université bordeaux segalen

Université Bordeaux Segalen

Année 2012 Thèse n° 2018

THÈSE Pour le

DOCTORAT DE L’UNIVERSITE BORDEAUX 2

Mention : Sciences, Technologie, Santé

Option : Nutrition

Présentée et soutenue publiquement

Le 21 décembre 2012

Par Merian NASSRA

Née le 25 mars 1978 à Lattaquié, Syrie

Effets anti-inflammatoires des stilbènes sur des cultures

cellulaires de microglies et mécanismes d'action

Membres du Jury

Pr. Yves DESJARDINS, Université de Laval, Québec Président

Dr. Catherine FELGINES, Université d’Auvergne, France Rapporteur

Pr. Victor De FREITAS, Université de Porto, Portugal Rapporteur

Pr. Jean-Michel MERILLON, Université de Bordeaux 2, France Examinateur

Dr. Stéphanie KRISA, Université de Bordeaux 2, France Directeur de thèse

Pour les personnes qui sont comme le soleil dans ma vie,

éloignées mais leurs chaleurs et amour illuminent ma vie

Maman, papa et George

Remerciements

Ce travail a été réalisé au Groupe d’Etude des Substances Végétales à Activité Biologique de

l’Université de Bordeaux Segalen, sous la direction du Dr. Stéphanie Krisa.

Je tiens dans un premier temps à la remercier, pour m’avoir confié ce travail de

recherche, ainsi que pour son aide, ses précieux conseils au cours de ces années, sa sympathie,

sa disponibilité et son implication.

J’exprime ma gratitude au Pr. Jean-Michel Mérillon, directeur du laboratoire, de

m’avoir accueillie au sein de son équipe.

Mes remerciements vont également à l’ensemble des membres du jury pour leur

collaboration à l’examen de ce travail et leur participation à la soutenance. Au Pr. Yves

DESJARDINS de me faire l’honneur de présider ce jury de thèse. Au Dr. Catherine FELGINES

et au Pr. Victor De FREITAS pour avoir accepté de juger ce travail en tant que rapporteurs.

Cette thèse n’aurait pu aboutir sans l’aide précieuse de certains collègues et

collaborateurs que je tiens vivement à remercier :

- le Dr. Pierre Waffo Téguo pour avoir fourni les stilbènes nécessaires pour mon

travail et également les personnes qui ont contribué à la purification de ces

molécules : Jonathan Bisson, Yorgos Papastamoulis et Gilbert Deccaux Kapche. Je

remercie aussi le Dr. Tristan Richard pour sa collaboration en me fournissant des

molécules pour cette thèse.

- le Dr. Jan Pieter Konsman du laboratoire Résonance Magnétique des Systèmes

Biologiques et madame Véronique Neaud du laboratoire Physiopathologie du cancer

du foie.

- Dr. Nadège Telef-Micouleau pour son aide et conseils précieux en biologie

moléculaire.

- Gérard Fondeville et Antonio Palos-Pinto pour leur aide et leur bonne humeur.

- aux étudiants qui ont effectué leur stage au GESVAB : Koovendren Ruthnum, Léa

Gontier-Morin et Eva Gatineau. Merci pour votre implication et votre sympathie.

A tous les membres du GESVAB, au-delà de la relation professionnelle, vous avez été

comme une famille pour moi pendant ces années. Merci à tous pour votre bonne humeur, pour

toutes ces séances de rires et de sourires, je me souviendrais longtemps des moments du café où

nous refaisions le monde. A travers nos conversations j’ai connu la culture, la cuisine et les

traditions françaises.

Je pense particulièrement à Stéphanie Krisa, cela a été aussi sympathique de travailler

avec toi, plein d’énergie et de la discussion. Hors du laboratoire, je te remercie pour les bons

moments d’amitié que nous avons partagés ensemble et avec ta famille.

Stéphanie Cluzet et Nadège Telef-Micouleau, merci pour tous les échanges agréables.

Un immense merci à Carole Lambert, une amie très spéciale avec qui j’ai partagé mes

meilleurs souvenirs en France (les balades, les voyages,…), et qui a été à côté de moi dans les

plus difficiles périodes.

Ces remerciements ne seraient pas complets sans une pensée pour tous ceux qui sont en

Syrie, ma famille et mes amis.

A ma famille,

Papa et Mama, je vous aime et j’aurais souhaité beaucoup que vous soyez auprès de moi

en ce jour. Ce travail est le fruit de votre travail pendant plusieurs années.

Un grand merci à Marwan, mon adorable frère, sans toi à mes côtés, je ne serais peut-

être pas ici aujourd’hui.

George mon amour, merci pour m’écouter et m’encourager, et pour m’avoir changé les

idées quand j’en avais besoin.

Et finalement toutes les personnes que j’aurais malencontreusement oubliées mais à qui

je témoigne toute mon affection.

Sommaire

Introduction général 1

Étude bibliographique 3

I. Le vieillissement du système nerveux central 3

I.A. Le vieillissement et les maladies neurodégénératives 3

I.B. L’inflammation dans les maladies neurodégénératives 4

I.C. Le système nerveux central 5

I.C.1. La barrière hémato-encéphalique 5

I.C.2. Les différentes cellules du SNC 6

I.C.2.1 Les neurones 6

I.C.2.2. Les cellules gliales 7

Les astrocytes

Les oligodendrocytes

Les péricytes

Les cellules microgliales

II. Les cellules microgliales, principales cellules immunitaires du SNC 8

II.A. Origine, morphologie et fonctions des cellules microgliales 8

II.A.1. L’origine des cellules microgliales 8

II.A.2. La morphologie des cellules microgliales 9

II.A.3. Les fonctions des cellules microgliales 9

II.B. Les immuno-modulateurs produits par les cellules microgliales 11

II.B.1. Les médiateurs pathogéniques 11

II.B.1.1 Les espèces réactives de l'oxygène 11

II.B.1.2 Le monoxyde d'azote 12 Les effets biologiques du monoxyde d'azote La biosynthèse du monoxyde d'azote

Le monoxyde d'azote dans le système nerveux central II.B.1.3. Les cytokines 13

Le facteur de nécrose tumorale

L’interleukine -1

II.B.1.4. Les prostaglandines 15

Les prostaglandines : généralités

La biosynthèse des prostaglandines

La prostaglandine 2

II.B.1.5. Les chémokines 17

II.B.2. Les médiateurs protecteurs 17

III. Activation des cellules microgliales 18

III.A. Les stimuli inflammatoires et leurs récepteurs 19

III.A.1. Généralités 19

III.A.2. Le lipopolysaccharide et son récepteur TLR-4 19

III.A.2.1. Le lipopolysaccharide 19

III.A.2.2. Le Toll-Like Receptor de type 4 20

III.B. Les principales voies de signalisation impliquées dans l’inflammation 21

III.B.1. Le facteur de transcription Nuclear Factor kappa B 21

III.B.2. Les Mitogen-Activated Protein Kinase 23

III.B.3. La voie de signalisation PI3K/Akt 24

III.C. L'activation des cellules microgliales dans la maladie d'Alzheimer 25

IV. Les polyphénols 27

IV.A. Les flavonoïdes 27 - Les flavonols

- Les flavones

- Les flavan-3-ols ou les flavanols

- Les anthocyanidines

- Les flavanones

- Les isoflavones

IV.B. Les non-flavonoïdes 29

- Les acides phénoliques

- Les stilbènes

V. Les stilbènes, des molécules d'intérêt 30

V.A. Les stilbènes dans le "monde végétal" 30

V.A.1. Les stilbènes dans la Vigne 30

V.A.2. Les stilbènes dans l'alimentation 31

V.A.3. Les plantes utilisées en médecine traditionnelle contenant des stilbènes 32

V.B. Les effets des stilbènes sur l’inflammation du SNC 33

V.B.1. La consommation du raisin et les maladies neurodégénératives 33

V.B.2. Les effets anti-inflammatoires des stilbènes chez l’animal 34

V.B.3. Les effets anti-inflammatoires des stilbènes in vitro 36

V.B.3.1. Mécanismes d’action du resvératrol 36

VB.3.2. Mécanismes d’action des dérivés du resvératrol 38

Objectifs 40

Matériels et Méthodes 42

I. Matériels 42

I.A. Lignée cellulaire BV-2 42

I.B. Les Stilbènes 42

I.C. Appareillage 43

II. Méthodes 43

II.A. Culture cellulaire BV-2 et conditions expérimentales 43 Composition du milieu de culture

Entretien des cellules

Les conditions expérimentales

II.B. Les dosages 44

II.B.1. Mesure de la viabilité cellulaire (test MTT) 44

II.B.2. Dosage des oxydes nitrique NO2 44

II.B.3. Dosage des cytokines inflammatoires 45

II.B.4. Dosage de la prostaglandine2 (PGE2) 45

II.B.5. Analyse de l’expression des protéines par western blot 46

Stimulation, préparation des extraits cellulaires et dosage des protéines

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide et transfert

Blocage, incubation avec les anticorps primaires et secondaires

Révélation

II.B.6. Analyses de l’expression des gènes par RT-PCR semi-quantitative 48

Extraction et dosage des ARN totaux

Elimination des traces d’ADN génomique

Analyse de l’expression des gènes par RT-PCR semi-quantitative

a) Synthèse des ADN complémentaire

b) RT-PCR semi-quantitative et révélation au GelRedTM

II.B.7. Détection de la translocation nucléaire de Nf-κB par immunocytochimie 50

II.B.8. Analyse statistiques 51

Résultats et Discussion 52

Chapitre 1 : Recherche de stilbènes présentant des propriétés

anti-inflammatoires 52

I. Production de NO dans les cellules BV-2 activées par le LPS 52 I.A. Cinétique d’accumulation de NO dans les cellules BV-2 après activation par

le LPS 52

I.B. Effets de différents stilbènes sur la production du NO dans les cellules

BV-2 activées 53

II. Synthèse d'iNOS dans les cellules BV-2 activées par le LPS 54

II.A. Cinétique de l’expression d’iNOS dans les cellules BV-2 après activation par le LPS 54

II.B. Effets des vitisines A et B sur la production de NO et la synthèse d’iNOS dans les

cellules BV-2 activées 55

III. Discussion du chapitre 1 56 .

Publication 1 : Inhibitory activity of plant stilbenoids against nitric oxide production

by lipopolysaccharide-activated microglia 58

Chapitre 2 : L’effet anti-inflammatoire de la moracine M 59

I. La moracine M 59

II. Effets de la moracine M sur la production des médiateurs inflammatoires dans

les cellules microgliales activées 60

II.A. Les conditions expérimentales 60

II.B. Effet de la moracine M sur la viabilité des cellules BV-2 activées 60

II.C. Effets de la moracine M sur la production de NO et la synthèse d’iNOS dans les

cellules BV-2 activées 61 II.D. Effets de la moracine M sur la production de TNF-α et d’IL-1β dans les microglies

activées 62 II.D.1. Cinétique d’accumulation de deux cytokines pro-inflammatoires et suivi des gènes

codant pour ces cytokines dans les cellules BV-2 activées 62

II.D.2. Effets de la moracine M sur la production des cytokines proinflammatoires et suivi

des gènes codant pour ces cytokines dans les microglies activées 63

II.E. Effets de la moracine M sur la synthèse de PGE2 dans les microglies activées 64

II.E.1. Cinétique d’accumulation de PGE2 dans les BV-2 activées 64

II.E.2. Effets de la moracine M sur la production de PGE2 dans les cellules BV-2 activées 64

