thibault virus a et e
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V.Thibault DU_janv.-2010 1
Virus de l'hépatite A et E Virus et marqueurs diagnostiques
Vincent THIBAULT Laboratoire de Virologie
Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière
Assistance Publique Hôpitaux de Paris
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Hépatites virales
parentéral
non A, non B B 1965 D
1977
A 1972
féco-oral
mode de transmission préférentiel
F, G, TTV, autres…
C 1990
E 1991
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Historique VHA � “La Jaunisse”
� 1745 : Cockayne, hépatites épidémiques
� 1908 : McDonald, "notion de virus…"
� Reproduction de la maladie 1942 :
� Volontaires (Voegt, Havens), Paul 1943 ingestion feces/serum
� Entité clinique :
� 17-18ème siècle - 1923 Blumer - 1947 McCallum (VHA "infectious"-VHB "serum")
� Visualisation : 1973 (Feinstone)
� Développement de la sérologie : épidémiologie
� 1979 : culture (Provost et Hilleman)
� 1981... : Clonage, Séquences nucléotidiques
� 1991… : Vaccination
� 2006 : Déclaration obligatoire
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Virus de l'hépatite A
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Virus de l’Hépatite A
ARN (+)
Vpg
Capside
27-32nm
• Famille : Picornaviridae
(entérovirus type 72)
• Genre : hépatovirus
• Taille 27-32 nm
• Non enveloppé
• Structure icosaèdrique
• ARN simple brin, • polarité positive
• lié de façon covalente à une protéine Vpg
V.Thibault DU_janv.-2010 6 �� ��
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VP1 VP3 VP2 VP4 2A Protéines de surface
immunogénicité
3D (POL) 3C (PRO) 2C 2B 1D 1C 1B 3 A-B 2A
P1 prot. Capside
Vpg 2.5kDa
P2 P3
0 7478
1A AAA
Structurales Non structurales
IRES Traduction
3D (POL) 3C (PRO) 2C 2B VP1 VP3 VP2
3 A-B
VP4
2A poly-
protéine 2 227 AA
?
Liaison NTP Hélicase
Vpg
Protéase
ARN Polymérase
Réplication VP1 VP3 VP2 VP4 2A
VP0
Maturation finale
X5 – X12
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Cycle de multiplication du VHA en culture de cellules
P3
P2
P1
Traduction Synthèse
de la polyprotéine
+ -
-
+
Réplication
Maturation
Libération du génome
Attachement
Relargage
Mem
brane cellulaire
Réticulum endoplasmique
Espace de Disse
Canalicule biliaire
Empaquetage
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VHA : physiopathologie
Absence d'effet cytopathique direct :
cytolyse résultant du processus immun de
défense de l'hôte,
�médiation cellulaire
�médiation humorale
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Agents Stabilité
Chaleur
Autoclavage (121°C, 20')100°C60°Ctempérature ambiante
4°CCongelé
InactivationInactivationStable 1 heureStable 1 mois (selles, eaux, sols)Plusieurs jours sur surface sèche4 h. Sur les mainsStable plusieurs moisStable des mois ou années
Acide-base pH 1 : stable 5 h.PH 3-11 : stable au moins 30'
U.V. Inactivation
Chimiques
Chlore, ozone,glutaraldéhyde, iode
Inactivation
Alcool 70° 3' : inactivation partielle
Propriétés Physiques du VHA
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Variabilité génétique
� Comparaison nucléotidique
7 Génotypes : IA,B ; II; IIIA,B ; IV-VII
Homme : génotype I (90%), (III, II=VII)
Singes : IV, V, VI
� Sérotype unique
Nombre limité d'épitopes antigéniques VP1, VP3
Tests immunologiques
Vaccination (HM175, CR326)
virus inactivé cultivé sur MRC-5
3D (POL) 3C (PRO) 2C 2B 1D 1C 1B 3 A-B 2A
P1 prot. Capside
Vpg 2.5kDa
P2 P3
0 7478
1A AAA
Structurales Non structurales
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IV Nonhuman primate, Philippines V Nonhuman primate, Kenya VI Nonhuman primate, Indonesia
D'après Nainan et al. 2006 Clin. Microb. Rev. ; 19:63-79
Génotypes et phylogénie
Phylogenetic analysis of 3,582 HAV isolates in the VP1/P2B region (315-bp fragment).
