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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E MODULADORA DO
ÓLEO ESSENCIAL DE ORIGANUM VULGARE EM LINHAGENS
RESISTENTES DE STAPHILOCOCCUS AUREUS.
ISIS CAROLINE DA SILVA CIRINO
ORIENTADOR: JOSÉ PINTO DE SIQUEIRA JÚNIOR
JOÃO PESSOA – 2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR
COORDENAÇÃO DO CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
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COORDENAÇÃO DO CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E MODULADORA DO ÓLEO
ESSENCIAL DE ORIGANUM VULGARE EM LINHAGENS RESISTENTES DE
STAPHILOCOCCUS AUREUS.
ISIS CAROLINE DA SILVA CIRINO
ORIENTADOR: JOSÉ PINTO DE SIQUEIRA JÚNIOR
Monografia apresentada à Coordenação
do curso de Ciências Biológicas do
Centro de Ciências Exatas e da Natureza
da Universidade Federal da Paraíba
como requisito parcial à obtenção do
grau de BACHAREL EM CIÊNCIAS
BIOLÓGICAS.
João Pessoa - 2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR
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ISIS CAROLINE DA SILVA CIRINO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E MODULADORA DO ÓLEO
ESSENCIAL DE ORIGANUM VULGARE EM LINHAGENS RESISTENTES DE
STAPHILOCOCCUS AUREUS.
MONOGRAFIA APROVADA EM __/__/___.
Banca Examinadora
__________________________________________
Prof. Dr. José Pinto de Siqueira Júnior
Orientador
__________________________________________
Profa. Dr.a Hilzeth de Luna Freire Pessôa
Examinador
__________________________________________
Profa. M.Sc Cybelle Pereira de Oliveira
Examinador
__________________________________________
Profa. M.Sc Vivyanne dos Santos Falcão Silva
Examinador
__________________________________________
Prof. M.Sc Vicente Carlos de Oliveira Costa
Examinador
4
DEDICATÓRIA
Dedico estas linhas, tão tortuosamente
escritas, a todas as pessoas que amo e que
fazem parte da minha vida, especialmente
aos meus pais sem os quais eu nada seria...
5
AGRADECIMENTOS
A Deus, aos meus pais e às minhas irmãs, por estarem sempre presentes em minha vida.
Ao Professor José Pinto de Siqueira Júnior, pela oportunidade de aprendizado, paciência
e dedicação durante toda a trajetória da construção deste projeto.
Aos amigos do LGM e agregados, em especial, Vivy, Sú, Rapha, Antony e Guga pelo
carinho, amizade e companheirismo dentro e fora do laboratório.
A Seu Bosco e Dona Severina pelo apoio na realização dos experimentos e pela
companhia no café da manhã de todos os dias.
À “Melhor Turma de Todos os Tempos da última Semana” pelos momentos
maravilhosos vividos durante os anos de graduação.
Às minhas queridas amigas Ana, Clara, Cláudia, Deby, Gi, Helô e Lia pela amizade e
por aguentarem toda minha dramaticidade.
Aos meus amigos João Neto e Vlad pelo carinho, cuidado, amizade e paciência para
sobreviver às minhas crises.
Aos companheiros de mestrado Derek, Rachel e Layanne pela ajuda durante a
elaboração deste projeto.
Ao CNPq pelo incentivo financeiro.
E por fim, a todos aqueles que de forma direta ou indireta, contribuíram para a
realização deste trabalho.
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RESUMO
A resistência bacteriana a drogas pode ser ocasionada por diferentes mecanismos.