II.E.3. Effets de la moracine M sur la synthèse d'enzymes impliquées dans la production

de PGE2 au niveau traductionnel et transcriptionnel 65

III. Discussion du chapitre 2 66

Chapitre 3 : Les mécanismes d’action de la moracine M sur les voies de

signalisation impliquées dans l’inflammation 68

I. La voie de signalisation NF-κB et la moracine M 68

I.A. Effet du LPS sur la voie NF-κB au cours du temps 68

I.B. Effet de la moracine M sur la voie de signalisation NF-ΚB 69

II. Effet de la moracine M sur les MAPK 70

III. Effet de la moracine M sur l'activation d'Akt 70

IV. Effet de la moracine M sur l'expression de TLR4 71

V. Discussion du chapitre 3 71

Conclusions générales et Perspectives 75

Références bibliographiques 79

Publications et Communications Scientifiques 92

Articles dans des journaux internationaux

Communications en congrès international (posters)

Annexes 94

Abréviations

ADN : Acide DésoxyriboNucléique

ADNc : Acide DésoxyriboNucléique complémentaire

ANOVA : ANalysis Of Variance

AP-1 : Activator Protein-1

APP : β-amyloid Precursor Protein

ARN : Acide Ribonucléique

ARNm : Acide Ribonucléique messager

βA : β-Amyloïde

BDNF : Brain-Derived Neurotrophic Factor

BHE : Barrière Hémato-Encéphalique

CD14 : Cluster of Differentiation 14

COX : Cyclooxygénase

cNOS : NO Synthase constitutive

cPGES : Cytosolique Prostaglandines E Synthase

DAMP : Damage-Associated Molecular Pattern

DAPI : 4',6'-diamidino-2-phénylindole

DEPC : Diethylpyrocarbonate

DNase : Désoxyribonucléase

EMSA : Electrophoretic Mobility Shift Assay

eNOS : NO Synthase endotheliale

ERK : Extracellular Signal-Regulated Kinase

GAPDH : Glyceraldehyde-3-phosphate déshydrogénase

GESVAB : Groupe d’Etude des Substances Végétales à Activité Biologique

GSK 3 : Glycogen Synthase Kinase 3

HO-1 : Hème-Oxygénase

IC50 : Concentration Inhibitrice de 50% de l’activité

IFN : Interferon

IFN-γ : Intérferon-γ

IGF-1 : Insulin-like Growth Factor-1

IκB : Inhibitor of kappa B

IKK : IB Kinase

IL : Interleukine

IL-1R : IL-1 Receptor

IL-1ra : IL-1 receptor antagonist

iNOS : NO Synthase inductible

IRF : Interferon-Regulatory Protein

JNK : c-Jun Aminoterminal Kinase

LPS : Lipopolysaccharide

MAPK : Mitogen-Activated Prorein Kinase

MAPKK : MAPK Kinase

MAPKKK : MAPK Kinase Kinase

mPGES : membranaire Prostaglandines E Synthase

mTOR : mammalian target of rapamycin

MTT : bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium

MyD88 : Myeloid Differentiation Factor 88

NADPH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate

NF-κB : Nuclear Factor-kappa B

NGF : Nerve Growth Factor

NO : Monoxyde d'azote

NOS : NO Synthase

nNOS : NO Synthase neuronale

NOX : Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate Oxydases

Nrf2 : Nuclear factor-erythroid 2-related factor2

PAMP : Pathogen Associated Molecular Patterns

PBS : Phosphate Buffered Saline

PG : Prostaglandines

PGES : Prostaglandines E Synthases

PIK : Phosphatidylinositol kinase

PI3K : PhosphatIdylinositol 3-Kinase

PIP2 : PhosphatidylInositol 4,5 diPhosphate

PIP3 : PhosphatidylInositol 3,4,5 triPhosphate

PKB : Protein Kinase B

PRR : Pattern Recognition Receptors

RAGE : Receptor for Advanced Glycation Endproducts

ROS : Espèces réactives de l'oxygène

RT : transcription inverse

RT-PCR : Reverse-Transcription-Polymerase Chain Reaction

sFKN : Chemokine Fractalkine

SNC : Système Nerveux Central

SOD : Superoxyde Dismutase

tau : tubule associated unit

TGF : Transforming Growth Factor

TGF-β : Transforming Growth Factor-β

TIR : Toll/IL-1 Receptor Toll-like Receptor

TLR : Toll-like Receptor

TNF-α : Tumor Necrosis Factor-α

TRAM : TRIF-Related Adaptor Molecule

TRIF : TIR-domain-containing adaptor-inducing interferon-β

VIH : Virus de l’Immunodéficience Humaine

Liste des Figures

Figure 1 : Schéma représentant le système nerveux central 5

Figure 2 : Composants de la barrière hémato-encéphalique 6

Figure 3 : Différents types des cellules du système nerveux central 6

Figure 4 : Morphologie des cellules microgliales : de gauche à droite, la transformation

de ces cellules activées de la forme ramifiée à la forme amiboïde (Kreutzberg, 1996) 9

Figure 5 : Transition entre l’état de quiescence (A) et l’état d’activation (B) des

cellules microgliales 9

Figure 6 : Biosynthèse du monoxyde d'azote (NO) 12

Figure 7 : Biosynthèse des prostaglandines 16

Figure 8 : Implication des voies de Nf-κB, de MAPK et de PI3K/Akt dans la réponse

au LPS 18

Figure 9 : Distribution des récepteurs de Toll-Like Receptor 1-9 dans le système nerveux

central 20

Figure 10 : Différents type de Toll-Like Receptor et leurs ligands spécifiques 20

Figure 11 : Voies dépendantes ou indépendantes de MyD88 des différents TLR 21

Figure 12 : Voie de signalisation du facteur nucléaire kappa-B, Nf-κB 22

Figure 13 : Voies de signalisation des mitogen-activated protein kinases 23

Figure 14 : Voie de phosphoinositide 3 kinase et d'Akt 25

Figure 15 : Structure chimique des flavonoïdes les plus communs 27

Figure 16 : Structure chimique des stilbènes les plus communs 30

Figure 17 : Structure chimique du trans-resvératrol 30

Figure 18 : Structure chimique des principaux monomères de stilbènes du vin 31

Figure 19 : Concentrations de NO à différents temps après l’activation des cellules

BV-2 par le LPS 53

Figure 20 : Effets de la vitisine A et de la vitisine B sur la production de NO dans

les cellules BV-2 activées 54

Figure 21 : Expression de la protéine iNOS (A) et le niveau d’ARNm codant pour le

gène iNOS (B) à différents temps après l’activation des cellules BV-2 par le LPS 55

Figure 22 : Effets de la vitisine A et de la vitisine B sur l’expression de la protéine

iNOS (A) et du transcrit correspondant (B) dans les cellules BV-2 activées 55

Figure 23 : Structure de la moracine M 60

Figure 24 : Effets des différentes concentrations de moracine M sur la viabilité des


Figure 25 : Effets de la moracine M sur la production de NO dans les cellules BV-2

activées 61

Figure 26 : Effets de la moracine M sur l’expression de la protéine iNOS (A) et d’ARNm

codant pour son gène (B) dans les cellules BV-2 activées 61

Figure 27 : Concentrations des protéines TNF-α et IL-1β (A) et niveau d’ARNm codant

pour les gènes correspondants (B) après différents temps d’activation des cellules BV-2

par le LPS 62

Figure 28 : Effets de la moracine M sur la production de TNF-α (A) et sur le niveau

d’expression de l’ARNm correspondant (B) dans les cellules BV-2 activées 63

Figure 29 : Effets de la moracine M sur la production d’IL-1β (A) et sur le niveau

d’expression de l’ARNm correspondant (B) dans les cellules BV-2 activées 64

Figure 30 : Concentrations de PGE2 à différents temps après activation des cellules

BV-2 par le LPS 64

Figure 31 : Effets de la moracine M sur la production de PGE2 dans les cellules BV-2

activées 64

Figure 32 : Effets de la moracine M sur l’expression des protéines COX-1, COX-2 et

mPGES-1 dans les cellules BV-2 activées 65

Figure 33 : Effets de la moracine M sur les niveaux de transcrits codant les gènes de

COX-1 et de COX-2 et mPGES-1 dans les cellules BV-2 activées 65

Figure 34 : Expression de la protéine IκB dans les cellules BV-2 à différents temps

après traitement avec du LPS 68

Figure 35 : Translocation nucléaire de Nf-κB/P65 dans les cellules BV-2 après

différents temps de traitement avec du LPS 68

Figure 36 : Effets de la moracine M sur la phosphorylation et la dégradation d’IκB-α

dans des cellules BV-2 activées 69

Figure 37 : Effet de la moracine M sur la translocation nucléaire de Nf-κB/P65 dans

les cellules BV-2 activées 69

Figure 38 : Effets de la moracine M sur la voie des MAPK (p38, JNK et ERK1/2)

dans les cellules BV-2 activées 70

Figure 39 : Effets de la moracine M sur la phosphorylation d’Akt dans les


Figure 40 : Effets de la moracine M sur les niveaux de transcrits codant le gène

de TLR4, dans les cellules BV-2 activées 71

Figure 41 : Schéma des différentes voies de signalisation de la réponse inflammatoire

induite par le LPS dans une cellule microgliale 71

Liste des Tableaux

Tableau 1 : Plantes riches en stilbènes utilisées en médicine traditionnelle 32

Tableau 2 : Résumé des principales études décrivant l'activité anti-inflammatoire de

différents stilbènes au niveau du Système 36

Tableau 3 : Liste des anticorps primaires spécifiques utilisés pour détecter les protéines

d’intérêt, leurs taux de dilution dans un tampon de blocage Odyssey/PBS(50/50)

et leur fournisseur 47

Tableau 4 : Liste des amorces utilisées pour amplifier les ADNc spécifiques des gènes

étudiés. Les numéros d’accession des séquences utilisées sont notés dans le tableau, ainsi

que la taille des oligonucléotides et la taille de l’amplifiat PCR. La définition de

oligonucléotides a été réalisée en utilisant le logiciel Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/) 50

Tableau 5 : Tableau récapitulant l’origine des stilbènes étudiés, les organes d’où ils ont

été extraits et leur dégré de polymérisation 53

http://frodo.wi.mit.edu/

Introduction générale

1


Dans un monde où l’espérance de vie de l’espèce humaine ne cesse d’augmenter (elle est

aujourd’hui de 80 ans alors qu’elle était de moins de 20 ans dans la Grèce antique), une

croissance des maladies chroniques liées à l'âge est observée. Les maladies chroniques, telles

que les maladies cardiovasculaires, le cancer, le diabète de type 2 et les maladies

neurodégénératives, sont actuellement la première cause de mortalité dans le monde. En 2003,

des experts de l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) et de l’Organisation des Nations

Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (FAO) mettent en évidence le lien entre

l’alimentation, la nutrition, l’exercice physique et le développement des maladies chroniques.

Il est aujourd’hui admis qu’une consommation régulière de fruits et légumes est liée à un effet

bénéfique sur la santé, si bien qu'un encouragement à la consommation de ces aliments

constitue désormais une des principales recommandations formulées par les autorités de santé

publique. Parmi les composés contenus dans l’alimentation, le ß-carotène, les vitamines C

et E, mais également les polyphénols peuvent contribuer à ces effets.