VP1/P2A Génotypes : >15% variations Sous types : 7.5% variations
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Répartition mondiale des génotypes
Génotypes infectant l'homme en noir , les singes en rouge. Souche PA21 (génotype IIIA), isolée d'un singe Panamanian Owl en vert.
Cristina J, Costa-Mattioli M. Virus Res. 2007 Aug;127(2):151-7.
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Symptomes
Ictère
VHA : Paramètres Biologiques
Semaines
Ag foie
VHA Sang
VHA Selles
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24
IgM
IgG protection contre réinfection
Ac anti-VHA = hépatite A ancienne ou vaccination IgM anti-VHA = hépatite aiguë A (clinique)
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Marqueurs indirects (+++) (ELISA)
1- Sang : Marqueurs indirects
� IgM
� IgG
� Génome viral (RT-PCR) 105 virions/mL sang
VHA : Marqueurs disponibles
3- Milieux : � Génome viral (RT-PCR) � Particules virales IEM
4- Foie : � Ag viral à la surface des hépatocytes � Génome viral : hybridation, RT-PCR
Marqueurs directs (plus spécialisé)
2- Selles : 109 virions/g selles � Génome viral (RT-PCR) - épidémiologie
� Particules virales IEM - EIA
Salive :
�IgG (ELISA)
�Génome viral (RT-PCR)
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IgM HAV uniquement à bon escient !
� Alaska : test "réflexe" si Ig-VHA totales + � Ig M HAV 32 % de faux + (Castrodale CID 2005:41;e86)
� Vaccination : 8 à 20 % d'IgM VHA + dans les 2 à 3 semaines suivant l'injection…
� NE RECHERCHER L'IgM anti-VHA QU'EN CAS D'HEPATITE AIGUË
Roque Afonso et al. CID 2006:42 -887
82 % 11 % 1 %
Faux positifs
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Diagnostic
� Sérologie +++
� IgM anti VHA : infection récente
� IgG anti VHA : infection passée ou vaccination
� IgM et IgG anti VHA
� Diagnostic direct (-) [uniquement dans le cadre d'études]
� Virémie : techniques sensibles (105 v./mL)
� Recherche de virus dans les selles, prolongée, importante
(109v./mL), épidémiologie
� Marqueurs biochimiques
Transaminases (ALAT, ASAT)
Bilirubine
Phosphatase alcaline
Facteurs de coagulation
Salive :
�IgG (ELISA)
�Génome viral (RT-PCR)
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Hépatite A : le vaccin virus inactivé
� AVAXIM 160U suspension injectable seringue préremplie
Virus de l'hépatite A souche GBM cultivée sur cellules diploïdes humaines MRC-
5 , inactivé
� HAVRIX 1 440 U Elisa/ml susp inj IM Ad en seringue
� HAVRIX 720 U Elisa/0,5 ml susp inj IM Enf/Nour en seringue
Souche HM 175 du virus de l'hépatite A cultivée sur cellules humaines
diploïdes MRC5
� Le schéma vaccinal habituel comprend 1 dose suivie d'un rappel (1 dose) 6 à
12 mois plus tard.
� La persistance des anticorps anti-VHA après vaccination n'est
actuellement pas connue . Les données disponibles suggèrent la persistance
des anticorps anti-VHA à un niveau protecteur jusqu'à 10 ans (20 ans ?)
après primo-immunisation.
Hepatitis A Vaccine versus Immune Globulin for Post-exposure Prophylaxis Victor et al. 2007 N Engl J Med 357;17
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Difficultés diagnostiques En routine
Adresser prélèvements au
Centre national de référence du VHA
Pr E Dussaix Laboratoire de virologie Hôpital Paul Brousse
12-14 av Paul Vaillant Couturier 94804 Villejuif cedex Tel : 01 45 59 37 21
http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste
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Grippe
SRAS ?
Hépatite E ? Hépatite E ? Grippe Hépatite E ?
