TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA SƯ PHẠM

THỰC HIỆN TIÊU BẢN HIỂN VI CỐ ĐỊNH MÔ TUYẾN TỤY CHUỘT ĐỒNG

(Rattus argentivente)

Luận văn tốt nghiệp

Ngành: SƯ PHẠM SINH VẬT

GV hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Trọng Hồng Phúc Phùng Thị Yến Thanh

Lớp: SƯ PHẠM SINH K31

MSSV: 3052132

Cần Thơ - 2009

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này tôi nhận được sự giúp đỡ của

nhiều tổ chức cá nhân. Qua đây tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc

đến:

- Ban giám hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban chủ nhiệm Khoa Sư

Phạm, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Sinh đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài

này.

- Quí thầy cô phòng sinh lý động vật đã tạo mọi điều kiện thuận để

tôi thực hiện đề tài

- Đặc biệt tôi xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Trọng Hồng Phúc

đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và

hoàn thành luận văn.

- Các bạn sinh viên khóa 31 đã ủng hộ và động viên tôi trong suốt

thời gian vừa qua.

Xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................ 1

PHẦN II: LƯỢT KHẢO TÀI LIỆU ......................................................................... 2

1. Chuột đồng............................................................................................................. 2

2. Kỹ thuật thực hiện tiêu bản hiển vi cố định........................................................... 3

2.1. Trích thủ ............................................................................................................. 3

2.2. Cố định ............................................................................................................... 3

2.3. Khử nước ............................................................................................................ 4

2.4. Tẩm parafin......................................................................................................... 4

2.4.1. Tẩm dung môi trung gian của parafin (khử cồn) ............................................ 4

2.4.2. Tẩm parafin (khử xylene) ............................................................................... 5

2.5. Đúc khuôn........................................................................................................... 5

2.6. Cắt và dán mẫu ................................................................................................... 5

2.6.1. Tải mảnh cắt lên lame..................................................................................... 6

2.7. Loại parafin ra khỏi mảnh cắt............................................................................. 6

2.8. Nhuộm Hematoxyline–Eosin ............................................................................. 7

3. Cấu trúc mô học ..................................................................................................... 7

3.1. Đại cương ........................................................................................................... 7

3.1.1. Vị trí và hình thể bên ngoài ............................................................................ 8

3.1.2. Cấu tạo và các ống tiết của tụy ....................................................................... 8

3.2. Cấu trúc vi thể của tuyến tụy .............................................................................. 9

3.2.1. Tụy ngoại tiết .................................................................................................. 9

3.2.1.1. Cấu trúc của tụy ngoại tiết ........................................................................... 9

3.2.1.2. Chức năng của tụy ngoại tiết ..................................................................... 12

3.2.2. Tụy nội tiết (tiểu đảo Langerhans)................................................................ 13

3.2.2.1. Cấu trúc và chức năng................................................................................ 14

3.2.2.2. Bệnh có liên quan đến tuyến tụy................................................................ 16

PHẦN III: PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN................................................. 17

1. Phương tiện và hóa chất....................................................................................... 17

1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài.............................................................. 17

1.2. Phương tiện và hoá chất ................................................................................... 17

1.2.1. Phương tiện ................................................................................................... 17

1.2.2. Hoá chất ........................................................................................................ 19

2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 20

2.1. Thực hiện tiêu bản hiển vi cố định tuyến tụy chuột ......................................... 20

2.1.1. Lấy mẫu ........................................................................................................ 20

2.1.2. Cố định.......................................................................................................... 21

2.1.3. Khử nước ...................................................................................................... 22

2.1.4. Tẩm parafin ................................................................................................... 22

2.1.5. Đúc khuôn ..................................................................................................... 22

2.1.6. Cắt mẫu ......................................................................................................... 23

2.1.7. Tải mẫu lên lame........................................................................................... 25

2.1.8. Nhuộm mẫu................................................................................................... 26

2.1.9. Cố định mẫu trong Baume Canada ............................................................... 28

3. Bảng tóm tắt quá trình thực hiện ......................................................................... 29

4. Các trở ngại thường gặp và biện pháp khắc phục................................................ 30

PHẦN IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ....................................................................... 31

1. Ưu và khuyết điểm............................................................................................... 31

1.1. Ưu điểm ............................................................................................................ 31

1.2. Tồn tại............................................................................................................... 31

2. Kỹ thuật................................................................................................................ 31

2.1. Mẫu hiển vi ....................................................................................................... 31

2.1.1. Lấy mẫu ........................................................................................................ 31

2.1.2. Cố định mẫu .................................................................................................. 33

2.1.3. Khử nước ...................................................................................................... 33

2.1.4. Tẩm parafin ................................................................................................... 33

2.1.5. Đúc khuôn ..................................................................................................... 34

2.1.6. Cắt mẫu ......................................................................................................... 35

2.1.7. Tải mẫu lên lame........................................................................................... 35

2.1.8. Làm tan parafin ............................................................................................. 36

2.1.9. Nhuộm Hematoxyline và Eosin .................................................................... 36

2.1.10. Khử nước ...................................................................................................... 37

2.1.11. Làm trong mẫu .............................................................................................. 37

2.1.12. Gắn mẫu ........................................................................................................ 37

3. Kết quả ................................................................................................................. 38

3.1. Vị trí và hình thể bên ngoài .............................................................................. 38

3.1.1. Vị trí .............................................................................................................. 38

3.1.2. Hình dạng...................................................................................................... 38

3.2. Cấu trúc vi thể của tuyến tụy ............................................................................ 39

3.3. Tụy ngoại tiết.................................................................................................... 40

3.3.1. Những nang tuyến......................................................................................... 41

3.3.2. Những ống bài xuất....................................................................................... 42

3.4. Tụy nội tiết (Tiểu đảo Langerhans) .................................................................. 44

PHẦN V: KẾT LUẬN–KIẾN NGHỊ ...................................................................... 47

1. Kết luận................................................................................................................ 47

2. Kiến nghị.............................................................................................................. 47

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Sơ đồ hình thể và mạch máu của tá tràng và tụy ................................................... 8

Hình 2: Tiểu thùy tụy........................................................................................................... 9

Hình 3: Tuyến túi (kiểu chùm nho)...................................................................................... 9

Hình 4: Nang tuyến tụy ngoại ........................................................................................... 10

Hình 5: Nang tụy ngoại và tiểu đảo Langerhans tiết ........................................................ 13

Hình 6: Tiểu đảo Langerhans ........................................................................................... 13

Hình 7: Tiểu đảo Langerhans ........................................................................................... 14

Hình 8: Sơ đồ các đường mổ trong giải phẫu chuột ......................................................... 21

Hình 9: Khuôn giấy đúc mẫu ............................................................................................ 22

Hình 10: Dạng khối mẫu đã gọt và gắn vào khối gỗ ........................................................ 23

Hình 11: Các lát cắt kết thành băng ................................................................................. 24

Hình 12: Chọn các lát cắt trên băng mẫu và tải lát cắt lên lame ..................................... 25

Hình 13: Cố định mẫu trong Baume Canada ................................................................... 28

Hình 14: Tiêu bản tuyến tụy chuột đồng cắt ngang .......................................................... 28

Hình 15: Nội quan trong khoang bụng của chuột............................................................. 32

Hình 16: Tuyến tụy sau khi tách khỏi khoang bụng chuột ................................................ 32

Hình 17: Vị trí và hình thể bên ngoài tuyến tụy của chuột ............................................... 38

Hình 18: Lát cắt ngang thân tụy (x400)............................................................................ 39

Hình 19: Lát cắt ngang của đuôi tuyến tụy (x400) ........................................................... 40

Hình 20: Động mạch chính của tụy (x1000)..................................................................... 40

Hình 21: Ống tụy chính (x1000) ....................................................................................... 40

Hình 22: Tụy ngoại tiết (x600).......................................................................................... 41

Hình 23: Nang tuyến tụy ngoại tiết (x600) ....................................................................... 42

Hình 24: Ống bài xuất lớn (x1000)................................................................................... 43

Hình 25: Ống bài xuất gian tiểu thuỳ (x1000) .................................................................. 43

Hình 26: Ống bài xuất trong tiểu thuỳ (x1000) ................................................................ 44

Hình 27: Tiểu đảo tụy và các nang tuyến (x600).............................................................. 44

Hình 28: Tiểu đảo Langerhans của chuột cái 200gram đang mang thai (x600) ............. 45

Hình 29: Cấu trúc mô không bình thường của tụy chuột bệnh ......................................... 46

TÓM TẮT

Qua đề tài “Thực hiện tiêu bản cố định tuyến tụy chuột đồng Rattus argentivente”

chúng tôi đã đạt được những kết quả sau:

- Xác định được phương pháp giải phẫu, tách lấy tuyến tụy chuột đồng.

- Xác định được quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi cố định tuyến tụy chuột

đồng.

- Thực hiện được 30 tiêu bản hiển vi cố định lát cắt ngang và 20 tiêu bản hiển vi

cố định lát cắt dọc tuyến tụy chuột đồng. Mẫu hiển vi được thực hiện bằng phương

pháp cắt lát trong parafin và nhuộm kép bằng Hematoxyline và Eosin Y. Mẫu đạt kết

quả tốt cho việc nghiên cứu cấu trúc mô học của tuyến tụy. Quan sát tiêu bản trên kính

hiển vi thấy được:

+ Tụy ngoại tiết: các nang tuyến, hệ thống ống tụy.

+ Tụy nội tiết: tế bào nội tiết như alfa, beta, delta,… và phân bố mạch trong

tụy.

+ Ở mức độ tế bào: phân biệt được sự tương phản giữa tế bào chất và nhân.

1

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ

Cơ thể động vật bậc cao là một cơ thể thống nhất và toàn vẹn. Tính thống nhất được

thực hiện được là nhờ sự phối hợp hoạt động nhịp nhàng của các cơ quan được điều

khiển bởi hệ thần kinh và hệ nội tiết. Nhờ các cơ chế điều khiển, điều hòa mà cơ thể có

thể tồn tại ở trạng thái bình thường.

Các tuyến nội tiết có chức năng điều hòa hoạt động của cơ thể, rối loạn hoạt động của

các tuyến nội tiết gây những ảnh hưởng trầm trọng đối với cơ thể. Tuyến tụy là tuyến vừa

có chức năng ngoại tiết giúp tiêu hóa thức ăn, lại vừa có chức năng nội tiết điều hòa

lượng đường trong máu. Bệnh tiểu đường và ung thư tuyến tụy là một trong những căn

bệnh nguy hiểm ngày nay liên quan trực tiếp đến hoạt động của tuyến tụy.Việc tìm hiểu

cấu trúc mô học của tuyến tụy là một bước vững chắc cho những nghiên cứu sâu về chức

năng sinh lý của tụy tạng.

Chuột đồng (Rattus argentivente) là một đối tượng khá phổ biến, dễ nuôi và dễ tìm.

Tuyến tụy chuột đồng có kích thước phù hợp cho việc thực hiện tiêu bản hiển vi.

Từ những thực tiễn trên tôi chọn đề tài: “Thực hiện tiêu bản hiển vi cố định mô tuyến

tụy ở chuột đồng (Rattus argentivente)”.

Bên cạnh tính khoa học và thực tiễn của đề tài, đề tài sẽ góp phần bổ sung nguồn mẫu

vật để phục vụ cho công tác nghiên cứu và giảng dạy của bộ môn.

2

PHẦN II: LƯỢT KHẢO TÀI LIỆU

1. Chuột đồng

Phân loại:

– Ngành: Chordata

– Lớp: Mammalia

– Bộ: Rodentia

– Họ: Muridae

– Giống: Rattus

– Loài: Rattus argentivente

Đặc điểm sinh hoc:

– Hình dạng ngoài:

Chuột đồng thuộc loại động vật có vú, thuộc bộ gặm nhấm, thân dài từ 7 đến 11cm,

đuôi dài 7–10cm, lông màu xám nâu mũi nhọn, lỗ tai dựng đứng, mắt không nhìn thấy

xa, không phân biệt được màu sắc, bù lại chuột có khả năng cảm nhận mùi vị thức ăn rất

tốt, rất thính tai. Chuột đồng có bộ răng kiểu gặm nhấm, mỗi nửa hàm có một đôi răng

cửa lớn, dài, cong chìa ra ngoài để gặm nhấm, không có chân răng. [Tòng, 1998]

– Đời sống:

Chuột vào ban đêm đi tìm thức ăn, ban ngày lẩn trốn ở trong hang hay chỗ kín. Ngoài

thiên nhiên chuột sống từng đàn, chuột leo trèo nhanh có thể bò ngược trên trần nhà, nhảy

vọt, chạy nhanh và bơi lội và có tài đào đất làm hang để ở, hay làm tổ trên cây, trong các

bụi rậm, thuộc loại ăn tạp.

– Sinh sản:

Chuột đồng sinh sản rất nhanh, thành thục sớm, đẻ nhiều lứa. Chuột sinh trưởng

khoảng 3 tháng thực hiện được chức năng sinh sản, mang thai từ 18–20 ngày, mỗi lứa đẻ

từ 2–6 con. Chuột con sống nhờ vào sữa mẹ trong thời gian 2–3 tuần lễ. [Tòng, 1998]

3

2. Kỹ thuật thực hiện tiêu bản hiển vi cố định

Thực hiện theo phương pháp tiêu bản cắt lát. Mẫu vật thực hiện theo phương pháp này

qua nhiều giai đoạn phức tạp và có thêm một số thao tác phụ, nếu một trong mỗi giai

đoạn chính chưa đạt được mong muốn thì sẽ làm ảnh hưởng đến kết quả về sau. Tóm

lược quy trình như sau: trích thủ–định hình–khử nước–tẩm parafin–đúc khuôn–cắt mẫu–

tải mẫu lên lame–nhuộm kép bằng Hematoxyline–Eosin khử nước–làm trong mẫu và cố

định mẫu trong Baume Canada.