Les polyphénols sont des molécules naturelles issues du métabolisme secondaire des

végétaux. Ils sont largement répandus dans l'alimentation (plusieurs centaines dans les plantes

comestibles) et les principales sources en sont les fruits et légumes, les céréales et les légumes

secs mais également certaines boissons (vin, thé, café, jus de fruits).

De nombreuses recherches ont révélé que la plupart des maladies chroniques sont liées à une

dysrégulation au niveau des voies de signalisation cellulaire de l’inflammation. Au niveau du

cerveau, cette inflammation, appelée neuro-inflammation, peut contribuer à une cascade

d'événements qui aboutissent à la détérioration progressive des neurones observée dans les

troubles neurodégénératifs. Les cellules microgliales sont les cellules immunitaires du

système nerveux central, elles jouent un rôle important dans les processus neuro-

inflammatoires. Plusieurs recherches ont été menées afin de déterminer des molécules ayant

des propriétés anti-inflammatoires, pouvant réduire l’activation exacerbée de ces cellules et

par conséquent éteindre l’inflammation cérébrale.


2

Les stilbènes, une famille de polyphénols, sont produits dans de nombreuses plantes et

présentent un intérêt croissant de par la diversité de leurs activités biologiques. Les stilbènes

peuvent donc fournir une approche d'intervention alternative qui pourrait empêcher ou

retarder l'apparition des maladies neurodégénératives, corriger l'évolution de la maladie et/ou

prévenir des autres dommages.

Dans ce contexte, l’objectif de mon travail est d’approfondir les connaissances sur le rôle des

polyphénols, et en particulier des stilbènes, dans les processus neuro-inflammatoires.

Pour réaliser cet objectif, nous nous sommes intéressés à :

- évaluer les effets anti-inflammatoires de plusieurs stilbènes d’origine naturelle sur un

modèle de cellules microgliales in vitro. Ces composés ont été isolés et purifiés à partir de

différentes plantes (Milicia excelsa, Morus alba, Gnetum africanum et Vitis vinifera) au sein

du Groupe d’Etude des Substances Végétales à Activité Biologique (GESVAB).

- étudier le potentiel pouvoir inhibiteur des stilbènes face à la production de différents

médiateurs inflammatoires (des cytokines et de la prostaglandine), ainsi qu'aux enzymes

intervenant dans ses synthèses.

- identifier les mécanismes moléculaires par lesquels ces composés peuvent prévenir le

développement de processus inflammatoires centraux.

La première partie de ce mémoire est une étude bibliographique concernant l’inflammation

dans le système nerveux central, les cellules microgliales, les différents immuno-modulateurs,

les voies de signalisation impliquées lors de la réponse inflammatoire ainsi que les stilbènes et

leurs effets anti-inflammatoires. Cette étude est suivie d’un descriptif des matériels et

méthodes utilisés au cours de ce travail. Puis nous présentons les résultats obtenus pendant

cette thèse, ainsi que les principales conclusions de ce travail.

Étude bibliographique

3


I. Le vieillissement du système nerveux central

I.A. Le vieillissement et les maladies neurodégénératives

Le vieillissement est un phénomène universel auquel sont confrontés tous les êtres vivants.

Chez l'Homme, par convention, on parle de vieillissement à partir de 65 ans. Il se caractérise

par des changements physiques et anatomiques qui conduisent progressivement à la réduction

des capacités fonctionnelles. Cette diminution est variable en fonction des individus, mais

également chez le même individu, en fonction des différents systèmes, organes et cellules.

Chez l’Homme, le vieillissement dépend de facteurs génétiques et environnementaux, dont le

mode de vie (Busse, 1987 ; Hung et al., 2010).

Les changements liés à l’âge ont pour conséquence une diminution des performances motrices

et cognitives, mais ils peuvent également être à l'origine de différents troubles tels que la

déficience de la fonction rénale, la diminution de la performance respiratoire, l’augmentation

de la pression sanguine et une atteinte de maladies neurodégénératives (Thal et al., 2004 ;

Askanas et al., 2012 ; Wang et Bennett, 2012). Durant le vieillissement, apparaît également

une perte irréversible de la masse cellulaire qui sera plus nocive dans les organes essentiels

comme le cœur, le cerveau et les muscles du squelette.

Chez les personnes âgées, les modifications biologiques s'accompagnent d'une augmentation

de la susceptibilité aux maladies et portent atteinte à leurs capacités d’autoréparation.

Dans le système nerveux central (SNC), le vieillissement se présente donc comme un terrain

propice au développement de maladies neurodégénératives (Lau et al., 2005). Par exemple,

40% des personnes âgées souffrant de troubles cognitifs légers seraient susceptibles de

développer une démence au bout de 3 ans. Ainsi, 11% de la population âgée de plus de 65 ans

et jusqu’à 50% des personnes âgées de plus de 85 ans, répondent aux critères de diagnostic

clinique validant une démence probable de type Alzheimer.


4

Les maladies neurodégénératives sont des maladies qui affectent le fonctionnement du SNC

de façon progressive et qui se caractérisent par une dégénérescence aboutissant à la mort

neuronale.

Ces maladies sont multifactorielles. Elles peuvent être associées à l’accumulation de protéines

spécifiques comme par exemple, le peptide β amyloïde (βA) et la protéine tau (tubule

associated unit) pour la maladie d'Alzheimer, l’α-synucléine pour la maladie de Parkinson, et

la superoxyde dismutase pour la sclérose latérale amyotrophique. Cependant, elles sont dans

tous les cas liées aux différentes modifications que subit le cerveau au cours du

vieillissement, comme des perturbations métaboliques, l’accumulation de radicaux libres et

l’activation chronique de l'inflammation cérébrale.

I.B. L’inflammation dans les maladies neurodégénératives

Le système immunitaire est un système capable de reconnaître les substances étrangères à

l'organisme (virus, bactéries, champignons, etc, …) et de déclencher des mesures de défense

contre celles-ci. Il est constitué de différents types de cellules comme les lymphocytes, les

phagocytes, les granulocytes (cellules immunitaires périphériques) et les microglies

(principales cellules immunitaires du SNC).

Le système immunitaire est à l’origine d’une réponse immune qui peut être innée ou

adaptative. La réponse innée est un mécanisme immédiat de défense non spécifique contre les

pathogènes, tandis que la réponse adaptative se développe suite à un premier contact avec le

pathogène (Winyard et Willoughly, 2003).

L’immunité innée est la plus précoce et se caractérise par la mise en place d’une réaction

inflammatoire. Cette inflammation est déclenchée en réponse à de nombreux stimuli. Elle

induit l'activation des cellules immunitaires qui vont libérer des facteurs inflammatoires tels

que des cytokines et des dérivés réactifs de l'oxygène et de l'azote.

Cette inflammation est bénéfique et transitoire dans la majorité des cas, on parle alors

d'inflammation aiguë. Cependant, dans le cas d’une réponse exacerbée ou inadaptée, qui

évolue en persistant ou en s'aggravant pendant une longue durée, la production de médiateurs

inflammatoires en excès entraîne des effets délétères. On parle alors d'inflammation

chronique (basal inflammation) (Degos et al., 2009).

Dans le système nerveux central, les cellules gliales, et plus particulièrement les cellules

microgliales (ou microglies), constituent les cellules immunocompétentes.


5

L’activation chronique de ces cellules, comme celle ayant lieu lors du vieillissement, aboutit à

une synthèse et un relargage des facteurs inflammatoires. L’accumulation de ces différentes

molécules peut engendrer des dommages sur les neurones. Cette détérioration neuronale

induit alors la libération de facteurs solubles toxiques, qui en retour entretient l’activation des

cellules gliales (Dheen et al., 2007; Block et al., 2007).

L’état inflammatoire du SNC est donc fortement lié à la neurodégénérescence, qu’elle soit

pathologique, ou simplement due au vieillissement.

I.C. Le système nerveux central

Le SNC est composé de deux parties, d'une part l’encéphale, comprenant le cerveau, le tronc

cérébral et le cervelet situés dans la boîte crânienne, et d'autre part la moelle épinière située

dans le canal rachidien (figure 1).

L'encéphale est constitué de différents éléments, les neurones, les cellules gliales et les

vaisseaux sanguins. La répartition de ces éléments dans le SNC permet de distinguer deux

parties, caractérisées par leur teinte, la substance grise et la substance blanche.

La substance grise est formée des corps cellulaires neuronaux et de cellules gliales, et la

substance blanche des fibres axonales myélinisées, des neurones et des cellules gliales. Selon

les régions du SNC considérées, les cellules gliales sont 10 fois plus nombreuses que les

neurones (ossipow et Pellissier, 2007).

Le SNC a plusieurs fonctions essentielles pour le corps dont coordonner les mouvements,

contrôler le fonctionnement des organes, véhiculer les informations sensorielles et motrices

vers les effecteurs et réguler l’intellect. Le système nerveux est responsable du bon

fonctionnement des activités végétatives et motrices

I.C.1. La barrière hémato-encéphalique

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une barrière de diffusion essentielle pour la

fonction normale du SNC. Elle sépare la circulation sanguine du liquide céphalo-rachidien, le

fluide dans lequel baignent le cerveau et la moelle épinière. La BHE est composée


6

principalement de cellules endothéliales, des pieds des prolongements astrocytaires et des

péricytes (figure 2).

Les cellules endothéliales des capillaires cérébraux diffèrent de celles du reste de l’organisme

car elles sont liées par des jonctions serrées ayant une résistance très élevée qui empêche la

diffusion des molécules hydrophiles à travers la BHE et empêche les substances toxiques qui

se trouvent dans la circulation sanguine de pénétrer librement dans le SNC. En revanche, les

petites substances lipophiles telles que l'oxygène et le dioxyde de carbone peuvent diffuser

librement et d’autres substances comme certains nutriments (glucose et acides aminées)

peuvent passer via des transporteurs à travers les membranes plasmiques. (Ballabh et al.,

2004 ; Sá-Pereira et al., 2012).

I.C.2. Les différentes cellules du SNC

Les différents types de cellules présentes dans le SNC sont les neurones et les cellules gliales.

Ces cellules sont présentées sur la figure 3, et sont détaillées dans les paragraphes suivants.

I.C.2.1 Les neurones

La cellule nerveuse « ou neurone » est l'unité fonctionnelle du SNC. C'est une cellule

hautement spécialisée. Le cerveau adulte contient entre 1011

et 1012

neurones (Emerit et al.,

2004). Les neurones sont généralement constitués de trois éléments principaux :

- le soma ou corps cellulaire contient le noyau cellulaire et le cytoplasme, sa forme est

très variable.

- les dendrites sont des extensions qui servent à augmenter la surface de réception de

l'influx nerveux. Le nombre d'embranchements est caractéristique du type de neurone.

- l'axone est un prolongement unique issu du corps cellulaire. Il est connecté aux

dendrites d'autres neurones. Le but de l'axone est de transmettre un signal

électrochimique à d'autres neurones, parfois sur une distance considérable.

L'écart entre axone et dendrite est une synapse. Chaque neurone contient entre 1000 et 10000

synapses. Les neurones forment un réseau sophistiqué de connexions, qui permet de

redistribuer l'information, en parallèle ou en série, dans différentes aires corticales. Les

messages transitent selon deux formes différentes : électrique à l'intérieur du neurone, et, le

plus souvent, chimique pour passer d'un neurone à l'autre (Kierszenbaum, 2002).