Dentre esses, podemos destacar as chamadas Bombas de efluxo as quais são partes
integrantes da membrana plasmática. Na tentativa de encontrar uma solução para esse
problema, os produtos de origem vegetal (extratos, óleos essenciais e fitoconstituintes)
surgem como uma rica fonte de pesquisa na busca de potenciais “moduladores da
resistência à droga”, ou seja, drogas que aumentam a atividade de certos antibióticos ou
mesmo revertem à resistência bacteriana. Entretanto, poucos trabalhos relatam o efeito
potencializador dos óleos essenciais quando combinados com drogas antimicrobianas
clássicas; mais escassos ainda são trabalhos avaliando os mesmos como moduladores de
resistência a drogas por inibição de bombas de efluxo. Neste trabalho, avaliamos como
modificadores da atividade antibiótica em linhagens de Staphylococcus aureus -
portadoras das bombas de efluxo - o óleo essencial de Origanum vulgare (OEOV), seu
constituinte majoritário, o Carvacrol, e o isômero deste último, o Timol. Como
resultado, observou-se que os produtos naturais avaliados apresentaram uma
significativa atividade antibacteriana e podem atuar como modificadores da atividade
antibiótica ao agirem como inibidores de bomba de efluxo na linhagem IS-58, ao
reduzirem a CIM da Tetraciclina em 4 vezes (64μg/mL para 16μg/mL) quando em
combinação com OEOV e em 2 vezes (64μg/mL para 32 μg/mL) quando combinados
com o Carvacrol e Timol. Não foi observada inibição e/ou redução da CIM ao serem
utilizadas a Norfloxacina e Eritromicina. Os resultados indicam que produtos naturais
de origem vegetal são, de fato, potenciais adjuvantes de antibióticos.
Palavras-chave: resistência bacteriana; Staphylococcus aureus; produtos naturais.
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ABSTRACT
The bacterial resistance to drugs can be developed by different mechanism. Among
these mechanisms, there are efflux bombs which are part of plasmatic membrane. To
find a solution to this problem, products from plants (extracts, essential oils and
phytochemicals) arises as a rich research source for potential modulators of drugs
resistance, that is, drugs that increase antibiotics activity or even change bacterial
resistance. However, few works show the potentiating effect of essential oils when they
are combined with classic antimicrobial drugs. Still scarcer are the drugs modulators by
inhibition of efflux bomb. In this work we evaluated modifiers of antibiotic activity in
Staphylococcus aureus lineage which contains efflux bomb, essential oil from
Origanum vulgare (OEOV), its main constituent Carvacrol e its isomer Tymol. As
result, we observed that natural products evaluated showed significant antibacterial
activity and that they can be modifiers of antibiotic activity, acting as inhibitors of
efflux bomb in IS-58 lineage, reducing Tetraciclin CIM four times (64μg/mL to
16μg/mL) when it is combined with OEOV, and reducing two times (64μg/mL para 32
μg/mL) when Carvacrol and Tymol are together. Inhibition and/or reduction of CIM was
not observed to Norfloxacin and Eritromicin. The results showed that natural products
from plants are, in fact, potential adjuvant of antibiotics.
Key-words: Bacterial resistance, Staphylococcus aureus, natural products.
8
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO.................................................................................................. 9
1. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 11
1.1 STAPHYLOCOCCUS AUREUS............................................................. 11
1.2 A UTILIZAÇÃO DOS ANTIBIÓTICOS E A PROBLEMÁTICA DA
RESISTÊNCIA BACTERIANA..............................................................
11
1.3 BOMBA DE FLUXO................................................................................ 14
1.4 AGENTES MODIFICANTES DE ATIVIDADE ANTIBIÓTICA....... 16
1.5 PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL.................................................. 17
2.5.1 ORIGANUM VULGARE 18
2. OBJETIVO......................................................................................................... 19
2.1 GERAL...................................................................................................... 19
2.2 ESPECÍFICOS.......................................................................................... 19
3. METODOLOGIA.............................................................................................. 20
3.1 LINHAGENS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS................................ 20
3.2 ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO, CARVACROL E TIMOL........ 20
3.3 ANTIBIÓTICOS....................................................................................... 20
3.4
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA
MÍNIMA (CIM) DO ÓLEO ESSENCIAL DE ORIGANUM
VULGARE, CAVACROL E TIMOL......................................................
21
3.5
DETERMINAÇÃO DAS CIM DOS ANTIBIÓTICOS E NA
PRESENÇA DO ÓLEO ESSENCIAL DE ORIGANUM VULGARE,
CAVACROL E TIMOL
21
4. RESULTADOS E DISCUSÔES........................................................................ 22
5. CONCLUSÃO.................................................................................................. 24
REFERÊNCIAS 25
9
INTRODUÇÃO
A introdução dos antibióticos para quimioterapia das infecções bacterianas foi
uma das mais importantes realizações da medicina nos últimos 60 anos. Entretanto, o
aparecimento da resistência bacteriana minou a utilidade terapêutica dos agentes
existentes, criando a necessidade, cada vez maior, da descoberta de novas drogas
antibacterianas (TAVARES, 2000). Para tanto, diversas estratégias emergiram, dentre
elas o aperfeiçoamento de antibióticos existentes por manipulação química e a procura
por novos alvos de drogas.
