana de extractos de harina de subproducto de limón italiano contra las
bacterias 1) S. typhimurium, 2) S. aureus, 3) E. coli, a diferentes temperatura (T) y tiempos (t) de secado
+++: Mayor actividad antimicrobiana sin presencia de bacterias;
++: Media actividad antimicrobiana de 2 a 12 UFC.
-: Ausencia antimicrobiana de 12 o más UFC.
T
(⁰C)
t
(h)
Actividad antimicrobiana T
(⁰C)
t
(h)
Actividad
antimicrobiana
1 2 3 1 2 3
Ambiente 0 + +++ ++ Ambiente 0 + +++ ++
40 12 - +++ - 80 12 - +++ - 24 - +++ - 24 - +++ - 36 - +++ - 36 - +++ - 48 - +++ - 48 - +++ -
50 12 ++ +++ +++ 90 12 - ++ - 24 ++ +++ - 24 - +++ - 36 - +++ +++ 36 - +++ - 48 ++ +++ +++ 48 - +++ -
60 12 - +++ - 100 12 - +++ - 24 - ++ - 24 - ++ - 36 - +++ - 36 - +++ - 48 - +++ - 48 - +++ ++
70 12 - +++ - 110 12 ++ +++ ++ 24 - ++ - 24 ++ +++ ++ 36 - +++ - 36 ++ +++ - 48 - +++ - 48 ++ +++ ++
RESULTADOS Y DISCUSIONES
60
7.2.3. Actividad antioxidante
La actividad antioxidante se refiere al parámetro que determina qué tanto un compuesto
antioxidante evita que su sustrato se oxide. Normalmente se representa como porcentaje de
inhibición de un radical libre. Si el valor es cercano a cien por ciento, la actividad
antioxidante del compuesto es alta. Para evaluar el análisis de la actividad antioxidante de
extractos polifenólicos de harina de subproducto de limón italiano, fue necesario ajustar los
extractos a una concentración de 28 mg EAG/g b.s. con la finalidad de observar si la
temperatura y tiempo de secado de los subproductos de limón italiano afectaban el
porcentaje de inhibición del radical DPPH.
En la figura 21 se representa el porcentaje de inhibición del radical DPPH obtenidos de los
extractos polifenólicos de subproductos de limón italiano secados a las diferentes
temperaturas y tiempos. De los resultados se obtiene que el extracto de la muestra fresca
presentó un porcentaje de inhibición del 5.3±1.1 %, lo que nos indica que si bien la
concentración de polifenoles totales es elevada la actividad antioxidante es menor. El
mayor porcentaje de inhibición obtenido en el presente trabajo fue con los extractos
obtenidos a la temperatura de 50 ⁰C y36 h (78±2.1 % de inhibición del radical DPPH) y el
menor fue del obtenido 100 ⁰C a las 12h de secado (24.1±4.9 % de inhibición del radical
DPPH). Así mismo, Al igual se observó que los extractos de harina de subproductos
secados a altas temperaturas, redujeron el porcentaje de inhibición del radical DPPH.
El extracto polifenólico de la harina de subproducto que fue secado a la temperatura de 90
⁰C, presentó un incremento en el porcentaje de inhibición en comparación con la
temperatura de 70, 80, 100 y 110 ⁰C en todos los tiempos. Estos resultados indicaron que
los compuestos activos se ven afectados por el incremento de la temperatura durante el
secado de los subproductos del limón italiano más que por el tiempo.
De acuerdo a Chen, M., y col., (2011) quienes reportaron que el porcentaje de inhibición
del radicales DPPH aumenta conforme incrementaba la temperatura de secado encascaras
de naranja, Indicaron que para una concentración de 1.6 mg/mL de polifenoles, observaron
que el porcentaje de inhibición en los tratamientos de secado a 50, 60, 70,80, 90 y 100 ⁰C
RESULTADOS Y DISCUSIONES
61
Figura 21. Porcentaje de inhibición de extractos de harina de subproducto de limón italiano con respecto a las
temperaturas a diferentes tiempos de secado
fueron de 37.3, 38.3, 29.1, 46.2, 68.4, 70.2 y 80.1%, respectivamente. Lo anterior fue
atribuido a que compuestos fenólicos de bajo peso molecular podrían ser formados en las
cáscaras calentadas. Sin embargo, la temperatura de 70 ⁰C presentó un porcentaje de
inhibición menor que las temperaturas de 50 y 60 ⁰C. Este resultado pudo deberse a la
ausencia de grupos hidroxilo en el anillo B de los flavonoides lo que podría disminuir su
actividad secuestradora. Estos autores concluyen que la actividad antioxidantes del extracto
puede verse afectada por el calentamiento, modificando la estructura de los flavonoides y
presentando como consecuencia un efecto en la actividad antioxidante, similar a lo
obtenido en el presente trabajo.
Yi, Z. y col., (2007) reportaron que el porcentaje de inhibición del radical DPPH de los
extractos de hesperidina, nobiletina y tangeretina del fruto Pericarpium Citri Reticulatae
aumentaba conforme aumentaba la concentración de los compuestos. Para los extractos de
nobiletina y tangeretina el porcentaje de inhibición a las mismas concentraciones reportó
valores muy cercanos, debido a que las estructuras de estos compuestos son similares. Para
el extracto de hesperidina el porcentaje de inhibición fue mucho menor en comparación con
los otros dos, debido a la ausencia de grupo hidroxilo.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Po
rcen
taje
de
inh
ibic
ión
del
ra
dic
al
DP
PH
(%
)
Temperatura (⁰C)
12h
24h
36h
48h
RESULTADOS Y DISCUSIONES
62
El análisis de varianza del porcentaje de inhibición del radical DPPH indicó que tanto el
factor temperatura como el tiempo y la interacción de los mismos tienen un efecto
significativo en la respuesta lo cual es observado en la gráfica de Pareto (figura 22).Las
condiciones más adecuadas para obtener mayor porcentaje de inhibición del radical DPPH
seria utilizando extractos de harina de subproductos de limón italiano secadas a 50 ⁰C a un
tiempo de 36h. Lo cual indica que los compuestos fenólicos de bajo peso molecular con alta
actividad antioxidante podrían ser formados en los subproductos calentados, o quizá habría
presencia de la eriocitrina (compuesto con mayor actividad antioxidante de todos los
flavonoides glucósidos presentes en el limón).
7.2.4. Color
El color de las harinas es un atributo importante tanto para la harina como los productos
elaborados a base de ella. Es una práctica común, juzgar la calidad de estos alimentos en
función del color de los mismos. Esta propiedad física, sensorialmente es la más importante
asociada con el sentido de la vista (López, J. y col., 2010). Por lo cual, es importante
evaluar visualmente el alimento, por ser el primer juicio hecho por los consumidos en la
calidad de la apariencia física y color.
Durante la determinación del color se obtuvo como resultado que el tratamiento térmico
evaluado en los subproductos de limón italiano (transformado en harina) afectó la
coloración. Estos subproductos cítricos después de su proceso industrial aun contienen
residuos de azucares reductores tales como glucosa, sacarosa, fructosa y carbohidratos que
pueden experimentar una reacción de Maillard con la intervención de compuestos amino
durante el secado produciendo un color pardo. Al igual, la reacción enzimática podría
Efectos estandarizados
0 1 2 3 4 5 6
AB
B:Tiempo (h)
A:Temperatura (C)
+
-
Figura 22. Gráfica de Pareto para el porcentaje de inhibición del radical DPPH
RESULTADOS Y DISCUSIONES
63
cambiar la coloración de los subproductos deshidratados a color marrón o más oscuro
debido a la oxidación de fenoles (Chong, C. y col., 2013).
En la figura 23 se observa el comportamiento del parámetro de color: luminosidad (L*),
croma (C*) y hue (h⁰) de las harinas de subproducto de limón italiano obtenidas a
diferentes temperaturas y tiempos. La figura 23a describe una disminución en la
luminosidad de las harinas conforme aumenta la temperatura y tiempo de secado de los
subproductos. La muestra fresca presentó un valor de luminosidad de 65.9 ± 0.7. Por su
parte, la mayor luminosidad de harinas se presentó a las temperaturas de 40 a 60 ⁰C, con un
valor promedio de luminosidad de 71±0.1 y la menor luminosidad a temperaturas de 110
⁰C a las 48h con un valor promedio de 41.2±0.4. La reducción de la luminosidad a las
temperaturas de 70 hasta 110 ⁰C, pudo deberse al efecto de reacciones no enzimáticas como
la reacción de Maillard producida entre los azucares reductores y aminoácidos (Chong, C. y
col., 2013).
La figura 23b representa el comportamiento del parámetro croma (C*) de harinas de
subproducto de limón italiano. Reportando para la muestra en fresco una saturación de
30.7±0.9. El mayor valor de C* (33.2±0.2) fue en la harina secada a 50 ⁰C a las 12 hora y el
menor valor en la harina secada a 110 ⁰C a 36 h con un valor de C* de 24.4 ± 0.1. La
variaciones de los resultados de la cromaticidad representan lo llamativo o apagado de las
harinas analizadas. La figura 23c, representa la disminución constante del parámetro hue
en las diferentes muestras de harina obtenidas a diferentes temperaturas y tiempos. La
muestra en fresco reportó un ángulo de hue de 94.5 ±0.011⁰ lo que indica que se encuentra
en los colores amarillos. El mayor valor del ángulo hue (49±0.001⁰) se encontró a 40 ⁰C a
las 24h y una menor concentración de hue (61.45±0.002 ⁰) se encontró presente a las 110
⁰C a las 36h. Los valores de hue permiten interpretar el ángulo de la medición polar lo que
indica que a mayor temperatura y tiempo de secado, los subproductos de limón italiano
tienden a colores rojos intensos.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
64
Los analisis de varianza realizados para los parámetros determinados de color se resumen
con los graficos de Pareto (figura 24). En la figura 24a, para la respuesta de luminosidad
de harinas de subproducto de limón italiano se observa que el factor de temperatura, tiempo
y la interacción temperatura y tiempo tienen un efecto significativo en la respuesta. La
temperatura es el principal factor que tiene influencia en la luminosidad. Para la respuesta
de cromaticidad (figura 24b), se observa que el factor temperatura y tiempo tienen un
efecto significativo en la respuesta, principalmente la temperatura y para la respuesta de
hue (figura 24 c) se obtuvo un efecto en la temperatura, tiempo y la interacción, siendo la
temperatura la que dé mayor influencia sobre la variable.
35
40
45
50
55
60
65
70
75
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Lu
min
osi
da
d L
*
Temperatura (⁰C)
12 h
24 h
36 h
48 h
22
24
26
28
30
32
34
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Cro
ma
C*
Temperatura (C)
12 h
24 h
36 h
48 h
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110
Hu
e h
*
Temperatura (⁰C)
12 h
24 h
36 h
48 h
a) b)
c)
Figura 23. Gráfica de parametros de color a) luminosidad (L*), b) cromaticidad (C*) y c) de hue (h⁰) de las harinas
de subproducto de limón italiano secadas a diferentes temperaturas
RESULTADOS Y DISCUSIONES
65
Despues de analizar los resultados obtenidos de todas las respuestas obtenidas en el primer
diseño factorial 4 x 8, se pudo observar que los extractos polifenólicos de harina de
subproductos secados a las temperaturas extremas evaluadas 40, 50, 100 y 110 ⁰C
obtuvieron concentraciones elevadas a menores tiempos, sin embargo a ese tiempo solo las
temperaturas altas obtuvieron la humedad requerida de acuerdo a la norma. En cuanto a la
actividad biológica la actividad oxidante se vio favorecida en los extractos obtenidos a
bajas temperaturas y tiempos cortos, mientras que para la actividad antimicrobiana no se
pudo identificar un comportamiento específico en función de los factores evaluados. De
acuerdo a lo anterior se decidió plantear otro diseño experimental basado en dos
temperaturas extremas las cuales presentaron mejores resultados a lo largo de los análisis
previos siendo estas las temperaturas de 50 y 110°C, así mismo se decidió reducir el tiempo
de muestreo con la finalidad de reducir el tiempo de secado y observar a detalle el
comportamiento de las muestras. En cuanto a la concentración de polifenoles y a la
actividad biológica de los extractos.
Efectos estandarizados
0 4 8 12 16 20
AB
B:Tiempo (h)
A:Temperatura (C)
+
-
a) Gráfica de Pareto de la luminosidad
Efectos estandarizados
0 2 4 6 8
AB
B:Tiempo
A:Temperatura
+
-
b) Gráfica de Pareto de la cromaticidad
c) Gráfica de Pareto de hue
Efectos estandarizados
0 5 10 15 20 25
AB
B:Tiempo (h)
A:Temperatura (C)
+
-
Figura 24. Gráfica de Pareto para a) luminosidad (L*), b) Cromaticidad (C*) y c) hue (h⁰)
RESULTADOS Y DISCUSIONES
66
7.3. Evaluación del efecto de las temperaturas de 50°C y 110°C en la reducción de
humedad y concentración de polifenoles de subproductos de limón italiano.
Como se mencionó anteriormente, los niveles del diseño factorial 2 x 8 fueron elegidos de
acuerdo a los resultados obtenidos en el primer diseño factorial 4 x 8, se evaluaron dos
temperaturas ubicadas en los extremos del primer diseño factorial con tiempos más corto de
secado para reducir el tiempo del mismo, así como evaluar si la concentración de
polifenoles influye en la actividad biológica.
Los niveles del tiempo a estudiar fueron 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 h para 50 ⁰C y 2, 4, 6, 8,
10, 12, 14 y16 h para 110 ⁰C
La figura 25 describe la reducción del porcentaje de humedad de harinas de subproducto de
limón italiano con respecto al tiempo y la temperatura de secado evaluada. La muestra en
fresco presentó una humedad de 80.8 ±0.2 %. Para la temperatura de secado de 50 ⁰C la
menor humedad (7.8±0.5%) se alcanzó hasta las 18h. Para la temperatura de secado de 110
⁰C la menor humedad se obtuvo a las 8 h (2.5±0.3 %), así mismo los resultados de la
humedad de harinas de los subproductos indicaron que los tiempos 8, 10, 12, 14 y 16 h
para la temperatura de 110 ⁰C y los tiempos 18, 21 y 24 h para las temperaturas de secado
50 ⁰C, obtuvieron humedad del 15 % tal como establece la CODEX para harina.