2.1. Trích thủ

Trích thủ là kỷ thuật lấy tế bào, mô, cơ quan ở cơ thể còn sống hay đã chết.

Nguyên tắc chung:

– Miếng mô hay cơ quan phải tươi (sau khi giết súc vật phải lấy ngay).

– Động tác trích thủ phải nhẹ nhàng, tránh đụng chạm mạnh dễ gây biến đổi cấu trúc

mô.

– Không dùng kẹp phẫu tích kẹp vào vùng mô cần nghiên cứu, không bóp mạnh và

không rửa miếng mô.

– Khi cắt phải dùng dao (kéo) sắc và cắt theo một hướng. [Địch, 2002]

2.2. Cố định

Nguyên tắc chung:

– Mẫu vật phải được cố định ngay sau khi lấy.

– Không được làm dập nát mẫu.

– Mẫu vật phải có kích thước vừa phải.

– Không để một mặt mẫu dính vào lọ đựng.

– Đủ dung dịch cố định cần thiết.

+ Đúng nồng độ.

+ Thể tích dung dịch cố định gấp từ 30–60 lần thể tích mẫu.

Thời cố định thích hợp. Mẫu dày tối đa 5mm thì cố định từ 24–48 giờ.

Có nhiều loại dung dịch cố định như: Bouin, Canoy, Duboscq-Brasil, Branca… trong

đó Bouin là dung dịch cố định phù hợp với nhiều loại mô và cơ quan. [Địch, 2002]

4

Rửa nước cho sạch màu vàng của Bouin dưới vòi nước chảy. [Hoè, 1976]

2.3. Khử nước

Mục đích của khử nước là làm thế nào rút hết nước trong mô ra mà không làm mô và

tế bào bị co hoặc không làm vị trí của các thành phần, cấu tạo trong mô bị thay đổi.

Quy trình khử nước thông thường chung cho mỗi loại mẫu (có thể gia giảm tùy kích

cở, mẫu, điều kiện của từng phòng thí nghiệm)

– Cồn II (cồn tuyệt đối sử dụng 2 lần) 4 giờ.

– Cồn I (cồn tuyệt đối sử dụng 1 lần) 4 giờ.

– Cồn tuyệt đối 6 giờ.

Muốn biết một miếng mô đã được khử hết nước chưa, người ta đổ xylene vào lọ đựng

mô đã rút hết cồn. Nếu xylene vẫn trong, điều này chứng tỏ sự khử nước tốt nếu xylene

hơi có vẫn đục (màu trắng sữa) phải khử nước lại bằng cồn 1000.

2.4. Tẩm parafin

2.4.1. Tẩm dung môi trung gian của parafin (khử cồn)

Thủ thuật này nhằm dùng dung môi ưa parafin để đẩy cồn ngấm trong mô sau khi rút

hết nước ở mô ra. Dung dịch sử dụng phải đồng thời hòa tan cồn và nến.

Dung môi trung gian của parafin thường dùng nhất là Toluen và xylene. Ngoài ra còn

có nhiều chất có 2 đặc tính khử cồn hòa tan parafin như Benzen, Ét–xăng bách hương,

Butanol, sunfuacacbon,... Những chất sau chỉ dùng hạn chế: ví dụ như Ét–xăng bách

hương dùng cho kỹ thuật xét nghiệm ty lạp thể, butanol dùng cho tổ chức hạch. Để khử

hết cồn dùng:

– Xylene (hay xylon) II (đã sử dụng 2 lần 4 giờ).

– Xylene I (đã sử dụng 1 lần 4 giờ).

– Xylene nguyên chất 6 giờ.

– Thời gian khử cồn tối đa là 24 giờ, mẫu ngâm quá lâu sẽ cứng và dễ vỡ. [Hoè,

1976]

5

2.4.2. Tẩm parafin (khử xylene)

Trước hết cần chọn loại parafin tốt và thích hợp. Parafin chỉ có thể ngấm vào mẫu và

loại xylene ra khi nó ở trạng thái lỏng, tẩm parafin chỉ thực hiện đầy đủ khi dung môi

trung gian đã bị loại hoàn toàn. Người ta khử dung môi trung gian bằng cách chuyển mẫu

lần lượt vào những lọ có parafin ngày càng tinh khiết. Để tiết kiệm hóa chất và thời gian,

trên thực tế chỉ cần 3 lần tẩm là đủ.

– Parafin I (đã sử dụng 2 lần) 6 giờ.

– Parafin II (đã dùng 1 lần) 6 giờ.

– Parafin III (nguyên chất) 12 giờ.

Loại parafin I và II có thể dùng nhiều lần hơn quy định.

Parafin III phải đảm bảo nguyên chất vì chính nó sẽ dùng để đúc khuôn.

Nói chung, thời gian tẩm lâu hay mau là tùy kích thước và tính chất của mẫu: nếu nhỏ

và lỏng lẽo thì tẩm vài ba giờ, nếu to và cứng thì tẩm từ 24–36 giờ. [Hoè, 1976]

2.5. Đúc khuôn

Người ta đổ vào khuôn chất parafin lỏng đã lọc từ trước (parafin ở lần chuyển thứ 3,

nghĩa là parafin hoàn toàn mới). Nhúng ngay mẫu vào chất parafin đang lỏng này. Dùng

kẹp hay kìm đã hơ nóng để định hướng mẫu theo ý muốn. Sau vài phút parafin sẽ đông

đặc lại và giữ mẫu ở nguyên vị trí. Khi lớp vỏ ngoài parafin đã đủ cứng, làm ướt cả

khuôn vào trong bát đựng đầy nước lạnh và chú ý đừng làm rạn, vỡ màng mỏng parafin

bên trên. Khoảng 20–30 phút sau, parafin sẽ cứng lại và thuần nhất toàn bộ. Cần tránh

làm lạnh ngay khi parafin còn lỏng, không được cắt mảnh ngay, phải đợi đến 24 giờ sau.

2.6. Cắt và dán mẫu

Cắt mẫu tẩm parafin bằng máy cắt với 3 giai đoạn:

– Cắt khối mẫu thành hình tháp, đáy hình thang, để lại khoảng 2–3 mm parafin quanh

mẫu. Gọt làm sao cho 2 cạnh trên và dưới song song.

– Hơ nóng nhanh khối gỗ và khối mẫu để gắn khối mẫu vào khối gỗ, điều chỉnh mẫu

sao cho ngay ngắn.

– Đặt lưỡi dao vào, định hướng khối và dao trên máy cắt cho thích hợp. Nhiệt độ tối

ưu là nhiệt độ phòng. Độ dày của mẫu cắt:

6

+ 3–5 mm đối với mẫu có yêu cầu quan sát tế bào học.

+ 10–15 mm đối với mẫu có yêu cầu quan sát tổ chức học định khu.

Tốc độ của tay quay tùy thuộc vào tính chất của khối và độ dày của khối, nói chung,

nên quay chậm với các khối dễ vỡ, đặc biệt là gan và lách. Còn đối với khối rắn không vỡ

cần quay nhanh. Hứng các mẫu cắt trên một tờ giấy trắng. [Hoè, 1976]

2.6.1. Tải mảnh cắt lên lame

Trước khi nhuộm cần phải tải mảnh cắt và dán mảnh trên lame. Muốn mảnh cắt dính

vào nền lame có thể dùng một chất dính Gelatin hoặc Albumin, trình tự thực hiện như

sau:

– Nhỏ vài giọt nước hoặc dung dịch dán còn ấm trên lame (dung dịch phải làm ướt

đều lame).

– Đặt lên trên dung dịch một mảnh cắt hay một dãy cắt.

– Đặt lame trên bàn nóng khoảng 50oC và theo dõi mảnh cắt tải ra, mảnh cắt phải nổi

trên dung dịch. Bàn nóng không được quá 500C, nếu quá 500C thì tổ chức sẽ bị khô.

– Nghiêng lame để tháo nước đi một cách thận trọng, làm thế nào cho dung dịch dán

trôi đi càng nhiều càng tốt.

Để tiêu bản khô theo tư thế nghiêng (mảnh cắt ở mặt dưới) ít nhất là 12 giờ ở nhiệt độ

bình thường hoặc 20–30 phút trong tủ ấm ở nhiệt độ khoảng 45 oC khi đã khô kiệt, các

mảnh cắt dính rất tốt vào lame. [Hoè, 1976]

2.7. Loại parafin ra khỏi mảnh cắt Loại parafin ra khỏi mảnh cắt chỉ tiến hành trước khi nhuộm vì không thể bảo quản lâu

được tổ chức rất hay vụn vỡ, hút ẩm.

– Đối với các tiêu bản đã được nhuộm cả khối:

+ Làm tan parafin bằng xylene.

+ Gắn bằng Baume canada.

– Đối với các tiêu bản chưa nhuộm và dán bằng albumin:

+ Làm đông đặc albumin bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn.

+ Hòa tan parafin bằng xylene từ 1–2 phút.

+ Loại xylene bằng cồn tuyệt đối 1 phút.

7

+ Cho vào cồn 950 1 phút.

+ Cho vào nước 5 phút.

2.8. Nhuộm Hematoxyline–Eosin

Cho tiêu bản vào Hematoxyline từ 5–45 phút tùy theo loại Hematoxyline.

Rửa tiêu bản trong nước chảy cho đến khi nào tiêu bản màu xanh (từ hồng sang xanh)

khoảng 10 phút ở nước chảy pH=8.

Nhúng vào cồn acid vài giây (1ml acid HCl + 99ml cồn 960).

Cần lắc tiêu bản rồi rửa nước lã cho xanh lại. Kiểm tra lại nếu biệt hóa chưa đủ thì

nhúng lại cồn acid, nếu màu nhạt sau khi rửa qua nước cất, có thể cho lại Hematoxylin từ

10–15 phút. Sau đó biệt hóa trở lại.

Ngâm tiêu bản trong Eosin từ 2–4 phút (Eosin Y 1% trong cồn để nhuộm nguyên sinh

chất).

Rửa nước từ 3–4 phút (kiểm tra trên kính hiển vi xem đã đạt yêu cầu chưa).

Nhúng tiêu bản trong cồn 900 khoảng 10–15 giây, sau đó là cồn tuyệt đối I, II, III (10–

30 giây mỗi lần) để khử nước.

Chuyển sang ngâm mẫu trong xylene cho đến khi trong mẫu.

Gắn tiêu bản chú ý: sau khi gắn xong, tiêu bản phải trong suốt. Baume Canada thường

dùng trong dung dịch xylene 55%. Cần đậy kín lọ. [Hoè, 1976]

3. Cấu trúc mô học

3.1. Đại cương

Tuyến tụy là tuyến lớn nhất phụ thuộc ruột non. Đầu tuyến tụy dính vào đoạn giữa tá

tràng. Ở người trưởng thành dài 20–25 cm, nặng 60–160g.

Tụy gồm có phần ngoại tiết mỗi ngày tiết chế khoảng 100–200ml dịch tiêu hóa và nội

tiết đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự chuyển hóa hydrat carbon của cơ thể.

Hai chức năng của tụy: ngoại tiết và nội tiết được thực hiện bởi hai nhóm tế bào khác

nhau về cấu tạo và chức năng nhưng có chung nguồn gốc là nội bì. [Mai, 2004]

8

3.1.1. Vị trí và hình thể bên ngoài

Hình 1: Sơ đồ hình thể và mạch máu của tá tràng và tụy. [Quyền, 2004]

Tụy bắt đầu từ phần xuống tá tràng, chạy chếch lên sang trái, băng qua phía trước cột

sống thắt lưng để đến rốn lách. Gồm 3 phần:

– Đầu tụy: nằm bên phải có hình như hình vuông được đóng khung bởi 3 phần: đầu

của tá tràng, phía dưới đầu tụy có một mỏm lồi sang trái gọi là mỏm móc, giữa mỏm này

và thân tụy có khuyết tụy để các mạch máu và mạc treo tràng trên đi qua.

– Thân tụy: nối tiếp đầu tụy bởi cổ tụy, ngang mức khuyết tụy, chạy chếch lên trên

và sang trái. Thân tụy có ba mặt là trước, sau và dưới. Ba bờ là trên, dưới và trước. Thân

và đầu tụy cố định vào phúc mạc thành sau bởi mạc dính tá tụy.

– Đuôi tụy: là phần tụy có hình cái lưỡi nối tiếp với thân tụy và đặc biệt là di động

giữa hai lá mạc nối tụy lách. Đuôi tụy có thể ngắn hoặc dài đến tận rốn lách.

3.1.2. Cấu tạo và các ống tiết của tụy

Phần nhu mô ngoại tiết của tụy chiếm ưu thế, còn phần nội tiết chỉ tập trung thành

từng cụm nhỏ nên gọi là các đảo tụy. Các chất ngoại tiết đổ vào các ống liên tiểu thùy rồi

đổ vào các ống tiết lớn của tụy gồm:

– Ống tụy chính: bắt đầu từ đuôi tụy, chạy qua thân tụy theo thân trục của tụy, đến

khuyết tụy thì bẻ cong xuống dưới qua đầu tụy, cùng các ống mật chủ đổ vào nhú tá lớn.