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Historique VHE � Découverte dépendante de la connaissance des virus des hépatites
1955 : Inde, hépatite chez des personnes immunisées contre le VHA, épidémie particulière. "NANBH"
� Entité clinique 1980 - similitude avec l’hépatite A :
� Inde : prévalence de l’hépatite A importante
� Epidémie : autre virus des hépatites, contamination par l’eau
� 1983 : reproduction de l’hépatite non A-non B chez un volontaire immunisé contre VHA (Balayan)
� Hépatite à J36
� J28-45, visualisation de particules virales > VHA (27-30nm)
� Reproduction de l’infection chez le singe (cynomolgus)
� Hépatite "non A - non B" à transmission entérique (ENANB)
� 1990 : Reyes et al. clonage et séquençage � "VHE"
� 1991 : Tam et al. VHE
� 2000 : Panda et al. cDNA infectieux
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VHE Virus non enveloppé Sphérique (SRV)
Surface irrégulière Capside 27-34 nm
Symétrie icosaédrique
ARN simple brin hélice droite polarité + 7,5kb
poly-A extrémité 3’
Stabilité Au laboratoire : instable(-70 à +8°C)
Décongélation/congélation Tractus GI : stable (pH)
Famille : Hepeviridae Genre : Hepevirus
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Organisation génomique Non structurales Structurales
28 5109 7124 5’ NC 3’NC Poly-A
ARN polarité + 7 200 nt
Protéines immunogènes
DIAGNOSTIC
MeT Y Pro P X Hel RdRp
ORF3
ORF2
Génotypes 1-3
Hétérogénéité génétique
� Au moins 4 groupes majeurs (<20% hétérogénéité ORF2) subdivisés en 24 sous groupes dont homologues animaux :
� Epitopes majeurs : parties C-ter de l’ORF3 et ORF2
� Protection croisée entre différentes souches : un seul sérotype
Développement de tests sérologiques (performances équivalentes entre les différents types ?)
Vaccin : ORF 2 recombinante
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Hétérogénéité génétique
� Au moins 4 groupes majeurs (<20% hétérogénéité ORF2) subdivisés en 24 sous
groupes dont homologues animaux :
I- Birmanie et certaines souches africaines et asiatiques
II- Mexique et certaines souches du Niger
III- Amérique, Italie, NZ, Autriche, Grèce, Argentine (+ souches porcines)
IV- Chine, Taiwan et Japon (plus sévère que III ?)
� Epitopes majeurs : parties C-ter de l’ORF3 et ORF2
Connaissances limitées sur l’immunité contre les Ag natifs
Parties structurales variables
Grande homologie des parties non structurales
Protection croisée entre différentes souches : un seul sérotype
Développement de tests sérologiques (performances équivalentes entre
les différents types ?)
Vaccin : ORF 2 recombinante
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301 nt 5' end of ORF2 sequences from 275 HEV strains,
1 2
3
4
1a
1b
1c
1e
1d
0.05
4d
4c
4b
4a
4e
3f
3e 3c
3d 3b
3a
D'après Lu et al. Rev. Med. Virol. 2006;16:5-36
Inde, Népal, Birmanie, Japon, Espagne
Chine, Pakistan, Bengladesh
Chine, Inde, Nepal, Russie
Maroc, Algérie
Algérie, Namibie, Afrique C.
Mexico, Nigeria
US, Japon, Corée, NL + porc
Japon + porc
NL (porc) Taiwan (porc)
France, UK, Japon, Espagne + porc
Espagne, UK, Grèce, NL, Japon + porc
Chine, Taiwan
Chine, Taiwan Japon, Vietnam
Chine (porc)
Inde (porc)
Génotype < 20% hétérogénéité ORF2
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Similarités des souches humaines et
animales
Borgen et al. BMC Infectious Diseases 2008, 8:61
Genetic relatedness between HEV strains from human and non-human sources and from various countries. Minimal spanning trees of 81 sequences of 148 nucleotides HEV RNA showing genetic distances between genotype 3 HEV strains from humans and animals. Dutch cases are marked with ID numbers inside the colored circles.
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Similarités des souches humaines et animales Bilic et al. Journal of General Virology
(2009), 90, 863–873
Unrooted phylogenetic tree of four avian HEV and nine mammalian HEV isolates, based on the complete genome region
aviaires humaines
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Similarités des souches humaines et animales
Phylogenetic tree of based on
full-length sequences HEV
genotypes 1, 2, 3, 4, and
avian HEV and the new
genotype from rabbits.