Figura 25. Reducción del porcentaje de humedad de harinas de subproducto de limón italiano
El análisis de varianza indicó que los factores principales tiempo y temperatura y su
interacción presentados en el diagrama de Pareto (figura 26a) tuvieron efecto significativo
sobre el porcentaje de humedad ya que el valor P fue menor al nivel de significancia (α=
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Porc
enta
je d
e hum
edad
(%
)
Tíempo (h)
50 ⁰C
110 ⁰C
RESULTADOS Y DISCUSIONES
67
0.05) establecido, mostrando que el tiempo mostró el mayor efecto sobre el porcentaje de
humedad.
7.3. a. Velocidad de secado de harinas de subproducto de limón italiano
Para determinar la velocidad de secado de los subproductos de limón italiano, fue necesario
graficar el porcentaje de reducción de H2O contenida en los subproductos con respecto al
tiempo de secado tal como lo muestra la figura 27, con ayuda del programa OriginPro 8 en
función de la ecuación de SGompertz (Anexo 4) se calculó el valor de la velocidad de
secado (k) para cada temperatura evaluada. Obteniendo como resultado los datos indicados
en la tabla 10.
Figura 27. Velocidad de secado de las harinas de subproducto de limón italiano
Por la estabilización en la pérdida de agua en los sistemas a las temperaturas evaluadas se
debió al fenómeno denominado “acortezamiento” (“case hardening”), este efecto impide la
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
dw
Po
rcen
taje
de
H2O
(%
)
Tiempo (h)
50 ⁰C
110 ⁰C
Efectos estandarizados
0 3 6 9 12 15
AB
A:Temperatura (C)
B:Tiempo (h)
+
-
Figura 26. Gráfica de Pareto para el porcentaje de humedad de muestras de harina de subproductos
de limón italiano
RESULTADOS Y DISCUSIONES
68
liberación de agua en el alimento debido a la formación de una capa superficial dura e
impenetrable que ralentiza la velocidad de secado (Garau, M. y col., 2007). Diferentes
autores han observado este fenómeno durante la deshidratación de diferentes productos
alimenticios (Cañizares, A. y col., 2007).
Los resultados de la velocidad de secado (k), la mayor pérdida de H2O de los subproductos
secados (a) y el coeficiente de correlación (r) que se obtuvo al emplear la ecuación de
SGompertz se observan en la tabla 10. A la temperatura de secado de 110 ⁰C se observó
mayor velocidad de pérdida de humedad en comparación con la temperatura de 50 ⁰C con
valores de 0.27±0.04 y 0.84 ±0.84 porcentaje de H2O / h respectivamente. De igual forma
se observa que al aumentar el tiempo de secado la perdida de humedad aumentaba hasta
obtener un valor constante, este efecto puede ser explicado con base a la disminución de la
transferencia de calor de la pared al solido que se está secando (Brennan, J. 2008) El
análisis de varianza indicó que si existe diferencia significativa entre las velocidades
obtenidas, (figura 28)
Tabla 10. Valores obtenidos de la ecuación de la recta en la cinética de secado
Temperatura
(⁰C)
Perdida
máxima de
H2O(a)
Velocidad
(k)
Coeficiente de error
50 125.14±10.81 0.27±0.04 0.9742
110 99.53±0.18 0.84±0.84 0.9625
Figura 28. Gráfico de medias de la velocidad de secado
Temperatura (C)
Velo
cid
ad
de s
ecad
o (
po
rcen
taje
de H
2O
50 110
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
RESULTADOS Y DISCUSIONES
69
7.3.1 .Efecto de la temperatura y tiempo de secado en la concentración de compuestos
polifenólicos de los subproductos de limón italiano.
La figura 29 describe el comportamiento de la concentración de polifenoles totales
obtenidos de los extractos de harina de subproductos de limón italiano secados a las
temperaturas de 50 y 110 ⁰C a los diferentes tiempos evaluados. Cabe mencionar que los
tiempos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 h presentados en la gráfica, corresponden a 3, 6, 9, 12,15, 18,
21 y 24 h para la temperatura de 50 ⁰C y 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16 h para la temperatura de
110 ⁰C. La codificación de los tiempos fue realizada con el fin de tener un mejor manejo en
los resultados.
La cantidad de compuestos polifenólicos en el extracto fresco fue de 55.6±3.1 mg EAG/g b.
s. La temperatura de 50 ⁰C a las 3 h presentó mayor concentración de polifenoles (55.4±6.7
mg EAG/g b. s.) y la menor a las 21h (23.3±4.1 mg/g b.s). Para la temperatura de secado de
110 ⁰C, la mayor concentración reportada de polifenoles fue a las 2h (57.0±8.5 mg/g b.s.) y
la menor a las 6h (31.7±0.7 mg EAG/g b.s). Los extractos de harinas de subproductos
cítricos que obtuvieron el 15 % de humedad a la temperatura de 50 y 110 ⁰C no presentaron
diferencia significativa en la concentración de polifenoles siendo mayores para la
temperatura de 110°C.
Los resultados obtenidos concuerdan con Chen M-L. y col., (2011), quienes estudiaron la
concentración de compuestos polifenólicos en cascara de naranja (C. sinensis (L.) Osbeck)
secada a 50, 60, 70, 80, 90 y 100 ⁰C. Ellos reportaron que la concentración de polifenoles
totales en los extractos incrementaba conforme aumentaba la temperatura de secado.
Obtuvieron concentraciones de polifenoles de 37.89±0.65 mg/g b.s. para la temperatura de
50 ⁰C y 65.72 ± 3.42 mg/g b.s para la temperatura de100 ⁰C.
Sin embargo en este trabajo se observó que al ir aumentando el tiempo de secado para las
dos temperaturas la concentración de polifenoles reducía. Resultados que concuerdan con
Li, B y col., (2006), que mencionan que el proceso de secado (la temperatura o largos
tiempos de secado) podrían afectar a algunos compuestos polifenólicos; así mismo cabe
mencionar que el agua presente en las células vegetales pudo haber ayudado a la extracción
de polifenoles.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
70
Figura 29. Concentración de polifenoles de harinas de subproducto de limón italiano
Con los resultados de la concentración de polifenoles totales, se realizó un análisis de
varianza (ANOVA) obteniendo como resultado que el tiempo, temperatura y la interacción
temperatura y tiempo tuvieron un efecto significativo sobre la concentración de polifenoles,
resultado resumido en el diagrama de Pareto (figura 30a) ya que el valor P es menor al
nivel de significancia (α= 0.05) establecido. Con el grafico de interacción figura 30b se
obtuvo que los extractos que presentaron mayor concentración de polifenoles fueron los
extractos de harina de subproducto de limón italiano secados a 50 y 110⁰C a su menor
tiempo. Sin embargo los subproductos secados a estas condiciones no presentaron la
humedad establecida por la CODEX para harina por lo tanto, estas condiciones no son
recomendadas para este trabajo. Por otro lado, se obtuvo que los extractos de harinas de
subproductos secados a temperaturas de 110 ⁰C presentaron mayor concentración de
compuestos polifenólicos en comparación con las temperaturas de 50 ⁰ C y con una
humedad inferior al 15 por ciento tal como lo establece la CODEX.
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
1 2 3 4 5 6 7 8
Co
nce
ntr
aci
ón
de
po
life
no
les
(mg
/g b
.s)
Tiempo (h)
50 ⁰C
110 ⁰C
RESULTADOS Y DISCUSIONES
71
7.3.2. Actividad antimicrobiana
La actividad antimicrobiana para este diseño factorial 2x8, solo fue determinado en los
extractos de harinas de subproducto de limón italiano que presentaron porcentaje de
humedad del 15 % o menos en conformidad a lo establecido por la CODEX para harina. La
determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de los extractos fue evaluada
contra los microorganismos S. typhimurium, S. aureus y E. coli. Para ello los extractos
fueron ajustados a 23.3 mg /g b.s. de polifenoles (mínima concentración de polifenoles en
extractos de harina de subproducto sin requerir concentrar la muestra).
En la tabla 11se presentan los resultados de CMI de los extractos polifenólicos de harina de
subproducto de limón italiano contra las bacterias S. typhimurium, S. aureus y E. coli. La
CMI contra la bacteria S. typhimurium fue de 5.8±0.0 mg EAG/g b.s para los extractos
obtenidos a las 21 y 24 h para la temperatura de 50 ⁰C y a las 12h para 110 ⁰C. La CMI
contra la bacteria S. aureus fue de 11.7 ±0 mg EAG/g b.s para los extractos obtenidos a los
tiempos 18, 21 y 24 h a la temperatura de 50 ⁰C. Y para extractos obtenidos a las 24h a la
temperatura de 110 ⁰C. Para la inhibición de la bacteria E. coli, la CMI fue de 11.7 ±0 mg
EAG /g b.s. a las 24 h a 50 ⁰C y al tiempo de14 y 16 h para la temperatura de secado de 110
⁰C. Al determinar la CMI con la técnica de dilución, se observó que los extractos de
polifenoles de harinas de subproducto de limón italiano mostraron actividad antimicrobiana
frente a las bacterias S. typhimurium, S. aureus, E. coli.
Yi, Z y col., (2008), obtuvieron una concentración mínima inhibitoria (CMI) de 200 μg /mL
Efectos estandarizados
0 1 2 3 4 5
A:Temperatura (C)
AB
B:Tiempo (h)
+
-
Concentr
ació
n d
e p
olife
nole
s (m
g/g
) b.s
Temperatura (C)
Tiempo (h)
1
23
4
56
7
8
23
33
43
53
63
50 110
a) Gráfica de Pareto de la
concentración de polifenoles totales
b) Gráfica de interacción de la
concentración de polifenoles totales
Figura 30. Grafica de Pareto a) concentración de polifenoles totales y b) interacción de polifenoles totales
RESULTADOS Y DISCUSIONES
72
del microorganismo Staphylococcus aureus, al emplear extractos de hesperedina y 800 μg
/mL b.s contra las cepas E. coli y Salmonella typhi.
Mandalari, G. y col., (2007) quienes estudiaron la CMI de extractos polifenólicos de
cascara de bergamota (Citrus bergamia Risso).obtuvieron que los extractos de
neohesperedina, hesperetina, neoeriocitrina, naringina y naringenina presentaron CMI de
›1000 μg/mL para las bacterias Escherichia coli, Salmonella entérica, Pseudomonas
putida, bacillus subtilis, listeria innocua, lactococcus lactis, Staphylococcus aureus y
saccharomyces cerevisiae. Al igual, reportaron que el extracto de erioditiol presento la
mejor CMI con un promedio de 662 μg/ mL para estos microorganismos. Como se
mencionó anteriormente estos autores mencionan que la inhibición de los microorganismos
pudo deberse a la interacción entre las diferentes agliconas o por el sinergismo entre los
compuestos debido a su reacción combinada con la membrana celular como un posible sitio
de diana primaria, pero con diferente modo de acción inhibitoria. Así mismo, diversos
autores han reportado que la actividad antimicrobiana (Mandalari, G. y col., 2007) y
antioxidante (Alothman, A., 2009 y Chen, M., 2011) depende del compuesto presente en el
extracto y no de la alta concentración de polifenoles.
En los análisis estadísticos se observó por medio del gráfico de media que no existe
diferencia significativa entre los tratamientos realizados a la temperatura de 50 y 100 ⁰C
para la CMI de las bacteria S. typhimurium (figura 31 a), S. aureus (figura 31c) y E. coli
(figura 31e). Con el grafico de interacción se observó que la mejor CMI de polifenoles para
el microorganismo S. typhimurium (figura 31 b) fue de 5.8 mg/g b.s reportado a 50 ⁰C a
tiempos de 21 y 24 h. y para 110 ⁰C a las 12 h. Para el microorganismo S. aureus (figura
31 d) la gráfica de interacción indico que la CMI fue de 11.7 mg /g b.s para la temperatura
de 50 ⁰C a 21 y 24 h y para la temperatura 110 ⁰C fue al tiempo de 14 y 16 h. Por último la
mejor CMI de E. coli (figura 31 f) fue de 11.7 mg/g b.s a la temperatura de 50 ⁰C a un
tiempo de 24 h y para la temperatura de 110 ⁰C a 14 y 16 h.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
73
7.3.3. Actividad antioxidante
Para evaluar la actividad antioxidante de los extractos polifenólicos de la harina de
subproducto de limón italiano, fue necesario ajustar los extractos a una concentración de
23.3 mg /g b.s. de polifenoles, con la finalidad de observar si la temperatura y tiempo de
secado de subproductos de limón italiano afectan el porcentaje de inhibición del radical
DPPH.
a) Gráfica de media de la CMI de
s.typhimurium
Temperatura (C)
CM
I de
S. ty
phim
uri
um
(m
g/g
) b.s
.
5
8
11
14
17
20
50 110
Tiempo (h)
1
23
Temperatura (C)
CM
I d
e S
. typ
him
uri
um
(m
g/g
) b
.s.
50 110
5.4
7.4
9.4
11.4
13.4
15.4
b) Gráfica de interacción de la CMI
de s.typhimurium
CM
I d
e S
.au
reu
s (m
g/g
) b
.s
50 110
Temperatura (C)
9.3
11.3
13.3
15.3
17.3
c) Gráfica de media de la CMI de
s. aureus
e) Gráfica de media de la CMI de
E. coli
Temperatura (C)
CM
I d
e E
.co
li (
mg
/g)
b.s
.
11
14
17
20
23
26
50 110
Tiempo (h)
1
23
f) Gráfica de interacción de la CMI
de E. coli
CM
I d
e S
.aure
us
(mg
/g)
b.s
Tiempo (h)
1
23
Temperatura (C)
11
13
15
17
19
50 110
d) Gráfica de interacción de la CMI
de s. aureus
CM
I d
e E
.co
li (
mg
/g)
b.s
.