7

I.C.2.2. Les cellules gliales

Les cellules gliales représentent environ 50% du volume cérébral. Elles présentent de

nombreuses fonctions. Principalement, elles assurent le lien entre les vaisseaux sanguins et les

neurones, et apportent les nutriments essentiels au fonctionnement métabolique des cellules

du SNC. Contrairement aux cellules neuronales, les cellules gliales sont capables de se

multiplier. Il existe plusieurs types de cellules gliales : les astrocytes, les oligodendrocytes, les

péricytes et les microglies (Jessen, 2004; Ossipow et Pellissier, 2007).

Les astrocytes

Parmi les cellules gliales, les astrocytes sont les plus nombreuses. Elles ont un corps cellulaire

volumineux d'aspect étoilé, ramifié. Leurs prolongements, de formes variées et de faible

longueur, s’élargissent en pieds astrocytaires au contact des autres cellules (Jessen, 2004 ; Sá-

Pereira et al., 2012). Ces cellules présentent plusieurs fonctions qui aident au soutien

physique et métabolique des neurones. Par exemple, les astrocytes fournissent le lactate qui

est un substrat énergétique utilisé dans l’activité glutaminergique. Le lactate agit en synergie

avec le glucose afin de fournir l'énergie nécessaire pour le cerveau (Jessen, 2004 ; Pellerin et

Magistretti, 2004). Les cellules astrocytaires participent au soutien de la barrière hémato-

encéphalique, en effet leurs pieds vont entourer les vaisseaux sanguins et donc les isoler au

sein même du cerveau (Sá-Pereira et al., 2012). De plus, elles sont capables de se lier à des

neurotransmetteurs comme le glutamate, l’acide gamma-aminobutyrique et la D-sérine à

l’aide de récepteurs spécifiques. Elles peuvent donc influencer l’efficacité synaptique

(Panatier et al., 2006). Elles jouent également un rôle dans la réparation du système nerveux

en produisant de nombreux facteurs neurotrophiques et neuroprotecteurs. De plus, les

astrocytes participent à la fonction immunitaire (Minagar et al., 2002).

Les oligodendrocytes

Les oligodendrocytes sont des petites cellules dont les prolongements s’enroulent autour des

neurones et forment une gaine de myéline. Elles assurent ainsi la protection et le soutien aux

neurones ainsi que l’isolation ionique, ce qui rend la transmission des signaux électriques

rapide dans le cerveau (Bergles et al., 2000 ; Jessen, 2004). Elles sont également capables de

sécréter de nombreux facteurs de croissance (Dai et al., 2003).


8

Les péricytes

Les péricytes sont des cellules ramifiées intégrées dans la membrane basale des capillaires et

des veinules post-capillaires. La contraction de ces cellules contrôle la perméabilité des

capillaires. Le degré de présence des péricytes autour d'un vaisseau sanguin varie selon le

type de tissu et semble être en corrélation avec le degré d'étanchéité des jonctions entre les

cellules endothéliales (Ribatti, 2011).

Les cellules microgliales

Chez l’Homme adulte, les cellules microgliales représentent en moyenne 12% des cellules du

SNC, et leur densité varie selon les régions du cerveau de 0,5 à 16,6%. Elles sont

principalement présentes dans la matière grise du cerveau. La plus forte concentration de ces

cellules se trouve dans l’hippocampe, le télencéphale olfactive et les noyaux gris centraux

(Block et al., 2007).

Nous détaillerons dans le paragraphe suivant leurs caractéristiques et leurs rôles dans le SNC.

II. Les cellules microgliales, principales cellules immunitaires

du SNC

Les cellules microgliales se distinguent des autres cellules gliales par leur origine, leur

morphologie et leur fonction.

II.A. Origine, morphologie et fonctions des cellules microgliales

II.A.1. L’origine des cellules microgliales

Les cellules microgliales sont souvent définies comme les macrophages résident du SNC.

Cependant, contrairement aux macrophages qui proviennent de la moelle osseuse (site de

l’hématopoïèse adulte), les cellules microgliales proviennent du sac vitellin (organe extra-

embryonnaire qui est le premier site de l’hématopoïèse embryonnaire). Elles migrent ensuite

vers le cerveau durant l'embryogenèse précoce. Leur prolifération et leur différenciation sont

dépendantes d'un ensemble de facteurs de transcription et de récepteurs de facteurs de


9

croissance qui sont très proches de ceux nécessaire pour le développement des macrophages.

Leur durée de vie est plus courte que celle des macrophages (Saijo et Glass, 2011).

II.A.2. La morphologie des cellules microgliales

Les cellules microgliales présentent une morphologie différente selon leur état d'activation

(figures 4 et 5). Lorsqu'elles sont « au repos » ou quiescentes, elles sont fortement ramifiées.

Par contre, suite à leur activation par des stimuli exogènes, infectieux ou traumatiques, elles

subissent des modifications morphologiques et prennent une forme amiboïde (Saijo et Glass,

2011 ; Nimmerjahn et al., 2005).

Dans le cerveau âgé, les cellules microgliales subissent des changements morphologiques et

immunophenotypiques. Au niveau morphologique, ces cellules sont caractérisées par des

anormalités dans leur structure cytoplasmique comme l’atrophie et la suppression de leurs

ramifications, de plus, elles portent fréquemment des renflements sphéroïdaux ou en forme de

bulbe (Streit, 2006).

II.A.3. Les fonctions des cellules microgliales

Dans les conditions physiologiques, les cellules microgliales ont de multiples fonctions

nécessaires à l’équilibre du SNC.

Elles sécrètent des facteurs de croissance comme le facteur de croissance neuronale (Nerve

Growth Factor, NGF) et d’autres facteurs neurotrophiques tels que le facteur de croissance

analogue à l'insuline (Insulin-like Growth Factor-1, IGF-1), le facteur neurotrophique dérivé

du cerveau (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) et le facteur de croissance

transformant-β (Transforming Growth Factor-β, TGF-β) afin d’initier la réparation des

neurones, des cellules gliales ou des vaisseaux sanguins (Elkabes et al., 1996 ; Polazzi et

Monti, 2010).

Elles peuvent également jouer un rôle dans la plasticité synaptique. En effet, les cellules

microgliales quiescentes peuvent établir des connexions avec des éléments pré- et post-

synaptiques, dont la fréquence est liée à l’activité neuronale (Wake et al., 2009).


10

La principale fonction des cellules microgliales est d'assurer la première ligne de défense en

cas de lésions ou de maladie. Ce sont les principales cellules immunitaires du cerveau. Leurs

prolongements leur permettent de communiquer avec les neurones, les autres cellules gliales,

mais également d’effectuer une « surveillance continue » de leur environnement. Ces cellules

sont responsables de la phagocytose des débris présents dans l’espace extracellulaire venant

de lésions tissulaires, de la mort neuronale, de plaques ou de corps étrangers (Aloisi, 2001).

Leurs stimulations conduisent à l'activation de nombreuses voies de signalisation impliquées

dans la réponse immunitaire engendrant la production de différents médiateurs inflammatoires

comme des espèces réactives de l’oxygène et de l'azote, des cytokines inflammatoires et des

prostaglandines (Streit, 2006). Elles peuvent également exercer la fonction de présentation à

l’antigène.

Une des caractéristiques des cellules microgliales est leur capacité à répondre aux lésions dès

les stades précoces de celles-ci. De plus, ces cellules répondent aux changements subis par le

cerveau dans son intégralité, mais également aux altérations dans leur microenvironnement

(Kreutzberg, 1996; Polazzi et Monti, 2010).

Lors du vieillissement, la réponse immunitaire est hyperactivée. L'activation exacerbée et

chronique des cellules microgliales peut s’avérer nocive et leur confère un rôle dans les

pathologies du SNC. En effet, les cellules microgliales activées déclenchent des processus

cellulaires conduisant à une réponse inflammatoire inadaptée. Cette réponse est caractérisée

par la suractivation de voies de signalisation et la libération importante de médiateurs

inflammatoires, ces composés produits en excès se montrent alors neurotoxiques (Lucin et

Wyss Coray, 2009 ; Frank-Cannon et al., 2009). Ce phénomène, qualifié de « neuro-

inflammation », est impliqué dans les maladies neurodégénératives telle que les maladies

d’Alzheimer, de Parkinson et de la sclérose en plaque (Block et Hong, 2005 ; Brown et Neher,

2010).

Ainsi, plusieurs auteurs soulignent le rôle paradoxal de ces cellules en donnant comme titres à

leurs articles " Microglie : l'ennemi intérieur" et "Microglie : gardien du SNC" (Kempermann

et Neumann, 2003; Tambuyzer et al., 2009; respectivement).


11

II.B. Les immuno-modulateurs produits par les cellules microgliales

Les cellules microgliales produisent une grande variété de substances biochimiques qui

peuvent être classées en médiateurs pathogéniques ou en médiateurs protecteurs (Streit et

Xue., 2009).

II.B.1. Les médiateurs pathogéniques

II.B.1.1 Les espèces réactives de l'oxygène

Les espèces réactives de l'oxygène (Reactive Oxygen Species, ROS) sont des espèces

chimiques telles que les radicaux hydroxyles, superoxydes et peroxydes. Elles sont obtenues

par réduction du dioxygène. La plupart possèdent un ou plusieurs électrons non appariés sur

leur couche externe ce qui leur confère une grande instabilité et une très forte réactivité face à

de nombreux composés. Les ROS interviennent dans différents systèmes de signalisation

cellulaire et présentent également une activité antimicrobienne. Cependant, ils deviennent

délétères dès lors qu’il y a un déséquilibre de leur production entrainant un stress oxydant. Ils

peuvent alors induire différents dommages tels qu’une dégradation de la membrane

mitochondriale et l’altération oxydative de macromolécules biologiques comme les protéines,

les lipides ou encore les acides nucléiques, phénomènes pouvant induire la mort cellulaire

(Beaudeux et al., 2006).

Les principales enzymes responsables de la production des ROS dans les cellules sont les

nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydases (NOX) et le complexe

enzymatique mitochondrial de la chaîne respiratoire (Huo et al., 2011 ; Emerit et al., 2004).

Les NOX sont des complexes enzymatiques membranaires. Chez l'Homme, il existe plusieurs

NOX, dont la NOX-2 qui se trouve dans les cellules neuronales et gliales, y compris dans les

microglies. L’activation des cellules microgliales entraine la phosphorylation et la

translocation d’une sous-unité cytoplasmique vers la membrane plasmique qui va générer des

ROS (Huo et al., 2011).

Au cours du vieillissement, les lysosomes des mitochondries des cellules microgliales

subissent un déclin fonctionnel qui induit une baisse du taux de production d’ATP et une

augmentation de la libération des ROS (Nakanishi et Wu, 2009). Ce dysfonctionnement


12

mitochondrial est un mécanisme pathologique commun observé lors du vieillissement et des

maladies neurodégénératives (Emerit et al., 2004).

II.B.1.2 Le monoxyde d'azote

Les effets biologiques du monoxyde d'azote

Le NO est un médiateur biologique, il présente de multiples effets au sein de l'organisme, tant

bénéfiques que potentiellement délétères. C'est un médiateur central des systèmes neuro-

musculaire, cardiovasculaire et immunitaire. Le NO est une molécule vasodilatatrice qui

augmente le calibre des vaisseaux par élongation de leurs fibres musculaires chez l’Homme et

dans différentes espèces animales (Hellsten et al., 2012). Dans le SNC, le NO joue un rôle de

neurotransmetteur important dans le contrôle de l’activité et de la plasticité neuronale (Song et

al., 2012 ; Tozer et al., 2012).

