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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
CENTRO DE DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO
CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
DISCIPLINA DE ENGENHARIA TECIDUAL
PROFESSORA FERNANDA NEDEL
Carolina Ximendes
Caroline Lucas
25 de Abril de 2011
Nanomateriais e cultivo celular
1
NANOMATERIAIS
Potenciais efeitos adversos na saúde humana
Testes de toxicidade
Material é colocado em contato com a cultura
Busca de alterações celulares por diferentes mecanismos2
Introdução
CULTIVO CELULAR
3
Introdução
Células epiteliais Células mesoteliais
Confluência de 80-90%
4
Introdução
ENSAIOS IN VITRO
Citotoxicidade
Proliferação celular
Genotoxicidade
Expressão gênica
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Introdução
AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Detectar o potencial de um material em produzir efeitosletais ou subletais
Importante no desenvolvimento de produtos para usoem humanos e animais
Aplicado à biomateriais
Liberação de substâncias tóxicas
Lesão celular ou redução da taxa de crescimento 6
AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Teste de exclusão de Trypan Blue
Microcultura de tetrazólio
Ensaio da Lactato Desidrogenase
7
AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Teste de exclusão de Trypan Blue
8
Controle
Identifica o número de células viáveis
AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Teste de exclusão de Trypan Blue
9
Nanopartículas Tipo celular Resultado
Amianto crocidolita Células mesoteliais Citotóxico
PLA para entrega de genes
Células epiteliaisNão citotóxico(até 4mg/mL)
Diferentes metais e nanotubos de
carbonoCélulas do pulmão
CuO - CitotóxicoFerro - Pouca toxicidade
NTCs - Citotóxicos
Hillegas et al; Bejjani et al; Karlsson et al
AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Microcultura de tetrazólio (MTT)
Ensaio metabólico colorimétrico
MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazoliumbromide]
Enzima desidrogenase
10
AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Microcultura de tetrazólio (MTT)
11
Adição do
tetrazólio
Controle: Cultivo +
tetrazólio
AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Microcultura de tetrazólio (MTT)
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Nanopartículas Tipo celular Resultado
Nanopartícula para entrega de fármaco
Células mesoteliaisAumento da
citotoxicidade
PLGA + Paclitaxel Células do pulmãoDiminuição da
viabilidade celular
Hillegas et al; Fonseca et al
AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Lactato desidrogenase (LDH)
Enzima citosólica
Indicadora de morte celular
Integridade da membrana
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AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Lactato desidrogenase (LDH)
14
Nanopartículas Tipo celular Resultado
Albumina e polialquilcianoacrilato
Células de pulmão Albumina – Não apresentou
aumento de LDH Polialquil – Aumento de LDH
Diferentes metais Células do fígadoDiâmetro maior – Mais
liberação de LDH
Brzoska et al; Hussain et al
AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR
Ensaios para avaliar a multiplicação celular
Métodos histoquímicos e imunohistoquímicos
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AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR
Conteúdo de DNA
Incorporação de timidina
Ki-67
Detecção por PCNA
16
AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR
Conteúdo de DNA
Observação e contagem de células em mitose
Quantificar e identificar agentes inibidores ou indutores
Resultado: divisão do número de células em mitose pelonúmero total de células em uma população
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AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR
Incorporação de timidina
Indicativo do número de células em proliferação
Técnica dispendiosa
Exige treinamento e instalações especiais
Longo período de incubação
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AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR
Antígenos nucleares
Ki-67
Presente em todas as fases do ciclo celular
PCNA
Associados com síntese e reparação do DNA
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AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Nanomateriais com propriedades físico-químicasdistintas.
Propriedades de superfície estão diretamenterelacionadas com o potencial genotóxico.
Análise dos efeitos diretos no DNA forneceminformações preliminares sobre o potencial degenotoxicidade.
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AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Teste de Ames em Salmonella typhimurium eEscherichia coli.
Identificação de mutações no DNA por avaliação daoxidação de guanina
Análise de cariótipos- Ensaio de aberraçõescromossômicas e Teste do micronúcleo
Ensaio cometa 21
AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Teste de Ames
Ames e colaboradores desenvolveram uma forma desimular o metabolismo humano no sistema bacteriano.
Realizado em presença ou ausência de sistema demetabolização exógeno (mistura S9).
Incorporação de enzimas do fígado de mamífero nosistema de teste em bactérias.
22
AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Teste de Ames
Ocorrência de uma mutação genética que não causaexigência a um determinado nutriente, que antes eraindispensável ao microrganismo.
S. typhimurium- histidina
E. coli- triptofano
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AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Teste de Ames
Salmonella typhimurium
24
AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Teste de Ames
Nanopartículas Bactérias Resultado
Partículas de UF·TiO2
S. typhimurium cepas TA98,TA100, TA1535, e TA1537 e E. coli
cepaWP2uvrA
Não mutagênica
Fulerenos
S. typhimurium strains TA98,TA100, TA1535, e TA1537 e E. coli
cepaWP2uvrA
Não mutagênica
Amianto crocidolitaferro dependente
S. typhimurium TA102 Mutagênica25
AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Teste de Ames
Possíveis diferenças na captação celular das nanopartículase complexidade genômica entre procariontes e eucariontes.
O ensaio de Ames deve ser complementado por outrosestudos.
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AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Identificação de mutações no DNA por avaliação daoxidação de guanina
Mutações pontuais podem ser identificadas mediante aanálise da oxidação de guanina.
Formação de (8-OHdG) e (oxo-dG).
Potencial do nanomaterial para gerar ROS.
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AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Identificação de mutações no DNA por avaliação da oxidação de guanina
Nanopartícula Tipo celularNíveis de (8-OHdG) e
(oxo-dG)
Liga de cromo-cobalto (∼30 nm)Fibroblastos
humanosNão ocorreu aumento de
(8-OHdG)
Sílica luminescente (∼50 nm)Células de
adenocarcinoma de pulmão (A549)
Mesmo níveis de (oxo-dG) no grupo exposto e no
controle.
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AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Ensaio de aberrações cromossômicas (CA)
Avalia efeitos no número e na integridade doscromossomos através da análise de cariótipos.
Técnicas de coloração e microscopia.
Tratamento durante a fase S.
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AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE
Ensaio de aberração cromossômica (CA)
Nanopartícula Concentração (μg/mL)
CA e aumento no número de
cromossomos
UF·TiO2 (≤60 nm) 209.7 a 5000 Não
UF·TiO2 (∼140 nm) 25 to 2500 Não
Fulerenos 5000 5% das células testadas
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AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE
Teste do micronúcleo
Micronúcleos se formam pela extrusão de cromossomosinteiros ou seus fragmentos durante a divisão celular.
Permite identificar eventual aumento na frequência demutações em células.
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AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Teste do Micronúcleo
Nanopartículas Linhagem celularFormação de micronúcleos
UF·TiO2 (≤20 nm)Fibroblastos de embriões de
hamster sírio.Aumentou
UF·TiO2
(<100 nm)Linfócitos humanos do sangue
periférico.Aumentou
UF·TiO2 (<100 nm) WIL2-NS Aumentou
TiO2, liga cobalto-cromo (∼30 nm)
Fibroblastos humanos Aumentou 32
AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE
Ensaio Cometa
Identificação de quebras simples e duplas no DNA.
Células com maior quantidade de danos no DNAapresentam migração mais rápida do material genético.
Extensão do dano avaliada pelo deslocamento do materialgenético (cauda do cometa formada) em relação ao núcleo.
33
AVALIAÇAO DE GENOTOXICIDADE
Ensaio cometa
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AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Ensaio Cometa
Nanopartículas CélulasTempo de exposição
OTM
TiO2 (<100 nm)Linfócitos humanos do
sangue periférico 0-24 h
Aumento dose e tempodependente
UF·TiO2 (<100 nm WIL2-N - Aumento de 5 vezes
Fulereno C60 - - Aumentou
Liga de cobalto-cromo (∼30 nm)
Fibroblastos humanos 24 h Aumentou
Silica luminescente (∼50 nm)
A549 -Não ocorreu mudança
significativa35
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
Técnicas para avaliação da expressão gênica
Northern blotting
Ensaio de proteção à ribonuclease (RPA)
Ensaios de PCR- RT-PCR e Real-Time PCR
Microarrays
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AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
Northern blotting
Analisa a localização e a quantidade de mRNA.
Compara padrão de expressão gênica entre duas amostras.
Desnaturação do RNA e corrida em gel de agarose.
Trasferência para membrana por ação capilar.
Sondas de RNA ou DNA para hibridizar.
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AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICAEnsaio de proteção a ribonuclease (RPA)
Detecta e quantifica transcrições específicas de mRNA.
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AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
Real-time PCR
Método quantitativo para detecção do número decópias do fragmento alvo.
Quantificação realizada a cada ciclo, baseada nadetecção e quantificação de fluorescência emitidadurante a reação.
Detecção específica e não específica
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AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICART-PCR
Reação da transcriptase reversa, seguida pela PCR.
A partir do RNA, a enzima transcriptase reversa sintetizauma cadeia de DNA complementar (cDNA).
Amplamente utilizada para verificar a expressão gênica.
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AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA Microarrays
Arranjo pré-definido de moléculas de DNAquimicamente ligadas à uma superfície sólida.
Detecção e quantificação de ácidos nucleicos (mRNA naforma de cDNA ou DNA genômico) provenientes deamostras biológicas.
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ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA
Ensaio Células Resultado
Partícula magnética coberta por ferritina x tratamento sem
partícula magnética
Fibroblasto Humano
Diferença de expressão de 1718 mRNA , genesresponsáveis pela organização do citoesqueleto esinalização celular
PLA-PEGCélulas
hepáticas de camundongos
Super expressão de transportadores ABC e baixaexpressão de Glutationa-S-transferase P1
Inalação de TiO2 -Efisema e indução da expressão de genesrelacionados com o ciclo celular, apoptose eexpressão de quimiocinas.
TiO2 revetido por BSA -Expressão do fator inibidor da migração demacrógafos (MIF)
Partículas submicrométricasde titânio
-Indução do fator estimulador decolônia de macrófago (M-CSF) em osteoblasto.s
Nanopartículas de carbono A549 Aumento da transcrição da heme oxigenase-1
Nanopartículas de cobaltoFibroblastos de camundongos
Ativação de vias celulares de defesa e demecanismos de reparo. 42
CONCLUSÃO
As técnicas podem ser utilizadas para avaliar a toxicidade dasnanopartículas, porém um número significativo de falsossinais positivos são gerados.
Mais de um ensaio e tipo celular devem ser empregados.
Realizar completa caracterização da variação de tamanho,área superficial e composição química dos nanomateriais.
Utilizar novas tecnologias, sistemas e métodos emergentes.
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REFERÊNCIAS
Jedd M Hillegass, Arti Shukla, Sherrill A Lathrop,Maximilian B MacPherson, Naomi K Fukagawa, Brooke TMossman. Assessing nanotoxicity in cells in vitro. Wileyinterdisciplinary reviews Nanomedicine andnanobiotechnology, 2010.
S.M. Hussain, K.L. Hess, J.M. Gearhart, K.T. Geiss, J.J.Schlager. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A ratliver cells. Elsevier, 2005.
Arora S, Jain J, Rajwade JM, Paknikar KM. Inter- actionsof silver nanoparticles with primary mouse fibroblastsand liver cells. Toxicol Appl Pharmacol, 2009. 44
REFERÊNCIAS
Bejjani RA, BenEzra D, Cohen H, Rieger J, Andrieu C, etal. Nanoparticles for gene delivery to retinal pigmentepithelial cells. Mol Vis, 2005.
Shukla A, Macpherson MB, Hillegass J, Ramos-Nino ME,Alexeeva V, et al. Alterations in gene expression inhuman mesothelial cells correlate with mineralpathogenicity. Am J Respir Cell Mol Biol, 2009.
Eva Herzog, Alan Casey, Fiona M. Lyng, GordonChambers, Hugh J. Byrne, Maria Davoren. A newapproach to the toxicity testing of carbon-basednanomaterials—The clonogenic assay. Elsevier, 2007. 45
OBRIGADA!
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