50 110
Temperatura (C)
10
12
14
16
18
20
22
Figura 31. Grafica de Parateo a) CMI de S.typhimurium, c) CMI de S. aureus y e) CMI de E.coli y grafica
de interacción para b) CMI de S.typhimurium, d) CMI de S. aureus y f) CMI de E.coli
RESULTADOS Y DISCUSIONES
74
En la tabla 11, se presentan los resultados de la actividad antioxidante de los extractos de
harina de subproducto de limón italiano, expresada en porcentaje de inhibición (%) contra
el radical DPPH. El extracto polifenólicos que presentó mayor porcentaje de inhibición a 50
⁰C fue el obtenido a las 21 h (93.4±2.5 % de inhibición) y el que presentó menor actividad
fue el obtenido a las 18 h (66.6±1.7 % de inhibición). Los extractos polifenólicos obtenidos
a 110 ⁰C presentaron mayor porcentajes de inhibición de 50±5.2 % de inhibición a las 12h
y menor a las 16 h (35 ± 2.2 % de inhibición). Estos resultados nos indican que las
actividades más elevadas pudieron deberse a la presencia de diversos compuestos fenólicos
con actividad antioxidante, así mismo los bajos porcentaje de inhibición pudieron estar
influenciado por la ausencia de grupos hidroxilo en el anillo B de los flavonoides presentes
lo que podría disminuir su actividad secuestradora. Esto último puede estar relacionado a
cambios en la estructura de los flavonoides afectados por la actividad antioxidante del
extracto durante el tratamiento por calentamiento (Chen, M., y col., 2011).
Los resultados estadísticos indicaron (figura 32 a) que no existe diferencia significativa
entre las temperaturas de 50 y 110 ⁰C para el porcentaje de inhibición del radical DPPH.
Con el grafico de interacción (figura 32b) se observa que el mejor tratamiento fue a la
temperatura de 50 ⁰C a 21 h presentando el mayor porcentaje de inhibición del radical
DPPH (93.4±2.5 % de inhibición).
Po
rcen
taje
de
inh
ibic
ión
del
rad
ical
DP
PH
(%
)
50 110
Temperatura (C)
60
62
64
66
68
70
72
Temperatura (C)
Po
rcen
taje
de
inh
ibic
ión
del
rad
ical
DP
PH
(%
)
52
56
60
64
68
72
76
50 110
Tiempo (h)
1
23
a) grafico de media para el
porcentaje de inhibición
b) grafico de interacción para el
porcentaje de inhibición
Figura 32. Gráfico de media para a) porcentaje de inhibición del radical DPPH y b) grafico de interacción
para el porcentaje de inhibición
RESULTADOS Y DISCUSIONES
75
Dif
eren
tes
letr
as d
e su
bín
dic
e en
la
mis
ma
colu
mn
a p
ara
las
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10
0 ⁰
C (
a, b
, c,
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duct
o d
e li
mó
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tali
ano
sec
ado
s a
50
⁰C
y 1
10
⁰C
RESULTADOS Y DISCUSIONES
76
7.4. Propiedades fisicoquímicas de harina de subproducto de limón italiano secadas a
50 y 110 ⁰C a diferentes tiempos.
La tabla 12, presenta los valores de las propiedades fisicoquímicas determinadas de las
harinas obtenidas del diseño factorial 2x8 que obtuvieron un porcentaje de humedad de
aproximadamente del 15 %. La luminosidad (figura 33a) de las harinas presentó diferencia
significativa a las temperaturas de secado evaluadas lo que indica que a mayor temperatura
y tiempo de secado las harinas pierden luminosidad. A la temperatura de 50 ⁰C las harinas
son más brillosas que las harinas obtenidas a 110 ⁰C. Para el parámetro hue que indica el
ángulo de medición polar, la temperatura de 50 ⁰C fue mayor que la temperatura de 110 ⁰C.
El pH de la harina se encontró en un rango de 3.43±0.02 a 3.52 ±0.02 para las dos
temperaturas. El porcentaje de acidez se presenta en un intervalo de 41.6 a 47.5 g ácido
cítrico / 100 mL.
Tabla 12. Resultados de color, pH y porcentaje de acidez de harinas obtenidas a 50 ⁰C y 110 ⁰C
Diferentes letras de subíndice en la misma columna para las temperaturas de 50 y 100 ⁰C (a, b, c) significan
que hay diferencia significativa (p≤0.05).
En la figura 33, se ejemplifica con las gráficas de medias la presencia de diferencia
significativa en las temperaturas evaluadas en relación base a la luminosidad de las harinas
(figura 33a) observando que la temperatura de 50 ⁰C tiene los mejores resultados y en la
cromaticidad (figura 33b) la temperatura de 50 ⁰C presentó el mayor valor. Para hue
(figura 33c) la temperatura de 50 ⁰C fue la que presentó los valores más altos. Donde no se
observó diferencia significativa fue en el porcentaje de acidez (figura 33e). En la figura
33d se observa que la temperatura de 110 ⁰C tiene mayor pH sin ser significativamente
diferente.
Temperatura
(⁰C)
Tiempo
(h)
Color pH % Acidez (g ácido
cítrico/ 100mL) L* C* h⁰
50 18 71.1±0.3c 31.5 ±0.2a 83.9±0.1a 3.52±0.02a 42.7±1.5b
21 72.7±0.2a 30.2±0.0b 84.3±0.1a 3.46±0.02b 41.6±0.0b
24 71.7±0.2b 31.5±0.2a 84.0±0.2a 3.43±0.02b 47.5±0.0a
110 12 50.8±0.1a 28.3±0.0a 69.1±0.0c 3.48±0.02b 43.8±0.0b
14 45.1±0.2b 28.0±0.0b 66.5±0.b 3.48±0.01b 43.8±0.0b
16 42.7±0.1c 27.7±0.1c 64.8±0.1a 3.51±0.0a 44.5±2.1b
RESULTADOS Y DISCUSIONES
77
Con base a los resultados presentado en el segundo diseño factorial 2x8, se determinó que
los subproductos de limón italiano secados a 50 ⁰C a 21 h (humedad del 7.8±0.5 %)
presentaron las mejores condición de secado, por su alta actividad biológica, reportando
una CMI de polifenoles contra las bacterias, S. typhimurium, S. aureus y E. coli de 5.8 ±0,
11.7±0, 17.5 ±8.2 mg EAG/g b.s respectivamente. Y un porcentaje de inhibición del radical
DPPH de 93.4 ±2.5 %.en comparación con la temperatura de secado de 110 ⁰C, que solo
presentó una alta concentración de polifenoles con baja actividad biológica.
Temperatura (C)
Lu
min
osi
dad
(L
*)
50 110
44
49
54
59
64
69
74
Temperatura (C)
Cro
mati
cid
ad
(*
C)
50 110
27
28
29
30
31
32
Hu
e (
h0
)
50 110
Temperatura (C)
66
70
74
78
82
86
pH
50 110
Temperatura (C)
3.46
3.47
3.48
3.49
3.5
Temperatura (C)
Po
rcen
taje
de a
cid
ez (
g d
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cid
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co
/10
0 m
L)
50 110
43
43.3
43.6
43.9
44.2
44.5
44.8
a) Grafica de media para la luminosidad b) Grafica de media para la cromaticidad
c) Grafica de media para hue d) Grafica de media para pH
e) Grafica de media para el porcentaje de acidez
Figura 33. Gráfica de media para a)luminosidad, b)cromaticidad,c) hue, d) pH y e) porcentaje de acidez
RESULTADOS Y DISCUSIONES
78
7.5. Análisis bromatológico de harina secada a 50 ⁰C por 21 h.
Se realizó un análisis bromatológico para evaluar las principales características de la
composición de la harina de subproducto de limón italiano (secadas a 50 ⁰C a las 21 h.)
con la presencia de polifenoles y posterior a la extracción de los mismos. Este análisis fue
realizado en el laboratorio de metales del CIATEJ Guadalajara, donde se analizaron la
humedad, proteína, cenizas, grasa, carbohidratos totales, fibra cruda, vitamina C, calcio y
potasio. Estos análisis reportaron como resultado los valores indicados en la tabla 13. La
humedad de las harinas con polifenoles (7.20 %) fue menor que la harina sin polifenoles
(11.72 %). Este aumento se debió al proceso de extracción de polifenoles, lo que implico
que la harina interactuara con disolventes lo cual provoco un aumento en la humedad. El
contenido de proteína en la harina con polifenoles y sin polifenoles fue menor al contenido
de proteínas en harina de maíz (8.54 %) (García, S. 2004). Las cenizas, grasas y
carbohidratos totales presentaron valores similares en la harina con polifenoles y sin
polifenoles. En cuanto a la fibra cruda, se observó que la harina sin polifenoles presento
mayor valor en comparación con la harina con polifenoles. Estudios realizados por García,
S. (2004) indicaron que la harina de maíz, maseca y minsa, presentaron un contenido de
4.05, 2.10 y 2.28 % (García, S. 2004), lo anterior indica que la fibra de harina de limón
italiano es mucho mayor que los valores reportado por Garcia, S (2004). Se ha reportado
que la fibra cruda es una medición que cuantifica principalmente celulosa y algunos tipos
de hemicelulosas por lo que puede ser utilizada como un buen sustrato para la producción
de alcohol de segunda generación, o para la formulación de alimentos para ganado o hasta
de consumo humano.
El contenido de calcio y potasio fue de 8 705.0 y 6 706.0 mg/kg respectivamente en las
harinas de subproducto de limón italiano y en las harinas sin polifenoles fue mucho menor
(tabla 13). La pérdida de estos elementos se pudo deber durante la extracción de los
compuestos polifenólicos por la interacción de solventes y agua.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
79
Tabla 13. Concentración proximal de harina de subproducto de limón italiano secada a 50 ⁰C por 21 h
Determinación Harina de subproducto de limón italiano
Con polifenoles (% en peso) Sin polifenoles(% en peso)
Humedad 7.20 11.72
Proteína 5.97 5.45
Cenizas 6.39 6.92
Grasas 1.29 1.75
Carbohidratos totales 79.15 74.16
Fibra cruda 15.55 16.15
Vitamina C 3.53 (mg/100g muestra) 5.39 (mg/100g muestra)
Calcio 8 705.0 mg/kg 6 706.0
potasio 6 706.0 mg/kg 4 177.0
7.6. Balance de materia y rendimiento
La tabla 14 presenta resumido el balance de materia y el rendimiento de subproductos de
limón italiano cuando son procesados a diferentes temperaturas. La humedad del
subproducto del limón italiano fue de 84.5±0.9 % y de la harina fue de 7.8 ±0.8 %. Valor
que se encuentra dentro de lo establecido por la CODEX para harina. El subproducto de
limón italiano (cascara, bagazo, semilla) secado a 50⁰ C por 21 h presentó un rendimiento
de 15.5±0.8 g / 100 g de subproducto. El balance general se especifica en la figura 34.
Secado
Materia prima
Entrada S (100g)
XH2O
0.845 (84.5g)
Xsólidos
0.149 (14.6g)
Xpolif
0.000056 (5.6mg)
Salida S1 (83.3g)
(Agua evaporada) X
H2O 0.9999 (76.8g)
Xpolif
0.0000459 (1.77mg)
Salida S2 o Entrada
M (15.5g) X
H2O 0.077 (1.2g)
Xsólidos
0.921 (14.3)
Xpolif
0.00016 (3.83mg)
Figura 34. Balance de materia y rendimiento de subproducto de limón italiano durante el secado
RESULTADOS Y DISCUSIONES
80
Tabla 14. Balance de materia y rendimiento de subproducto de limón italiano durante el secado y el molido
Análisis Subproducto Harina
Humedad (%) 84.5±0.9 7.8±0.5
YMATERIA SECA/SUBPRODUCTO
(g/100g BH)
Durante secado
- 15.5 + 0.8
YHARINA/SUBPRODUCTO
(g/100g BS)
Durante molido
- 89.58
En la tabla 15 se presenta resumido el balance de materia y el rendimiento de la
concentración de polifenoles. Para la cuantificación de compuestos polifenoles en
subproducto cítrico se tuvo un rendimiento de 5.56±0.31 mg EAG / 100 g b.s. y en las
harinas se obtuvo un rendimiento de 2.33±0.041 mg EAG/g b.s. Durante el proceso de
secado de los subproductos de limón italiano se perdió 3.2 g/ 100 g de materia b.s.
Obtenido al final del proceso una concentración de 2.3 g/ 100g b. s. El balance general se
especifica en la figura 35
Después del seca y el molido de los subproductos de limón italiano se obtuvo para la harina
un rendimiento de 45g/ 100 g b.s.
Tabla 15. Balance de materia de polifenoles extraídos de harina de limón italiano
Análisis Subproducto Harina
Polifenoles totales mg/100g BS 5.56 ± 0.31 2.33 ± 0.41
YPOLIF.
DE HARINA/POLIF.
EN SUBPRODUCTO
(g /100g BS) Después del secado y
molienda
- 45
YPOLIF. EN
HARINA/SUBPRODUCTO
(g /100g BS)
Después del secado y molienda
- 2.3
RESULTADOS Y DISCUSIONES
81
La cáscara de cítrico deshidratada, es un subproducto de la industria citrícola cuyo mercado
principal es la obtención de pectina. En la actualidad se buscan otras alternativas aplicables
a estos subproductos. Debido a su gran contenido de fibra y su costo relativamente bajo,
comparado con su alto valor nutricional, podría transformarse en un producto base para la
elaboración de alimentos nutracéuticos .De igual forma, estos subproductos de acción
benéfica para la salud, podría convertirse en harinas funcional de aplicación veterinaria
(Albarracin, P.M. et al., 2011).