– Ống tụy phụ: tách từ ống tụy chính, qua phần trên đầu tụy để đổ vào nhú tá bé.

9

3.2. Cấu trúc vi thể của tuyến tụy

Tụy là một tuyến pha gồm hai phần: phần ngoại tiết hay gọi tắt là tụy ngoại tiết và

phần nội tiết hay tiểu đảo Langerhans. Tụy được bao bọc bởi màng liên kết mỏng và bên

ngoài là bao liên kết có lớp trung mô của phúc mạc. Từ bao liên kết có nhiều vách chứa

mạch và dây thần kinh chia tụy ra thành nhiều tiểu thuỳ rất mỏng nhưng dễ nhận nhờ sự

co lại khi làm tiêu bản mô học. Trong mỗi tiểu thuỳ đều có phần ngoại tiết (97%) và phần

nội tiết (3%). [Kiệt, 1994]

1: Ống bài xuất gian tiểu thùy. 2: Vách liên kiết gian tiểu thùy. 3: Ống bài xuất trong tiểu thùy. 4: Nang tuyến tụy ngoại tiết. 5: Dây thần kinh. 6: Tiểu đảo Langerhans.

Hình 2: Tiểu thùy tụy. [Địch, 2002]

3.2.1. Tụy ngoại tiết

3.2.1.1. Cấu trúc của tụy ngoại tiết

Tụy ngoại tiếp là tuyến kiểu túi

chùm nho, gồm hai phần: các nang

tuyến (phần chế tiết) và các ống bài

xuất. Phần chế tiết phình rộng hơn

phần bài xuất, tuyến gọi là tuyến nang.

Một tuyến túi (tuyến nang có nhiều

nang) đổ vào một trong những nhánh

của ống bài xuất, trông giống như một

chùm nho.

Hình 3: Tuyến túi (kiểu chùm nho). [Địch, 2002]

1

2

3

4

5

6

10

– Những nang tuyến

Những nang tuyến chế tiết ra sản phẩm để bài xuất ra ngoài, có hình cầu hay hình ống

ngắn. Thành của nang tuyến được lợp bởi hai lớp tế bào: tế bào tuyến và tế bào trung tâm

nang tuyến. Lòng của nang tuyến thay đổi tùy thuộc vào điều kiện hoạt động chức năng

của tuyến: lòng nang tuyến hẹp khi nang tuyến ở giai đoạn nghỉ, lòng nang tuyến rộng ra

khi hoạt động bài xuất tích cực. [Địch, 2002]

Các nang tuyến được bao bọc bởi các mô liên kết bên trong có các mạch máu, thần

kinh và ống tiết. [Mai, 2004]

– Những tế bào tuyến (tế bào chế tiết)

Gồm một hàng tế bào hình tháp nằm trên màng đáy hay lớp tế bào cơ–biểu mô.

+ Nhân tế bào hình cầu nằm gần cực đáy hơn cực ngọn. Vùng cực ngọn tế bào

chứa đầy những hạt hay những giọt chất chế tiết. Ở những tiêu bản nhuộm bằng xanh

methylen, bào tương vùng đáy tế bào được nhuộm đậm và có sự tập trung nhiều

ribonucleprotein.

+ Bộ Golgi nằm ở vùng trên gần nhân và có sự thay đổi không chỉ về kích thước

mà cả về vị trí trong các điều kiện sinh lý khác nhau.

+ Những hạt hay giọt chất sinh men có nguồn gốc từ vùng bộ Golgi.

+ Khi những hạt sinh men đã bài xuất ra khỏi tế bào, bộ Golgi phát triển lên và

những giọt chế tiết mới được hình thành.

1: Tế bào nang 2: Tế bào trung tâm tuyến

nang 3: Tế bào ống trung gian 4: Màng đáy

Hình 4: Nang tuyến tụy ngoại. [Địch, 2002]

11

+ Quan sát bằng kính hiển vi điện tử, người ta thấy nữa đáy tế bào có nhiều ống có

hướng song song của lưới nội bào có hạt. Trong nền bào tương có nhiều ribosom tự do,

những ti thể dài có nhiều màu và có nhiều hạt đậm trong nền.

+ Ở trên mặt tự do của màng đáy thường có những vi nhung mao ngắn, thấp có

hướng khác nhau.

+ Những hạt sinh men được trong thấy ở vùng bộ Golgi và ở cực ngọn của tế bào.

[Địch, 2002]

– Những tế bào trung tâm mang tuyến

Tế bào trung tâm nang tuyến hay còn gọi là tế bào ống, không được xếp thành lớp

liên tục. Những tế bào này kéo dài có hình dẹt, hình sao hay hình thoi, bào tương sáng

màu vì rất ít bào quan. Nhân hình bầu dục, nhuộm màu base rất đậm. Những tế bào này

nằm trên cực ngọn tế bào nang (tế bào tiết), vừa góp phần tạo nên thành ống bài xuất

nang tuyến, vừa nằm sâu trong lòng nang tuyến. Trong tiêu bản nhuộm H&E, thường chỉ

nhìn rõ nhân tế bào.

– Những ống bài xuất

Phần bài xuất của tụy ngoại tiết gồm một hệ thống những ống từ nhỏ đến lớn, bắt đầu

từ ống bài xuất nang tuyến, ống bài xuất tiểu thuỳ, ống bài xuất gian tiểu thuỳ và cuối

cùng chất tiết qua ống tụy chính và ống tụy phụ đổ vào tá tràng.

+ Ống trung gian.

§ Là những ống nhỏ, ngắn, thành lợp bởi biểu mô hình khối vuông.

§ Ống trung gian tiếp với một hay nhiều nang tuyến. Tế bào trung tâm nang

tuyến chính là những tế bào lợp thành ống trung gian phần nằm trong nang tuyến.

+ Ống bài xuất trong tiểu thùy.

§ Nối tiếp với ống trung gian, lòng ống đều đặn, thành ống được lợp bởi một

biểu mô hình khối vuông hay hình trụ.

§ Lớp biểu mô lợp thành ống có tính chất chế tiết rõ rệt. Các tế bào tuyến hấp

thu những phân tử bé từ máu và bằng cơ chế sinh tổng hợp nội bào, biến chúng thành một

sản phẩm có cấu trúc phức tạp hơn rồi sau đó bài xuất chúng ra khỏi tế bào.

12

+ Ống bài xuất gian tiểu thùy: cỡ nhỏ, lòng rộng, thành lợp bởi biêu mô hình khối

vuông hay trụ, chung quanh là màng đáy, phía ngoài màng đáy mô liên kết tạo thành một

vỏ xơ dày.

+ Ống bài xuất lớn và những ống cái

§ Lòng ống rộng, thành lợp bởi biểu mô trụ đơn, giống biểu mô ruột non: tế bào

mâm khía (tế bào hấp thụ) và tế bào hình đài (tiết nhầy).

§ Tế bào mâm khía: tế bào hình trụ cao 20–26mm. Nhân hình bầu dục, nằm ở

cực đáy. Phía dưới mâm khía có vùng sáng, thường không có bào quan.

§ Tế bào hình đài: những tế bào hình trụ cao, nằm rãi rát không đều đặn xen kẽ

giữa những tế bào hấp thụ. Phần cực ngọn của tế bào phình to ra chứa những giọt chất

nhày, phần đáy hẹp chứa nhân dẹp.

Chung quanh biểu mô lợp có màng đáy bọc. Ngoài màng đáy là vỏ xơ chun bọc, trong

có những sợi cơ trơn có hướng vòng.

3.2.1.2. Chức năng của tụy ngoại tiết

Tụy ngoại tiết (tế bào tuyến và tế bào trung tâm) tiết ra dịch tụy đổ vào đoạn đầu của tá

tràng

– Tế bào tuyến: tiết ra enzim tiêu hóa

+ Nhóm enzim phân giải protein: trysin, chymotrysin, cacboxypolypeptitdaza.

+ Nhóm enzim phân giải lipit: lipaza, photpholipaza.

+ Nhóm enzim phân giải gluxit: amylaza, mantaza, lactaza, sacaraza.

– Tế bào trung tâm: bài tiết nước và các chất vô cơ và quan trọng nhất là muối

NaHCO3. [Mai, 2004]

13

3.2.2. Tụy nội tiết (tiểu đảo Langerhans)

A: Tụy ngoại tiết. B: Tụy nội tiết (tiểu đảo Langerhans). 1: Tế bào nang. 2: Tế bào trung tâm tuyến nang. 3: Nang tuyến 4: Ống bài xuất trong tiểu thùy. 5: Tế bào tụy nội tiết. 6: Mau mạch máu.

Hình 5: Nang tụy ngoại và tiểu đảo Langerhans tiết. [Địch, 2002]

Tụy nội tiết là tuyến kiểu lưới, sản phẩm tiết được đưa thẳng vào trong máu, chỉ có

phần chế tiết, không có phần bài xuất.

Xen vào giữa các nang tuyến tụy ngoại tiết người ta có thể gặp những đám nhỏ gồm

những tế bào nội tiết và rất nhiều mao mạch tạo thành những tiểu đảo Langerhans.

Mỗi tiểu đảo là một khối (đường kính 100–300 mm ) được tạo thành bởi những đáy tế

bào tuyến nối với nhau thành lưới tế bào xen kẽ với lưới mao mạch kiểu xoang.

Ở tụy người trưởng thành, có khoảng

từ 1 đến 2 triệu tiểu đảo, chiếm khoảng

1,5% thể tích tuyến tụy. Ở đuôi tụy, số

tiểu đảo nhiều hơn ở thân tụy hoặc ở đầu

tụy. Loại tiểu đảo có những dây tế bào

chạy quanh co chiếm chủ yếu ở đầu tụy,

loại tiểu đảo hình tròn hoặc hình trứng

chiếm chủ yếu ở thân và đuôi tụy.

Các tiểu đảo được định ranh giới bởi

một lớp mỏng sợi võng bao quanh mô

tuyến, nhưng có rất ít sợi võng có mặt ở

bên trong tiểu đảo. [Địch, 2002]

Hình 6: Tiểu đảo Langerhans. [Paulo, 2007]

12

3A

B

4

5

6

14

3.2.2.1. Cấu trúc và chức năng

Người ta phân biệt được

trong dãy tế bào có các loại tế

bào có chứa hạt trong bào

tương: tế bào a mang hạt

(alfa), tế bào b mang hạt

(Beta) và tế bào d mang hạt

(delta).

– Tế bào a

+ Vị trí: Là tế bào lớn

nhất trong các tế bào của tụy

nội tiết, thường nằm ở vùng

ngoại vi của tiểu đảo.

+ Cấu trúc:

§ Nhân tế bào lớn, ít chất nhiễm sắc nên sáng.

§ Trong tế bào tương có những hạt tương đối lớn, không tan trong cồn, ưa bạc.

§ Hình ảnh siêu vi của tế bào a cho thấy một lượng khá nhiều những hạt cầu

lớn, đậm đặc có màng bọc xung quanh. Cái màng này được tách rời hạt nằm ở trong bởi

một khoảng sáng hẹp. Đường kính hạt tương đối lớn từ 200–300nm.

§ Những ti thể có hình gậy, mảnh, dài, có một số ống và túi lưới nội bào có hạt

và bộ Golgi nằm gần nhân có chứa những hạt chế tiết. [Kiệt, 1994]

§ Nhuộm H&E tế bào chất a bắt màu hồng đậm. [Cooper,1998]

+ Chức năng:

§ Các tế bào a tiết ra Glucagon (một peptid có 29 acid amin). Lượng Glucagon

chiết xuất từ tụy có tương quan một cách tương đối với số lượng tế bào a có trong tiểu

đảo Langerhans.

§ Glucagon có tác dụng:

o Tác dụng lên sự chuyển hóa gluxit: tăng đường huyết.

Hình 7: Tiểu đảo Langerhans. [Gerrit, 1979]

Tế bào d

Tế bào b

Tế bào a

15

o Tác dụng lên sự chuyển hóa protid: tăng phân giải protein.

o Tác dụng lên sự chuyển hóa lipid: tăng thoái hoá lipid.

– Tế bào b

+ Vị trí: Nhỏ hơn tế bào a , là loại tế bào có nhiều nhất tiểu đảo ở người, tế bào b

chiếm từ 60–80% tế bào tụy nội tiết, thường nằm ở vùng trung tâm của tiểu đảo.

+ Cấu trúc:

§ Nhân tế bào nhỏ, có nhiều chất nhiễm sắc.

§ Bào tương có những hạt b , hòa tan trong cồn, không ưa bạc.

§ Tế bào B có những ti thể lớn và một bộ Golgi rõ hơn ở tế bào a .

§ Lưới nội bào có hạt kém phát triển hơn ở tế bào a .

§ Ở loài người, những hạt b có biểu hiện bên ngoài khác các hạt khác. Mỗi hạt

có một hay nhiều tinh thể nhỏ, đậm đặc, có hình đa diện hoặc tứ giác, những tinh thể này

nằm cách màng của hạt bởi một khoảng trống hẹp.

§ Khi nhuộm bằng azan, các hạt b bắt màu kém hơn kém hơn những hạt a .

[Kiệt, 1994]

§ Nhuộm H&E tế bào chất b bắt màu hồng sáng. [Cooper,1998]

+ Chức năng: Tế bào b tiết insulin. Insulin có vai trò quan trọng trong việc dự trữ

các chất sinh năng lượng

§ Tác dụng của insulin lên chuyển hóa gluxit: giảm đường huyết.

§ Tác dụng của insulin quá trình chuyển hóa lipit: tăng dự trữ lipid.