Uma estratégia alternativa seria um melhor entendimento do modo de ação dos
antibióticos já existentes. Assim, vias bioquímicas ou processos inibidos por antibióticos
já em uso clínico podem, apesar de tudo, conter funções chaves que representam alvos
ainda não explorados para a descoberta de novas drogas.
Uma das soluções para o problema da resistência envolve o desenvolvimento de
análogos aos antibióticos existentes, entretanto, que não sofram ação enzimática, não
reconheçam a bomba de efluxo e nem se liguem ao alvo modificado presente na bactéria
resistente. Essa abordagem clássica em muito contribuiu para contornar o problema da
resistência. No entanto, os resultados muitas vezes tiveram vida curta, já que novas
variantes bacterianas surgiram com mecanismos de resistência que faziam frente aos
novos análogos.
O importante, então, é que as futuras estratégias de pesquisa ultrapassem o
antigo paradigma da “manipulação sintética das classes estruturais já existentes”. A
prioridade deveria ser a identificação de novas estruturas que teriam, ipso facto,
diferentes modos de ação, diminuindo assim a chance de resistência cruzada (CHOPRA
et al., 2002; MCDEVITT, et al., 2002). De qualquer forma, meros antibióticos (stricto
sensu) já não são mais suficientes para conter o fardo das doenças infecciosas
existentes. O conceito de antimicrobiano deve ser expandido (COURVALIN e DAVIES,
2003; PROJAN, 2003).
Dentro dessa perspectiva, estão sendo consideradas abordagens válidas as
pesquisas com as - assim chamadas - “drogas não-antibióticas”, as quais apresentam
alguma influência na fisiologia e na viabilidade de micro-organismos; influência essa
que pode se revelar pela atividade do antibiótico, pela modificação da atividade
antimicrobiana do antibiótico e pela atividade na fisiologia e na patogenicidade do
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micro-organismo. Incluem-se entre os não-antibióticos: neurolépticos tricíclicos,
antidepressivos, anti-inflamatórios não esteróides, agentes mucolíticos, bloqueadores de
canal de cálcio, inibidores de bomba de próton (MUÑOZ-BELINDO et. al., 2000 e ref.
cit.; AMARAL e KRISTIANSEN, 2000; GUNICS et al., 2000; DASTIDAR et al.,
2000; AMARAL et al., 2000). Pela importância dos biofilmes na resistência bacteriana, a
avaliação de agentes que interfiram com a sua formação/manutenção seria também uma
abordagem expressiva (POOLE, 2002).
Reconhecida a importância e os avanços da Farmacognosia (o estudo dos
produtos naturais biologicamente ativos), a avaliação da atividade antimicrobiana de
produtos naturais de origem vegetal é também uma abordagem de grande interesse
capaz de oferecer relevantes contribuições em vista da biodiversidade.
Bombas de efluxo são partes integrantes da membrana plasmática bacteriana que
têm sido responsabilizadas por diversos casos de resistência bacteriana a antibióticos
(MARQUEZ, 2005; PIDDOCK, 2006). Agentes modificadores de atividade antibiótica
ou moduladores da resistência são compostos que potencializam a atividade de um
antibiótico, sendo que alguns desses agentes agem como inibidores de bombas de efluxo
(IBE). Espécies vegetais constituem uma rica fonte de potentes IBE e diversos
fitoconstituintes já foram identificados como tal (GIBBONS, 2004, STRAVI et al.,
2007).
Frente ao alarmante problema da resistência bacteriana aos antibióticos, tem se
tornado então cada vez mais relevante, a avaliação da atividade antimicrobiana direta,
bem como a atuação de produtos naturais de origem vegetal como “modificadores de
atividade antibiótica/moduladores da resistência a drogas"; enfim, como "adjuvantes de
antibióticos”.
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1. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
1.1 STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Os Staphylococcus aureus são constituintes da família Micrococcaceae e
caracterizam-se por serem cocos Gram-positivos e por apresentarem colônias que
medem entre 1 a 3 mm, além de produzirem as enzimas catalase e coagulase. Devido à
presença de carotenóides podem, também, possuir um pigmento amarelo-dourado. São
bactérias anaeróbicas facultativas que estão dispostas sozinhas, em pares ou formando
grupos irregulares com aspecto de cacho de uva. São constituintes da microbiota normal
da pele e da mucosa humana, tendo a nasofaringe como o principal local de
colonização. Entretanto, uma vez que contaminam a ruptura da pele ou as membranas
da mucosa, poderá infectar qualquer tipo de tecido do corpo, causando lesões no local
(LINDSAY; HOLDEN, 2004).