Materia prima
Entrada S (100g)
XH2O
0.845 (84.5g)
Xsólidos
0.149 (14.6g)
Xpolif
0.000056 (5.6mg)
Salida S1 (83.3g)
(Agua evaporada) X
H2O 0.9999 (76.8g)
Xpolif
0.0000459 (1.77mg)
Salida S2 o Entrada
M (15.5g) X
H2O 0.077 (1.2g)
Xsólidos
0.921 (14.3)
Xpolif
0.00016 (3.83mg)
Salida M1(1.53 g)
(pérdida) X
H2O 0.077 (0.115g)
Xsólidos
0.923 (1.385)
Xpolif
0.00102 (1.53mg)
Molido
Secado
Harina
Salida M2 (13.9g) X
H2O 0.077 (1.1g)
Xsólidos
0.922 (12.8g)
Xpolif
0.0016 (2.3mg)
Figura 35. Balance de materia y rendimiento de subproducto de limón italiano durante el secado y el
molido
RESULTADOS Y DISCUSIONES
82
7.7. Vida de anaquel de la harina de subproducto secado a 50 ⁰C por 21 h
Para determinar el tiempo de vida de anaquel de la harina que tuvo las mejores condiciones
de secado (50 ⁰C por 21 h) de subproducto de limón italiano, fue necesario el empleó de
metodologías como las utilizadas en las pruebas aceleradas de la determinación de la vida
de anaquel, que consisten en aplicar calor a los alimentos, esto para disminuir el tiempo
necesario y poder estimar la vida de anaquel del producto, que de otro modo seria
excesivamente largo. Para este estudio se emplearon dos temperaturas 35 y 60 ⁰C. Los
parámetros críticos a evaluar en función de la temperatura y tiempo de almacenamiento
fueron la concentración de polifenoles, actividad antimicrobiana, antioxidante y las
propiedades fisicoquímicas (humedad, pH, acidez y color). Para conocer el porcentaje de
inhibición del radical DPPH y la CMI de los tres microorganismos, fue necesario ajustar los
extractos polifenolicos de harina de subproducto de limón italiano a una concentración de 5
mg/g b.s.
En la figura 36 se presentan los resultados de la concentración de polifenoles y su actividad
antioxidante, así como la CMI de S. typhimurium, S. aureus y E.coli, el porcentaje de
humedad y la actividad del agua de la harina que fue secada a 35 ⁰C por un periodo de 106
días. En la figura36a se observa para el día 78 de secado, la mayor concentración de
polifenoles (10.1±2.2 mg EAG/g base seca) al igual, mayor porcentaje de inhibición del
radical DPPH (70.5±3.4 %). En general, durante los 106 días de secado de la harina, la
concentración de polifenoles sufrió un descenso y posteriormente un ligero incremento que
no fue significativamente diferente. La reducción de la concentración pudo deberse al
efecto de la temperatura de secado (Garau, M. y col., 2007) y el aumento a la formación de
nuevos compuestos polifenólicos con bajo peso molecular (Chen, M. y col., 2011). Para el
porcentaje de inhibición del radical DPPH se observó que conforme pasaban los días de
almacenado de la harina, el porcentaje de inhibición del radical DPPH incrementaba. Lo
anterior podría ser indicativo de que los compuestos polifenolicos presentes tuvieron alta
actividad antioxidante y quizá se tuvo la presencia de compuestos como hesperidina,
diosmina y eriocitrina, compuestos con mayor actividad antioxidante presentes en el limón
(Del Río, J. y col., 2004).
RESULTADOS Y DISCUSIONES
83
La humedad de la harina almacenada a 35⁰C disminuyo conforme aumentaron los días de
almacenamiento (figura 36b), encontrándose el valor dentro de lo reportado por la CODEX
para harina. Con una actividad de agua (Aw) de 0.36 a 0.43. Valor que se encontró por
debajo de lo reportado por Schmidt, S. y col., (2006) en harina de trigo (Aw de 0.523).
La figura 36c indica un pH de 3.3 a 3.5 y un porcentaje de acidez de 21.4±1.2 a 29.9±5.4 g
ácido cítrico/ 100 mL. La figura 36d muestra que los extractos polifenólicos de harina de
subproducto de limón italiano presentaron una CMI de 0.9 mg/g b.s contra S. typhimurium,
1.3 mg/g b.s contra S. aureus y para E.coli 1.9 mg/g b.s.
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.0
90.0
100.0
0
2
4
6
8
10
12
14
0 8
15
22
29
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43
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57
64
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106
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0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0
1
2
3
4
5
6
7
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9
10
0 8
15
22
29
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Po
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(%
)
Tiempo (Días)
a
b
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
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pH
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g/g
b.s
)
Tiempo (Días)
S.Typhimurium S.aureus E. colid)
Figura 36. Resultado de vida de anaquel de la harina de subproducto de limón italiano, secada a 35 ⁰C por 106 días. a)
concentración de polifenoles y porcentaje de inhibición del radical DPPH ,b) porcentaje de humedad y actividad del agua
(Aw), c) pH y porcentaje de acidez, y d) CMI de S.typhimurium, S.aureus y E.coli
RESULTADOS Y DISCUSIONES
84
En la figura 37 se presentan los resultados de la concentración de polifenoles y su actividad
antioxidante, así como la CMI de S. typhimurium, S. aureus y E.coli, el porcentaje de
humedad y la actividad del agua de la harina que fue almacenada a 60 ⁰C por un tiempo de
53 días. En la figura37a se observa para el día 29, la mayor concentración de polifenoles
(11.0±0.3 mg EAG/g b.s.) y el menor valor al día 15, reportando 7.3±0.7 mg/g b.s. De igual
forma se observa que a partir del día 22 la concentración de polifenoles aumentó con
respecto a la muestra de harina con las mejores condiciones de secado (9.1±0.2 mg/g b.s).
En general, durante los 53 días de almacenado de la harina, la concentración de polifenoles
aumentó, esto pudo deberse quizá a la formación de nuevos compuestos polifenólicos con
bajo peso molecular (Chen, M. y col., 2011). Para el porcentaje de inhibición del radical
DPPH se observó que a partir del día 39 el porcentaje de inhibición del radical DPPH
incrementó más del doble del porcentaje de inhibición de la harina de subproducto obtenida
de las mejores condiciones de secado (28.8±0.3 %). Lo cual podría decirnos que los
compuestos polifenólicos presentes tuvieron alta actividad antioxidante y tal vez presencia
de los compuestos hesperidina, diosmina y eriocitrina, compuestos con mayor actividad
antioxidante presentes en el limón (Del Río, J. y col., 2004).
El porcentaje de humedad y la actividad de agua de la harina secada a 60⁰C disminuyó
conforme aumentaron los días de almacenamiento (figura 37b), encontrándose el valor
dentro de lo reportado por la CODEX para harina. Con una actividad de agua (Aw) de 0.08
a 0.3, valor que se encontró por debajo de lo reportado por Schmidt, S. y col., (2006) en
harina de trigo (Aw de 0.523). La figura 37c indicó un pH de 3.4 a 3.5 y un porcentaje de
acidez de 23.8 a 25.6 g ácido cítrico/ 100 mL.
En la figura 37d se reportó que los extractos polifenólicos de harina de subproducto de
limón italiano presentaron una CMI de 0.9 mg/g b.s contra los microorganismos S.
typhimurium y S. aureus y para E.coli 1.3 mg/g b.s.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
85
En la figura 38 se muestran los valores de la luminosidad, croma y hue en función de los
días de almacenamiento de las harinas de subproducto de limón italiano en función del
tiempo 1 representando a la harina obtenida con las mejores condiciones de sacado del
subproducto de limón italiano y 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ,13, 14 y 15.que representa
los días 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71, 78, 85, 92, 99 y 106 para la temperatura de
secado a 35 ⁰C y 4, 8,11, 15,18,22, 25, 29, 32,36, 39, 43, 46, 50 y 53 para la temperatura de
secado a 110 ⁰C. En la figura 38a se observó que la harina con las mejores condiciones
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0
1
2
3
4
5
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7
8
9
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0
2
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0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
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b)
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de
´´a
cid
o c
ítri
co/
10
0 m
l)
a)
pH
Tiempo (Días)
a
b
a) b)
c)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
0 10 20 30 40 50 60
Con
cen
traci
ón
de
poli
fen
ole
s
para
la i
nh
ibic
ión
de
mic
roorg
enis
mos
(mg
/g b
.s)
Tiempo (día)
S.Typhimurium S.aureus E.coli
d)
Figura 37. Resultado de vida de anaquel de la harina de subproducto de limón italiano, secada a 60⁰C por 53 días. a) concentración
de polifenoles y porcentaje de inhibición del radical DPPH ,b) porcentaje de humedad y actividad del agua (Aw), c) pH y porcentaje
de acidez, y d) CMI de S.typhimurium, S.aureus y E.coli.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
86
presento una luminosidad de 73.6±0.1 y durante el secado a 35 ⁰C durante un tiempo de
almacenamiento de 106 días, perdió ligeramente la luminosidad en comparación con la
harina secada a 110 ⁰C. El valor de la cromaticidad (figura 38b) permaneció constante
durante el tiempo de almacenamiento de 35 ⁰C con un valor promedio de 30. Así mismo la
harina almacenada a 60 ⁰C aumentó su cromaticidad y volvió a disminuir al día 56 de
almacenamiento. Para el valor de hue (figura 38c), las harinas secadas a temperatura de 35
y 60 ⁰C permanecieron con valores constantes.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516
Cro
ma
tici
da
d (
*C
)
Tiempo (h)
35 ⁰C
60 ⁰C
0102030405060708090
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516
Hu
e (h
⁰)
Tiempo (h)
35 ⁰C
60 ⁰C
a) b)
c)
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Lu
min
isid
ad
(*
L)
Tiempo (h)
35 ⁰C
60 ⁰C
Figura 38. Grafica de a) luminosidad, b) cromaticidad y c) hue de harina de subproducto de limón secada a35 y 60 ⁰C
RESULTADOS Y DISCUSIONES
87
En los resultados de los análisis estadísticos se observó por medio del gráfico de medias
que la temperatura de almacenamiento de 60°C conservó la mayor concentración de
polifenoles así como la actividad antioxidante. Sin embargo para la concentración mínima
inhibitoria, la harina secada a 35 ⁰C presentó los mejores resultados. La luminosidad se
pierde a mayor velocidad cuando las muestras son almacenadas a 60 ⁰C.
La figura 39 y 40 ilustra el color que presento la harina al ser almacenada a temperaturas
de 35 y 60 ⁰C durante la prueba de vida de anaquel. .
7.7.1 Variable de respuesta
La variable de respuesta seleccionada como valor crítico para la determinación de la vida
útil de harina de subproducto de limón italiano fue el color, debido a que por fue la única
variable que presentó un cambio constante durante la prueba acelerada, lo cual afectó la
apariencia física de la harina. En la literatura existen reportes como el presentado por,
García, C. y col., (2011), quienes emplearon la degradación de color como indicador de
deterioro para la estimación de la vida útil de una pasta de tomate. Para ello, utilizaron la
escala L*, a*, b* del método de Hunter Lab para definir el color como valor control o
estándar de la pasta de tomate y posteriormente establecer un valor considerado como no
aceptable determinado mediante una prueba sensorial. Debido a que la medición de color se
puede representar como un punto ubicado en el espacio, es decir, con los ejes L, a y b
establecidos, los autores calcularon vectores correspondientes a los valores obtenidos a
partir de la medición del color, para lo que emplearon la ecuación 6
𝑉𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟 = √𝐿2 + 𝑎2 + 𝑏2 Ec 6.
Con base a estos estudios, se decidió emplear el mismo procedimiento para estimar el
tiempo de vida de anaquel de harina de subproducto de limón italiano.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
88
Figura 39. Harina secada por un tiempo de 106 días a una temperatura de 35 ⁰C
Control
8º día 15º día 22º día 29º día
36º día 43º día 50º día 57º día
64º día 71º día 78º día 85º día
92º día 99º día 106º día
RESULTADOS Y DISCUSIONES
89
Control
4º día 8º día 11º día 15º día
18º día 22º día 25º día 29º día
32º día 36º día 39º día 43º día
46º día 50º día 53º día
Figura 40. Harina secada por un tiempo de 53 días a una temperatura de 35 ⁰C
RESULTADOS Y DISCUSIONES
90
7.7.2 Estimación del tiempo de anaquel de harina de subproducto de limón italiano
En la figura 41 se presentan los resultados del cambio de color en función del tiempo para
cada temperatura evaluada. De igual forma, se observa que a medida que pasa el tiempo el
vector de color disminuye, es decir, el color amarillo de la harina se va oscureciendo.
Las regresiones lineales obtenidas de estos gráficos se presentan en la ecuación 7 y 8.
Donde la pendiente de cada una de ellas representa la constante de reacción o deterioro de
color. Este deterioro presenta una tendencia lineal con pendientes negativas expresadas
mediante la ecuación de la recta.
Vector = 78.665-0.0445t Ec 7.
Vector =77.346-0.3913t Ec 8.
Con las dos constantes obtenidas por mínimos cuadrados, y representadas por los valores
de la pendiente en las ecuaciones 7 y 8, para las dos temperaturas estudiadas se construyó
un gráfico del ln k en función de 1/T (Figura 42).
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.0
90.0
0 20 40 60 80 100 120
Va
lore
s H
un
ter
Tiempo (Días)
35 ⁰C
60 ⁰C
-4
-3
-2
-1
0
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03
lnK
1/T
Figura 41. Vectores en función del tiempo para las temperaturas de 35 y 60 ⁰C
Figura 42. Gráfico del ln k en función de 1/T
RESULTADOS Y DISCUSIONES
91
La ecuación que se ajustó por mínimos cuadrados es la ecuación 9, y la energía de
activación que se obtuvo de esta ecuación es de 1518.30 J/ mol.
lnk=2.1053-182.61(1/T) Ec. 9
Por otro lado, se determinó que los valores L*=50.9±0.7, a*=11.5±0.2, b*=28.6±0.5, los
cuales representan un color obscuro de la harina de subproducto de limón italiano, son
valores que proporcionan un color no atractivo para el consumidor, siendo el vector
resultante de estos valores 59.5.
Al sustituir este resultado del vector en las ecuaciones 7 y 8 se estima que la harina
incubada a 35 ⁰C y 60 ⁰C tiene una vida útil de 431 días y 46 días respectivamente.
Posteriormente se graficó el logaritmo de la vida útil a las temperaturas estudiadas (figura
43).
Con la ecuación obtenida (ecuación 10) se puede estimar la vida útil de la harina de
subproducto de limón italiano para diferentes temperaturas de almacenamiento.
Log vida útil= 3.9993-0.039T Ec. 10
Y despejando la ecuación 10 se obtiene la ecuación 11:
Vida útil = 10(3.9993-0.039T)
Ec.11
Donde T está dada en ⁰C.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 20 40 60 80
Lo
g v
ida
uti
l
Temperatura (⁰C)
Figura 43 . Gráfico del log vida útil en función de las temperaturas
RESULTADOS Y DISCUSIONES
92
Con base a la ecuación 11 se estimó que a la temperatura de 25 ⁰C y 30 ⁰C el tiempo de
vida útil de harina de los subproductos de limón italiano son los valores que se indican en la
tabla 16:
Tabla 16. Tiempo de vida de anaquel de harina de subproducto de limón italiano
Temperatura
(⁰C)
Tiempo de
vida útil
25 2años y 9meses
30 1año y 8meses
7.8. Evaluación del mejor sistema de extracción de compuestos polifenólicos en harina
de subproducto de limón italiano mediante un diseño factorial 34.
Una vez establecidas las mejores condiciones de secado de subproductos de limón italiano
(50 ⁰C por 21 h) para la obtención de la harina cítrica, se prosiguió con la segunda etapa del
trabajo, la cual consistió en evaluar diferentes métodos de extracción para la obtención de
compuestos polifenólicos, lo anterior mediante un diseño factorial 34
(Anexo 3), los factores
evaluados fueron: solventes (etanol, acetona y metanol), concentración de solvente (50, 70
y 90 %), temperatura (15, 25 y 40 ⁰C) y tiempo de extracción (1, 2.5, 4 h). Las variables de
respuesta analizadas fueron: porcentaje de humedad, concentración de polifenoles y
flavonoides, actividad antimicrobiana y antioxidante, con la finalidad de obtener un método
de extracción con el mayor rendimiento posible que conservara la actividad biológica Para
evaluar el efecto del nuevo método evaluado, se utilizó como método de referencia de
extracción el descrito por Sánchez-Contreras y col., 2012, en el que mediante extracción
criogénica con metanol se obtuvo alrededor de 10.0 ± 3.1 mg EAG/g b.s de concentración
de polifenoles.
7.8.1. Concentración de polifenoles
En la figura 44 se presentan los resultados de los promedios de las concentración de los
polifenoles totales obtenidos a partir de los extractos de la harina de subproductos de limón
italiano, evaluados con el diseño factorial propuesto y expresados con respecto al tiempo de
extracción para cada uno de los solventes a las diferentes concentraciones propuestas. En la
RESULTADOS Y DISCUSIONES
93
figura 44a se presenta los resultados de la extracción realizada a la temperatura de 15 ⁰C.
La mayor concentración de polifenoles obtenida fue de 8.7± 0.1mg EAG/g b.s., con en el
extracto evaluado con etanol al 50 % durante 1h de extracción y la menor concentración fe
de 5.8±0.0 mg EAG/g b.s, la cual se encontró en el extracto obtenido con metanol al 50 %
por un tiempo de 2.5 h. La figura 44b presenta los resultados de la concentración de
polifenoles obtenidos de la extracción realizada a la temperatura de 25 ⁰C. La mayor
concentración de polifenoles (9.9±1.7 1mg EAG/g b.s) fue empleando acetona al 90 % por
1h y la menor (5.8±0.6 mg EAG/g b.s) se presentó en el extracto de metanol al 50 %
extraído por un tiempo de 4h. Para la temperatura de extracción de 40 ⁰C (figura 44 c), el
mayor contenido de polifenoles (8.6±0.9 mg EAG/g b.s) se presentó en el extracto de
acetona al 70 % por un tiempo de 2.5 h y la menor (6.1±0.1mg EAG/g b.) se reportó en el
extracto de metanol al 50 % extraído por 1 y 2.5 h. La mayor concentración de polifenoles
presentada en las tres temperaturas de extracción evaluadas, se encontró dentro de los
valores obtenidos por el estándar de referencia.
Con los resultados presentados se realizó un análisis de varianza multifactorial que indicó
que el tiempo, solvente, concentración del solvente y la interacción solvente-concentración,
presentaron un efecto significativo en la concentración de polifenoles totales. Estos
resultados se comprueban con el diagrama de Pareto (figura 45a). En la figura 45b, se
observa la interacción solvente-concentración, reportando que la mayor concentración de
polifenoles (7.9 mg EAG /g b.s) se podría obtener usando el solvente acetona a una
concentración de 70 % y 90 %. Dichas concentraciones fueron analizadas mediante la
gráfica de media (figura 45c), la cual a su vez reportó que no existe diferencia significativa
entre las dos concentraciones.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
94
Debido a que la acetona a las concentraciones de 70% y 90 % presentaron mayor
concentración de polifenoles se prosiguió a evaluar por medio del grafico de medias, a que
temperatura y tiempo de extracción se favorece la mayor extracción de polifenoles. Por lo
tanto en la figura 45d se obtuvo que la temperatura de 25 ⁰C y 40 ⁰C a un tiempo de 1 h
(figura 45e) presentaron las mejores condiciones de extracción de compuestos polifenoles.
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1 2.5 4Co
nce
ntr
aci
ón
de
po
life
no
les
(mg
EA
G/g
b.
s)
Tiempo (h)
Etanol 50% Etanol 70% Etanol 90%
Acetona 50% Acetona 70% Acetona 90%
Metanol 50% Metanol 70% Metanol 90%
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1 2.5 4
Co
nce
ntr
aci
ón
de
po
life
no
les
(m
g E
AG
/g b
. s)
Tiempo (h)
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1 2.5 4
Co
nce
ntr
aci
ón
de
po
life
no
les
(m
g E
AG
/g b
. s)
Tiempo (h) a) b)
c)
Figura 44. Concentración de polifenoles totales con respecto al tiempo a diferentes solventes y concentración de
solvente, en muestras de harina de subproducto de limón italiano. La figura a) presenta la concentración de
polifenoles totales en extractos obtenidos a temperatura de 15 ⁰C b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
95
El solvente acetona al 70 %, que presentó las mejore condiciones para la mayor extracción
de polifenoles concuerda con lo reportado por Sulaiman S. y col., (2011), quienes
evaluaron los solventes acetona, etanol y metanol al 70 %, he indicaron que la acetona fue
el mejor solvente para la extracción de compuestos fenólicos. Reportaron concentraciones
de 0.4±0.1 a 138.2±2.1 mg EAG /g b.s. De la misa manera, observaron que la diferencia en
las polaridades de los solventes podría influir en la solubilidad de los componentes
químicos para cada muestra y por consiguiente en su rendimiento de extracción. Por otro
lado mencionan que para obtener extractos polifenólicos a partir de vegetales con mejor
rendimiento es necesario tomar en cuenta el solvente y la polaridad de la extracción de los
disolventes, así como el tiempo y temperatura de extracción, al igual que las características
físicas de las muestras. Hasta la fecha, no se encontró en la literatura un disolvente
Efectos estandarizados
0 1 2 3 4 5
A:Temperatura (C)
AD
BC
B:Solvente
C:Concentración (%)
D:Tiempo (h) +
-
Concentración de los solventes(%)
Conce
ntr
ació
n d
e polife
nole
s to
tale
s (m
g/g
b.s
)
Solvente
Etanol
AcetonaMetanol
6.3
6.6
6.9
7.2
7.5
7.8
8.1
50 70 90
Co
ncen
tració
n d
e p
oli
fen
ole
s to
tale
s (m
g/g
) b
.s
15 25 40
Temperatura (C)
7.1
7.5
7.9
8.3
8.7
Concentración de solvente (%)
Co
ncen
tració
n d
e p
oli
fen
ole
s to
tale
s (m
g/g
) b
.s
70 90
7.5
7.7
7.9
8.1
8.3
Co
ncen
tracio
n d
e p
oli
fen
ole
s to
tale
s (m
g/g
) b
.s
1 2.5 4
Tiempo (h)
7.1
7.4
7.7
8
8.3
8.6
8.9
a) Gráfica de Pareto b) Gráfica de interacción
c) Gráfica de media d) Gráfica de media
e) Gráfica de media
Figura 45. Analisis estadistico del diseño experimental 34, resumido en a) gráfica de pareto, b) interacción
concentración del solvente x tipo de solvente y grafica de media en la concentración de polifenoles a diferente
c) concentración de solvente, d) temperatura y e) tiempo.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
96
específico o apropiado de extracción para la recuperación del mayor contenido polifenólico
total en muestras de subproductos cítricos, debido a las diversas estructuras químicas que se
pudieran encontrar que van desde formas simples y polimerizadas de los polifenoles.
Alothman. A y col (2009), quienes estudiaron la extracción de compuestos polifenólicos en
frutas tropicales (piña, platano y guayaba), empleando tres sistemas de solvente (metanol,
etanol y acetona) a tres diferentes concentraciones (50%, 70 y 90%), obtuvieron que el
solvente etanol así como la acetona en sus tres concentraciones presentaron mayor
concentración de polifenoles en comparación con el metanol.
7.8.2. Concentración de flavonoides totales
En la figura 46 se presentan los resultados de los promedios de la concentración de
flavonoides totales, los cuales fueron obtenidos a partir de los extractos de la harina de
subproducto de limón italiano con respecto al tiempo de extracción para cada solvente a las
diferentes concentraciones evaluadas. Cabe mencionar que para la prueba se empleó un
extracto de referencia (Sánchez-Contreras y col., 2012) para comparar la eficacia de los
ensayos obtenidos del diseño 34, con un valor promedio de 3.81 mg EQ /g b.s de
concentración de flavonoides. En la figura 46a se presentan los valores promedios de la
concentración de flavonoides que va de 3.80 a 3.83 mg EQ /g b.s de extractos obtenidos a
temperatura de 15 ⁰C. En la figura 46b se observan promedios de 3.81 a 3.83mg EQ/g b.s
obtenidos de la extracción a temperatura de 25 ⁰C y por último en la figura 46c se reportan
las concentraciones de los extractos de flavonoides obtenidos a la temperatura de 40 ⁰C,
con un valor promedio de 3.81 a 3.84 mg EQ/g b.s. Los valores de concentración de
flavonoides totales obtenidos en el diseño factorial se encuentran dentro del valor de
referencia establecido, lo cual implica que las condiciones tales como: solvente,
concentración de solvente, tiempo y temperatura experimentada, favorecen la extracción de
flavonoides totales.
Con los resultados presentados, se realizó un análisis de varianza multifactorial que indicó
que la temperatura, tiempo, solvente y la concentración del solvente, presentaron un efecto
significativo en la concentración de flavonoides totales. Estos resultados se comprueban
con el diagrama de Pareto (figura 47a). Por otro lado, en la gráfica de media se observa
que la temperatura de 40 ⁰C (figura 47 b) a los tiempos de 2.5 y 4h (figura 47c), con el
RESULTADOS Y DISCUSIONES
97
solvente acetona (figura 47d) a concentración de 70 y 90 % (figura 47e) presentaron una
mayor concentración de flavonoides.
3.763.773.783.793.803.813.823.833.843.853.863.87
1 2.5 4
Co
nce
ntr
aci
ón
de
fla
vo
no
ides
tota
les
(EQ
mg
/g)
b.s
Tiempo (h)
a)
3.77
3.78
3.79
3.80
3.81
3.82
3.83
3.84
3.85
3.86
3.87
1 2.5 4Co
nce
ntr
aci
ón
de
fla
vo
no
ides
tota
les
(EQ
mg
/g)
b.s
.
Tiempo (h) b)
3.78
3.79
3.80
3.81
3.82
3.83
3.84
3.85
3.86
3.87
1 2.5 4Co
nce
ntr
aci
ón
de
fla
vo
no
ides
tota
les
(EQ
mg
/g)
b.s
.
Tiempo (h)
Etanol 50% Etanol 70% Etanol 90%
Acetona 50% Acetona 70% Acetona 90%
Metanol 50% Metanol 70% Metanol 90%
c)
Figura 46. Concentración de flavonoides totales con respecto al tiempo a diferentes solventes y concentración de
solventes, en muestras de harina de subproducto de limón italiano. La figura a) presenta la concentración de
flavonoides totales en extractos obtenidos a temperatura de 15 ⁰C b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
98
7.8.3. Actividad antioxidante de extractos de la mejor harina elaborada de
subproducto de limón italiano.
En la figura 48 se presentan los resultados de los promedios del porcentaje de inhibición
del radical DPPH de los extractos de la mejor harina de subproducto de limón italiano
obtenida. La inhibición fue expresada con respecto al tiempo de extracción para cada
solvente a las diferentes concentraciones evaluadas. Para este análisis se empleó un extracto
de referencia (Sánchez-Contreras y col., 2012) que reportó 28.8 ± 0.3 % de inhibición del
radical DPPH. En la figura 48a se presentan los resultados del porcentaje de inhibición del
radical DPPH de los extractos obtenidos a la temperatura de 15 ⁰C. El mayor porcentaje de
inhibición (73.2±14.4 %) fue en el extracto de etanol al 70 % durante 2.5h de extracción y
el menor (31.9 ±4.2 %.) se encontró en el extracto de acetona al 50 % por un tiempo de 4 h.
La figura 48b presenta el porcentaje de inhibición del radical DPPH de los extractos
Efectos estandarizados
0 3 6 9 12 15
AB
C:Tiempo (h)
A:Solvente
B:Concentración (%)
D:Temperatura (C)+
-
Co
ncen
tració
n d
e f
lav
on
oid
es
tota
les
(mg
/g)
b.s
.