§ Tác dụng của insulin lên chuyển hóa protein: tăng việc tổng hợp và chuyển

hoá protein cho cơ thể.

– Tế bào d

+ Vị trí: Chiếm khoảng 5–8% tế bào tụy nội tiết, thường nằm ở ngoại vi tiểu đảo.

+ Cấu trúc:

§ Tế bào hình quả lê hoặc hình sao chứa nhiều hạt delta trong bào tương. [Kiệt,

1994]

16

§ Hạtd không có khoảng sáng giữa màng và khối vật chất bên trong hạt, mật độ

điện tử nhạt.

§ Kích thước hạt thay đổi trong khoảng từ 100 đến 400nm. [Địch, 2002]

§ Tế bào chất bắt màu đậm. [Gerrit, 1979]

+ Chức năng: Sản phẩm chế tiết của tế bào d là somatostatin. Somatostatin của tế

bào d có tác dụng:

§ Ức chế hoạt động của tiểu đảo Langerhans, vì vậy làm giảm sự bài tiết insulin

và glucagon.

§ Là giảm các nhu động của của dạ dày, tá tràng và sự co bóp của túi mật.

§ Giảm sự bài tiết dịch tụy và hấp thu ở đường tiêu hóa. [Mai, 2004]

Ngoài các tế bào miêu tả ở tụy ngoại tiết và tụy nội tiết còn những tế bào trung gian

(nang–tiểu đảo). Tế bào tập trung xung quanh tiểu đảo và chế tiết vào máu. [Kiệt, 1994]

– Tế bào PP (tế bào tạo pancreatic polypeptid)

Là loại tế bào ở tiểu đảo người. Tế bào pp chỉ có ở những tiểu đảo tụy có tế bào xếp

thành dây quanh co. Hạt chế tiết của tế bào pp nhỏ hơn hạt chế tiết của các tế bào nội tiết

khác có hình tròn hoặc hình trứng, mật độ điện tử không đồng đều giữa các hạt, không có

khoảng sáng giữa màng và khối vật chất bên trong hạt.

3.2.2.2. Bệnh có liên quan đến tuyến tụy

Viêm tụy mãn tính: tụy tăng sinh tổ chức liên kết ở gian hay trong tiểu thuỳ. Các

mạch máu xơ hoá, một số sợi thần kinh tăng sản. Các lớp biểu mô của tuyến mất, các ổ

tái sinh hình thành các xoang nhỏ đè ép vào ống dẫn, ống tụy giãn, có thể có sỏi. Các tiểu

đảo Langerhans bị teo xơ.

Viêm tụy cấp:

– Viêm tụy cấp không hoại tử: hay gặp nhất, tụy bị tổn thương chủ yếu là phù nề,

nhìn tụy bóng láng, sưng to.

– Viêm tụy cấp hoại tử: tụy có nhiều đốm xuất huyết, có khi hoại tử.

Bệnh đái tháo đường: giảm số lượng tế bào bêta đảo Langerhans, thoái hoá các tế

bào bêta, thoái hoá trong và xơ hoá các đảo tụy, thâm nhiễm tế bào lympho, xuất huyết,

hoại tử hoặc vôi hoá tuyến tụy. [Thanh, 2000]

17

PHẦN III: PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN

1. Phương tiện và hóa chất

1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện trong phòng thí nghiệm sinh lý động vật–Bộ môn Sinh–Khoa Sư

phạm–Đại học Cần Thơ.

Đề tài được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 10/2008 đến tháng 05/ 2009.

1.2. Phương tiện và hoá chất

Để thực hiện được tiêu bản hiển vi cố định tuyến tụy chuột đồng trải qua nhiều khâu

phức tạp, cần các phương tiện và hoá chất nhất định như sau:

1.2.1. Phương tiện

STT TÊN PHƯƠNG TIỆN SỐ LƯỢNG

1 Kính hiển vi 1cái

2 Tửu tinh kế 1 cái

3 Cân kỹ thuật 1 cái

4 Tủ sấy 1 cái

5 Đồng hồ bấm giây 1 cái

6 Máy cắt mẫu 1 cái

7 Khay dựng lame 1 cái

8 Lame 4 hộp

9 Lamelle 3 hộp

10 Chai màu đựng hoá chất 5 chai

11 Hủ yaourt 20 cái

12 Đủa thuỷ tinh 1 cây

13 Cốc đựng Baume Canada 1 chai

18

14 Khay mổ 1 cái

15 Kim mũi giáo 1 cây

16 Kim phá tuỷ 1 cây

17 Kéo 1 cây

18 Kẹp 1 cây

19 Ống hút nhựa 2 cây

20 Pipete 5 ml 1 cây

21 Bercher 200ml 1 cái

22 Bercher 500ml 1 cái

23 Bercher 1000ml 1 cái

24 Đĩa đồng hồ 1 cái

25 Ống đong 500ml 1 cái

26 Phểu thuỷ tinh 1 cái

27 Thùng nhựa 1 lít 10 cái

28 Hộp đựng mẫu 1 cái

29 Đèn cồn 1 cái

30 Hộp quẹt 1 cái

31 Tủ lạnh 1 cái

32 Giấy thấm 3 hộp

33 Giấy vệ sinh 5 cuồn

34 Lưỡi lam Gillete 4 hộp

35 chuột 25 con

36 Băng keo trong 1 cuồn

37 Băng keo giấy 1 cuồn

38 Film ảnh 1 cuồn

19

39 Ấm điện 1 cái

40 Hột gà 1 trứng

41 Giấy lịch 1 tấm

42 Khối gỗ 5 cái

43 Dao thái lan 1 cây

44 Dao mổ 1 cây

45 Đèn 75W 8 cái

1.2.2. Hoá chất

STT TÊN HOÁ CHẤT SỐ LƯỢNG

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Nước cất

Cồn tuyệt đối

N–Butanol

Acid Sunfuric đậm đặc

Xylene

Baume Canada

Hematoxyline

Eosin Y

Acid picric

Acid Acetic

Formaldehyd

Parafin

Phenol

Bicromate Kali

10 lít

12 lít

1 lít

250ml

5 lít

15g

3g

3g

30g

250ml

0,5 lít

500g

100ml

50g

20

2. Phương pháp nghiên cứu

2.1. Thực hiện tiêu bản hiển vi cố định tuyến tụy chuột

Nghiên cứu cấu trúc tuyến tụy chuột thông qua việc thực hiện tiêu bản hiển vi cố định

gồm những bước có tính chất nguyên tắc: lấy mẫu, cố định, khử nước, tẩm parafin, đúc

khuôn, cắt lát, nhuộm mẫu, khử nước, làm trong và gắn mẫu.

2.1.1. Lấy mẫu

Thao tác tách lấy tuyến tụy của chuột tiến hành qua các bước sau: Giết chuột, giải

phẫu, quan sát xác định vị trí tuyến tụy, tách lấy tuyến tụy.

– Giết chuột: chuột trước giải phẫu chuột cần gây mê bằng ether hay clorofome, hoặc

dìm vào chậu nước (cho đến khi chuột vừa chết tiến hành mổ ngay).

– Giải phẫu: thao tác mổ được thực hiện ở mặt bụng (theo sơ đồ hình 8). Gồm hai giai

đoạn:

+ Giai đoạn 1: Cắt da

§ Sau khi gây mê hoặc dìm chết đặt chuột nằm giữa bàn mổ, kéo 4 chân và ghim

xuống tấm cao su đặt trên mâm mổ.

§ Tiến hành mổ từ một điểm A (cách hậu môn chuột 1cm), luồn mũi kéo vào

bên trong lớp da bụng của chuột rồi cắt từ từ cẩn thận theo các đường 1; 2; 3) khi cắt

hướng mũi kéo lên để khỏi chạm vào các mạch máu lớn ở cổ.

§ Căng da và ghim xuống tấm cao su.

+ Giai đoạn 2: Cắt thịt

§ Cắt thịt che bụng theo các đường AB, AC cho đến đốt sườn thứ nhất thì dừng

lại. Cắt vòng theo chu vi cơ hoành.

§ Cắt sườn theo các đường BD, CE để bỏ hẳn thịt ngực.

– Quan sát, xác định vị trí tuyến tụy: tuyến tụy phân tán đổ vào đoạn đầu ruột non. Để

xác định vị trí tuyến tụy chính xác, ta tiến hành tháo gỡ hệ tiêu hóa.

+ Hệ tiêu hóa được bắt đầu từ trực tràng lên dạ dày. Gỡ các thể mỡ dính theo màng

treo ruột, chừa tỳ tạng. Loại bỏ các liên hệ của gan và các cơ quan khác. Trình bày hệ tiêu

hóa về bên phải người mổ.

+ Cắt rời màng liên kết gỗ giữa tụy và các cơ quan khác.

21

– Tách lấy tuyến tụy màu hồng nhạt. Tụy chuột là một tuyến phân tán.

Hình 8: Sơ đồ các đường mổ trong giải phẫu chuột

Nguyên tắc lấy mẫu là mẫu phải tươi, nguyên, vì tuyến tụy chuột là một tuyến nhỏ,

mỏng rất mềm khi còn tươi, do đó trong quá trình giải phẫu chuột phải cẩn thận tránh làm

dập mẫu. Trong thao tác nên nhẹ nhàng tránh bóp mạnh, nếu không sẽ làm đứt, biến dạng

cấu trúc mô bên trong hay làm vỡ tĩnh mạch, bên trong tuyến tụy.

Đánh dấu để xác định phần đầu, thân và đuôi tụy. Sau đó bỏ ngay vào dung dịch cố

định Bouin. (Nếu thao tác mổ lâu thì vùi tuyến tụy trở lại dịch mô của chuột một lúc rồi

đem cho vào dung dịch cố định).

2.1.2. Cố định

Để tuyến tụy vào dung dịch cố định Bouin (công thức pha xem ở phần phụ lục) chứa

trong một keo nhựa. Giai đoạn này được thử nghiệm qua các thời gian 20 giờ.

Trong lúc cố định nên có những động tác lắc hoặc khuấy nhẹ để trộn đều dung dịch

cũng như thay đổi vị trí của mẫu nhằm tránh hiện tượng mặt mẫu luôn nằm tiếp xúc với

đáy lọ không được tiếp xúc tốt với dung dịch cố định (về sau mặt này của mẫu sẽ bắt màu

không đều so với những vùng khác).

Thể tích dung dịch cố định phải gấp 30–60 lần thể tích mẫu, khi đó dung địch cố định

sẽ dễ dàng thấm sâu vào cấu trúc mô, mô cố định sẽ tốt hơn.

A

B C

D E

1

2 2

3 3A

22

2.1.3. Khử nước

Vớt mẫu trong dung dịch cố định ra rửa dưới vòi nước chảy khoảng 2–3 giờ để giảm

bớt màu vàng của dung dịch Bouin: dùng một chai nước khoáng bị đục thủng đáy, miệng

chai đặt một cái phểu thuỷ tinh có lót một miếng cước rửa chén. Đặt mẫu lên miếng cước

rồi mở vòi nước chảy thẳng vào mẫu.

Tiếp theo cho rửa trong lọ nước cất (5 phút x 2 lần) rồi lần lượt chuyển qua các lọ cồn

với độ cồn tăng dần 700, 900, 9905 nhằm khử hết nước có trong mẫu mà không làm phá

huỷ đột ngột các cấu trúc mô. Cụ thể được thực hiện như sau:

– Cồn 700: 2 giờ/ lần x 2 lần.

– Cồn 900: 2 giờ/ lần x 2 lần.

– Cồn 9905: 2 giờ/ lần x 2 lần.

– n–Butanol: 2 giờ/ lần x 2 lần.

Chú ý: mỗi lọ cồn chỉ được sử dụng một lần cho một lần làm mẫu.

2.1.4. Tẩm parafin

– Chuyển mẫu từ n–Butanol sang lọ Xylene: 2 giờ/ lần x 2 lần.

– Chuyển mẫu vào xylene:parafin lỏng với tỷ lệ (1:1) để trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C

trong khoảng 12 giờ.

– Chuyển mẫu qua parafin nguyên chất lỏng trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C trong 16

giờ. Trộn mẫu thường xuyên để mẫu ngấm đều parafin.

2.1.5. Đúc khuôn

Hình 9: Khuôn giấy đúc mẫu

– Chuẩn bị: dùng giấy lịch (mặt không màu) xếp thành các khuôn có kích thước 3cm

x 1.5cm x 1.5cm như hình 9.

4.5cm

1.5cm

9cm

1.5cm

3cm

23

– Chuẩn bị sẵn sàng các hủ đựng sáp nguyên chất ở thể lỏng (khoảng 600C trong tủ

sấy). Đèn cồn, kim mũi giáo và kẹp gấp mẫu.

– Đúc khuôn: đặt khuôn vào nơi bằng phẳng, rót parafin lỏng nguyên chất vào khuôn,

rót cho đầy khuôn. Nhanh chóng dùng kẹp gắp mẫu từ trong parafin tẩm ra và đặt vào lớp

parafin vừa rót. Dùng kim mũi giáo đã hơ nóng trên lửa đèn cồn làm chảy parafin xung

quanh mẫu để chỉnh cho mẫu ở đúng vị trí trong khuôn, đồng thời làm hết bọt khí nếu có.

Sau đó để khuôn đúc yên tại vị trí trong 6 giờ ở nhiệt độ phòng. Trữ trong tủ lạnh 150C.

2.1.6. Cắt mẫu

Chuẩn bị:

– Vật liệu:

+ Máy cắt mẫu.