La biosynthèse du monoxyde d'azote

Le monoxyde d'azote (NO) est un composé chimique formé d’un atome d’oxygène et d'un

atome d’azote. C'est un gaz dans les conditions normales de pression et de température. Le

NO est formé à partir de la L-arginine et de l’oxygène sous la dépendance d’une famille

d’enzymes, les NO synthases (NOS) (figure 6). Les NOS sont des enzymes ubiquitaires et

sont de deux types : les NOS constitutives (cNOS) et les NOS inductibles (iNOS).

Les cNOS sont calcium/calmoduline-dépendantes. Leurs activités s'expriment en dehors de

toute stimulation. Elles produisent de façon permanente de faibles quantités de NO de l’ordre

de la picomole. Il y a deux isoformes de cNOS, la nNOS qui est présente dans les cellules

neuronales et l’eNOS qui se trouve dans les cellules endothéliales (Beaudeux et al., 2006).

En ce qui concerne les iNOS, la présence de calcium est également nécessaire à leur activité,

mais à une concentration intracellulaire beaucoup plus faible que celle pour les cNOS. Les

iNOS ne sont pas exprimées dans les cellules en état physiologique, mais elles sont induites

lors d’une réponse immunitaire. Il a été montré que les iNOS sont exprimées dans les cellules

microgliales et les cellules intestinales endothéliales suite à une activation par un stimuli

inflammatoire (Sabry et Dinh-Xuan, 1996 ; Hatoum et al., 2003).


13

Le monoxyde d'azote dans le système nerveux central

Dans les conditions d'inflammation du SNC, une augmentation de la production de NO dans

les neurones, mais également dans les cellules gliales (astrocytes et cellules microgliales)

activées est observée. En effet, Doherty a mis en évidence une augmentation de l'expression

d’iNOS dans les tissus post-mortem provenant de personnes atteintes de maladies

neurodégénératives (2011). Suite à sa synthèse, l’iNOS produit des concentrations élevées et

soutenues de NO de l’ordre de la nanomole qui diffusent rapidement vers les neurones voisins

sur lesquels ils peuvent être toxiques (Beaudeux et al., 2006). Ainsi le NO et les voies de

signalisation impliquées dans sa production ont un rôle important dans les maladies

neurodégénératives.

II.B.1.3. Les cytokines

Les cytokines sont des peptides de faible poids moléculaire (entre 8 et 50 kDa). Elles sont

synthétisées et sécrétées par différents types cellulaires, mais principalement par les cellules

impliquées dans la réponse immunitaire (réaction inflammatoire et hypersensibilité). Les

cytokines interviennent en tant que facteurs de communication intercellulaire. Elles peuvent

agir localement ou à distance (Ponvert, 1997).

Les cellules gliales, et plus particulièrement les cellules microgliales, sont capables de libérer

de nombreuses cytokines, telles que la famille des interleukines (IL), les interférons (IFN), le

facteur de nécrose tumorale (Tumor Necrosis Factor, TNF) et le facteur de croissance de

transformant (Transforming Growth Factor, TGF) (Szelenyi, 2001).

Les cytokines peuvent être classées en fonction de leurs actions biologiques. En général trois

groupes sont définis :

- les cytokines qui peuvent stimuler ou inhiber la prolifération de différents types de

cellules. Ce sont les cytokines IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-10, IL-11, IL-12.

- les cytokines pro-inflammatoires qui ont pour fonction d’augmenter l’intensité et la

durée de la réponse immunitaire. Cette classe comprend les cytokines IL-1, IL-6, IL-8,

TNF-α/β, IFN-γ,…

- les cytokines anti-inflammatoires ou inhibitrices de l’inflammation qui regroupent

l’antagoniste du récepteur à l'IL-1 (IL-1ra), le TNF-α binding protein, l’IL-1 binding

protein, le TGF-β, … (Gruys et al., 2005).


14

Par conséquence, les effets soit neuroprotecteurs, soit neurotoxiques des cytokines sont liées à

la balance entre les cytokines pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. Les cytokines pro-

inflammatoires décalent la balance vers l’inflammation, et d’un autre côté, les cytokines anti-

inflammatoires maintiennent l’homéostasie et protègent la viabilité cellulaire par l’inhibition

de la réponse inflammatoire.

L’altération de l’expression des cytokines dans le cerveau est observée dans les troubles de

SNC. Une modification dans l’équilibre de balance entre la production de cytokine en faveur

de cytokine pro-inflammatoires est fortement liée au processus de neurodégénérescence

(Szelényi, 2001).

Le facteur de nécrose tumorale

Le TNF-α est un des principaux médiateurs de l’inflammation, il joue un rôle central dans

l'initiation et le maintien de la réponse inflammatoire. Dans le SNC, cette protéine soluble de

17kDa, est synthétisée par les cellules gliales et par certaines populations de neurones.

Dans les cerveaux sains, les concentrations de TNF-α sont très faibles et son rôle

physiologique n’est pas réellement défini. Lors d’une inflammation, le TNF-α va être produit

principalement par les microglies activées, mais également par les astrocytes (McCoy et

Tansey, 2008). Il existe deux récepteurs du TNF-α, le TNFR1 (p55) et le TNFR2 (p75)

présents sur tous les types de cellules du SNC. Ainsi, d'une part, le TNF-α peut stimuler les

voies de signalisation liées à l'inflammation au niveau microgliale, et d'autre part, induire

l'excitotoxicité glutaminergique et l'activation des caspases liée à l’apoptose dans les neurones

(Pickering et al., 2005). Il est donc doublement lié à la mort neuronale.

Des niveaux élevés de TNF-α ont été observés chez des patients atteints de maladies

neurodégénératives associées à la neuro-inflammation, comme la maladie d'Alzheimer, la

maladie de Parkinson ou la démence associée au virus de l’immunodéficience humaine (VIH)

(Belarbi et al., 2012).

L’interleukine-1

Les interleukines-1 (IL-1) sont des cytokines qui possèdent plusieurs effets biologiques dans

l’activation des phénomènes inflammatoires, l'excitotoxicité, l'ischémie et une fonction

importante dans les réponses neuro-immunitaires (Allan et al., 2005).


15

La famille des IL-1 est constituée de trois membres IL-1α, IL-1β et IL-1ra. Ces IL-1 sont

constitutivement exprimées dans le SNC en concentrations très faibles ou indétectables, mais

la présence des stimuli inflammatoires entrainent l’expression des gènes codant pour les IL-1α

et IL-1β. Ces deux protéines alors synthétisées agissent en agoniste et se fixent sur un

récepteur plasmatique membranaire spécifique, IL-1 type-1 récepteur (IL-1R) qui déclenche

la traduction de signaux inflammatoires (Allan et Rothwell, 2001).

Patel et ses collaborateurs (2005) ont mis en évidence une corrélation entre les taux de

cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-1β, IL-6) et la présence du peptide βA dans le

cerveau de souris transgéniques développant la maladie d'Alzheimer. D'autre part, des taux

élevés d’IL-1β ont étés mis en évidence dans les cerveaux de patients atteints de maladie

d’Alzheimer ou du Syndrome de Down (Rothwell, 1991)

Le TNF-α et l’IL-1β sont capables d'activer des voies de signalisation impliquées dans la

réponse inflammatoire (voies de signalisation qui seront précisées dans la section III). Ces

cytokines possèdent une action autocrine. Dans les cellules gliales, elles induisent en effet leur

propre production, mais également la production d’autres cytokines, ce phénomène engendre

une suractivation des microglies. Les cellules entrent alors dans un cercle vicieux où la

production de cytokines pro-inflammatoires entretient la réaction inflammatoire.

II.B.1.4. Les prostaglandines

Les prostaglandines : généralités

Les prostaglandines (PG) sont des métabolites lipidiques oxygénés. Ces substances sont

classées en 3 groupes, les séries 1, 2 et 3 qui dépendent de leurs précurseurs : l'acide di-homo-

-linoléique, l'acide arachidonique et l'acide eicosapentaénoïque, respectivement. Les PG les

plus largement distribuées et les mieux caractérisées sont celles de la série 2, contenant les

PGD-2, PGE-2, PGF-2, le thromboxane et la prostacycline (Clària et al., 2003).

Les PG jouent un rôle majeur dans la physiologie et la pathologie humaine. Elles

interviennent dans de nombreux organes tels que le cœur, les reins, l'intestin, le cerveau et de

nombreux systèmes tels que les systèmes immunitaire, respiratoire, reproducteur,

neurologique (Miller, 2006).


16

La biosynthèse des prostaglandines

La synthèse des PG fait intervenir plusieurs enzymes (figure 7) : les cyclooxygénases (COX)

et différentes isomérases ou synthases (Jouzeau et al., 2004).

Les COX sont des enzymes membranaires qui jouent un rôle clé dans la synthèse des PG,

puisqu'elles catalysent les 2 premières étapes de cette synthèse. Elles transforment l'acide

arachidonique en PGG2 (par cyclooxygénation) puis le PGG2 en PGH2 (par peroxydation). Il

existe plusieurs isoformes de la COX, l’isoforme de type 1, la COX-1 et celle de type 2, la

COX-2. Il est admis depuis longtemps que la COX-1 est exprimée constitutivement dans

presque tous les tissus tandis que la COX-2 est induite principalement en réponse aux stimuli

inflammatoires. Cependant des données récentes ont remis en question cette vision, montrant

que la COX-1 n'est pas seulement responsable de la production physiologique de PG, mais

cette enzyme peut également être inductible (Aïd et Bosetti, 2011).

Dans le SNC, la COX-1 est principalement exprimée dans les cellules microgliales. La

COX-2 est produite par les astrocytes et les cellules microgliales stimulées par des médiateurs

inflammatoires, alors qu'elle est exprimée constitutivement dans les neurones en conditions

physiologiques (Hewett et al., 2006).

La conversion de la PGH2 en PG de la série 2 (PGD2, PGE2, PGF2, thromboxane et

prostacycline) dépend des isomérases et des synthases qui sont exprimées sélectivement dans

certains tissus ou certains types cellulaires (Jouzeau et al., 2004).

La prostaglandines E2

La PGE2 est la PG la plus largement produite dans l'organisme (cerveau, reins, muscles lisses

et plaquettes), elle présente un grand nombre de fonctions biologiques incluant des fonctions

reproductive, neuronale, métabolique et immune. Sa synthèse à partir du PGH2 fait intervenir

trois PGE synthases (PGES) dont deux sont membranaires (mPGES-1 et mPGES-2) et une

cytosolique (cPGES).

Au niveau du SNC, la PGE2 est généralement considérée comme faisant partie des composés

les plus impliqués dans les processus de neuro-inflammation. Il apparait, en effet, que la

concentration en PGE2 dans le liquide cérébrospinal de patients atteints des maladies

d'Alzheimer et de Parkinson est plus élevée que celle des sujets sains du même âge (Montine

et al., 1999 ; Mattammal et al., 1995). De plus, l'expression des mPGES dans les cerveaux de

patients atteints de la maladie d'Alzheimer est augmentée (Chaudhry et al., 2008; 2010).