Temperatura (C)
15 25 40
3.8
3.805
3.81
3.815
3.82
3.825
3.83
Co
ncen
tració
n d
e f
lav
on
oid
es
tota
les
(mg
/g)
b.s
1 2.5 4
Tiempo (h)
3816
3818
3820
3822
3824
(X 0.001)
Co
ncen
tració
n d
e f
lav
on
oid
es
tota
les
(mg
/g)
b.s
50 70 90
Concentración de los solventes
3.815
3.817
3.819
3.821
3.823
3.825C
on
cen
tració
n d
e f
lav
on
oid
es
tota
les
(mg
/g)
b.s
Etanol Acetona Metanol
Solvente
3.81
3.813
3.816
3.819
3.822
3.825
a) Diagrama de Pareto b) Diagrama de media
c) Diagrama de media d) Diagrama de media
e) Diagrama de media
Figura47. Analisis estadistico del diseño experimental 34, resumido en a) gráfica de pareto y grafica de
media para concentración de polifenoles a diferente b) temperatura, c)tiempo, d)concentración de solvente
y e) tipo de solvente
RESULTADOS Y DISCUSIONES
99
obtenidos a la temperatura de 25 ⁰C. El mayor porcentaje de inhibición del radical DPPH
(64.5±10.5 %) fue obtenido al emplear acetona al 50 % por 4h y la menor (24.4 ±2.6 %) se
presentó en el extracto de metanol al 90% extraído por un tiempo de 2.5 h. Para la
temperatura de extracción de 40 ⁰C (figura 48 c), el mayor porcentaje de inhibición del
radical DPPH (53.1±0.4 %) se presentó en el extracto de acetona al 90 % por un tiempo de
2.5 h y la menor (29.1±0.8 %) se reportó en el extracto de metanol al 50 % extraído por un
tiempo de 4 h. Con base a los resultados obtenidos, se pudo observar que el porcentaje de
inhibición del radical DPPH de los extractos polifenólicos obtenidos a las diferentes
temperaturas superó el valor de referencia. Lo que implica que los factores solvente,
concentración de solvente, tiempo y temperatura de extracción favorecen el incremento de
inhibición del radical DPPH.
Con los resultados presentados, se realizó un análisis de varianza multifactorial que indicó
que la temperatura, solvente y la interacción temperatura-concentración del solvente,
presentaron un efecto significativo en el porcentaje de inhibición del radical DPPH en
extractos polifenólicos, los cuales son comprobados con el diagrama de Pareto (figura
49a).
En la gráfica de interacción (figura 49b) se observa que el porcentaje de inhibición del
radical DPPH a temperatura de 15 ⁰C, y a concentración de 50 % y 70 % no presentó
diferencia significativa (figura 49c). Por lo tanto, se continuó a evaluar los solventes. En la
gráfica de medias (figura 49d) se observa que no hubo diferencia significativa entre ellos.
Para obtener mayor porcentaje de inhibición del radical DPPH de extractos polifenólicos es
necesario emplear un tiempo de 1h (figura 49e).
Xu, G. y col., (2007), quienes analizaron la cáscara de una variedad de cítrico huyou, (C.
pardisi Changshanhuyou), realizaron un pre tratamiento que consistió en calentar las
cáscaras a diferentes temperaturas y tiempos, realizando la extracción con metanol al 80%.
Los autores observaron que la capacidad antioxidante del extracto de huyou aumentó con el
tiempo de calentamiento y la temperatura. Por ejemplo, después de calentar a 120 ⁰C
durante 90 min, los compuestos polifenólicos totales aumentaron de 37.33 a 47.20 mg
EAG/ g b.s. y la capacidad antioxidante total (CAT) aumentó de 43.66 a 58.21 ECAT mg /
g b.empleando el método de ABTS (azinobis 3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico), y
19.66 a 33.14 ECAT mg / g b.s. por el ensayo FRAP (poder antioxidante reductor del
RESULTADOS Y DISCUSIONES
100
hierro). Estos estudios revelaron que la capacidad antioxidante aumentó con el tiempo y
temperatura de extracción, al igual que el contenido de polifenoles totales lo cual no fue
similar a lo obtenido en este trabajo.
0102030405060708090
100
1 2.5 4
Po
rcen
taje
de
inh
ibic
ión
del
ra
dic
al
DP
PH
(%
)
Tíempo (h) a)
0
20
40
60
80
100
1 2.5 4
Po
rcen
taje
de
inh
ibic
ión
del
ra
dic
al
DP
PH
(%
)
Tiempo (h) b)
0102030405060708090
100
1 2.5 4
Po
rcen
taje
de
inh
ibic
ión
del
rad
ica
l D
PP
H (
%)
Tíempo (h)
Etanol 50% Etanol 70% Etanol 90%
Acetona 50% Acetona 70% Acetona 90%
Metanol 50% Metanol 70% Metanol 90%
c)
Figura 48. Porcentaje de inhibición del radical DPPH de extractos polifenólicos de harina de subproducto de
limón italiano con respecto al tiempo a diferentes solventes y concentración de solventes. La figura a) presenta la
concentración de polifenoles totales en extractos obtenidos a temperatura de 15 ⁰C, b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
101
7.8.4. Actividad anticrobiana expresada como la Concentración Mínima Inhibitoria
(CMI) de las bacterias E. coli, S. aureus, S. typhimurium, en los diferentes
tratamientos de extracción de polifenoles en harina de subproducto de limón italiano.
Para determinar la CMI de las bacterias E.coli, S.aureus y S.typhimurium, fue necesario
ajustar los extractos polifenólicos a una concentración de polifenoles de 5 mg EAG/ g b.s,
en cuanto a los resultados obtenidos contra la bacteria E. coli, se puede apreciar en la
figura 50 CMI se encontró en un intervalo de 2.5 a 5mg EAG/g b.s., Si bien no fue posible
identificar una tendencia en el comportamiento de las muestras, se puede observar que a
a) Diagrama de Pareto b) Gráfica de interacción
c) Gráfica de media d) Gráfica de media
e) Gráfica de media
Efectos estandarizados0 1 2 3 4 5
B:Concentración (%)
D:Tiempo (h)
AD
C:Solvente
AB
A:Temperatura (C) +
-
Figura 49. Analisis estadistico del diseño experimental 34, resumido en a) diagrama de pareto, b)
grafica de interacción temperatura-concentración de solvente y grafica de media para el porcentaje de
inhibición del radical DPPH de extractos polifenolicos obtenidos a diferente c) concentración, d)
solvente y e) tiempo.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
102
temperaturas de 15 y 40°C se observaron mayores concentraciones inhibitorias promedio
independientemente del tiempo y el solvente, por consiguiente la temperatura de 25°C
presentó extractos polifenólicos que requirieron menor concentración para inhibir a la
bacteria haciéndolos de esta forma más eficientes.
7.8.4.1. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de las bacterias E. coli
En cuanto a la CMI obtenida para S. aureus, como se puede observar en la figura 51, la
temperatura de 40°C mostró que se requieren concentraciones de alrededor de 2.5 mg de
EAG/g b.s. independientemente del tiempo y tipo de solvente empleado para la extracción,
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
1 2.5 4
CM
I d
e E
. co
li (
mg
EA
G/g
)
b.s
Tiempo (h) a)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
1 2.5 4CM
I d
e E
. co
li (
mg
EA
G/g
)
b.s
Tiempo (h) b)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
1 2.5 4
CM
I d
e E
.co
li (
mg
EA
G/g
) b
.s
Tiempo (h)
Etanol 50% Etanol 70% Etanol 90%
Acetona 50% Acetona 70% Acetona 90%
Metanol 50% Metanol 70% Metanol 90%
c)
Figura 50. CMI de extractos polifenólicos de harina de subproducto de limón italiano con respecto al tiempo a
diferentes solventes y concentración de solventes. La figura a) presenta la concentración mínima inhibitoria (mg/g
b.s) de E.coli a temperatura de a) 15 ⁰C, b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
103
así mismo los resultados obtenidos para las muestras extraídas a 15 y 25° presentaron
valores muy similares entre sí que se encontraban en los intervalos de 2.5 y 5 mg/g B.S.
7.8.4.2. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de la bacteria S. aureus
En cuanto a los resultados de la CMI obtenidos contra la bacteria S. typhimurium se
observó (figura 52) que al igual que para la bacteria S. aureus las muestras obtenidas a
40°C presentaron los valores más pequeños encontrándose alrededor de 2.5 mg EGA/g b.s.
los tratamientos obtenidos a las temperaturas más bajas fueron muy similares
encontrándose en el intervalo de 2.5 y 5mg de EGA/g b.s.
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
1 2.5 4CM
I S
. a
ure
us
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b.s
Tiempo (h)
a)
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3
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1 2.5 4
CM
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g/g
) b
.s.
Tiempo (h)
b)
0
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2
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1 2.5 4CM
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. a
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us
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b.s
.
Tiempo (h)
Etanol 50% Etanol 70% Etanol 90%
Acetona 50% Acetona 70% Acetona 90%
Metanol 50% Metanol 70% Metanol 90%
c)
Figura 51. CMI de extractos polifenólicos de harina de subproducto de limón italiano con respecto al tiempo
a diferentes solventes y concentración de solventes. La figura a) presenta la concentración mínima inhibitoria
(mg/g b.s) de S.aureus a temperatura de a) 15 ⁰C, b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
104
7.8.4.3. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de la bacteria S. typhimurium
Con la finalidad de buscar identificar los compuestos presentes en los extractos que
presentaron las mejores características en cuanto actividad antimicrobiana se realizaron
placas de cromatografía para identificar algunos de los compuestos presentes en las
muestras y que pudieran ser responsables del efecto biológico al simplemente presentarse
en la muestra o por la mayor cantidad del mismo en el extracto.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1 2.5 4
CM
I S
. ty
ph
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mg
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b.s
.
Tiempo (h) a)
0123456789
10
1 2.5 4
CM
I S
. ty
ph
imu
riu
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mg
/g)
b.s
.
Tiempo (h) b)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1 2.5 4
CM
I d
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. ty
ph
imu
riu
m (
mg
/g)
b.s
.
Tiempo (h)
Etanol 50% Etanol 70% Etanol 90%
Acetona 50% Acetona 70% Acetona 90%
Metanol 50% Metanol 70% Metanol 90%
c)
Figura 52. CMI de extractos polifenólicos de harina de subproducto de limón italiano con respecto al tiempo a
diferentes solventes y concentración de solventes. La figura a) presenta la concentración mínima inhibitoria (mg/g b.s)
de S.typhimurium a temperatura de a) 15 ⁰C, b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
105
7.8.5. Cromatografía en capa fina (CCF)
Una forma de conocer la presencia de metabolitos secundarios es hacer una cromatografía
en capa fina del extracto polifenólico, para lo cual se utilizó como fase móvil acetato de
etilo: ácido fórmico: agua (11:2:7) y se reveló con tricloruro de aluminio (AlCl3) al 5%.
Los extracto polifenólico estudiados fueron acetona al 70 % a una temperatura de 40 ⁰C por
un tiempo de 1 h, extracto de etanol al 90 % a temperatura de 40 ⁰C por un tiempo de 4h y
por último un extracto control (Sánchez-Contreras y col., 2012). Con ayuda de los
estándares de Neohesperidina, Hesperidina, Naringina y Ácido elágico se pudo comprobar
la presencia de alguno de estos en los extractos.
En el cromatofolio de la figura 53 que pertenece a los extractos polifenolicos de harina de
subproducto de limón italiano se pueden observar mediante la incidencia de luz UV la
presencia de bandas fluorescentes con un valor de Rf v de 0.344, la cual corresponde a la
neohesperidina de acuerdo a las muestras de estándares analizados, lo que implica la
presencia de este compuesto en los extractos polifenoles (tabla 17). Al igual se observa la
presencia de otras bandas que pudieran ser compuestos polifenolicos que no fue posible
identificar con los estándares evaluados. El compuesto encontrado en extractos de harina de
subproducto de limón italiano coincide con lo reportado por autores como Del Rio, J. y
col., (200, quienes reportaron que en los frutos cítricos existe la presencia de flavonoides
tales como; naringina, hesperidina, neohesperidina, rutina, naringenina, hesperidina,
nairutin, y tangeretina los cuales presentan actividad biológica que en su mayoría se
expresa como actividad antioxidante sin embargo en algunos casos se ha asociado a la
actividad antimicrobiana.
El compuesto con mayor presencia indicado por el grosor de banda correspondió a la
neohesperidina en todos los casos a los mejores métodos de extracción.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
106
Figura 53. Cromatofolio de extractos polifenólicos de harina de subproducto de limón italiano.
Bajo luz ultravioleta (UV). 1 y 4) extracto con acetona, 2 y 5) extracto con etanol, 3 y 6) extracto
control, 7) Neohesperidina, 8) Hesperidina, 9) Naringina y 10) Ácido elágico
Tabla 17. Factor de retención de los compuestos polifenólicos
Muestra RfA Rf
B
1.-Ext. con acetona 0.08 0.344
2.-Ext. con etanol 0.08 0.344
3.-Control 0.08 0.344
4.- Ext. con acetona 0.08 0.344
5.-Ext. con etanol 0.08 0.344
6.-Control 0.08 0.344
7.-Neohesperidina --- 0.344
8.-Hesperidina --- 0.372
9.-Naringina --- 0.04
10.-Ácido elágico --- ---
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
CONCLUSIONES
107
8. CONCLUSIONES
El subproducto de limón italiano (muestra fresca) presentó 73.7 ± 6.98mg EAG/g b.s. de
polifenoles, valor que se encuentra dentro de lo reportado en la literatura. El factor
temperatura y tiempo de secado así como su interacción presentaron efectos significativos
en el contenido de polifenoles, obteniendo valores más elevados al aumentar la temperatura
(36 -39 mg EAG/ g b.s).
Los extractos polifenólicos presentaron actividad contra S. aureus en todos los tiempos y
temperaturas evaluadas. Y los extractos obtenidos del secados de subproductos a bajas
temperaturas (40 – 60ºC), presentaron mayor inhibición del radical DPPH.
Elevadas temperaturas de secado en las harinas de subproducto de limón italiano afectaron
la luminosidad, cromo y hue de las muestras evaluadas, efecto producido por reacciones de
pardeamiento.
Las mejores condiciones de secado para la obtención de harinas de subproducto de limón
italiano fueron a la temperatura de 50ºC a tiempos de 21 h con un contenido de polifenoles
de 23.3 ±4.1 mg EAG/ g b.s con actividad antimicrobiana y antioxidante.
El contenido de polifenoles con actividad biológica no presentó ningún cambio durante el
tiempo de vida evaluado. Por lo tanto se determinó que el color de la harina de subproducto
de limón italiano como factor de calidad es crítico para establecer el tiempo de vida.