+ Dao cắt mẫu.

+ Dao.

+ Kim mũi giáo.

+ Kẹp.

+ Giấy.

+ Đèn cồn.

+ Khối gỗ.

Mẫu Khối gỗ Khối gỗ có gắn mẫu

Hình 10: Dạng khối mẫu đã gọt và gắn vào khối gỗ

– Lấy khuôn parafin có chứa mẫu ra, tháo khuôn giấy ra rồi gọt mẫu đúc parafin

thành khối hình thang cân.

Mẫu

Parafin

24

– Hơ nóng khối gỗ trên ngọn đèn cồn, đồng thời hơ nhanh khối mẫu hình thang cân

rồi dán lên khối gỗ.

Tiến hành:

– Thận trọng từng động tác một, tránh gió, thở mạnh sẽ làm bay đi những mảnh cắt

hoặc mảnh cắt sẽ bị dơ. Máy cắt để gần nguồn lạnh. Tốt nhất là nên cắt vào lúc sáng sớm

hoặc cắt vào buổi tối.

– Gắn mẫu sao cho ngay ngắn, thẳng góc với lưỡi dao cắt.

Hình 11: Các lát cắt kết thành băng.

– Gắn dao vào bàn để dao, khoá chặt cần cố định dao.

– Điều chỉnh cho lưỡi dao nghiêng một góc khoảng 150, khóa chặt cần điều chỉnh độ

nghiêng của dao.

– Vặn ốc điều chỉnh độ dày lát cắt ở 8mm.

– Di chuyển lưỡi dao tiến lại gần vị trí khối mẫu.

– Mở khoá tay quay và bắt đầu quay với vận tốc vừa phải để lưỡi dao bắt đầu cắt khối

mẫu. Ban đầu cắt với độ dày 20mm. Khi cắt đến mẫu thì điều chỉnh độ dày còn 8mm. Khi

đó các lát cắt sẽ dính nhau thành băng, hứng băng mẫu trên một tờ giấy sạch màu trắng

và bảo quản trong hộp giấy ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh (tránh nguồn nóng vì

nguồn nóng sẽ làm nóng chảy parafin, làm cả băng mẫu dính vào tờ giấy trắng, mẫu sẽ

hư, không thể tải từng lát cắt lên lame).

25

2.1.7. Tải mẫu lên lame

Chuẩn bị:

– Sử dụng lame sạch, dùng 1 lamelle kéo dàn một lớp mỏng dung dịch Albumin

Glycerin (công thức pha ở phần phụ lục) lên lame. Sau đó đặt lame trong tủ sấy ở nhiệt

độ 600 đến khi Albumin khô (khoảng 60 phút).

Hình 12: Chọn các lát cắt trên băng mẫu và tải lát cắt lên lame

– Khi lame đã khô lại, nhỏ một giọt nước ấm lên lame. Chọn lát cắt tốt trong dãy băng

mẫu, cứ cách 3 mẫu thì chọn một mẫu, dùng kim mũi giáo hoặc lưỡi lame cắt rời mẫu ra

khỏi băng và dùng kim mũi giáo có dính một ít nước để lấy lát cắt lên, sau đó chuyển lát

cắt lên giọt nước ấm. Khi chuyển cần nhẹ nhàng, tải xuống từ từ đề tránh bọt khí.

– Cho lame đã tải xong mẫu để dưới đèn tròn 75w, khoảng 45–500C cho đến khi giọt

nước ở lame khô đi, mẫu căng ra và được dán vào lớp Albumin trên lame (khoảng 60

phút).

Mẫu chọn Mẫu chọn Mẫu chọn Mẫu chọn

26

2.1.8. Nhuộm mẫu

Áp dụng phương pháp nhuộm kép 2 màu tương phản là Hematoxyline và Eosin Y, các

mẫu đã dán xong cần được nhuộm ngay trong vòng 24 giờ để tránh bụi và những hư hại

do va chạm hay các tác nhân khác.

Giai đoạn nhuộm gồm nhiều khâu phức tạp. Trong đó, cần có nhiều dụng cụ và hoá

chất cần thiết.

– Chuẩn bị:

+ 5 lọ xylene.

+ Cồn 500, 700, 900, 990 5 mỗi thứ 2 lọ.

+ 1 lọ cồn 800

+ 4 lọ nước cất

+ 1 lọ Hematoxyline

+ 1 lọ Eosin Y

+ 1 Thau nước máy

+ 1 đèn cồn

+ 1 hộp quẹt

+ Giấy vệ sinh

+ Giấy thấm

+ Đồng hồ bấm giây

+ 1 kim mũi giáo

+ Kính hiển vi

+ Lame

+ Lamelle

+ Kẹp

+ Khay đựng mẫu

+ Lọ Baume Canada

27

– Tiến hành:

+ Mẫu sau khi được tải lên lame nên được xem ngay dưới kính hiển vi, nếu mẫu có

lỗi về kỹ thuật thì ta nên tải mẫu khác ngay.

+ Mẫu tốt đã dính lên bề mặt lame có Albumin được hơ nhanh qua ngọn lửa đèn

cồn cho chảy parafin ra rồi cho vào lọ xylene I (khoảng 5–7 phút), nâng lame lên xuống

cho sạch parafin. Sau đó chuyển sang lọ Xylen II, cũng với thao tác tương tự rồi chuyển

sang lọ xylene III.

+ Tiếp tục chuyển sang các lọ cồn có nồng độ giảm dần:

§ Cồn 9905 3–5phút.

§ Cồn 900 3–5phút.

§ Cồn 700 3–5phút.

§ Nước cất 10 phút.

Lưu ý: khi chuyển từ dung dung này sang dung dịch khác thì nên dùng giấy thấm chùi

sạch những giọt dung dịch dính trên lame để tránh làm sai khác nồng độ dung dịch tiếp

theo.

+ Sau khi chuyển qua các lọ có nồng độ cồn giảm dần thì ta tiến hành nhuộm

Hematoxyline trong 20 phút, sau đó chuyển lame đã nhuộm Hematoxyline vào một thau

đầy nước máy, di chuyển lame nhiều lần để rửa thuốc nhuộm đồng thời để các ion có

trong nước máy oxy hoá Hematoxyline thành Hematine có màu tím xanh, rửa lại bằng

nước cất trong 5 phút.

+ Tiếp tục chuyển lame từ lọ nước cất sang các lọ cồn có nồng độ tăng dần là cồn

500 (5 phút) rồi cồn 700 (5phút) rồi nhuộm Eosin Y trong vòng 5 phút.

+ Sau đó chuyển mẫu từ lọ thuốc nhuộm Eosin Y sang lọ cồn 800 để rửa bớt thuốc

nhuộm. Dùng giấy thấm lau sạch các vùng chung quanh mẫu. Dùng đầu kim mũi giáo có

quấn gòn thấm cồn 900 để chùi sạch albumin dính xung quanh mẫu.

+ Tiếp theo chuyển lame sang các nồng độ cồn tăng dần là 900, 9905, n–butanol

trong khoảng 3–5 phút/lọ rồi chuyển sang hủ xylene để làm trong mẫu vật trong vòng 3

phút.

28

2.1.9. Cố định mẫu trong Baume Canada

Lau sạch xylene dính ở mặt dưới của lame, dùng giấy thấm lau xylene quanh mẫu

(tránh chạm vào mẫu). Nhỏ một giọt Baume Canada gần mẫu vật. Dùng lamelle đậy mẫu

bằng cách đặt lamelle nghiêng một góc 450 so với lame, dùng kim mũi giáo hạ lamelle

nhẹ nhàng và từ từ để tránh bọt khí len vào giữa lame và lamelle.

Sau khi dán Baume Canada, đặt yên mẫu trong 24–48 giờ ở nhiệt độ phòng để khô

xylene trong Baume Canada. Có thể dùng dao mổ cắt sát mép lamelle rồi dùng gòn tẩm

xylene lau sạch các vết Baume Canada dư xung quanh mép lame (nếu có).

Hình 13: Cố định mẫu trong Baume Canada

Dán nhãn tiêu bản, ghi rõ: Tên mẫu, ngày tháng năm làm tiêu bản.

Hình 14: Tiêu bản tuyến tụy chuột đồng cắt ngang

Tuy

ến t

ụy

chuộ

t đồ

ng

cắt

ngan

g

H&

E

06/0

4/20

09

29

3. Bảng tóm tắt quá trình thực hiện

GIAI ĐOẠN VẬT LIỆU SỬ DỤNG THỜI GIAN

Lấy mẫu Chuột, kéo, kẹp, thau nước, khay mổ, nước

máy 15 phút

Cố định mẫu Dung dịch Bouin 20 giờ

Rửa nước Vòi nước máy, chai bị đục đáy

Nước cất

2–3 giờ

20 phút

Khử nước

Cồn 700

Cồn 900

Cồn 9905

n–Butanol

2 giờ x 2lần

2 giờ x 2lần

2 giờ x 2lần

2 giờ x 2lần

Tẩm parafin

Xylen

Xylen:parafin (1:1)

Parafin nguyên chất lỏng

2 giờ x 2 lần

12 giờ

36 giờ

Đúc khuôn Khuôn giấy, kẹp, kim mũi giáo, đèn cồn,

parafin nóng chảy, hộp quẹt

Cắt mẫu

Máy cắt Microtome, lưỡi lam Gillete, hộp

giấy đựng mẫu, giấy trắng, kẹp, kim mũi

giáo, nước đá, khối gỗ gắn mẫu

Tải lát cắt lên lame

Dung dịch dán Albumin, nước ấm, kim mũi

giáo, kẹp, lame, ống hút nhựa, đèn 75W, tủ

sấy

Làm tan parafin Đèn cồn, xylene (3lọ) 3–5 phút/lọ x 3 lọ

Nhuộm

Hematoxyline

Cồn 9905

Cồn 900

Cồn 700

5phút

5phút

5phút

30

Nước cất

Hematoxyline

Nước máy

Nước cất

10phút

20 phút

10 phút

5 phút

Nhuộm Eosin Y

Cồn 700

Eosin Y

Cồn 800

Cồn 900

Cồn 9905

n–butanol

Xylen

Kim mũi giáo, gòn

5 phút

5phút

5 phút

5 phút

5 phút

5 phút

3 phút

Cố định bằng

Baume Canada

Baume Canada, lamelle, kim mũi giáo, tủ

sấy

Sau khi nhuộm

4. Các trở ngại thường gặp và biện pháp khắc phục

Trở ngại và biện pháp khắc phục khi đúc block (khối mẫu). (Bảng 1 phần phụ lục)

Trở ngại và biện pháp khắc phục khi cắt mẫu. (Bảng 2 phần phụ lục)

Trở ngại và biện pháp khắc phục khi tải mẫu lên lame. (Bảng 3 phần phụ lục)

Trở ngại và biện pháp khắc phục khi nhuộm mẫu. (Bảng 4 phần phụ lục)

31

PHẦN IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN

Qua quá trình thực hiện thí nghiệm trên đối tượng chuột đồng từ 150 gram đến 250

gram, chúng tôi đã làm được 50 tiêu bản hiển vi cố định với kết quả như sau:

1. Ưu và khuyết điểm

1.1. Ưu điểm

Lấy mẫu chính xác, đúng vị trí, không bị biến dạng.

Tiêu bản hiển vi trong, sạch và lát cắt thẳng mỏng, không bị tách lớp. Mẫu được khử

nước tốt có thể trữ được rất lâu.

Tiêu bản có màu tương phản, phân biệt rõ cấu trúc tế bào:

– Nhân có màu tím xanh (màu Hematoxyline).

– Tế bào chất có màu hồng nhạt (màu Eosin Y).

Phân biệt được tụy ngoại tiết, tụy nội tiết, các loại tế bào và các cấu trúc mô khác trong

tuyến tụy.

1.2. Tồn tại

Ở một số tiêu bản chưa thật sạch vì khâu vệ sinh albumin–glycerin xung quanh mẫu bị

hạn chế do mẫu dễ bị vỡ khi chạm phải.

2. Kỹ thuật

2.1. Mẫu hiển vi

2.1.1. Lấy mẫu

Muốn có một tiêu bản hiển vi đẹp, chính xác thì thao tác mổ tách lấy mẫu phải nhẹ

nhàng thể hiện ở tất cả các khâu: Giết chuột, giải phẫu, quan sát xác định vị trí tuyến tụy,

tách lấy tuyến tụy.

– Giết chuột: dìm chuột vào chậu nước (cho đến khi chuột vừa chết tiến hành mổ

ngay).

– Giải phẫu: thao tác mổ được trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu. Ta quan sát

được rõ hệ thống ống tiêu hoá bên trong xoang bụng chuột (hình 15).

32

Hình 15: Nội quan trong khoang bụng của chuột

– Quan sát, xác định vị trí tuyến tụy

Vị trí tuyến tụy được xác định

như hình: phía trên tiếp giáp dạ

dày, phía dưới tiếp giáp manh

tràng, bên trái tiếp giáp tá tràng và

bên phải tiếp giáp tỳ tạng. Tuyến

tụy hồng nhạt.

– Tách lấy tuyến tụy: Sau khi

xác định vị trí tuyến tụy, ta thực

hiện thao tác tách tuyến tụy của

chuột. Cắt màng liên kết giữa tụy

và các cơ quan khác: từ màng liên

kết tụy và tỳ tạng, tách tụy và dạ

dày, đến đoạn đầu ruột non và kết

thúc ở màng liên kết tụy và manh tràng. Tuyến tụy sau khi tách cố định ngay trong lọ

đựng Bouin.