Por serem citados como os principais patógenos hospitalares e pelo fato de
estarem tornando-se cada vez mais virulentos e resistentes aos antibióticos, S. aureus
destacam-se como os principais disseminadores de doenças infecciosas humanas no
mundo, causando desde lesões superficiais na pele até infecções que ameaçam a vida,
tais como: osteomielite, endocartide, bacteremia e pneumonia (SMITH et al., 2005).
Esses fatores de virulência proporcionam a adesão da bactéria às células e
tecidos do hospedeiro, aquisição de nutrientes e evasão da resposta imune do hospedeiro
(ARVIDSON; TEGMARK, 2001; VELÁZQUEZ-MEZA, 2005).
1.2 A UTILIZAÇÃO DOS ANTIBIÓTICOS E A PROBLEMÁTICA DA RESISTÊNCIA
BACTERIANA
A inserção dos antibióticos no tratamento das infecções bacterianas
proporcionou uma drástica redução da mortalidade causada por doenças microbianas.
Com o passar dos anos, a facilidade de acesso e o uso exacerbado de tais fármacos,
possibilitou o desenvolvimento, por parte das bactérias, de mecanismos de resistência,
tornando ineficiente a utilização de certas drogas (COHEN; TARTASKY, 1997). Este
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fenômeno de resistência a diversos antibióticos e agentes quimioterápicos impõe sérias
limitações às opções para o tratamento de infecções bacterianas, representando uma
ameaça para a saúde pública (SILVEIRA, 2006).
Os mecanismos que condicionam a resistência aos antimicrobianos são de
natureza genética e decorrem da existência de genes contidos no microorganismo que
codificam diferentes proteínas, responsáveis por mecanismos bioquímicos que impedem
a ação das drogas. Esta resistência pode ser originada por mutações espontâneas e –
podem ocorrer no microorganismo durante o processo de replicação – resultam em uma
modificação na seqüência de bases no DNA cromossômico. A importação de genes por
meio dos mecanismos de transdução, transformação e conjugação - sendo este último o
mais freqüente - é outra forma de aquisição a resistência sendo esta do tipo transferível.
Os elementos genéticos transferíveis são: plasmídeos, transposons e integrons (SMITH
e JARVIS, 1999) (Figura 1).
Os antibióticos apresentaram, por muitos anos, efeito no tratamento de muitas
infecções causadas por patógenos, como S. aureus (FOURNIER et al., 2000). A
utilização indiscriminada destas drogas, no decorrer dos últimos anos, tem
proporcionado um aumento considerável a resistência bacteriana a diversos fármacos. A
Figura 1. Mecanismos de transferência da resistência
bacteriana (http://textbookofbacteriology.net).
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habilidade dos S. aureus em adquirir resistência à praticamente todos os antibióticos
utilizados atualmente é motivo de considerável preocupação (GIBBONS, 2004).
Após a difusão do uso clínico da penicilina, na década de 40, foram
encontradas linhagens de estafilococos capazes de produzir uma enzima, a penicilinase,
que tornaria o efeito da penicilina ineficiente. Em um curto período de tempo, ainda no
fim dos anos 50, a espécie Staphylococcus aureus já havia adquirido resistência à
praticamente todos os antibióticos de uso parenteral, dentre eles a eritromicina e a
tetraciclina. Da mesma forma, houve resistência aos antibióticos lançados no mercado
nos anos seguintes, como a meticilina (penicilina semi-sintética resistente as
penicilinases) (CHAMBERS, 1988).
Com o passar dos anos, outras linhas de defesa contra a ameaça do S. aureus
surgiram, como a descoberta do antibiótico vancomicina – um glicopeptídico isolado a
partir do fungo Amycolatopsis orientalis – a qual apresentou um excelente desempenho
frente às linhagens MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus). Este fato
propiciou, ainda que de forma temporária, certa tranquilidade no combate a esses
microorganismos patogênicos, causando inclusive uma desaceleração nos investimentos
de empresas farmacêuticas em programas de descobrimento e desenvolvimento de
novos agentes antimicrobianos. Porém, a incidência recente de S. aureus resistentes a
vancomicina (VRSA) vem abalando essa tranquilidade (SILVEIRA et al., 2006).