La energía de activación obtenida mediante la ecuación de Arrhenius es de 1518.30 J/ mol y
la vida útil estimada de la harina obtenida de subproductos de limón italiano a 35 ⁰C y 60
⁰C es de 431días y 46 días respectivamente. Con los tiempos y las temperaturas estudiadas
se obtuvo una ecuación general para estimar la vida útil de la harina de subproducto de
limón italiano para diferentes temperaturas de almacenamiento; esta ecuación esta descrita
por: vida útil= 10(3.9993-0.039T).
CONCLUSIONES
108
La cual permite predecir el comportamiento del producto a diferentes condiciones de
temperatura que pueden encontrarse en las diferentes regiones del país.
En el diseño experimental 34 los extractos de polifenoles totales presentaron
concentraciones de 5.8 ± 0.6 hasta 9.9 ± 1.7 mg EAG/g b.s., valor que se encuentra dentro
de lo reportado en la literatura. Por otro lado el análisis de varianza multifactorial establece
que las mejores condiciones de extracción de polifenoles totales fueron favorables al
emplear el solvente acetona a una concentración de 70 % a una temperatura de 25 ⁰C hasta
40 ⁰C por un tiempo de una hora y el mismo solvente con la misma concentración a una
temperatura de 40 ⁰C por un tiempo de dos hora y media favorece la extracción de
flavonoides en harinas de subproducto de limón italiano secadas a 50 ⁰C por 21 h. Al igual
en este diseño experimental, se obtuvo que el mejor método de extracción de compuestos
polifenólicos con mayor actividad inhibitoria del radical DPPH resultó ser utilizando el
solvente acetona a una concentración de 50 % hasta 70% a temperatura de 15ºC y tiempo
de 1h. Para la CMI de E. coli, S. typhimurium y S. aureus, se obtuvo que las mejores
condiciones resulto ser el solvente etanol a una concentración de 90 % a temperatura de
25⁰C hasta 40 ⁰C por un tiempo de 4h.
La concentración mínima inhibitoria para los microorganismos S. aureus, S. typhimurium y
E.coli fue de 5 mg EAG/ g de harina b.s.
El análisis por cromatografía en capa fina de los extractos polifenólicos condujo a la
identificación parcial del compuesto neohesperidina como compuesto mayoritario y posible
responsable de la actividad biológica.
RECOMENDACIONES
109
9. RECOMENDACIONES
La harina elaborada a base del secado de subproducto de limón italiano almacenada a las
condiciones adecuadas podría incrementar su vida de anaquel por lo que se sugiere
almacenarla en recipientes herméticos favoreciendo el incremento de la vida de anaquel, así
mismo debido a las características nutrimentales de la misma es recomendado evaluarla en
formulaciones de alimento para ganado y sustitución en productos alimenticios para uso
humano por su alto contenido de fibra.
Se recomienda identificar mediante técnicas cromatográficas como cromatografía de
líquidos los compuestos polifenólicos mayoritarios presente en los extractos de harina de
subproducto de limón italiano que presentaron la mayor actividad biológica, con la
finalidad de establecer la correlación directa con la actividad biológica y así generar
alternativas para la obtención de agentes antimicrobianos o antioxidantes obtenidos a partir
de subproductos de limón
Los polifenoles al ser compuesto aromáticos, es decir contienen el núcleo del benceno, son
sensibles a la luz y por consiguiente fácilmente degradables Por ello es necesario tener el
mayor cuidado durante la extracción y el almacenamiento de los extractos obtenidos para
poder mantener su actividad biológica, así como evaluar métodos de almacenamiento para
su uso en alimentos o área farmaceútica.
BIBLIOGRAFÍA
110
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ANEXO I. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL 4X8
118
11. ANEXO I. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL 4X8
Num. De
tratamientos
Tiempo
(h) Temperatura (⁰C) Variable de
respuesta
1 12 40
Porcentaje de
humedad,
concentración de
polifenoles y
flavonoides
totales, actividad
antioxidante y
antimicrobiana
2 24 40
3 36 40
4 48 40
5 12 50
6 24 50
7 36 50
8 48 50
9 12 60
10 24 60
11 36 60
12 48 60
13 12 70
14 24 70
15 36 70
16 48 70
17 12 80
18 24 80
19 36 80
20 48 80
21 12 90
22 24 90
23 36 90
24 48 90
25 12 100
26 24 100
27 36 100
28 48 100
29 12 110
30 24 110
31 36 110
32 48 110
ANEXO II. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL 2X8
119
12. ANEXO II. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL 2X8
Num. De
tratamientos
Tiempo
(h) Temperatura (⁰C) Variable de
respuesta
1 12 40
Porcentaje de
humedad,
concentración de
polifenoles y
flavonoides
totales, actividad
antioxidante y
antimicrobiana
2 24 40
3 36 40
4 48 40
5 12 50
6 24 50
7 36 50
8 48 50
9 12 60
10 24 60
11 36 60
12 48 60
13 12 70
14 24 70
15 36 70
16 48 70
ANEXO III. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL34
120
13. ANEXO III. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL34
Num. De
Muestra
Disolvente Pureza (%) Tiempo (h) Temperatura
(⁰C)
Variable de
respuesta
1 1.0 50.0 1.0 15.0
Porcentaje de
humedad,
concentración de
polifenoles y
flavonoides totales,
actividad antioxidante
y antimicrobiana
2 2.0 50.0 1.0 15.0
3 3.0 50.0 1.0 15.0
4 1.0 70.0 1.0 15.0
5 2.0 70.0 1.0 15.0
6 3.0 70.0 1.0 15.0
7 1.0 90.0 1.0 15.0
8 2.0 90.0 1.0 15.0
9 3.0 90.0 1.0 15.0
10 1.0 50.0 2.5 15.0
11 2.0 50.0 2.5 15.0
12 3.0 50.0 2.5 15.0
13 1.0 70.0 2.5 15.0
14 2.0 70.0 2.5 15.0
15 3.0 70.0 2.5 15.0
16 1.0 90.0 2.5 15.0
17 2.0 90.0 2.5 15.0
18 3.0 90.0 2.5 15.0
19 1.0 50.0 4.0 15.0
20 2.0 50.0 4.0 15.0
21 3.0 50.0 4.0 15.0
22 1.0 70.0 4.0 15.0
23 2.0 70.0 4.0 15.0
24 3.0 70.0 4.0 15.0
25 1.0 90.0 4.0 15.0
26 2.0 90.0 4.0 15.0
27 3.0 90.0 4.0 15.0
28 1.0 50.0 1.0 25
29 2.0 50.0 1.0 25
30 3.0 50.0 1.0 25
31 1.0 70.0 1.0 25
32 2.0 70.0 1.0 25
33 3.0 70.0 1.0 25
34 1.0 90.0 1.0 25
35 2.0 90.0 1.0 25
36 3.0 90.0 1.0 25
37 1.0 50.0 2.5 25
38 2.0 50.0 2.5 25
39 3.0 50.0 2.5 25
40 1.0 70.0 2.5 25
41 2.0 70.0 2.5 25
42 3.0 70.0 2.5 25
43 1.0 90.0 2.5 25
44 2.0 90.0 2.5 25
45 3.0 90.0 2.5 25
46 1.0 50.0 4.0 25
47 2.0 50.0 4.0 25
ANEXO III. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL34
121
Num. De
Muestra
Disolvente Pureza (%) Tiempo (h) Temperatura
(⁰C)
Porcentaje de
humedad,
concentración de
polifenoles y
flavonoides totales,
actividad antioxidante
y antimicrobiana
48 3.0 50.0 4.0 25
49 1.0 70.0 4.0 25
50 2.0 70.0 4.0 25
51 3.0 70.0 4.0 25
52 1.0 90.0 4.0 25
53 2.0 90.0 4.0 25
54 3.0 90.0 4.0 25
55 1.0 50.0 1.0 40.0
56 2.0 50.0 1.0 40.0
57 3.0 50.0 1.0 40.0
58 1.0 70.0 1.0 40.0
59 2.0 70.0 1.0 40.0
60 3.0 70.0 1.0 40.0
61 1.0 90.0 1.0 40.0
62 2.0 90.0 1.0 40.0
63 3.0 90.0 1.0 40.0
64 1.0 50.0 2.5 40.0
65 2.0 50.0 2.5 40.0
66 3.0 50.0 2.5 40.0
67 1.0 70.0 2.5 40.0
68 2.0 70.0 2.5 40.0
69 3.0 70.0 2.5 40.0
70 1.0 90.0 2.5 40.0
71 2.0 90.0 2.5 40.0
72 3.0 90.0 2.5 40.0
73 1.0 50.0 4.0 40.0
74 2.0 50.0 4.0 40.0
75 3.0 50.0 4.0 40.0
76 1.0 70.0 4.0 40.0
77 2.0 70.0 4.0 40.0
78 3.0 70.0 4.0 40.0
79 1.0 90.0 4.0 40.0
80 2.0 90.0 4.0 40.0
81 3.0 90.0 4.0 40.0
Disolvente: 1) etanol, 2) acetona, 3) metanol
ANEXO IV. VELOCIDAD DE SECADO
122
14. ANEXO IV. VELOCIDAD DE SECADO
Para calcular la velocidad de secado se utilizó el programa OriginPro 8. Para ello, se
graficó el porcentaje de H2O con respecto al tiempo para obtener la curva de calibración y
en función de la ecuación de SGompertz (ecuación 12) se calculó la velocidad de secado.
0 10 20 30 40 50
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Vel
oci
dad
de
seca
do d
w p
orc
enta
je d
e H
2O
/ dt
Tiempo (h)
Equation y = a*exp(-exp(-k*(x-xc)))
Adj. R-Squa 0.9895
Value Standard Err
B a 94.0564 1.99716
B xc 7.27915 0.54544
B k 0.08871 0.00655
𝑌 = 𝑎𝑒−𝑒(−𝑘(𝑥−𝑥𝑐)) Ec. 12
Donde
𝑎 = 𝑃𝑒𝑟𝑑𝑖𝑑𝑎 𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑎 𝑑𝑒 𝐻2𝑂
𝑘 = 𝑉𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑐𝑎𝑑𝑜
𝐾𝑐 = 𝑝𝑒𝑟𝑑𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝐻2𝑂 𝑑𝑢𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑒𝑙 𝑝𝑒𝑟𝑖𝑜𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒
𝑌 = 𝑉𝑎𝑟𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒 𝑑𝑒𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
ANEXO V. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
123
14. ANEXO V. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
Secado de los subproductos de limón italiano de harina de subproductos de limón
italiano
Humedad
Análisis de varianza del porcentaje de humedad (%) de harinas de subproducto de limón Italiano del
diseño 4x8
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Tiempo 1050.83 1 1050.83 20.68 0.0000
B:Temperatura 831.614 1 831.614 16.37 0.0001
AB 375.667 1 375.667 7.39 0.0078
Total error 4572.22 90 50.8024
Total (corr.) 7778.88 95
Concentración de polifenoles
Análisis de varianza para la concentración de polifenoles (mgEAG/g) b. s. de harinas de subproducto
de limón Italiano del diseño 4x8
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 23.8013 1 23.8013 2.22 0.1400
B:Tiempo 114.601 1 114.601 10.67 0.0015
AB 98.1242 1 98.1242 9.14 0.0033
Total error 966.488 90 10.7388
Total (corr.) 1203.11 95
Porcentaje de inhibición del radical DPPH •
Análisis de varianza para el porcentaje de inhibición del radical DPPH• (%) b. s. en extractos de harina
de subproducto de limón Italiano del diseño 4x8
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 4926.25 1 4926.25 33.39 0.0000
B:Tiempo 3051.22 1 3051.22 20.68 0.0000
AB 1493.34 1 1493.34 10.12 0.0020
Total error 13276.5 90 147.517
Total (corr.) 23212.8 95
Actividad antimicrobiana
Análisis de varianza de la actividad antimicrobiana de extractos polifenólicos de harinas de
subproducto de limón Italiano contra la bacteria S. typhimurium del diseño 4x8
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 1.00446 1 1.00446 12.71 0.0006
B:Tiempo 0.01875 1 0.01875 0.24 0.6273
AB 0.0223214 1 0.0223214 0.28 0.5964
Total error 7.11071 90 0.0790079 Total (corr.) 8.15625 95
ANEXO V. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
124
Análisis de varianza de la actividad antimicrobiana de extractos polifenólicos de harinas de
subproducto de limón Italiano contra la bacteria S.aureus del diseño 4x8
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 1.00446 1 1.00446 2.04 0.1570
B:Tiempo 3.16875 1 3.16875 6.42 0.0130
AB 0.650893 1 0.650893 1.32 0.2537
Total error 44.3946 90 0.493274
Total (corr.) 49.4063 95
Análisis de varianza de la actividad antimicrobiana de extractos polifenólicos de harinas de
subproducto de limón Italiano contra la bacteria E. coli del diseño 4x8
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 0.262401 1 0.262401 0.29 0.5945
B:Tiempo 0.352083 1 0.352083 0.38 0.5376
AB 0.0524802 1 0.0524802 0.06 0.8117
Total error 82.7393 90 0.919325
Total (corr.) 83.4896 95
Color
Análisis de varianza para la luminosidad (*L) de harinas de subproducto de limón italiano del diseño
4x8
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 8013.28 1 8013.28 366.70 0.0000
B:Tiempo 260.633 1 260.633 11.93 0.0008
AB 197.708 1 197.708 9.05 0.0034
Total error 1966.72 90 21.8524
Total (corr.) 10439.1 95
Análisis de varianza para la cromaticidad (*C) de harinas de subproducto de limón Italiano del diseño
4x8
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 117.933 1 117.933 36.71 0.0000
B:Tiempo 14.8403 1 14.8403 4.62 0.0343
AB 4.58581 1 4.58581 1.43 0.2353
Total error 289.104 90 3.21227
Total (corr.) 426.466 95
Análisis de varianza para hue (h⁰) de harinas de subproducto de limón Italiano del diseño 4x8
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 4888.81 1 4888.81 585.80 0.0000
B:Tiempo 170.17 1 170.17 20.39 0.0000
AB 74.2973 1 74.2973 8.90 0.0037
Total error 751.091 90 8.34546
Total (corr.) 5884.41 95
ANEXO V. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
125
Diseño experimental 2x8
Humedad
Análisis de varianza del porcentaje de humedad (%) de harinas de subproducto de limón Italiano del
diseño 2x8
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 5656.76 1 5656.76 47.15 0.0000
B:Tiempo 22167.0 1 22167.0 184.76 0.0000
AB 767.835 1 767.835 6.40 0.0153
Total error 5039.13 42 119.979
Total (corr.) 33633.0 47
Concentración de polifenoles
Análisis de varianza de la concentración de polifenoles totales (mg EAG/g) b.s. de harinas de
subproducto de limón Italiano del diseño 2x8
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 361.846 1 361.846 7.14 0.0107
B:Tiempo 1209.25 1 1209.25 23.88 0.0000
AB 379.911 1 379.911 7.50 0.0090
Total error 2127.21 42 50.6479
Total (corr.) 4108.84 47
Actividad antimicrobiana
Análisis de varianza de la concentración mínima inhibitoria de extractos polifenólicos de harinas de
subproducto de limón Italiano contra la bacteria S.typhimurium
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 45.63 1 45.63 4.07 0.0902
B:Tiempo 22.4267 2 11.2133 1.00 0.4219
AB 160.88 2 80.44 7.17 0.0256
Total (corr) 296.217 11
Análisis de varianza de la concentración mínima inhibitoria de extractos polifenólicos de harinas de
subproducto de limón Italiano contra la bacteria S.aureus
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 11.2133 1 11.2133 1.00 0.3559
B:Tiempo 22.4267 2 11.2133 1.00 0.4219
AB 22.4267 2 11.2133 1.00 0.4219
Total (corr) 123.347 11
ANEXO V. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
126
Análisis de varianza de la concentración mínima inhibitoria de extractos polifenólicos de harinas de
subproducto de limón Italiano contra la bacteria E. coli
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 44.8533 1 44.8533 2.00 0.2070
B:Tiempo 156.987 2 78.4933 3.50 0.0983
AB 22.4267 2 11.2133 0.50 0.6297
Total (corr) 358.827 11
Porcentaje de inhibición
Análisis de varianza del porcentaje de inhibición del radical DPPH
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 39.605 1 39.605 0.91 0.3598
B:Tiempo 558.391 2 279.195 6.39 0.0129
AB 203.059 2 101.53 2.32 0.1403
Total (corr) 1325.32 17
Color
Análisis de varianza para la luminosidad (*L) de harinas de subproducto de limón Italiano
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 2956.81 1 2956.81 325.26 0.0000
B:Tiempo 0.09 2 0.045 0.00 0.9951
Interacción
AB 0.0233333 2 0.0116667 0.00 0.9987
Total (corr) 3066.0 17
Análisis de varianza para la cromaticidad (*C) de harinas de subproducto de limón Italiano
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 42.6272 1 42.6272 114.35 0.0000
B:Tiempo 0.0677778 2 0.0338889 0.09 0.9137
Interacción
AB 0.00777778 2 0.00388889 0.01 0.9896
TOTAL (corr) 47.1761 17
Análisis de varianza para hue (h⁰) de harinas de subproducto de limón Italiano del diseño 4x8
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 1348.54 1 1348.54 121368.20 0.0000
B:Tiempo 12.4433 2 6.22167 559.95 0.0000
AB 14.3478 2 7.17389 645.65 0.0000
Total (corr) 1375.46 17
ANEXO V. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
127
pH
Análisis de varianza para el pH de harinas de subproducto de limón Italiano
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 0.00108889 1 0.00108889 4.56 0.0541
B:Tiempo 0.0036 2 0.0018 7.53 0.0076
AB 0.0120444 2 0.00602222 25.21 0.0001
Total (corr) 0.0196 17
Acidez
Análisis de varianza para la acidez harinas de subproducto de limón Italiano
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 0.0408333 1 0.0408333 0.04 0.8538
B:Tiempo 25.4117 2 12.7058 11.51 0.0088
AB 14.7117 2 7.35583 6.66 0.0299
Total (corr) 46.7892 11
Vida de anaquel de harinas de subproducto de limón italiano
Concentración de polifenoles totales
Análisis de varianza de la concentración de polifenoles (mg EAG/g b.s) en extractos de harinas de
subproducto de limón Italiano
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 20.0566 1 20.0566 28.25 0.0000
B:Tiempo 35.6242 14 2.54459 3.58 0.0016
AB 24.4946 14 1.74962 2.46 0.0187
Total (corr) 101.476 59
Actividad antimicrobiana
Análisis de varianza de la concentración mínima inhibitoria de extractos polifenólicos contra la
bacteria S.aureus.
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 15.6315 1 15.6315 82.79 0.0000
B:Tiempo 56.4193 14 4.02995 21.34 0.0000
AB 15.3255 14 1.09468 5.80 0.0000
Total (corr) 93.0404 59
ANEXO V. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
128
Análisis de varianza de la concentración mínima inhibitoria de extractos polifenólicos contra la
bacteria E. coli
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 0.9375 1 0.9375 2.00 0.1676
B:Tiempo 80.0521 14 5.71801 12.20 0.0000
AB 27.9687 14 1.99777 4.26 0.0004
Total (corr) 123.021 59
Análisis de varianza de la concentración mínima inhibitoria de extractos polifenólicos contra la
bacteria S. typhimurium
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 8.4375 1 8.4375 46.29 0.0000
B:Tiempo 104.779 14 7.48419 41.06 0.0000
AB 18.7109 14 1.3365 7.33 0.0000
Total (corr) 137.396 59
Porcentaje de inhibición
Análisis de varianza del porcentaje de inhibición del radical DPPH
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 77.2935 1 77.2935 4.67 0.0387
B:Tiempo 10069.2 14 719.228 43.49 0.0000
AB 955.359 14 68.2399 4.13 0.0006
Total (corr) 11598.0 59
Humedad
Análisis de varianza del porcentaje de humedad de harinas de subproducto de limón italiano
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 240.329 1 240.329 820.91 0.0000
B:Tiempo 56.6874 14 4.0491 13.83 0.0000
AB 17.7311 14 1.26651 4.33 0.0000
Total (corr) 332.313 89
Actividad del agua
Análisis de varianza de la actividad del agua de harinas de subproducto de limón italiano
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 1.39876 1 1.39876 9190.28 0.0000
B:Tiempo 0.201767 14 0.0144119 94.69 0.0000
AB 0.117783 14 0.0084131 55.28 0.0000
Total (corr) 1.72744 89
ANEXO V. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
129
Color
Análisis de varianza para la luminosidad ( *L)de harinas de harinas de subproducto de limón italiano
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 3442.88 1 3442.88 13626.29 0.0000
B:Tiempo 1350.73 14 96.4806 381.85 0.0000
AB 506.456 14 36.1754 143.18 0.0000
Total (corr) 5315.22 89
Análisis de varianza para la cromaticidad (*C) de harinas de harinas de subproducto de limón Italiano
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 101.548 1 101.548 1740.83 0.0000
B:Tiempo 27.3227 14 1.95162 33.46 0.0000
AB 59.5849 14 4.25606 72.96 0.0000
Total (corr) 191.956 89
Análisis de varianza para la hue de harinas de harinas de subproducto de limón Italiano
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 2021.33 1 2021.33 19024.24 0.0000
B:Tiempo 517.407 14 36.9576 347.84 0.0000
AB 118.173 14 8.4409 79.44 0.0000
Total (corr) 2663.28 89
Acidez
Análisis de varianza para la acidez de harinas de harinas de subproducto de limón Italiano
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 11.7042 1 11.7042 0.54 0.4675
B:Tiempo 137.172 14 9.79802 0.45 0.9404
AB 87.5283 14 6.25202 0.29 0.9914
Total (corr) 884.71 59
PH
Análisis de varianza del pH de harinas de harinas de subproducto de limón Italiano
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 0.0138017 1 0.0138017 150.56 0.0000
B:Tiempo 0.112843 14 0.00806024 87.93 0.0000
AB 0.0504233 14 0.00360167 39.29 0.0000
Total (corr) 0.179818 59
ANEXO V. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
130
Diseño factorial 34
Concentración de polifenoles totales
Análisis de varianza de la concentración de polifenoles totales (mg EAG/g b. s ) en extractos de harina
de subproducto de limón Italiano
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 0.8748 1 0.8748 1.12 0.2912
B:solvente 3.71482 1 3.71482 4.76 0.0306
C:Concentración 12.1874 1 12.1874 15.63 0.0001
D:Tiempo 16.5518 1 16.5518 21.22 0.0000
AD 2.67961 1 2.67961 3.44 0.0657
BC 3.5689 1 3.5689 4.58 0.0340
Total error 120.105 154 0.779902
Total (corr.) 161.005 161
Análisis de varianza de la concentración de polifenoles totales (mg EAG/g b.s) en extractos de harina de
subproducto de limón italiano para la temperatura
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
Entre los grupos 2.63109 2 1.31554 1.32 0.2804
Dentro de los grupos 32.8432 33 0.995249
Total (Corr.) 35.4743 35
Análisis de varianza de la concentración de polifenoles totales (mg EAG/g b.s) en extractos de harina de
subproducto de limón italiano para la concentración de solvente
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
Entre los grupos 0.000025 1 0.000025 0.00 0.9961
Dentro de los grupos 35.4743 34 1.04336
Total (Corr.) 35.4743 35
Análisis de varianza de la concentración de polifenoles totales (mg EAG/g b.s) en extractos de harina de
subproducto de limón italiano para el tiempo
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
Entre los grupos 6.13654 2 3.06827 3.45 0.0435
Dentro de los grupos 29.3378 33 0.889023
Total (Corr.) 35.4743 35
ANEXO V. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
131
Flavonoides totales
Análisis de varianza de la concentración de flavonoides totales (mg EQ/g b.s) de extractos de harina de
subproducto de limón italiano
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Solvente 0.000323787 1 0.000323787 7.51 0.0069
B:Concentración 0.000507 1 0.000507 11.75 0.0008
C:Tiempo 0.000200083 1 0.000200083 4.64 0.0328
D:Temperatura 0.00773515 1 0.00773515 179.29 0.0000
AB 0.000133389 1 0.000133389 3.09 0.0807
Total error 0.00668714 155 0.0000431428
Total (corr.) 0.0156251 161
Análisis de varianza de la concentración de flavonoides totales (mg EQ/g b.s) de extractos de harina de
subproducto de limón italiano para la temperatura
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
Entre los grupos 0.00776853 2 0.00388427 78.61 0.0000
Dentro de los grupos 0.00785654 159 0.0000494122
Total (Corr.) 0.0156251 161
Análisis de varianza de la concentración de flavonoides totales (mg EQ/gb.s) de extractos de harina de
subproducto de limón italiano para el tiempo
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
Entre los grupos 0.00020579 2 0.000102895 1.06 0.3485
Dentro de los grupos 0.0154193 159 0.0000969766
Total (corr.) 0.0156251 161
Análisis de varianza de la concentración de flavonoides totales (mgEQ/g b.s) de extractos de harina de
subproducto de limón italiano para el solvente
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
Entre los grupos 0.00130209 2 0.000651043 7.23 0.0010
Dentro de los grupos 0.014323 159 0.0000900816
Total (corr.) 0.0156251 161
ANEXO V. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
132
Actividad antioxidante
Análisis de varianza multifactorial del diseño factorial 34
para la actividad antioxidante expresada en
porcentaje de inhibición del radical DPPH
Actividad antimicrobiana
Análisis de varianza multifactorial del diseño factorial 34
para la CMI de compuestos polifenólicos
contra E.coli
Análisis de varianza multifactorial del diseño factorial 34
para la CMI de compuestos polifenólicos
contra S. aureus
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Temperatura 1822.87 1 1822.87 20.23 0.0000
B:Concentración 20.107 1 20.107 0.22 0.6373
C:Solvente 417.327 1 417.327 4.63 0.0329
D:Tiempo 288.12 1 288.12 3.20 0.0757
AB 991.609 1 991.609 11.00 0.0011
AD 339.301 1 339.301 3.77 0.0541
Total error 13876.5 154 90.1073
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Solvente 0.231481 1 0.231481 0.17 0.6776
B:Concentración 1.44676 1 1.44676 1.08 0.2994
C:Tiempo 2.83565 1 2.83565 2.12 0.1469
D:Temperatura 0.231481 1 0.231481 0.17 0.6776
AB 4.25347 1 4.25347 3.19 0.0762
BD 7.03125 1 7.03125 5.27 0.0231
Total error 206.848 155 1.3345
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Solvente 5.78704 1 5.78704 5.15 0.0246
B:Concentración 4.6875 1 4.6875 4.18 0.0427 C:Tiempo 0.925926 1 0.925926 0.82 0.3652
D:Temperatura 42.1875 1 42.1875 37.58 0.0000 AB 2.17014 1 2.17014 1.93 0.1664
Total error 175.145 156 1.12272 Total (corr.) 230.903 161
ANEXO V. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
133
Análisis de varianza multifactorial del diseño factorial 34
para la CMI de compuestos polifenólicos
contra S . typhimurium
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P
A:Solvente 8.33333 1 8.33333 7.06 0.0087
B:Concentración 0.0578704 1 0.0578704 0.05 0.8251 C:Tiempo 2.83565 1 2.83565 2.40 0.1232
D:Temperatura 36.169 1 36.169 30.64 0.0000 Total error 185.32 157 1.18038
Total (corr.) 232.716 161
A:Solvente 8.33333 1 8.33333 7.06 0.0087
ANEXO VI. PRESENTACIÓN EN CONGRESO
134
15. ANEXO VI. PRESENTACIÓN EN CONGRESO
ANEXO VI. PRESENTACIÓN EN CONGRESO
135
ANEXO VI. PRESENTACIÓN EN CONGRESO
136
ANEXO VI. PRESENTACIÓN EN CONGRESO
137
ANEXO VI. PRESENTACIÓN EN CONGRESO
138
ANEXO VI. PRESENTACIÓN EN CONGRESO
139
ANEXO VI. PRESENTACIÓN EN CONGRESO
140
141