Zhao et al. Journal of Medical Virology 81:1371–1379 (2009)
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Culture et Modèles animaux
• Culture � Difficile � Culture primaire d’hépatocytes de macaques (cynomolgus)
� Cellules PLC/PRF/5 hépatocarcinome (Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007)
� Cellule embryonnaire
• Modèles animaux � Primates : reproduction de la pathologie humaine � Volontaires...
� VHE du porc, du poulet
� Présence d’Ac chez poulet, porc, rat, souris, mouton...
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Symptomes
Ictère
VHE : Paramètres Biologiques
Jours
VHE Sang
VHE Selles
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 200
IgM
IgG
Titre peu élevé protection contre réinfection ?
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HEV – virémie- transmission
Matsubayashi K, et al. Transfusion. 2008 Jul;48(7):1368-75.
serum
salive
selle
IgG
IgM
Concentré de plaquettes à J0 Transfusé à un homme de 64 ans traité pour Lymphome non-Hodgkinien par GM autologue
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Immunodépression, hépatite chronique et stratégie diagnostique
Kamar et al. American Journal of Transplantation 2008; 8: 1744–1748
Dans le cadre d'une investigation chez un patient immuno déprimé,
La détection du génome viral (RT-PCR) sera privilégiée !
(ceci s'applique pour de nombreux diagnostics viraux - PCR)
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� Marqueurs non biologiques
� circonstances de la maladie (voyage, autres causes, épidémie)
� A adapter en fonction de la zone géographique ? (Sud versus Nord ?)
� clinique : hépatite “classique”, absence de chronicité (chez
l'immunocompétent ! )
� Absence de marqueurs biologiques : diagnostic d'exclusion
� Absence des marqueurs des virus des autres hépatites (A, B, C, D)
� Notions sérologiques pour d’autres virus (EBV, CMV, herpès)
� Marqueurs sérologiques spécifiques
� IgM anti-HEV
� IgG anti-HEV (+++)
� RT-PCR : détection du génome viral (sang, selles)
Stratégie Diagnostique
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Spécificité et Sensibilité des ELISAs
� Epidémie Indonésie, 82 symptomatiques; 174 asymptomatiques; 496 contrôles
� Comparaison de 5 tests sérologiques Référence = RT-PCR
Concordance IgM : 81%
Concordance IgG : 85%
Myint et al. JCM, 2006, p. 1581–1583
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Performance des tests
MicroplaqueAdaltis
MicroplaqueMP Diagnostics
941644545Total (n=50)
544545Negatif (n=9)
437239140Positif (n=41)
négatifpositifnégatifpositifnégatifpositif
Test rapideMP Diagnostics
IgM anti-HEV
anti-HEV IgG
97.810010082Test rapide
MP Diagnostics
98.595.799.588Microplaque
MP Diagnostics
98.810010090MicroplaqueAdaltis
Spécificité%
Sensibilité%
VPN %
VPP%
J. Izopet Comm. Pers. CVV 2008
Panels 50 sérums ARN HEV (+), G3 406 sérums IgG ARN HEV (-)
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Stratégie Diagnostique Se donner les moyens de faire le diagnostic
- - + Immunité ancienne
- - +++ Douteux
+ - - ou + Probable
+ ++ ++ Certain
RT-PCR IgM IgG Diagnostic
Diagnostic Direct
Recherche du génome sur
prélèvements sang et selles
Diagnostic Indirect
Recherche de l'immunité antivirale
IgM anti VHE
IgG anti VHE
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VHE et vaccination
Risque cumulé d'un premier épisode d'hépatite E
Moyenne géométrique du taux d'anticorps anti-VHE
20 µg d'antigène rHEV (capside exprimée dans baculovirus) dans 0.5 ml de PBS sur 0.5 mg d'hydroxyde d'aluminium. 3 injections
Shrestha,et al 2007 N Engl J Med 356;9
Efficacité : 95,5% après 3 doses
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Adresser les prélèvements au
Centre national de référence du VHE
Dr E Nicand Laboratoire de biologie
HIA Val de Grâce Tel : 01 40 51 40 00
http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste