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204 HANYANG MEDICAL REVIEWS Vol. 30 No. 3, 2010

신호준

아주대학교의과대학미생물학교실

Ho-Joon Shin, Ph.D.

Department of Microbiology, and Department of

Molecular Science and Technology, Ajou University

School of Medicine, Suwon, Korea

책 주 경기도수원시영통 원천동산 지: 442-749, 5

아주대학 과대학미생물학 실

Tel: 031-219-5076, Fax: 031-219-5079

E-mail: [email protected]

고 년 월 심사 년 월 게재확 년 월: 2010 6 8 , : 2010 6 20 , : 2010 6 29

Abstract

Free-living Naegleria fowleri is a causal agent of

primary amoebic meningoencephalitis in mainly

children and youngadults. An nfa1 gene, encoding

360bpof nucleotides, was cloned fromaN. fowleri

cDNA library by SEREX method. By immunohisto-

chemistry and aconfocal microscope, Nfa1 protein

was found in amoebic pseudopods, especially in

food-cups, whenamoebawas in contactwith target

cells.Whenananti-Nfa1 antibodywas added to the

coculture system, the cytotoxicity of N. fowleri

trophozoites onto target cells was decreased, and

the severe morphological destruction of rat micro-

glial cells cocultured with N. fowleri trophozoites

was reduced. In a tansfection system, an expres-

sion vector with an nfa1 gene was successful

transfected into nonpathogenic N. gruberi, and

transgenicN. gruberi showed the increasing in vitro

cytotoxicity. The siRNA decreased the expression

levels of nfa1mRNAandNfa1 protein in transfected

N. fowleri trophozoites. On the immunization of

micewith the rNfa1protein, theprotective immunity

of host was induced. Thus, mice showed the

prolonged mean survival times in PAM-developed

mice. In final, thenfa1geneandNfa1protein playan

important role in the pathogenesis of N. fowleri

infection.

Key Words: Naegleria fowleri; nfa1 gene, Cyto-

toxicity, Protective immunity, Recombinant protein

서 론

생 아 토양과 담수에(free-living amoeba)

생 하 연 경에 균들 포식하 살아,

가 아 들 재 지 아 (Naegleria spp.),

가시아 (Acanthamoeba spp.), Balamuthia Sappinia

아 등 보고 고 다.1 아 (genus

Naegleria 에 약 여 상 것 보고 고) 30

,2 그 병원 강한 울러 아 (Naegleria

fowleri 체 마우스 다 실험동 들에 원 아) ,

수막뇌염(primary amoebic meningoencephalitis;

한다PAM) .3-6 에 미 에 캠핑 갔 학생2008

들 집단 울러 아 에 감염 어6 PAM

사망하 사건 생하여 사 란 했었 계(

보 월 재 지 계 약 건, 2009 7 30 ), 200

상 생 가 보고 고PAM ,1 내에

울러 아 에 한 생 아직 보고 고PAM

지 않다.7

울러 아 도에 생장하35℃

파울러 아메바 접촉성병 기전에 관여하는nfa1 전

Thenfa1GeneContributedon theContact-dependent

PathogenicMechanismsof Naegleria fowleri

205The nfa1 Gene Contributed on the Contact-dependent Pathogenic Mechanisms of Naegleria fowleri

에 도 생 가능하다 크 가 고 운40~50 . 7~20 m℃ µ

동 매우 한 아 시 (amoeboid stage),

도 크 갖고 막 원 모양 포낭10~18 mµ

시 시 편모 갖 편모 시(cystic stage)

(flagellate stage) 생 사 가지고 다(Fig.

1).3,8

울러 아 도 경 양상태 등에 라 양, ,

에 포낭 뀌 포낭(trophozoite) (cyst)

과 라고 하 살 경에(encystation) ,

포낭 에 양 탈낭과

라 한다(excystation) .6 포낭 과 에 과 건

신 보 하 역할 포낭 (encysting)

울러 아 하나 핵 과 포질 내 공포(nucleus)

(cyto 식포 수 포plasmic vacuoles), (food vacuoles),

(con 들 많 갖고 그 리보핵tractile vacuoles) ,

산단 질 포함한 포 아마도(ribonucleoprotein)

가포식 체 공포들 것 라 하 다(autophagosome) .9

막 가포식 체가 생 라 (lysosome)

과 합 어 단 질과 포질 내 들 해하게

다 가 포식 진핵 포 진 과 에 보. (autophagy)

어 내 단 질 해 경 (protein degradation

런 단 질 해 경 한 양 상태pathway) ,

에 포 생 에 드시 필 하다.10 가포식 용에

한 연 들 아직 보단계 지만 한 병3

취 하 도 한다 포낭 항생 약효 해 시.