As formas pela quais as bactérias tornam-se resistentes podem ser agrupadas
em quatro grupos distintos: 1) inativação ou modificação da droga, onde enzimas
ocasionam inativação dos antibióticos. Por exemplo, as -lactamases que hidrolisam a
classe dos -lactâmicos; 2) modificação do alvo, decorrente de mutações no gene da
molécula-alvo do antibiótico, impedindo o reconhecimento do mesmo e
consequentemente sua ação. Como observado em fluoroquinolonas, que têm como alvo
duas proteínas da replicação do DNA: topoisomerase e DNA girase; 3)
impermeabilidade da membrana, de maneira que a droga não penetra de forma eficiente
na célula bacteriana. É o caso da resistência a vancomicina; 4) bomba de efluxo, que
promove a eliminação de agentes antimicrobianos para o meio extracelular mais rápido
que a difusão pela membrana plasmática, de maneira que a concentração intracelular do
agente se mantém insuficiente para bloquear as funções celulares (POOLE, 2002;
KÖHLER et al., 1999).
Dentre os grupos citados, os dois primeiros mecanismos são específicos para
um ou mais antibióticos relacionados, já os dois últimos mecanismos estão geralmente
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associados à resistência múltipla as drogas (MDR – MultiDrug Resistance) (KÖHLER
et al., 1999).
1.3 BOMBA DE EFLUXO
Bombas de efluxo são proteínas transmembrana as quais estão envolvidas no
transporte de substratos tóxicos – incluindo todas as classes de antibióticos clinicamente
relevantes – do interior da célula para o ambiente extracelular, diminuindo a
concentração intracelular do substrato antimicrobiano e tornando a célula menos
susceptível ao agente. Assim, a proteína de efluxo nas bactérias contribui para a
sobrevivência delas no seu habitat (VAN BAMBEKE et al., 2003). Este mecanismo
requer gasto de energia para mover o antibiótico para fora da célula e a expressão deste
tipo de resistência a antibióticos é normalmente regulada pela célula, de modo que só
ocorre quando o antibiótico está presente (GUILFOILE, 2007).
Os genes das proteínas de efluxo e seus produtos estão presentes em todos os
organismos, desde bactérias até fungos e eucariotos superiores (VAN BAMBEKE et al.,
2003). Essas proteínas de efluxo podem ser específicas a um substrato ou transportar
vários compostos estruturalmente não relacionados, como antibióticos de classes
Figura 2. Alguns mecanismos de resistência aos
antibióticos (LEVY, 2004).
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diferentes. Neste último caso, tais bombas podem estar associadas à MDR (WEBBER;
PIDDOCK, 2003).
De acordo com a energia usada para expulsar o substrato e a similaridade na
seqüência, os mecanismos de efluxo estão agrupados em 5 grandes famílias, são elas:
superfamília MFS (major facilitator), superfamília ABC (ATP binding cassette), família
RND (resistance nodulation division), família MATE (multidrug and toxic compound
extrusion) e família SMR (small multidrug resistance) (KUMAR; SCHWEIZER, 2005;
SÁNCHEZ, 2003). Todos esses sistemas utilizam gradiente de próton (H+/Na
+) como
energia para exportar os substratos, exceto a família ABC, que utiliza hidrólise de ATP
(Figura 3).
Figura 3 . Representação esquemática das principais famílias de MDR transportadores
e em procariotos (McKEEGAN et al., 2004 com alterações)
A maior proteína de efluxo MDR caracterizado em S. aureus é a NorA,
encontrada tanto em linhagens MSSA como MRSA (GIBBONS et al., 2004;
PIDDOCK, 2006a). O gene norA foi o primeiro identificado em S. aureus, em 1990.
Sua proteína (NorA) transporta diversos substratos, tais como: fluorquinolonas
hidrofílicas (norfloxacina, ciprofloxacina, lomefloxacina e ofloxacina), brometo de
etídio, acriflavina, rodamina, centrimida, cloreto de benzalcônio, brometo de
tetrafenilfosfônio, clorafenicol, além do alcalóide berberina (NEYFAKH et al., 1993;
AESCHIMANN, et al., 1999; KAATZ; SEO, 1995). A desativação da proteína NorA
fornece o aumento da susceptibilidade bacteriana de quatro a oito vezes mais para as
fluorquinolonas (YAMADA et al., 1997; HSIEH et al., 1998). JONES et al. (2000) e
KAATZ et al. (1993) isolaram linhagens clínicas que superexpressam o gene norA.