Cependant, certains travaux ont mis en évidence que la PGE2 pouvait au contraire atténuer


17

l'inflammation en réduisant l'activation microgliale, et donc le taux de cytokines pro-

inflammatoires et d'iNOS (Caggiano et al., 1998 ; Zhang et Rivest, 2001). Différents auteurs

suggèrent que ces effets opposés observés pourraient être en partie expliqués par l'existence

de plusieurs récepteurs de ces PG. En effet, PGE2 peut se lier à quatre récepteurs EP 1 à 4

(Prostaglandin E receptor), dont les taux d'expression sont très variables selon les types

cellulaires. Ce qui peut induire une variabilité importante de la réponse (Chaudhry et al.,

2010; Andreasson et al., 2010)

II.B.1.5. Les chémokines

Les chémokines sont des polypeptides qui jouent un rôle dans la communication

intracellulaire et le recrutement des cellules inflammatoires. Par ailleurs, les chémokines

peuvent modifier la perméabilité de la BHE en altérant les protéines de jonction (Degos et al.,

2009). La chémokine CXCL10 est exprimée fortement par les astrocytes, les cellules

microgliales et les neurones dans plusieurs maladies neurodégénératives (Rappert et al.,

2004).

II.B.2. Les médiateurs protecteurs

Il existe plusieurs médiateurs capables de réguler négativement l’inflammation provoquée par

les cellules microgliales activées. Ce sont des médiateurs endogènes, produits par les cellules

microgliales elles-mêmes, ou exogènes, produits par d’autres types cellulaires. Par exemple,

certaines cytokines présentent des effets protecteurs contre la neuro-inflammation comme

l'IL-4 et l'IL-10 (Szelényi, 2001).

IL-4 est une cytokine anti-inflammatoire produite par les cellules neuronales, les astrocytes

mais aussi par les cellules microgliales. Elle est capable d'inhiber la production des

médiateurs inflammatoires par les microglies in vivo et in vitro (Ledeboer et al., 2000 ; Zhao

et al., 2006 ; Fenn et al., 2012). Il a été montré que l’addition d’IL-4 à des co-cultures de

cellules primaires de microglies et de motoneurones (cellules spécialisées du système nerveux

impliquées dans la motricité) peut protéger ces dernières des lésions induites par les

microglies activées par le lipopolysaccharide (LPS). Son effet neuroprotecteur agit

principalement par la réduction de la production de NO et l’inhibition de la libération d’O2- à

partir des cellules microgliales activées (Zhao et al., 2006). Park et ces collaborateurs, 2005


18

ont montré pour la première fois que les microglies peuvent produire l’IL-4 in vivo après

injection intracorticale de LPS. Selon les auteurs l’IL-4 peut réguler l'inflammation cérébrale

en provoquant la mort des cellules microgliales activées et l'augmentation de la survie

neuronale.

De plus, la chémokine soluble fractalkine (sFKN) induit l'expression d’une enzyme anti-

oxydante, l’hème oxygénase-1, dans les microglies en l'absence de la production des

molécules neurotoxiques, y compris NO, TNF-α, et le glutamate. Le traitement en sFKN de la

co-culture des cellules primaires neuronales et microgliales atténue significativement la mort

des cellules neuronales induite par le glutamate (Noda et al., 2011).

III. Activation des cellules microgliales

Toute réponse cellulaire initiée par un signal est le résultat d’une suite d’évènements qui

peuvent être résumés par l’interaction du signal avec un récepteur, l’activation d’une voie de

signalisation intracellulaire et enfin la réponse biologique.

Concernant la réponse inflammatoire au niveau du SNC, les principaux acteurs sont les

cellules microgliales. La transition entre l’état de quiescence et l’état d’activation de ces

cellules est déclenchée dès l’apparition de différents signaux, dont la nature biochimique et

les sources sont très variées.

Suite à l'activation des cellules microgliales, les processus cellulaires de régulation de

l'inflammation sont déclenchés. Ils font intervenir de nombreuses voies de signalisation,

comme celles impliquant le facteur de transcription "Nuclear Factor kappa B" (NF-κB), les

"Mitogen-Activated Protein Kinase" (MAPK), les Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt

(PI3K/Akt) et d'autres facteurs de transcription (figure 8).

Une des particularités du phénomène inflammatoire est qu'il peut être maintenu par la

présence continue des facteurs pathogéniques et des lésions, et par la production des cytokines

pro-inflammatoires. Dans ce cas, les cellules microgliales sont en état chronique d’activation

(Nakanishi et Wu, 2009).

Les cellules microgliales sont activées dans de nombreuses pathologies du SNC, comme les

accidents vasculaires cérébraux, les infections du cerveau (la démence du SIDA et la

méningite bactérienne) et les maladies neurodégénératives. Cette activation est également

observée lors du vieillissement normal.


19

III.A. Les stimuli inflammatoires et leurs récepteurs

III.A.1. Généralités

De nombreux signaux sont capables d'activer les cellules microgliales. En effet, ces stimuli

peuvent être des composants de la paroi bactérienne, des enveloppes virales, de l'Acide

DésoxyriboNucléique (ADN) bactérien, de l’Acide Ribonucléique (ARN) viral, des prions,

regroupés sous le nom de motifs moléculaires associés aux pathogènes (Pathogen Associated

Molecular Patterns, PAMP). Ils peuvent être également des débris cellulaires, des peptides

comme le peptide βA, regroupés sous le nom de motifs moléculaires associés aux lésions

(Damage-Associated Molecular Patterns, DAMP). De plus, les cellules microgliales peuvent

également être activées par des cytokines pro-inflammatoires (INF-γ, TNF-α, IL-1β) (Tang et

al., 2012)

Les cellules microgliales expriment de nombreux récepteurs chargés de reconnaître les

différents motifs moléculaires, ce sont les Pattern Recognition Receptors (PRR). Les

récepteurs dirigés contre les PAMP sont principalement des Toll-like receptors (TLR) et des

NOD-like receptors, et ceux dirigés contre les DAMP sont des récepteurs des AGE (Receptor

for Advanced Glycation Endproducts, RAGE), des récepteurs purinergiques et les TLR.

(Block et al., 2007 ; Brown et Neher, 2010).

Dans ce manuscrit, nous détaillerons un exemple de signal et de son récepteur, celui du LPS

et de TLR-4.

III.A.2. Le lipopolysaccharide et son récepteur TLR-4

III.A.2.1. Le lipopolysaccharide

Le LPS représente la principale composante non protéique de la surface externe des bactéries

Gram négatives ; c'est une endotoxine. Il est formé de trois parties, le lipide A, l’antigène O et

le noyau. Le lipide A est la partie responsable de l’induction de la réponse immunitaire non

spécifique. Il induit le même effet que le LPS complet purifié. L’antigène O est de nature

polysaccharidique, spécifique d'une espèce à une autre. Il se situe à l’interface entre la

bactérie et le milieu extérieur, représente la partie immunogénique spécifique du LPS, et

influence la relation hôte-bactérie à différents niveaux. Le noyau, de nature


20

polysaccharidique, représente le pont entre les deux autres parties et est divisé à son tour en

deux parties, le noyau interne plutôt hydrophobe et le noyau externe plutôt hydrophile (Wang

et Quinn, 2010 ; Szalo et al., 2006).

Le LPS initie de nombreuses réponses cellulaires qui jouent un rôle critique dans les réponses

inflammatoires et photogéniques.

III.A.2.2. Le Toll-Like Receptor de type 4

Parmi les PRR, la famille des TLR regroupe des protéines transmembranaires impliquées dans

la reconnaissance et la défense contre des composés spécifiques de pathogènes. La famille des

TLR est constituée de 11 membres chez l’Homme. Dans le SNC (figure 9), les TLR 1 à 9 sont

exprimés ou non selon le type cellulaire, mais tous sont exprimés dans les cellules

microgliales (Hanke et Kielian, 2011).

Structurellement, les TLR présentent 2 domaines : un domaine extracellulaire (comportant de

nombreux motifs riches en leucine) qui est nécessaire à la reconnaissance du ligand, et un

domaine cytoplasmique qui montre une forte similarité avec celui de la famille des récepteurs

pour IL-1. Ce dernier est donc appelé Toll/IL-1 récepteur (TIR). Chaque TLR reconnaît de

façon spécifique quelques ligands exogènes ou endogènes (figure10) (Takeda et Akira, 2004).

Le TLR4 est l’un des TLR les mieux caractérisés, il est présent à la surface des différentes

cellules du système immunitaire. Le TLR4 est considéré comme le récepteur principal du

LPS. Ce dernier entraine l’activation du récepteur TLR4 conduisant à la production excessive

de plusieurs médiateurs inflammatoires (Lu et al., 2008 ; Hanke et Kielian, 2011).

La liaison du ligand avec son TLR induit un changement de conformation du récepteur qui va

alors se lier à une protéine adaptatrice grâce à son domaine TIR intracellulaire. Les

principales protéines adaptatrices associées aux TLR sont le facteur de différenciation

myeloïde 88 (myeloid differentiation factor 88, MyD88), le domaine TIR contenant un

adaptateur induisant l'interféron β (TIR-domain-containing adaptor-inducing interferon-β,

TRIF) et le TRIF-related adaptor molecule (TRAM). Aujourd'hui, deux voies de transduction

du signal TLR sont décrites, la voie dépendante et la voie indépendante de MyD88, cette

dernière faisant intervenir TRIF et/ou TRAM. L'implication de l'une de ces voies, ou des

deux, mènera alors à des profils de production de médiateurs inflammatoires différents. En

effet la voie dépendante de MyD88 induit une série de phosphorylations conduisant à


21

l’activation de NF-κB et de MAPK, alors que la voie indépendante active la voie interferon-

regulatory protein (IRF). Tous les TLR, sauf TLR3, sont associés à la voie dépendante de

MyD88. TLR3 est associé à la voie indépendante et TLR4 est associé aux deux. La figure11

présente les voies dépendante et indépendante de MyD88. (Hanke et Kielian, 2011 ; Carty et

Bowie, 2011).

Cependant, TLR4 est également capable de stimuler les voies NF-κB et MAPK sans passer

par l’intermédiaire de MyD88, mais par l'intermédiaire de TRAM associé à TRIF. Takeda et

Akira (2004) soulignent la nécessité de l’activation des deux voies MyD88 (dépendante et

indépendante) pour induire la production des différents médiateurs inflammatoires.

Ces différentes observations montrent la complexité de la régulation des voies de signalisation

par un même récepteur.

III.B. Les principales voies de signalisation impliquées dans

l’inflammation

III.B.1. Le facteur de transcription Nuclear Factor kappa B

La voie de signalisation du facteur de transcription NF-κB est la principale voie impliquée

dans les processus inflammatoires. Depuis son identification, il y a plus de 20 ans, les

mécanismes de régulation de ce facteur de transcription ne cesse d'être étudiés, plus de 3000

revues sont relatives à NF-κB (Hayden et Ghosh, 2008).

Le terme NF-κB est l'abréviation de "nuclear factor k-light-chain-enhancer of activated B

cells", appelé couramment Nuclear Factor kappa B.

Ce facteur nucléaire est ubiquitaire et inductible. L'activation de la voie de signalisation NF-

κB fait intervenir 3 éléments principaux : NF-κB, une sous-unité inhibitrice IB et un

complexe IB Kinase (IKK).

- NF-κB n’est pas une protéine unique, mais un terme générique qui désigne une famille

de facteurs de transcription dimériques composés de l’association de cinq sous-unités

NFκB1 (p50/p105), NFκB2 (p52/p100), RelA (p65), RelB et c-Rel. Ces sous-unités

peuvent former des hétéro- et homodimères avec les autres sous-unités de la famille. De

ce fait, différentes combinaisons seront à l’origine de réponses spécifiques et auront des

effets différents au niveau transcriptionnel. Ainsi, les combinaisons p50/p65, p50/c-Rel,

p65/p65, p65/c-Rel sont toutes transcriptionnellement activatrices alors que les


22

homodimères p50/p50 ou p52/p52 répriment la transcription de leurs gènes cibles

(Ghosh et al., 1998). L’hétérodimère p50/p65 représente la forme de NF-κB la plus

abondante dans les différents types cellulaires.

- La famille des protéines IκB est composée de sept membres dont les plus communs sont

IκBα, IκBβ et IκBε. Les sous-unités IκBα et IκBβ sont principalement associées aux

complexes p50/p65 et p50/c-Rel, alors qu’IκBε s’associe principalement aux

homodimères p65 et c-Rel (Thompson et al., 1995; Whiteside et Israël, 1997).

- Le complexe IKK est constitué, entre autres, de 2 sous-unités catalytiques à activité

kinase, IKK et IKKβ, et d'une sous-unité régulatrice IKK.

Dans des conditions physiologiques normales, NF-κB est séquestré sous forme de dimère

inactif dans le cytoplasme par la sous-unité inhibitrice IB qui masque, par sa liaison, la

séquence de localisation nucléaire de NF-κB. Lors de l'activation de la voie de signalisation,

IB est rapidement phosphorylée par IKK. Elle est ensuite ubiquitinylée, puis dégradée par le

protéasome. Elle libère ainsi NF-κB. Le dimère NF-κB libre subit alors une translocation

nucléaire, se lie aux sites spécifiques de l'ADN et active la transcription de gènes codant pour

des protéines impliquées dans l'immunité, l'inflammation ou la prolifération cellulaire

(Baeuerle et Henkel, 1994). Parmi ces gènes, NF-κB active également le gène codant pour

IBα qui sera alors rapidement néosynthétisée. L'IB s'accumule dans le noyau où elle sera

sumoylée rendant sa dégradation par le protéasome impossible. Les protéines IκBα

nouvellement synthétisées peuvent alors déplacer NF-κB de son site de liaison à l’ADN et

ainsi favoriser sa translocation vers le cytoplasme où le complexe NF-κB/IB restera

disponible pour une nouvelle activation. De cette façon, IκBα joue un rôle de régulateur

négatif de NF-κB (Hay et al., 1999; Hayden et Ghosh, 2008). L'activation de NF-κB est

présentée en figure12.

NF-κB stimule l’expression d’un grand nombre de gènes codant pour des médiateurs de

l’inflammation comme des cytokines pro-inflammatoires par exemple IL-1 et TNF-α et leurs

récepteurs, des chimiokines, des enzymes telles que iNOS et COX-2, des molécules

d’adhésion, des protéines de stress, et des régulateurs de l’apoptose et du cycle cellulaire

(Sarkar et al., 2008).


23

NF-κB présente des caractéristiques originales, en particulier la rapidité de sa régulation, la

grande variété des gènes qu'il contrôle et son implication probable dans des pathologies

diverses. Une régulation appropriée de NF-κB apparaît cruciale (Mohamed et McFadden,

2009).

III.B.2. Les Mitogen-Activated Protein Kinase

Les MAPK sont des sérine-thréonine kinases impliquées dans plusieurs processus cellulaires

comme la régulation de la croissance et la survie cellulaire, la différentiation, l’apoptose et la

réponse immunitaire. Elles sont activées à la suite de l’exposition à des stimuli variés. La voie

de signalisation MAPK implique une cascade de phosphorylations de kinases intracellulaires

et l’activation des facteurs de transcription (Roux et Blenis, 2004).

Chez les cellules mammifères, il existe plusieurs familles de MAPK, dont les trois majeures

sont :

- les extracellular signal-regulated kinases (ERK) 1 et 2 : elles sont principalement

activées par des facteurs de croissance et des hormones, et régulent la prolifération et la

différenciation cellulaires.

- les c-Jun aminoterminal kinases (JNK) 1, 2 et 3 : elles activent principalement les gènes

pro-inflammatoires par l'intermédiaire notamment, du facteur de transcription dimérique

Activator Protein-1 (AP-1) composé d'une protéine de la famille Jun et d'une protéine de

la famille Foc, comme par exemple le complexe c-Jun/c-Fos.

- les p38 kinases (α, β et δ) (Kaminska et al., 2009).

Les voies des JNK et des p38 sont stimulées par les stress environnementaux et les cytokines

pro-inflammatoires, mais également par des irradiations aux ultraviolets, des chocs

thermiques ou osmotiques (Whitmarsh, 2007).

Chaque famille de MAPK est composée d’un système de trois protéines kinases, ce sont les

MAPK, MAPK kinase (MAPKK) et MAPK kinase kinase (MAPKKK). Après activation par

des stimuli extracellulaires, les MAPKKK phosphorylent et activent les MAPKK, ces

dernières vont à leur tour phosphoryler et activer les MAPK. Les différentes kinases

intervenant dans les familles des MAPK sont décrites dans la figure 13 (kaminska et al.,

2009).


24

Suite à leur activation, ces kinases induisent la phosphorylation de protéines cibles au niveau

cytosolique et nucléaire. Ces protéines peuvent être d'autres protéines kinases, des protéines

phosphatases, des protéines du cytosquelette et des protéines transcriptionnelles. Leur

phosphorylation conduit à l’activation de facteurs transcriptionnels comme par exemple

NF-κB, STAT 1/2/3, AP-1 qui réguleront alors l’expression de leurs gènes cibles (Spencer et

al., 2012). Par exemple, les voies de signalisation MAPK via p38 et JNK induisent plus

particulièrement la production de COX-2 et des cytokines TNF-α et IL-6 ; alors que

l'activation d'AP-1 dans les cellules microgliales augmente l'expression iNOS, TNF-α, IL-1β

et COX-2 (Bae et al., 2006; Kang et al., 2004)

III.B.3. La voie de signalisation PI3K/Akt

La voie de signalisation PI3K/Akt a des fonctions de régulation de l’apoptose, de la

croissance et du cycle cellulaire, du métabolisme du glucose, de l’angiogénèse ainsi que de la

réponse inflammatoire. En pathologie cancéreuse, cette voie est fréquemment dérégulée dans

les cellules tumorales (Cantley, 2002).

Akt, également appelée Protein kinase B (PKB), est une sérine-thréonine kinase présente dans

le cytoplasme des cellules en conditions physiologiques normales, sous une forme non

phosphorylée et inactive.

Après activation, la PI3K va entraîner la phosphorylation de lipides membranaires. Elle

catalyse ainsi la formation de phosphatidylinositol 3,4,5 triphosphate (PIP3) à partir de

phosphatidylinositol 4,5 diphosphate (PIP2). L’interaction d’Akt avec les

phosphatidylinositols provoque le recrutement d’Akt au niveau membranaire et des

changements conformationnels d’Akt, ce qui permet à cette dernière d’être phosphorylée sur

deux sites par des phosphatidylinositol dependent kinases (PIK).

Chez l’humain, on dénombre trois isoformes d’Akt (Akt1, Akt2 et Akt3) et Akt1, qui

prédomine dans la plupart des tissus, possède deux sites de phosphorylation : la sérine 473 et

la thréonine 308.

Les principaux effets biologiques de l’activation d’Akt concernent la survie cellulaire à

plusieurs niveaux. Notamment, Akt activée peut inhiber la phosphorylation des protéines pro-

apoptotiques, la caspase 9 et Bad. La protéine Akt peut activer la mammalian target of

rapamycin (mTOR) qui joue un rôle central dans la modulation des signaux prolifératifs.

Akt intervient également dans la régulation du métabolisme cellulaire en inactivant la


25

glycogen synthase kinase 3 (GSK 3) et en activant la glycolyse et le transport du glucose

(Cortot et al., 2006). La voie d’AKT est présentée sur la figure 14.

Il a été également montré que la voie de signalisation PI3K/Akt active IKK et donc active le

facteur de transcription NF-κB (Lu et al., 2009). Récemment, Saporano et al. (2012) montrent

que l'activation de la voie PI3K/Akt induite par le LPS précède l'activation de la voie NF-κB

induite par le LPS. Ces résultats suggèrent que la voie dépendante de PI3K/Akt est impliquée

dans la réponse inflammatoire de cellules microgliales activées par le LPS.

III.C. L'activation des cellules microgliales dans la maladie

d'Alzheimer

La constante augmentation de l’espérance de vie s’accompagne d’une augmentation de la

prévalence des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson, la sclérose en

plaque ou encore la maladie d’Alzheimer. En 2007, cette dernière concernait plus de 860 000

individus en France, et près de 25 millions dans le monde. On considère que ce chiffre

pourrait être multiplié par quatre d’ici 2050.

La maladie d’Alzheimer est caractérisée par des déficits cognitifs qui progressent ensuite vers

des démences irréversibles. Elle est définie par des dégénérescences neuro-fibrillaires dues à

l’accumulation de protéines tau anormalement phosphorylées dans certains neurones, mais

également par l’apparition de plaques séniles (ou plaques amyloïdes) dans l’espace extra-

cellulaire de certaines régions cérébrales (Mucke, 2009). Ces plaques, majoritairement

constituées de peptides βA, sont entourées de prolongements nerveux où s’est accumulée la

protéine tau anormale. De plus, cette pathologie est intimement liée à l'état inflammatoire du

cerveau (Giulian, 1999).

Le peptide βA est un produit du clivage du β-amyloïd precursor protein (APP) (protéine

ubiquitaire portant un domaine transmembranaire) par des sécrétases. Lorsque les peptides βA

sont produits en trop grand nombre ou non dégradés, ils peuvent être polymérisés en

oligomères solubles, puis en fibrilles insolubles qui s’agrègent entre elles, constituant les

plaques amyloïdes (Crouch et al., 2008).

Ces oligomères solubles peuvent induire une cytotoxicité menant à une dégénérescence

neuronale, et deux voies sont possibles : d'une part, les oligomères peuvent agir directement

sur les neurones en induisant leur nécrose et/ou leur apoptose, et d'autre part, cette toxicité


26

peut être indirecte, car ces oligomères peuvent activer des cellules microgliales induisant la

synthèse et le relargage de facteurs inflammatoires (Block et Hong, 2005). En effet, le βA est

capable d'interagir avec différents récepteurs des cellules microgliales, comme le TLR4 et le

TLR2, et avec des co-récepteurs comme le Cluster of Differentiation 14 (CD14) (Hanisch et

Kettenmann 2007; Walter et al., 2007; Udan et al., 2007).

Des études immunohistochimiques post-mortem ont révélé une densité plus élevée de cellules

microgliales au niveau de zones lésées du cerveau chez des patients atteints de maladie

d’Alzheimer. Cette densité est plus importante dans les cerveaux des individus présentant des

plaques amyloïdes que dans ceux des individus présentant des plaques diffuses (Frank-

Cannon et al., 2009). Il a été montré par Hickman et ses collaborateurs (2008) que les cellules

microgliales de souris transgéniques PS1-APP âgées produisent des quantités importantes de

médiateurs inflammatoires et ne présentent pas d’activité phagocytaire contre les peptides βA

contrairement aux cellules microgliales de souris jeunes. Ainsi la sénescence du système

immunitaire du SNC pourrait contribuer à son inflammation chronique (Streit, 2006 ; Luo et

al., 2010).