키 주 용 아 감염 료에,

어 포낭 효과 아 료(amoebiasis)

해하게 포낭 억 하 아 감염 질,

료에 료 효과 할 수 다.11

울러 아 에 한 원 아 수막뇌PAM(

염 아 에 염 에 수 수상 포)

아 양 체에 감염 어 생 것

알 다.12-15 Cerva Novak (1968)

12, 13 보고에

체 슬 키아에 가 생하16 PAM

같 수 장에 감염 었다고 하 다 근 병. PAM

가 수도 공 과도 연 것 보고 고

다.9

주 감염 경 체 비강 통해(nasal cavity)

루어지 비강에 들어 아 양 비강 막,

하고 그 후에 후신경(mucosal membrane) (nasal

통하여 후엽 과 뇌막 하nerve) (olfactory bulb)

수막뇌염 시 감염 후 내에 사망에 게7~10

한다.9 키 아 주 감염 신PAM

경계 감염 후 상 격심한(central nervous system) ,

통 식 진 스꺼움 토 고열 사지, , , , (38~40 ),℃

능장애 뇌막 극 징후 그리고 뇌염 동 한 극심한, ,

상 킨다 진행 도가 매우 빠 고 감염. PAM

특수 에 진단 어 워 사망 상에 고95%

재 지 한 료 미비한 상태,

다.1, 4, 16

아 병원 (pathogenic mecha-

아직 지 않았지만 숙주 포에nisms) ,

아 어난 다 숙주 포사(adhesion)

도하 포병변 효과 가 어난다고(cytopathic effect)

보고 었다.17, 18 울러 아 후신경 통해

신경계 들어 갈 수 , sucker-like appendage

과 동 한 간주함(food-cup ) amebostome

라 용한 식 포 용 과 효(phagocytosis)

등 비하 포용해 과 에 해(enzyme) (cytolysis)

신경 직 한다.6, 7, 9, 19-22 숙주 포 fibronectin

통해 울러 아 가 착하 , integrin-like

가 여 한다 것 보고 었protein protein kinase C

다.23 포용해에 여하 병 (viluence factor)

phospholipases,24-26 neuraminidases,27 pore forming

enzymes,28-30 protease31, 32 등 보고 고 다 한편.

등 보체 막공격복합체Fritzinger (2006) (complement)

Fig. 1. Life-cycle of Naegleria fowleri.

206 Hanyang Medical Reviews Vol. 30 No. 3, 2010

여러 가지 균 독 에(membrane attack complex)

한 공격 아 막pore-forming protein

보 하 클 닝하 다 그 여러CD59-like protein .

보고 들 리하 울러 아 병

다 과 같 가 가능하다(Fig. 2).

첫 째 병 병 (contact-dependent

아 포질 태pathogenic mechanism)

체나 체들 하food-cup amoebostome

여 포에 착하여 포 하 과 다

째 병 비 병(Fig. 2A). (contact-

수용independent pathogenic mechanism)

용해 질 들 비하여(soluble) (cytolytic factor)

포 하 과 다 마지막 째 엄격하(Fig. 2B).

게 말해 포에 한 병 아니지만 아 생

에 한 알 지고 가포식3 (auto-

과 다phagy) (Fig. 2C).

근에 생 학 술들 하 아 병

능 담당하 들 클 닝 가능하게 었

에 보듯 본 연 등에 해 울러 아, Fig. 2

nfa1, hsp70 actin 등 클 닝 어

병원 과 연 등 생 학 특 들 다.22, 33, 34

본 에 울러 아 첫 째 병

병 에 여하 보고 nfa1

(Naegleria fowleri 첫 째 클 닝 어 학 첫

들 에 해 고찰하고 한다) .

본 론

등Shin33 N. fowleri 하고cDNA library N.

fowleri에 한 감염 청 역 청 생산하 그,

것들 용하여 통해 새 운immunoscreening

클 닝하 (SEREX Method, serum reaction

라 리움method ), N. fowleri 특(pseudopodia)

Fig. 2. Three hypothetical mechanisms for Naegleria fowleri patho-

genesis. (A) Contact-dependent mechanism. (B) Contact-independent

mechanism. (C) Autophagy mechanism.


에 특 하 것 하여, food-cups nfa1

하 다.

1. 분자생물학적특성

새 클 닝 nfa1 생 학 특

알아보고(molecular and biological characterization)

염 열 사 들(sequencing data),

과 상동 비 재 합 단 질(homology search)

(recom 생산하 다binant protein; rNfa1 protein) .

1) nfa1 염 열

울러 아 클 닝 nfa1 atg

시 돈 료 돈(start codon) , taa (stop codon)

용하 개 아미 산 염 열120 (360bp DNA )

갖고 었다.33 한 벡, (expression vector)

벡 에TOPO nfa1 클 닝하고 E. coli 시스

용하여 얻 재 합 단 질(recombinant protein;

생산하 시스 갖 었다rNfa1 protein) .