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Sabe-se atualmente que as bombas de efluxo têm sido responsabilizadas por
diversos casos de resistência bacteriana a antibióticos (MARQUES, 2005; PIDDOCK,
2006). Desta forma, observa-se uma real necessidade de desenvolvimento de novos
agentes antimicrobianos.
1.4 AGENTES MODIFICANTES DE ATIVIDADE ANTIBIÓTICA
O aparecimento da resistência aos antibióticos tem minado o valor terapêutico
dos agentes existentes, criando a necessidade da descoberta de novos agentes
antibacterianos cada vez mais eficientes. Sejam estes de origem natural, semi-sintética
ou sintética (SILVEIRA et al., 2006; CHOPRA et al., 2002).
Os moduladores da resistência a drogas por inibição de bomba de efluxo,
também chamados modificadores de atividade antibiótica ou adjuvantes de antibióticos,
são considerados como a alternativa mais apropriada das novas terapias antibacterianas
(VAN BAMBEKE et al., 2006; LYNCH, 2006).
Ainda não são perfeitamente compreendidos os mecanismos pelos quais os
inibidores de bomba de efluxo podem atuar, entretanto algumas possibilidades têm sido
propostas. Dentre estas podemos mencionar: a ligação direta a um ou mais sítios de
ligação na proteína de efluxo – de maneira competitiva ou não-competitiva;
interferência no gradiente de próton; apresentação da afinidade pelo substrato
transportado pela bomba – de maneira a formar um complexo que poderá não ser mais
reconhecido pela bomba de efluxo; interação com a membrana plasmática modificando
a conformação da proteína de efluxo ou inibição da expressão do gene de efluxo. Todos
esses mecanismos interferem no efluxo do substrato da bomba. Assim, a aplicação
desses inibidores em associação com antibióticos convencionais poderá aumentar a
concentração intracelular desses antibióticos, restaurando sua eficiência, além de reduzir
o emergente desenvolvimento da resistência bacteriana (LOMOVSKAYA; BOSTIAN,
2006; ZLOH et al., 2004; POOLE; LOMOVSKAYA, 2006; MARKHAM et al.,
1999)(Figura 4).
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1.5 PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL
As plantas produzem uma grande quantidade de metabólitos secundários e
parte significativa dessa diversidade química serve para protegê-la contra patógenos
microbianos. Espécies vegetais constituem uma rica fonte de potentes inibidores de
bomba de efluxo e diversos constituintes já foram identificados como tal (GIBOONS,
2004; STRAVI et al., 2007).
Certos produtos naturais, como o reserpina (alcalóide), têm sido capazes de
bloquear bombas de efluxo e reduzir o CIM (mínima concentração inibitória) da
norfloxacina e outros antibióticos. Porém, a concentração necessária de reserpina para
inibir a bomba de efluxo é neurotóxica para os humanos (MARKHAN et al., 1999).
A escassez de inibidores de efluxo efetivos na prática clínica leva a constante
procura pela identificação e desenvolvimento de novos inibidores, tanto contra os
sistemas de efluxo em microrganismos como em células tumorais resistentes a múltiplas
a drogas (DICKSON et al., 2006; KAATZ et al., 2003). A procura por novos agentes
tem focado os produtos naturais como moduladores da atividade antibiótica por bomba
de efluxo.
Os produtos naturais, tanto de origem terrestre quanto marinha, constituem
uma excelente fonte de moléculas com atividades biológicas promissoras, não apenas
pelo grande número de espécies encontradas nesses habitats naturais, mas
Figura 4. Atuação de um inibidor de efluxo (LEVY,1998).
18
principalmente pela variedade estrutural dos compostos produzidos e pelas propriedades
medicinais inexploradas (NIELSEN, 2002; NEWMAN; CRAGG; SANDER, 2003).
1.5.1 ORIGANUM VULGARE
O gênero Origanum, pertence à família Lamiaceae, tem características
arbustiformes de ocorrência sazonal e perene sendo nativa do Mediterrâneo, Ásia,
México e de algumas localidades da América do Sul, apresentando um total de 38
espécies conhecidas no mundo (PEREIRA, A., 2006). No Brasil, a espécie Origanum
vulgare L., popularmente conhecida por orégano, é a mais comum e amplamente
cultivada nas regiões Sul e Sudeste do país para uso como condimento alimentar
(SIGNOR et al., 2007).
As folhas secas e o óleo essencial de O. vulgare são usados medicinalmente por
vários séculos em diferentes partes do mundo, de forma que o seu efeito positivo sobre
a saúde humana tem sido atribuído à presença de compostos antioxidantes na erva e
consequentemente em seus produtos derivados (CERVATO et al., 2000; HERNÁNDEZ
et al., 2003).
O óleo essencial de O. vulgare apresenta como seus principais componentes
fenólicos, carvacrol [2-metil-5 - (1-metil-etil) fenol], e timol (2-isopropil-5-metilfenol),
os quais são conhecidos pelo seu largo espectro de atividade antimicrobiana, o que tem
sido o assunto de várias investigações in vitro (DORMAN & DEANS, 2000;
LAMBERT et al, 2001) e in vivo (ADAM et al, 1998).
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2. OBJETIVO
2.1 GERAL
O objeto geral deste trabalho detém-se à avaliação de produtos naturais no que
se refere à sua atividade antimicrobiana direta, bem como, devido aos poucos trabalhos
relatados na literatura, sua atuação como moduladores da resistência a drogas em
linhagens de Staphylococcus aureus, ou seja, como potenciais adjuvantes de
antibióticos.
2.2 ESPECÍFICOS
O objetivo específico deste trabalho é avaliar a atividade antimicrobiana do
óleo essencial de Origanum vulgare e de seu constituinte majoritário Carvacrol, bem
como sua atuação como possível inibidor de bomba de efluxo.
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3. METODOLOGIA
3.1 LINHAGENS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Foram utilizadas linhagens de Staphylococcus aureus fornecidas pelo Dr.
Simon Gibbons (Universitry of London): SA-1199B, que superexpressa o gene norA
que codifica a proteína de efluxo NorA, responsável pelo efluxo de fluorquinolonas e
outras substâncias (KAATZ et al., 1993; KAATZ; SEO, 1995); RN-4220 que possui o
plasmídeo pUL5054, o qual, carrega o gene que codifica a proteína para efluxo de
macrolídeos (MrsA) (ROSS et al., 1989) e IS-58, que possui o gene que codifica a
proteína TetK para efluxo de tetraciclina (GIBBONS; UDO, 2000). Estas linhagens são
mantidas em meio de cultura agar sangue (Blood agar base – Difco) inclinado. Antes de
serem utilizadas, as células crescem em caldo nutritivo de infusão (Brain heart infusion
- BHI, Difco) acrescido de antibiótico, em concentração subinibitória, como forma de
preservar a resistência dos microorganismos aos respectivos antibióticos por 18-24 hs a
37 ºC.
3.2 ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO, CARVACROL E TIMOL
O óleo essencial Orégano e o seu constituinte Carvacrol foram fornecidos pelo
Prof. Dr. Evandro Leite de Souza (Laboratório de Microbiologia de Alimentos/UFPB).
Já o isômero do Carvacrol, Timol foi obtido do fabricante Sigma.
3.3 ANTIBIÓTICOS
As soluções estoque da norfloxacina, da tetraciclina e da eritromicina (Sigma-
Aldrich) foram preparadas conforme recomendação (CLSI/NCCLS document M100-
S15).
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3.4 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) DO ÓLEO
ESSENCIAL DE ORIGANUM VULGARE, CAVACROL E TIMOL
As CIM dos produtos naturais foram determinadas pelo método da diluição em
meio nutritivo solidificado (BHI) acrescido de twenn 20 (0,5%), usando-se
concentrações crescentes e dobradas do óleo essencial (0,015625 a 1%) e suspensões
bacteriana na concentração de 105
ufc/mL, em caldo nutritivo (BHI) na presença de
antibiótico. A CIM foi definida como a menor concentração que inibiu completamente o
crescimento bacteriano.
3.5 DETERMINAÇÃO DAS CIM DOS ANTIBIÓTICOS E NA PRESENÇA DO ÓLEO
ESSENCIAL DE ORIGANUM VULGARE, CAVACROL E TIMOL
As CIM foram determinadas pelo método da diluição em meio nutritivo
solidificado (BHI) acrescido de twenn 20 (0,5%), com concentrações variando de
256 a 0,25 µg/mL ou 128g/mL a 0,125g/mL (diluições seriadas ½). Os ensaios
para atividade moduladora, foram realizados pelo método da diluição em meio
nutritivo solidificado, na presença do óleo essencial em uma concentração fixa e
subinibitória (¼ CIM), usando-se diluições seriadas dos referidos antibióticos.
22
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Realizamos primeiramente experimentos para determinar a concentração
inibitória mínima (CIM) do óleo essencial de Orégano, bem como do seu constituinte
majoritário carvacrol e do seu isômero timol em linhagens de Staphylococcus aureus
que codificam proteínas de efluxo (Tabela 1).
Tabela 1: Concentração Inibitória Mínima do óleo essencial de orégano, carvacrol e
timol frente as linhagens de Staphylococcus aureus.
O óleo essencial de orégano apresentou uma relevante atividade antibacteriana
para as três linhagens utilizadas, variando entre 0,125% e 0,250% a concentração
necessária para inibir o crescimento bacteriano. No que se refere a carvacrol e timol,
ambos apresentaram resultados semelhantes com relação a CIM com variações entre
0,03125% e 0,0625%. Este resultado pode ser explicado pelo fato destes serem
isômeros (figura 5).
CIM (%)
Linhagem Orégano Carvacrol Timol
IS-58 0,125 0,03125 0,03125
RN-4220 0,125 0,0625 0,0625
AS-1199B 0,250 0,0625 0,0625
Figura 5. Estrutura do Timol e Carvacrol
23
Pôde-se observar que mesmo apresentando uma diferença estrutural com relação
a posição do grupo hidroxila, timol e carvacrol apresentam, se não o mesmo mecanismo
de ação, a mesma atividade antibacteriana.
Determinadas as concentrações inibitórias mínimas, foram realizadas as CIM
dos antibióticos (norfloxacina, tetraciclina e eritromicina) usando-se concentrações
crescentes e dobradas (0,25µg/mL até 256µg/mL) na ausência, bem como, na presença
dos produtos naturais (≤ ¼ da CIM) (Tabela 2). É importante mencionar que o uso de
uma concentração tão baixa quanto ¼ da CIM é recomendado para evitar possíveis
resultados falso-positivos (STAVRI et al., 2007).
Tabela 2: Concentração Inibitória Mínima dos antibióticos na presença e na ausência
dos produtos naturais.
*Valor de redução da CIM
Resultados relevantes foram obtidos com Orégano, Carvacrol e Timol na
linhagem S. aureus IS-58, na qual se observou uma modulação com redução da CIM da
tetraciclina em até 4 vezes. Já para as linhagens RN-4220 e AS-1199B, apesar dos
produtos naturais testados terem apresentado uma significativa atividade antibacteriana
quando foram incorporados ao meio de cultura juntamente com o antibiótico e em uma
concentração subinibitória, não houve redução da concentração da eritromicina e da
norfloxacina necessária para inibir o crescimento bacteriano, não apresentando inibição
da bomba de efluxo.
Linhagem / Antibiótico
CIM (µg/mL)
CIM dos
antibióticos + Orégano + Carvacrol + Timol
IS-58 / Tetraciclina 64 16 (4x)* 32(2x)* 32(2x)*
RN-4220 / Eritrommicina 256 256 256 256
AS-1199B / Norfloxacina 64 64 64 64
24
5. CONCLUSÃO
Os poucos trabalhos encontrados na literatura relatando tanto o efeito
potencializador de produtos naturais – quando em combinação com drogas
antimicrobianas clássicas – quanto trabalhos avaliando estes como moduladores de
resistência a drogas por inibição de bomba de efluxo, destacam a relevância deste
trabalho e motivam novos estudos que venham a auxiliar na avaliação biológica destes
produtos no combate aos mecanismos de resistência, mais especificamente sobre a
bomba de efluxo.
Os resultados aqui apresentados destacam o óleo essencial de orégano, seu
constituinte carvacrol e isômero timol, para além de outras propriedades, com um
promissor papel antibacteriano contra linhagens de S. aureus resistentes. O presente
trabalho também mostrou que eles modularam a atividade antibiótica de tetraciclina,
reduzindo a quantidade necessária do antibiótico para inibir o crescimento bacteriano.
As conclusões deste estudo destacam a relevância da avaliação biológica de
tais produtos naturais, os quais poderiam ser utilizados no combate das infecções
bacterianas resistentes a múltiplas drogas, agindo com putativos inibidores de bomba de
efluxo.
25
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