Lưu ý: Tuyến tụy là một tuyến phân tán, khá dài gồm nhiều thuỳ nên rất khó phân biệt

các phần đầu, thân và đuôi tụy. Vì vậy, nên tách riêng phần đầu tuỵ với thân và đuôi tụy

sẽ chính xác hơn cho việc nghiên cứu cấu trúc mô cũng như thực hiện các khâu sau đó.

Hình 16: Tuyến tụy sau khi tách khỏi khoang bụng chuột

Tuyến Tụy

Mỡ

Tỳ Tạng

Dạ Dày

Tá Tràng

Manh Tràng

33

2.1.2. Cố định mẫu

Lúc cố định trong Bouin nên có động tác lắc nhẹ hay khuấy nhẹ để trộn dung dịch

nhằm làm cho mẫu tiếp xúc tuyến tụy tốt hơn.

Thể tích dung dịch phải lớn hơn 30–60 lần thể tích mẫu để dung dịch cố định ngấm

mẫu tốt và đều mẫu.

Thời gian cố định phải thích hợp:

– Nếu cố định quá lâu thì khi cắt mẫu sẽ bị giòn khó cắt. Lát cắt bị rạng nứt.

– Nếu thời gian cố định quá ngắn thì mẫu sẽ bị hoại tử, mẫu mềm khi cắt nên lát cắt

bị biến dạng, khi nhuộm thì mẫu bắt màu phẩm nhuộm chưa tốt.

Do đó để tìm ra thời gian cố định mẫu thích hợp, mẫu được cố định trong các khoảng

thời gian 12 giờ, 16giờ, 20 giờ và 24 giờ. Kết quả như sau:

Kết quả thực hiện thí nghiệm cố định mẫu qua 4 nghiệm thức được trình bày ở bảng 5

phần phụ lục.

Kết luận: Thời gian cố định mô tuyến tụy chuột thích hợp nhất ở 20 giờ.

2.1.3. Khử nước

Trước khi khử nước phải rửa sạch mẫu vật dưới vòi nước chảy trong khoảng 2–3 giờ

để giảm bớt màu vàng của Bouin, nếu không mẫu sẽ bắt màu nhuộm không tốt.

Trong quá trình khử nước, thể tích cồn trong từng lọ phải gấp hơn 10 lần thể tích mẫu

để dịch mô trong mẫu thoát ra không đủ làm loãng nồng độ cồn và để đảm bảo nồng độ

cồn, ở mỗi nồng độ nên có 2 lọ/ 1 nồng độ.

Nếu khử nước không tốt thì khi đúc khuôn mẫu bị bong ra khỏi khỏi khối paraffin.

Để khử nước một cách hiệu quả chúng tôi đã thực hiện các nghiệm thức sau:

Kết quả thực hiện thí nghiệm cố định mẫu qua 4 nghiệm thức được trình bày ở bảng 6

phần phụ lục.

Kết quả: Chúng tôi chọn nghiệm thức II để tiến hành khử nước.

2.1.4. Tẩm parafin

Parafin sử dụng là parafin nguyên chất được cho vào tủ sấy trước để parafin nóng

chảy. Parafin được chọn lựa trước về độ cứng (tức nhiệt độ nóng chảy).

34

Độ cứng của khối parafin phải được lựa chọn thích hợp vì nó có tính chất quyết định

trong khâu cắt lát:

– Nếu parafin quá cứng thì khó cắt, mẫu bị răng cưa, mẫu bị trầy xước.

– Nếu parafin quá mềm thì khó cắt, các lát cắt bị đùn lại, lát cắt bị nhăn nhúm không

tạo thành băng khi cắt.

– Độ cứng vừa phải của parafin kết hợp với với độ dày lát cắt thích hợp thì sẽ tạo điều

kiện thuận lợi cho việc cắt mẫu cũng như việc tạo ra một tiêu bản tốt.

Bên cạnh đó thời gian tẩm parafin cũng là yếu tố quyết định trong việc cắt mẫu:

– Nếu tẩm parafin quá lâu thì khi cắt mẫu sẽ bị giòn, dễ rách và bong ra khỏi lát

parafin.

– Nếu tẩm parafin quá nhanh thì parafin không kịp len lõi vào bên trong tuyến tụy

làm mẫu dễ bị biến dạng khi cắt.

Kết quả: Cuối cùng qua thời gian thử nghiệm chúng tôi chọn parafin nguyên chất với

nhiệt nóng chảy 600C và thời gian tẩm parafin là 16 giờ.

2.1.5. Đúc khuôn

Parafin đúc khuôn cũng phải là parafin nguyên chất và được chuẩn bị trước ở dạng

nóng chảy. Nếu parafin xấu thì sau khi đúc khuôn và trữ trong tủ lạnh thì mẫu sẽ bị vỡ ra,

khuôn không cắt lát được.

Khi cho parafin vào khuôn ở lớp đầu tiên phải rót nhẹ nhàng nếu không thì khuôn sẽ bị

bọt khí, parafin không dính chặt vào mẫu hoặc khó gọt khối mẫu.

Việc đúc khuôn được tiến hành gần nguồn nóng nhằm đảm bảo parafin luôn ở trạng

thái nóng chảy, tránh trường hợp mẫu và khuôn tách rời nhau ra.

Khi gắp mẫu tẩm ra khỏi lọ parafin phải đặt ngay vào khuôn có sẵn parafin đang se

đặc để tránh tình trạng mẫu bị đóng một lớp parafin bên ngoài làm khuôn và mẫu không

liên kết chặt chẽ với nhau.

Điều chỉnh vị trí của mẫu cho ngay ngắn bằng kim mũi giáo đã được hơ nóng, đợi cho

lớp parafin dưới hơi sệt lại thì nhẹ nhàng đổ thêm một lớp parafin nóng chảy nữa lên trên

ngay để tránh tình trạng khuôn bị tách làm 2 lớp, ngoài ra có thể dùng thêm biện pháp

dùng kim mũi giáo hơ nóng để làm nóng chảy parafin lớp dưới.

Để yên khuôn khoảng 6 giờ rồi trữ trong tủ lạnh để bảo quản.

35

2.1.6. Cắt mẫu

Thời gian cắt mẫu thích hợp nhất là vào lúc sáng sớm (6h–8h) hoặc lúc trời tối (20–

21h). Máy cắt để gần nguồn lạnh để tránh trường hợp mẫu bị nhăn, đùn lại, không dính

thành băng. Lưỡi dao cắt mẫu phải sắc, nếu không mẫu sẽ bị trầy, cuốn lại hay rời ra

thành từng mảnh.

Nếu cắt quá dày, tiêu bản sẽ gồm nhiều lớp tế bào, khi đó khó phân biệt được cấu trúc

mô học. Nếu cắt quá mỏng thì mẫu sẽ bị nhăn nhúm, cuốn lại, khi tải mẫu không thể làm

cho lát cắt thẳng ra.

Chúng tôi thực hiện lát cắt mỏng 8 mm

2.1.7. Tải mẫu lên lame

Cần các thao tác cẩn thận, nhẹ nhàng. Cần chuẩn bị các dụng cụ, vật liệu cần thiết và

nước ấm lý tưởng (400C). Nên thao tác gần nguồn nóng (tủ sấy, ấm điện).

Khi tráng Albumin glyceryl lên lame cần chú ý:

– Nếu tráng quá dày thì tiêu bản sẽ bị dơ, khó chùi sạch lớp albumin sau khi nhuộm

xong. Tiêu bản không trong, sạch.

– Nếu tráng quá mỏng thì lát cắt sẽ không dính vào lame, khi thao tác mẫu sẽ bị tách

rời khỏi lame.

Nhỏ một giọt Albumin glyceryl lên lame, dùng lamelle nghiêng một góc 45o với lame

tráng một lớp mỏng Albumin glyceryl lên lame.

Đầu kim mũi giáo đã tẩm nước ấm để lấy một lát cắt từ băng mẫu rồi tải lên lame sẽ

thực hiện dễ dàng hơn so với việc dùng một kim mũi giáo khô.

Giọt nước ấm nhỏ trên lame chỉ khoảng 400C, vì nếu quá nóng sẽ làm mẫu hư hoại

hoặc nếu nhiệt độ thấp quá thì không làm căng lát cắt ra được.

Cần điều chỉnh cho mẫu nằm ngay ngắn trên giọt nước ấm để sau khi dán xong thì

mẫu không bị nằm xéo, lệch, không đảm bảo mỹ quan.

Tráng Albumin cần lưu ý: sau khi tráng Albumin cần để lame trong tủ sấy ở nhiệt độ

600C đến khi nào thấy lớp Albumin khô hẳn mới tải mẫu.

36

2.1.8. Làm tan parafin

Khi được tẩm parafin, parafin sẽ len lõi vào tất cả các cấu trúc của mẫu do đó ta phải

thực hiện thao tác làm tan parafin trước khi nhuộm. Thao tác làm tan parafin trong lát cắt

trải qua các giai đoạn:

– Mỗi tiêu bản được hơ nhanh qua ngọn đèn cồn một lần để làm chảy sáp. Tránh hơ

lame quá lâu rồi đưa ngay vào lọ xylene khi đó sẽ làm nứt bể lame cũng như hơ nóng quá

lâu sẽ làm thay đổi cấu trúc mô của tuyến tụy.

– Chuyển tiêu bản qua lọ xylene ngâm có lắc nhẹ trong 3 phút để làm tan hẳn parafin

trong lát cắt.

2.1.9. Nhuộm Hematoxyline và Eosin

Khả năng bắt màu thuốc nhuộm cấu trúc mô tụy ở chuột có khối lượng khác nhau thì

không giống nhau. Vì vậy để xác định thời gian nhuộm hợp lý nên khảo sát đối tượng

cùng giới tính và cùng khối lượng.

Ngoài ra mẫu bắt màu tốt hay xấu phụ thuộc chủ yếu vào thời gian nhuộm, chất lượng

thuốc nhuộm và thời gian chín của thuốc nhuộm.

Trong suốt quá trình nhuộm cần phải tiến hành liên tục, vì mẫu bị khô cồn hay xylene

sẽ bị đen không quan sát được cấu trúc mô.

Sau mỗi lọ ngâm, lame cần được lau khô bằng giấy thấm (tránh chạm vào mẫu) rồi

mới ngâm tiếp qua dung dịch tiếp theo để tránh sự sai lệch nồng độ của các lọ ngâm mẫu.

Để đảm bảo cho tiêu bản bắt màu tương phản, rõ, phân biệt được cấu trúc mô chúng

tôi đã tiến hành thử nghiệm như sau:

Kết quả thực hiện nhuộm mẫu qua 4 nghiệm thức được trình bày ở bảng 7 phần phụ

lục.

Kết quả: do thời gian nhuộm cấu trúc mô tụy ở chuột có trọng lượng khác nhau thì

không giống nhau. Thời gian nhuộm mẫu thích hợp được chọn là:

– Đối với chuột có trọng lượng ³200 gram thời gian nhuộm là:

Nhuộm Hematoxylin: 20 phút Nhuộm Eosin: 5 phút.

– Đối với chuột có trọng lượng £150 gram thời gian nhuộm là:

Nhuộm Hematoxylin: 15 phút Nhuộm Eosin: 5 phút.

37

2.1.10. Khử nước

Khử nước trong cồn có nồng độ tăng dần đến cồn tuyệt đối nhằm đảm bảo cho mẫu đã

được khử nước hoàn toàn, tạo điều kiện tốt nhất cho mẫu tồn trữ được lâu sau khi đã gắn

mẫu trong Baume Canada.

Trong giai đoạn này, dùng đầu kim mũi giáo quấn gòn tẩm cồn 900 để chùi sạch các

vết thuốc nhuộm, các lớp Albumin dính bên ngoài mẫu ở trên lame.

2.1.11. Làm trong mẫu

Làm trong mẫu nhanh qua xylene (3–5 phút) để có thể quan sát được tốt dưới kính

hiển vi quang học.

2.1.12. Gắn mẫu

Thao tác gắn mẫu cần được tiến hành cẩn thận, nhẹ nhàng để tránh bọt khí như đã

miêu tả ở phần phương pháp nghiên cứu, lượng Baume Canada dùng phải vừa đủ, vì:

– Nếu dư, Baume Canada sẽ tràn ra bên ngoài lamelle, làm mất mỹ quan của mẫu, dễ

dính bụi bẩn và rất lâu khô. Khắc phục: dùng dao mổ gọt bỏ Baume Canada thừa bên

ngoài lamelle, dùng xylene lau lại cho sạch.

– Nếu thiếu, mẫu trong tiêu bản có thể bị tiếp xúc với không khí, mẫu trữ được không

lâu. Thêm vào đó, thiếu Baume Canada cũng làm mất thẩm mỹ tiêu bản.

Baume Canada có độ loãng vừa phải. Pha Baume Canada đặc–Xylene 55% là hợp lý.

Vì:

– Nếu Baume Canada quá đặc thì không thể đậy lamelle.

– Nếu Baume Canada quá loãng thì khi xylene bay hơi thì Baume Canada không trải

đều hết lamelle. Tiêu bản không thể trữ lâu.

Lưu ý: Nên pha Baume Canada một ngày trước khi sử dụng vì trong quá trình pha

loãng Baume Canada dễ tạo bọt khí.

38

3. Kết quả

3.1. Vị trí và hình thể bên ngoài

1: Dạ dày 2: Tá tràng 3: Ống tụy 4: Đầu tụy 5:Thân tụy 6: Đuôi tụy 7: Manh tràng 8: Tỳ tạng

Hình 17: Vị trí và hình thể bên ngoài tuyến tụy của chuột

3.1.1. Vị trí

Tuyến tụy chuột là một tuyến khá lớn, phân tán và khá dài ở đầu ruột non, liên hệ với

các cơ quan khác qua các màng liên kết mỏng. Tụy định vị ở giữa, phía trên là dạ dày,

phía dưới là manh tràng, bên trái là tá tràng và bên phải là tỳ tạng.

3.1.2. Hình dạng

Tuyến tụy của chuột là một tuyến phân tán thành nhiều thuỳ, có màu hồng nhạt, khá

mỏng, giống hình cây có nhiều nhánh. Thân cây là ống tụy chính (ống bài xuất lớn), động

mạch và tĩnh mạch chính, các nhánh là các ống bài xuất nhỏ, động mạch và tĩnh mạch

phụ, tận cùng là các tiểu thùy với các nang tuyến và xen kẻ các tiểu đảo Langerhans.

7

3

4

1

2

8

5

6

39

3.2. Cấu trúc vi thể của tuyến tụy

Cấu trúc mô học hiển vi của tuyến tụy chuột, qua quan sát thực tế tiêu bản đã phân biệt

được các tổ chức mô như: tụy ngoại tiết (các nang tuyến, hệ thống ống tụy), tụy nội tiết

(tế bào nội tiết như alfa, beta, delta,...) và phân bố mạch trong tụy.

Quan sát lát cắt tuyến tụy từ ngoài vào qua tiêu bản, ta quan sát được màng liên kết

mỏng bao quanh tụy, từ màng này hình thành nhiều vách chia tụy thành nhiều thuỳ. Mỗi

thuỳ lại được chia thành nhiều tiểu thùy nhờ vách liên kết gian tiểu thuỳ.

Vùng tế bào ở vùng rìa của tụy thường bắt màu kém hơn so với các vùng tế bào bên

trong. Vì vùng rìa là nơi tiếp xúc đầu tiên với các dung dịch có nồng độ khác nhau được

sử dụng trong quá trình làm tiêu bản. Sự chênh lệch nồng độ các chất đột ngột làm ảnh

hưởng đến cấu trúc bên trong tế bào, làm giảm sự bắt màu phẩm nhuộm của các tế bào ở

vùng này.

Hình 18: Lát cắt ngang thân tụy (x400)

Quan sát tổng thể cấu trúc mô qua lát cắt tuyến tụy chuột kết quả được ghi nhận như

sau:

– Tụy ngoại tiết: gồm nhiều nang tuyến (chiếm phần lớn diện tích) và các ống bài

xuất nhỏ nằm trong các tiểu thùy và các ống bài xuất lớn trong vách gian tiểu thùy.

– Tụy nội tiết: gồm nhiều tiểu đảo Langerhans cũng nằm trong các tiểu thùy, nằm rãi

rát trong đám tuyến nang có màu nhạt hơn, dễ dàng nhận thấy. Bên cạnh là hệ thống

mạch máu.

Vùng bắt màu kém

Màng liên kết

Vách liên kết

40

1: Nang tuyến tụy ngoại tiết 5: Tiểu đảo langerhans 2: Ống bài xuất trong tiểu thùy 6: Tĩnh mạch 3: Ống bài xuất gian tiểu thùy 7: Động mạch

4: Ống bài xuất lớn

Hình 19: Lát cắt ngang của đuôi tuyến tụy (x400)

3.3. Tụy ngoại tiết

Tụy ngoại tiết có cấu tạo kiểu chùm nho, gồm 2 phần: các nang tuyến và ống bài xuất.

Lát cắt ngang ta quan sát được các nang tuyến hình túi, và bên cạnh là mặt cắt ngang của

các ống bài xuất.

Hình 20: Động mạch chính của tụy (x1000)

Hình 21: Ống tụy chính (x1000)

1

7

4

5

3

4

6

3

2

41

Ta có thể phân biệt được ống tụy với mạch máu nhờ cấu trúc mô học khác nhau. Ống

tụy được lợp bằng các tế bào biểu mô khối vuông hay trụ vuông. Mạch máu được lợp

bằng biểu mô lát đơn rất mỏng và dẹp.

1: Nang tuyến 4: Ống bài xuất gian tiểu thùy 2: Ống trung gian 5: Ống bài xuất lớn 3:Ống bài xuất trong tiểu thùy

Hình 22: Tụy ngoại tiết (x600)

3.3.1. Những nang tuyến

Nang tuyến điển hình có hình túi, ta cũng có thể quan sát được các nang tuyến hình

tam giác, hình bầu dục,... tùy thuộc vào vị trí lát cắt. Lát cắt ngang ta thường quan sát

được nang tuyến gồm khoảng 7 đến 13 tế bào nang tuyến và một hoặc vài tế bào trung

tâm.

– Tế bào nang (Tế bào tụy ngoại tiết): hình tháp, phân biệt rất rõ hai phần: nhân và tế

bào chất.

+ Nhân: hình cầu, lệch về phía cực đáy của tế bào, ưa kiềm bắt màu hematoxyline,

màu xanh tím đậm. Phân biệt được màng nhân, nhân chất và nhân con.

1

4

2

3

5

4

3

42

+ Tế bào chất gồm hai vùng: Vùng cực ngọn có nhiều hạt chế tiết mang các enzim

tiêu hóa (phản ứng kiềm), ưa acid, bắt màu hồng nhạt của Eosin.Vùng cực đáy chứa

nhiều lưới nội bào ưa baz, bắt màu tím xanh của hematoxyline.

Các tế bào nang lân cận liên kết với nhau nhờ phức hợp liên kết ngăn không cho enzim

lọt vào khoảng gian bào, không bắt màu thuốc nhuộm.

Màng đáy bao bọc nang tuyến có mạch máu và dây thần kinh.

+ Tế bào trung tâm nang tuyến (tế bào ống): tế bào kéo dày, lát cắt ngang ta thường

quan sát nhân hình bầu dục, không quan sát được màng tế bào. Các tế bào này vừa thành

ống trung gian (ống xuất của nang tuyến) vừa nằm sâu trong lòng nang tuyến (nằm ở cực

ngọn của tế bào nang).

A: Lát cắt ngang nang tuyến B: Lát cắt dọc nang tuyến 1: Tế bào nang 4: Màng đáy 2: Màng liên kết giữa 5: Tế bào ống trung gian 3: Tế bào trung tâm tuyến nang 6: Ống trung gian

Hình 23: Nang tuyến tụy ngoại tiết (x600)

3.3.2. Những ống bài xuất

Quan sát tiêu bản ta có thể nhận dạng toàn bộ hệ thống ống bài xuất. Phân biệt các

loại ống bài xuất dựa trên: vị trí, đường kính và cấu trúc thành của các ống bài xuất.

Gồm: 4 loại ống bài xuất:

– Ống bài xuất lớn: nằm giữa lát cắt, thường ở màng liên kết các tùy của tụy, lòng ống

có kích thước lớn nhất. Thành ống cấu tạo hai thành phần chính: tế bào biểu mô và màng

liên kết bao quanh.

B

1

16

1

2

3

4

A

43

+ Tế bào biểu mô: thành ống lợp bằng biểu mô trụ đơn, thường gồm hai loại tế bào:

tế bào mâm khía có nhân hình bầu dục và tế bào đài có nhân dẹt, tế bào chất gần nhân ưa

baz, bắt màu hematoxyline đậm là tế bào tiết dịch nhày. Khó phân biệt khoảng gian bào.

Nhân của hai loại tế bào này đều bắt màu tím đậm, khó phân biệt nhân chất và nhân con.

+ Màng liên kết bao quanh lớp tế bào thành ống gọi là màng đáy, bên ngoài màng

đáy là các sợi cơ trơn có tính chất hướng vòng.

1: Tế bào hình đài 2: Tế bào mâm khía 3: Màng liên kết

Hình 24: Ống bài xuất lớn (x1000)

– Ống bài xuất gian tiểu thùy: kích

thước nhỏ hơn so với ống bài xuất lớn,

định vị ở vách liên kết gian tiểu thùy.

Thành ống lợp bởi một lớp tế bào biểu

mô khối hay trụ vuông. Mô liên kết

bao quanh dày, lòng ống nhỏ. Ống bài

xuất gian tiểu thùy đổ vào ống bài xuất

lớn.

Hình 25: Ống bài xuất gian tiểu thùy (x1000)

3

2

1

44

– Ống bài xuất trong tiểu thùy: kích

thước nhỏ. Thành ống lợp bằng các tế

bào biểu mô khối vuông hay trụ. Các tế

bào này có tính chế tiết. Lòng ống đều,

tròn.

– Ống trung gian: ống rất nhỏ,

ngắn. Thành ống là tế bào trung tâm

nang tuyến.

3.4. Tụy nội tiết (Tiểu đảo Langerhans)

Phần ngoại tiết của tụy được đại diện bởi các tiểu đảo Langerhans, nằm rải rát giữa các

nang tuyến. Tiểu đảo có hình cầu, có bao liên kết mỏng, bắt màu nhạt hơn so với nang

tuyến nên rất dễ nhận dạng. Vùng tiểu đảo tuyến tuỵ của chuột cái thường bắt màu Eosin

đậm hơn so với chuột đực. (Khảo sát trên 6 con chuột thuộc hai giới khác nhau).

1: Tế bào alfa 2: Tế bào beta 3: Tế bào delta 4: Mau mạch

Hình 27: Tiểu đảo tụy và các nang tuyến (x600)

Hình 26: Ống bài xuất trong tiểu thuỳ (x1000)

3

1

2

4

45

Thành phần cấu tạo của tiểu đảo được quan sát gồm: các tế bào nội tiết, mau mạch có

lỗ thủng, sợi liên kết bao quanh tiểu đảo.

Trong tiêu bản chúng tôi phân biệt được 3 loại tế bào nội tiết chủ yếu dựa vào sự bắt

màu của nhân và tế bào chất.

– Tế bào anfa: tế bào có nhân to nhất, định vị chủ yếu ở vùng rìa của tiểu đảo chiếm

khoảng 25% trong tiểu đảo. Nhân ít chất nhiễm sắc, bắt màu sáng, màu xanh tím nhạt, tế

bào chất bắt màu hồng đậm của Eosin do tế bào chất có các hạt chế tiết chứa glucagon.

– Tế bào beta: kích thước tương đương tế bào anfa. Nhân bắt màu đậm hơn so với tế

bào anfa. Chiếm phần lớn trong tiểu đảo, tập trung nhiều ở trung tâm của tiểu đảo. Tế bào

chất có hạt chế tiết chứa insulin.

1: Tế bào alfa 5: Mau mạch 2: Tế bào beta 6: Lớp sợi võng 3: Tế bào delta 7: Tế bào trung gian 4: Tế bào hình sao (tế bào nang–tiểu đảo)

Hình 28: Tiểu đảo Langerhans của chuột cái 200gram đang mang thai (x600)

4

12

5

3

6

46

– Tế bào delta: rất ít trong tiểu đảo, thường phân bố rải rác trong tiểu đảo. Loại tế bào

này có dạng hình sao hoặc hình quả lê, nhân hình bầu dục bắt màu nhạt hematoxyline, tế

bào chất có nhiều hạt chế tiết chứa somatostatin bắt màu Eosin đậm.

– Tế bào hình sao: quan sát được ở tụy của chuột cái mang thai. Tế bào hình sao màu

đỏ nhạt, gần như màu của mạch máu. Nhân tế bào có màu đỏ đậm rất khó nhận ra trong

tiểu đảo, có thể là tế bào gốc tụy, tế bào sinh ra các tế bào nội tiết trong tiểu đảo tụy.

Bên trong tiểu đảo có rất nhiều mạch máu. Bên ngoài tiểu đảo được bao bọc bởi màng

mỏng, cấu tạo bởi sợi võng.

Khoảng giữa nang tuyến và tiểu đảo là tế bào trung gian, có hạt chế tiết trong bào

tương và tiết vào máu.

Bên cạnh các cấu trúc mô bình thường ta còn quan sát rất nhiều cấu trúc mô bệnh như

sau: phì đại tụy nội tiết, phá hủy cấu trúc tụy ngoại tiết… Trong quá trình làm thí nghiệm

thường gặp cấu trúc mô bệnh: 10 tuyến tụy khảo sát có khoảng 4 tuyến tụy có cấu trúc

mô không bình thường.

Hình 29: Cấu trúc mô không bình thường của tụy chuột bệnh

47

PHẦN V: KẾT LUẬN–KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Qua thử nghiệm bằng phương pháp giải phẫu và nhuộm kép bằng Hematoxyline và

Eosin, quy trình thực hiện “Thực hiện tiêu bản hiển vi cố định mô tuyến tụy ở chuột đồng

(Rattus argentivente)” được xác định và kết quả thực hiện được: 150 tiêu bản trong đó

chọn ra được 50 tiêu bản đạt yêu cầu nhất về nội dung lẫn hình thức.

Tiêu bản đáp ứng yêu cầu quan sát cấu trúc mô học, phân biệt được các tổ chức mô

như: tụy ngoại tiết (các nang tuyến, hệ thống ống tụy), tụy nội tiết (tế bào nội tiết như

alfa, beta, delta,...) và phân bố mạch trong tụy.

2. Kiến nghị

Do kinh phí hổ trợ đề tài và thời gian có hạn nên đề tài chỉ thực hiện đối với mẫu chuột

được chọn ngẫu nhiên, chúng tôi có vài đề nghị như sau nếu đề tài được tiếp tục nghiên

cứu:

– Nên chủ động nuôi chuột trong phòng thí nghiệm

+ Để lấy mẫu tuyến tụy ở cùng một độ tuổi, giới tính và cùng trọng lượng, điều này

giúp cho các tiêu bản có độ bắt màu phẩm nhuộm đồng đều và có thể so sánh sự khác

nhau về cấu trúc mô học.

+ Đồng thời có thể gây cho chuột bị bệnh tiểu đường dễ dàng hơn trong việc

nghiên cứu cấu trúc mô bệnh. Qua nghiên cứu tôi nhận thấy có rất nhiều cấu trúc mô

bệnh ở tụy chuột đồng.

– Đề tài nghiên cứu tiếp theo có thể nghiên cứu sâu hơn về những vấn đề này.

i

PHỤ LỤC

1. PHỤC LỤC HÓA CHẤT VÀ CÁCH PHA

1.1. Dung dịch Bouin:

Chuẩn bị:

– Acid piric : 1.126g.

– Nước cất : 75ml.

– Formaldehyde 40% : 25ml.

– Acid acetic : 5ml.

Tiến hành:

Hòa tan acid piric vào nước cất tạo dung dịch Bouin bão hòa, sau đó đổ từ từ

formaldehyde và acid acetic vào.

1.2. Dung dịch hematoxyline

Chuẩn bị:

– Nước cất : 100 ml.

– Glycerin : 100 ml.

– Alcohol : 100 ml.

– Amonium alumsulfat : 3g.

– Hematoxyline : 2g.

– Glacial acetic acid : 10 ml.

Tiến hành:

Hòa tan hematoxyline trong alcohol và amonium alumsulfate trong nước cất. Trộn

hai dung dịch lại. Sau đó thiêm cùng lúc glycerin và methanol vào. Để chín từ 6 - 8 tuần.

Bảo quản trong chai màu sậm.

1.3. Eosin Y

Chẩn bị:

– Eosin Y : 1g.

– Alcohol 70% : 1000 ml.

– Glacial acetic acid : 5 ml.

ii

Tiến hành:

Hòa tan Eosin Y trong alcohol 70% đậy kính tránh bay hơi. Khi sử dụng nhỏ vào 2-3

giọt acetic acid.

1.4 Albumin:

Chuẩn bị:

– Lòng trắng trứng : 50ml.

– glycerin : 50ml.

– Phenol : 5ml.

Tiến hành:

Trộn lòng trắng trứng và glycerin lại với nhau, đánh cho nổi bọt, lọc bỏ bọt sau đó

thêm vài giọt phenol, trữ lạnh, khi sử dụng pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:20.

iii

2. PHỤ LỤC BẢNG

Bảng 1: Trở ngại và biện pháp khắc phục khi đúc khuôn

BIẾN CỐ NGUYÊN NHÂN SỬA CHỮA

Khối block dễ vỡ,

có nhiều hạt, nhiều

đốm trắng

Parafin xấu, bẩn. Thay parafin mới,

nguyên chất.

Mẫu tách rời khỏi

khối parafin, mẫu

có thể bị lúc lắc

trong khối parafin

Parafin quá nguội khi đúc,

parafin ngấm không đều bên trong

khối mẫu.

Đúc lại, tăng thời gian

ngâm mẫu trong parafin ở

nhiệt độ thích hợp, lắc

mẫu thường xuyên khi

ngâm.

Sau vài tuần, khối

mẫu đúc bị cong lại

rạn nứt, khó cắt, tổ

chức mô bị xơ

Khử nước chưa tốt. Làm lại từ khâu khử

nước: tăng thời gian khử

nước bằng cách ngâm mẫu

trong cồn tuyệt đối.

iv

Bảng 2: Trở ngại và biện pháp khắc phục khi cắt mẫu

BIẾN CỐ NGUYÊN NHÂN SỬA CHỮA

Mẫu bị cong về

một bên

- Hai cạnh trên và dưới của khối

mẫu hình thang không song song.

- Lưỡi dao một bên không sắc bén

(có thể là bên uốn cong đã bị cắt

rồi).

- Một trong 2 cạnh bị nóng hơn

cạnh kia.

- Gọt mẫu lại.

- Thử cắt ở một vị trí khác

trên dao.

- Làm cho cả khối mẫu

lạnh. Tránh xa các đèn, lửa

(đèn cồn).

Các lát cắt lúc dày

lúc mỏng hay lát

mỏng bị nhăn lại

- Các đinh ốc cố định chưa được

xiết chặt.

- Dao không sắc hoặc bị mẻ.

- Xiết chặt các đinh ốc

- Thay dao hoặc thử một vị

trí khác trên dao.

Mẫu tách rời khỏi

khối parafin khi cắt

lát

- Nhiệt độ tẩm parafin quá cao,

mẫu bị cứng, giòn.

- Chưa rút hết nước trong mẫu.

- Mẫu chưa ngấm đều parafin.

- Giảm nhiệt độ tẩm

Parafin xuống, tăng thời

gian tẩm.

- Khử nước lại từ cồn 900,

cồn tuyệt đối.

- Tăng thời gian tẩm

parafin.

Parafin bị chẻ làm

đôi ở chỗ có mẫu

- Dao bị mẻ hoặc bị bẩn. - Thay dao khác hoặc thử

một vị trí khác trên dao.

Mặt cắt bị xước

- Lưỡi lam có chỗ bị mẻ hoặc lưỡi

lam không còn bén.

- Khối mẫu có chỗ quá cứng hoặc

có những hạt bụi cát.

- Thử một vị trí khác trên

lưỡi lam hoặc thay lưỡi

lam khác.

- Đúc khuôn lại bằng

parafin nguyên chất.

Lát cắt bị co rúm, - Lát cắt quá mỏng. - Cắt dày hơn.

v

nhăn nheo không

thành băng

- Nhiệt độ phòng cao.

- Độ nghiêng của bàn để dao chưa

hợp lý.

- Để máy cắt gần nguồn

lạnh.

- Điều chỉnh lại độ

nghiêng bàn để dao.

Lát cắt không

thành băng mà rời

ra và bị cuốn lại

- Cắt quá dày.

- Parafin quá cứng hay nhiệt độ

phòng quá thấp.

- Cắt mỏng hơn.

- Thay parafin khác mềm

hơn hoặc tăng nhiệt độ

phòng (có thể cắt vào buổi

trưa).

Lát cắt dính hết vào

dao

- Parafin quá mềm.

- Nhiệt độ phòng quá cao.

- Đúc lại với parafin cứng

hơn.

- Để máy cắt gần nguồn

lạnh (có thể cắt vào buối

sớm hoặc tối).

Cát mảnh cắt bị các

vật kim khí hút,

khó thao tác

-Các mảnh cắt bị tích điện. - Làm ấm bằng cách làm

ấm quanh nơi cắt, hoặc

ngừng cắt một thời gian.

vi

Bảng 3: Trở ngại và biện pháp khắc phục khi tải mẫu lên lame

BIẾN CỐ NGUYÊN NHÂN SỬA CHỮA

Mẫu bị nhăn sau

khi sấy dán

Lát cắt bị nhăn và khi tải mẫu lên

lame nước tải không đủ ấm.

Dùng nước ấm để tải

mẫu lên lame.

Mẫu không dính

vào lame

- Albumin không tốt, biến tính.

- Albumin quá loãng.

- Thời gian để mẫu tải dưới đèn

tròn 75w chưa đủ.

- Thay Albumin.

- Pha Albumin đậm đặc

hơn.

- Tăng thời gian lên cho

mẫu dính chặt hơn.

Lát cắt bị gấp nếp - Lát cắt bị vặn, thao tác tải mẫu

không cẩn thận.

- Cận thận lúc tải mẫu,

sao cho mẫu tải đều trên

giọt nước ấm.

vii

Bảng 4: Trở ngại và biện pháp khắc phục khi nhuộm mẫu

BIẾN CỐ NGUYÊN NHÂN SỬA CHỮA

Mẫu không bắt

màu Eosin Y

Thời gian nhuộm Hematoyline

quá lâu.

Giảm thời gian nhuộm

Hematoyline.

Mẫu sậm màu

Eosin Y

Thời gian nhộm Eosin Y quá lâu.

Giảm thời gian nhuộm

xuống.

Mẫu không phân

biệt rõ được các

vùng

Thời gian nhuộm H&E chưa cân

đối.

Điều chỉnh thời gian

nhuộm Hematoxyline và

Eosin cho cân đối.

Tiêu bản bị nhiễm

bẩn

Thuốc nhuộm bị cặn hoặc các lọ

cồn, xylene bị cặn.

Lọc thuốc nhuộm, thay

các lọ hoá chất.

viii

Bảng 5: Kết quả thực hiện thí nghiệm cố định mẫu

Chất cố định Thời gian Kết quả

Bouin 12 giờ Mẫu mềm, khó cắt, khi cắt mẫu bị biến dạng. Khi

nhuộm và quan sát thì thấy mẫu bắt màu phẩm nhuộm

chưa tốt, các tế bào bị nén lại, không quan sát rõ các

tế bào.

Bouin 16 giờ Mẫu tương đối cứng nhưng lát cắt chưa mỏng theo ý

muốn và ăn màu phẩm nhuộm không đều, có những

vùng bị hoại tử.

Bouin 20 giờ Mẫu đủ cứng, dễ cắt. Mẫu ăn màu tốt, rõ đẹp.

Bouin 24 giờ Mẫu giòn nên bị rạng nứt khi cắt, khó cắt.

ix

Bảng 6: Kết quả thực hiện khử nước mẫu theo các nghiệm thức

Nghiệm

thức Vật liệu Thời gian Kết quả

I

Cồn 700

Cồn 900

Cồn tuyệt đối

2 giờ x 1 lần

2 giờ x 1 lần

2 giờ x 1 lần

- Sau khi đúc khuôn thì mẫu tuyến tụy

bị tách khỏi khuôn do khử nước

không tốt.

- Lát cắt: Mẫu bị bong ra khỏi khối

parafin.

II

Cồn 700

Cồn 900

Cồn tuyệt đối

n-Butanol

2giờ/lọ x 2lọ

2giờ/lọ x 2lọ

2giờ/lọ x 2lọ

2giờ/lọ x 2 lọ

- Khối mẫu bình thường sau khi đúc.

- Các lát cắt tốt.

- Mẫu ăn màu tốt.

x

Bảng 7: Kết quả thực hiện nhuộm mẫu theo các nghiệm thức.

Vật liệu Thời gian Kết quả

Hematoxylin (1:4)

Eosin Y

5 phút

5 phút

Bắt màu Eosin nhưng màu Hematoxylin chưa rõ

=> Mẫu không tương phản.

Hematoxylin (1:4)

Eosin Y

15phút

10phút

Mẫu ăn màu Hematoxylin và Eosin nhưng vẫn

không tương phản nhân và tế bào chất, chưa phân

biệt được các tế bào tụy nội của tuyến tụy.

Hematoxylin (1:4)

Eosin Y

15phút

5phút

Mẫu ăn màu Hematoxylin và Eosin, tương phản

nhân và tế bào chất nhưng không phân biệt rõ

được các tế bào trong tụy nội.

Hematoxylin (1:4)

Eosin Y

20phút

5phút

Mẫu ăn màu Hematoxylin và Eosin tốt, rõ đẹp,

tương phản nhân và tế bào chất. Phân biệt rõ các

cấu trúc mô, các tế bào bắt màu tốt, phân biệt

được tụy ngoại và tụy nội và các loại tế bào trong

tụy nội.

xi

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Phạm Phan Địch và ctv, 2002, Mô học, Nxb Y học, Hà Nội.

2. Garter-Jame Hiatt, 2001, Color textbook of histology, Nxb The C.V.Mosby

combany.

3. Gerrit Bevelander – Judith A.Ramaley, 1979, Essentials of histology, Nxb The

C.V.Mosby combany.

4. Dương Thị Huỳnh Hoa, 2003, Giải phẫu người, ĐH Cần Thơ.

5. Vũ Công Hòe, 1976, Kỹ thuật hiển vi học thông thường, Nxb Y học, Hà Nội.

6. Trương Đình Kiệt, 1994, Mô học, Nxb ĐH Y Dược TPHCM.

7. Nguyễn Quang Mai, 2001, Sinh lý động vật và người, Nxb Khoa Học Hà Nội.

8. Huỳnh Văn Miền, 2005, Thực hiện tiêu bản hiển vi cố định tủy sống thỏ

(Oryctolagus cuniculus), Luận văn tốt nghiệp Đại học Cần Thơ.

9. Paulo Alexandre Abrahamsohn, 2007, Basic histology: Text & atlas, The

McGraw-Hill Companies.

10. Peter Gray, 1969, Handbook of Microtechnique, Nxb Mc Graw-Hill.

11. Nguyễn Trọng Hồng Phúc, 2005, Luận văn tốt nghiệp, ĐH Cần Thơ.

12. Nguyễn Quang Quyền, 2004, Giản yếu giải phẫu người, Nxb ĐH Y Dược

TPHCM.

13. Nguyễn Hữu Thanh và nhiều tác giả, 2002, Bài giảng hệ tiêu hoá. ĐH Cần Thơ.

14. Trần Thanh Tòng, 1998, Động vật có xương sống, Tủ sách ĐH Khoa Học Tự

Nhiên.

WEBSITE

15. Dr. Douglas Cooper, 1998, Glands associated with the digestive tract: liver, pancreas, and salivary gland, http://www.sacs.ucsf.edu/home/cooper/Ant118/GI-Gland/pancreas/pancreas-acinus.