상동 비2)

울러 아 nfa1 염 열DNA

에 등 한 후GeneBank (Accession number AF230370)

에 클 닝 들 염 열 상동 비DNA

한 결과 여러 생 체 들과, myohemerythrin

상동 갖고 었다26~43% .33 Myohemerythrin O2

운 단 질 알 단 질, Nfa1 myohemery-

단 질과 상동 보 것 아니지만thrin , nfa1

가 아 생 에 한 역할 담당할 것 라 것

그 당시 시하 다.

재 합 단 질3) Nfa1

클 닝 nfa1 벡 벡 에 클TOPO

닝하고, E. coli 시스 용하여 얻 재 합 단 질

량 갖고 었다 순수(rNfa1 protein) 13.1 kDa (

에 용하 해 단 질 단 질Tag Tag-fusion

17.1 kDa ) (Fig. 3A).

면역세포학적특성2.

울러 아 클 닝 nfa1 역

포학 특 알아보고(immunocytological characters)

항 항체 생산하 역-Nfa1 (anti-Nfa1 antibody) ,

포 직 학 실험 시행하(immunocytochemistry)

다.

항 항체 생산1) -Nfa1

클 닝 nfa1 하여 얻 재 합 단 질

마우스 복강 내 차 에(rNfa1 protein) 1 rNfa1

과 어 주 하50 mg complete adjuvant 1:1(v/v)

주 간격 차에 과, 3 2, 3 rNfa1 25 mg incomplete

adjuvan 어 주 하 고 주후 마지막t 1:1 (v/v) , 3 4

차에 과 생리식염수 어rNfa1 25 mg 1:1 (v/v)

주 하 다 차 주 끝난 후 마우스 액 채취하여. 3

항체가 한 뒤 항 다클 항체-Nfa1 (polyclonal

사용하 다antibody) .20, 33 단 질에 한 단클 항Nfa1

Fig. 3. SDS-PAGE and western blotting results. A) Lane 1

and 2 show a N. fowleri lysate and a recombinant His-tag

fusion Nfa1 protein. Lane 3 and 4 show reacting bands by

western blotting using an anti-Nfa1 polyclonal antibody. B)

All lanes show band patterns of recombinant His-tag fusion

Nfa1 proteins with anti-Nfa1 monoclonal antibody produced

from various hybridoma clones. PM, prestained marker.


체 생산 포 합(monoclonal antibody) (cell fusion)

술 용하 생산 다hybridoma technique ,

클 항체 단클 항체 모 항원 에13.1 kDa

보 다(Fig. 3B).20, 21

역 포 직 학 특2)

울러 아 클 닝 nfa1 항원

도 포 내 포(antigenicity) (cellular localiza-

알아 보고 다클 항체tion) anti-Nfa1 peroxidase

색효 사용한 실험결과immunolocalization ,33 비

병원 그루 아 (Naegleria gruberi 양)

과 하지 않았 나 울러 아 양 과

하여 특 보여주었다- (species-specific) .

한편 in vivo 실험 마우스에 울러 아 감염

시 얻 실험 생 마우스 뇌 직에 보PAM

항체 울러 마에 양 에anti-Nfa1

어 차후 진단 항체 용가 보여주었다.35 TEM

미경 사용한 찰에 보 ,35 단 질 아Nfa1

과 식포 주 에 주 포하 단 질(food cup)

동과 연 것 보고 하 다 공 미.

경 용한 찰에 보(confocal microscope) ,20 Nfa1

단 질 아 특 한 식 포 용, (phago-

과 연 에 고 었cytosis) food-cup ,

포가 특 에 것 보food-cup

아 울러 아 병원 과 연 보여주었다.

병인유전자로써의특성3.

울러 아 클 닝 nfa1 가 아

병원 어떤 연 지 알아보고 in vitro 포

독 실험 복 감염(cytotoxicity) , (gene transfec-

실험 억 실험tion) (gene knock-down)

시행하 다.

1) 항 항체-Nfa1 in vitro 포독

울러 아 양 포들(trophozoite)

포 식 포, CHO (Chinese hamster ovary cells),

신경 포 들 강(macrophage) (miroglial cell)

하게 시킴 포독 갖고 다.20, 21, 35-38

러한 in vitro 포독 실험에 어 항 다클 항-Nfa1

체 단클 항체 공동 양시스 (coculture system,

같 양 용 내에 아 양 들과 포들

합하여 양하 것 에 여하 울러 아 양) ,

들 포들에 한 포독 감 다.20, 21, 36

미경 찰 통한 포독 실험에 보(TEM, SEM)

,38 공동 양시시 에 항 항체 처리했 아-Nfa1

양 들 모양 약간 움 들어 포에 착능

떨어짐 찰 었다.

질 아2) (transgenic)

클 닝 nfa1 병원 과 하

하여 비병원 생 아 그루 아, (N.

gruberi) nfa1 하 복 감transfection

Fig. 4. Confocal microscopic findings of the Nfa1 protein in Naegleria

fowleri trophozoites cocultured with CHO cells (red color) for 3 hr (A)

and 6 hr (B). Strong fluorescent signals were shown in the food-cups

of the N. fowleri trophozoite (×400).


염 시험 수행한 결과(gene transfection) , nfa1

갖고 가 그루 아 포transfection vector

질 미경 그리고transfection nfa1

가 염색체내 들어간 것 통해 하PCR ,

질 그루 아 (transgenic N. gruberi)

포에 한 포독 약간 가하 다.39, 40

억3) (gene knock-down)

울러 아 nfa1 아 체에

억 었 아 포독 에 어떤 변 가 지

알아보고 , double-stranded41 antisense RNA

37 RNAi

간 한 용하여(RNA interference) siRNA

울러 아 양 (N. fowleri 내trophozoites)

주 시 다 실험 결과. nfa1 knockdown

것 찰 었 포에 한 포독 한,

결과 nfa1 억 울러 아

포독 하 찰 어 클 닝, nfa1 가 아

병원 과 보고하 다.

숙주의방어면역4.

울러 아 클 닝 nfa1 가 아

용한 식 포 용에 연 어 그food-cups

해 아 병원 에 한 역할 담당하고

찰 어 울러 아 감염 시 숙주 어 역, (protec-

보 해 재 합 단 질 마우스tive immunity) rNfa1

에 역시킨 후 실험 시 마우스 사망PAM

찰함 숙주 마우스 어 역 알아보고

하 다(Fig. 5).

역 블린 항체1) (immunoglobulin antibody)

재 합 단 질 마우스 복강 주 하여 역rNfa1

시킨 후 역여 알아보 해 마우스 청에 역,

블 항체 하 상(immunoglobulin) ,

마우스 청보다 재 합 단 질 역 마우스rNfa1

청에 수 가 아IgG (immunoglobulin G)

알 수 었다(Fig. 6).

실험 수막뇌염 에 한 마우스2) (experimental PAM)

평균사망

울러 아 단 질 마우스에 역시킨rNfa1

후 실험 하여 마우스들 사망 찰하PAM

건강한 마우스 그룹에 평균 사망 었, 15.0

고 아 재 합 단 질만 역시킨 마우스 그, rNfa1

룹에 평균 사망 었 역 돕 해25.0 ,

단 질 같 합하여 역시킨 마우스rNfa1 adjuvant

그룹에 평균 사망 었다 라24.4 (Fig. 7).

울러 아 감염에 한 단 질 처리 역Nfa1 ( )

가 숙주에 항체 도하여 마우스 평균 사망

린 결과 보여주어 숙주 어 역 도 었

알 수 었다.

결 론

울러 아 (N. fowleri 체 마우스 다 실) ,

험동 들에 원 아 수막뇌염 한다(PAM) .

아 병원 아직 지지 않

았지만 숙주 포에 아 하다고, (adhesion)

Fig. 5. Flow-chart of immunization and infection schedule.

Fig. 6. Serum IgG level in mice immunized with the rNfa1

protein. rNfa1, recombinant Nfa1 protein; PBS, phosphate

buffered saline.


보고 었다 울러 아 처 클 닝. nfa1

울러 아 울러cDNA library

아 에 한 감염 청 역 청 용하여 immu-

통해 클 닝 새 운 다 클 닝noscreening .

nfa1 염 열 갖고360 bp DNA 13.1

량 갖 단 질 하고 다kDa . Immuno-

실험결과cytochemistry , 울러 아 (pseu-

특 에 특 하여 아dopodia) , food-cups

병 과 연 보 항 항체 처, -Nfa1

리 포들에 한 울러 아 포독 감

시 다 비병원 그루 아. (N. gruberi 에)

nfa1 복 감염 시키 질(transfection)

그루 아 아진 포독 보 등, siRNA

울러 아 체에 nfa1 억 시

키 울러 아 포독 감 하 다 재 합.

단 질 마우스 복강 내 여러 주 하 울러rNfa1

아 에 한 역항체가 생 역 마우스,

에 실험 울러 아 양 들 감염시

도하 재 합 단 질 역 마우스들PAM rNfa1

평균 생 간 연장 었다 합하여 보 클 닝. , nfa1

울러 아 병 에

역 담당하 나가 아 병 규 과 PAM

진단 료 에 매우 용하고 한 다, .

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