De plus, de nombreuses études ont mis en évidence des concentrations importantes de

marqueurs d'inflammation, tels que le TNF-α, l'IL-1β et la PGE2 dans le cerveau de patients

atteints de maladie d’Alzheimer (Rothwell, 1991 ; Montine et al., 1999 ; Alvarez et al., 2007 ;

Belarbi et al., 2012). La production excessive de ces médiateurs a des effets délétères sur les

cellules neuronales. Par exemple, certaines cytokines pro-inflammatoires peuvent augmenter

l’expression d’APP, la transcription de l'ARNm de la protéine β-sécrétase et par conséquent la

formation de βA (Lee et al., 2008). Il a également été montré que le peptide βA est capable de

stimuler les microglies (activation de la voie de NF-κB) et ainsi d'induire la mort neuronale

dans des co-cultures de cellules microgliales et de neurones (Chen et al., 2005).

Ainsi, la neuro-inflammation joue un rôle critique dans la progression de la maladie

d’Alzheimer, elle est fortement liée aux troubles cognitifs et comportementaux apparaissant

dans cette pathologie. Dés 1992, McGeer et Rogers ont suggéré que des traitements anti-

inflammatoires peuvent être une cible thérapeutique possible de la maladie d’Alzheimer.


27

IV. Les polyphénols

Les polyphénols sont des molécules naturelles issues du métabolisme secondaire des

végétaux. Ils sont produits dans tous les organes de la plante, depuis les racines jusqu'aux

fruits. Etant donné leur présence dans plusieurs centaines de plantes comestibles, ces

composés sont largement répandus dans l'alimentation humaine. Les principales sources en

polyphénols sont les fruits et légumes, les céréales et les légumes secs mais également

certaines boissons (vin, thé, café, jus de fruits). En France, la consommation moyenne de

polyphénols apportés par l’alimentation est estimée à 1g/jour/personne (Brat et al., 2006).

Les polyphénols sont des molécules d’intérêt de parte leurs différentes activités biologiques,

telles que des propriétés anti-oxydantes, antivirales, antibactériennes, anti-inflammatoires et

anticancéreuses (Lau et al., 2005 ; Dao et al., 2011 ; Yuan, 2011 ; Jin et Yin, 2012).

Les polyphénols sont caractérisés par la présence d’au moins un noyau benzénique portant

deux ou plusieurs groupements hydroxyles, modifiés ou non. Plus de 8000 structures

phénoliques ont été décrites dans la littérature. Ils ont été classés en deux familles : les

flavonoïdes et les non-flavonoïdes (Crozier et al., 2009).

IV.A. Les flavonoïdes

Les flavonoïdes sont les polyphénols les plus abondants dans notre alimentation, plus de 4000

flavonoïdes sont déjà identifiés dans les plantes. Ils sont caractérisés par un squelette de base

à 15 carbones de structure C6-C3-C6 ; deux noyaux benzéniques reliés entre eux par un

chaînon à 3 carbones. Ils comprennent principalement 6 sous-groupes, les flavonols, les

flavones, les flavan-3-ols, les anthocyanidines, les flavanones et les isoflavones (figure 15).

D’autres flavonoïdes sont présents à de plus faibles concentrations dans l'alimentation : les

dihydroflavonols, les flavanes-3 ,4-diols, les coumarines, les chalcones, les dihydrochalcones

et les aurones (Crozier et al., 2009).

- Les flavonols

Les flavonols ont une double liaison entre le C2 et le C3 et un groupement hydroxyle en

position C3. La molécule la plus étudiée dans cette famille est la quercétine. Dans notre

alimentation, les sources principales des flavonols sont les oignons (jusqu’à 1,2g/kg de


28

matière fraîche), les choux frisés, les poireaux, les brocolis et les myrtilles. Le thé et le vin

contiennent environ 45 et 30mg de flavonols/L, respectivement. La biosynthèse des flavonols

est stimulée par la lumière, ainsi, pour cette raison, ils sont accumulés dans les tissus aériens

et extérieurs des fruits et leur concentrations varient dans une même plante selon l’exposition

à la lumière (D’Archivio et al., 2007).

- Les flavones

Les flavones différent des flavonols par l'absence du groupement hydroxyle en position C3

(Crozier et al., 2009). Ce sont les composés les moins fréquents parmi les flavonoïdes.

L’apigénine et la lutéoline sont parmi les flavones les plus communes, elles sont présentes

dans l'alimentation principalement dans le persil et le céleri (D’Archivio et al., 2007).

- Les flavan-3-ols ou les flavanols

Les flavan-3-ols ont une structure non plane présentant deux centres chiraux en C2 et C3. Ces

flavonoïdes se présentent sous forme de monomères (catéchine et épicatéchine), d'oligomères

et de polymères (proanthocyanidines) communément appelés tanins condensé (Crozier et al.,

2009). Ces molécules sont largement répandues dans notre alimentation mais contrairement

aux autres flavonoïdes, ces composés ne se retrouvent pas sous forme glycosylée dans les

aliments. Les catéchines et les épicatéchines sont les principaux flavanols dans les fruits

comme les abricots et les cerises (environ 250mg/kg de la matière fraiche). Alors que les

gallocatéchines, les épigallocatéchines et les épigallocatéchines gallates se trouvent

particulièrement dans le thé (jusqu’à 800mg/L) (D’Archivio et al., 2007).

- Les anthocyanidines

Les anthocyanidines sont des aglycones et les anthocyanines, les formes glycosylés, ces

dernières sont largement répandues dans le règne végétal. Ces molécules sont des pigments

responsables des couleurs rouge, bleu et pourpre, notamment dans les fleurs et les fruits. Ils

existent sous différentes formes chimiques en fonction du pH. Les anthocyanidines se

trouvent également dans les tissus des feuilles, des sarments, des graines et des racines

(Crozier et al., 2009). Dans l'alimentation, les anthocyanidines se trouvent dans le vin rouge,

dans les feuilles et racines de certains légumes (aubergines, choux, haricots, oignons, radis), et

en abondance dans les fruits rouges. Le vin contient environ 200 à 350mg/L


29

d’anthocyanidines qui ont subi des transformations enzymatiques et chimiques au cours de la

fermentation et de l’élevage du vin (Manach et al., 2004).

- Les flavanones

Les flavanones ont un centre chiral en C2. Dans la majorité des flavanones d’origine

naturelle, le cycle C est lié au cycle B en α-configuration à la position C2. Dans les aliments,

les flavanones se retrouvent particulièrement dans les agrumes à forte concentration, mais

également dans les tomates et certaines plantes aromatiques comme la menthe. Les aglycones

les plus représentés dans les aliments sont la narginine dans les pampleousse, l’hespéridine

dans les oranges et l’ériodictyol dans les citrons. Les flavanones peuvent également être

glycosylés, en général par un disaccharide en position 7 (D’Archivio et al., 2007).

- Les isoflavones

Ces flavonoïdes ont une structure ressemblant aux œstrogènes car ils présentent des groupes

hydroxyle en positions C7 et C4, comme l’œstradiol. Ils sont capables de se lier au récepteur

de l'œstrogène et, pour cette raison, ils sont définis comme étant des phytoestrogènes. Les

isoflavones sont contenus presque exclusivement dans les légumineuses comme le soja qui

contient les 3 molécules principales : la génistéine, la daidzéine et la glycitéine (Manach et

al., 2004).

IV.B. Les non-flavonoïdes

Les non-flavonoïdes sont divisés en deux groupes :

- Les acides phénoliques

Les acides phénoliques regroupent des dérivés de l’acide hydroxybenzoïque de structure C6-

C1 (acide gallique, vanillique …) et des dérivés de l’acide hydroxycinnamique de structure

C6-C3. La teneur en acides hydroxybenzoïques est généralement très faible dans les plantes

comestibles sauf dans certains fruits rouges et noirs, les radis et les oignons. Le thé est une

source importante d’acide gallique. Les dérivés d’acide hydroxycinnamique (acides

p-coumarique, caféique, férulique et sinapique) sont plus communs que les dérivés d’acide

hydroxybenzoïque (Manach et al., 2004).


30

- Les stilbènes

Les stilbènes se caractérisent par la présence d'au moins deux noyaux benzéniques reliés par

une double liaison (C6-C2-C6) (figure 16). Cette famille regroupe une grande variété de

molécules, dont la nature varie en fonction du nombre et de la position des groupements

hydroxyles, de la substitution par des sucres ou des résidus méthoxy, de la configuration

stérique (trans ou cis) de la molécule ainsi que du degré d'oligomérisation. Le resvératrol

(3,5,4´-trihydroxy-stilbene) est la molécule de base de la famille des stilbènes (figure 17).

V. Les stilbènes, des molécules d'intérêt

V.A. Les stilbènes dans le "monde végétal"

Les stilbènes sont produits dans de nombreuses familles de plantes comme par exemple les

Celastraceae, Cyperaceae, Dipterocarpaceae, Fabaceae, Gnetaceae, Iridaceae, Moraceae,

Paeoniaceae et Vitaceae (Rivière et al., 2012). Parmi elles, ce sont les Cyperaceae,

Dipterocarpaceae, Gnetaceae et les Vitaceae qui sont les familles contenant les plus grandes

quantités de stilbènes.

Ces molécules sont souvent impliquées dans les mécanismes de défense des plantes. Ce sont

des phytoalexines produites en réponse à un stress (Bavaresco, 2003) : leur principale

fonction serait donc de protéger la plante contre les agresseurs.

V.A.1. Les stilbènes dans la Vigne

Au sein de la famille des Vitaceae, les stilbènes sont synthétisés dans plusieurs genres, parmi

lesquelles Ampelopsis, Cissus, Cyphostemma, Parthenocissus et Vitis.

Parmi les Vitis, Vitis vinifera est l'espèce la plus étudiée en ce qui concerne sa composition en

stilbènes. C'est en effet, la plante la plus cultivée dans le monde avec 7,6 millions d'hectares

de terres viticoles en 2010. Sa culture est principalement utilisée pour la production de vin

(6,8 millions ha), mais également pour le jus, la consommation du raisin de table et de fruits

secs (Pawlus et al., 2012).


31

Chez Vitis vinifera, la production des stilbènes peut être soit constitutive soit induite par un

stress abiotique ou biotique. Bien qu'il existe des exceptions, la production des stilbènes est

principalement exprimée de façon constitutive dans les organes lignifiés (racines, sarments et

est principalement induite dans les feuilles et les pellicules des baies (Bavaresco et Fregoni,

2001).

Au sein du Groupe d’Etude des Substances Végétales à Activité Biologique (GESVAB), les

stilbènes des racines, des tiges et des feuilles ont été étudiés en raison de leur importance dans

la résistance aux maladies de la vigne (Belhadj et al., 2006 ; Lambert et al., sous-presse).

Chez V. vinifera, 17 monomères, 24 dimères, 6 trimères et 16 tétramères ont été identifiés et

les stilbènes les plus abondants sont le resvératrol, le picéide (glucoside du resvératrol), pour

les monomères, et l’ε-viniférine pour les dimères (Pawlus et al. 2012).

V.A.2. Les stilbènes dans l'alimentation

Différents stilbènes ont été mis en évidence dans plusieurs sources de notre alimentation. La

majorité d'entre eux sont des monomères dérivés du resvératrol et les composés les plus

largement identifiés sont le resvératrol et le picéide.

On les retrouve principalement dans les vins rouges et dans les autres produits dérivés du

raisin. Dans les vins, la composition en stilbènes peut être affectée par divers paramètres

comme le cépage, le degré de maturité à la récolte, la pression fongique, le climat, le sel et les

techniques de vinification. Si chez Vitis vinifera, un peu plus de 60 stilbènes ont été mis en

évidence, seuls 18 ont été identifiés à ce jour comme constituants du vin (8 monomères,

9 dimères et 1 tétramères). La concentration en stilbènes totaux dans les vins rouges est

généralement comprise entre 25 et 80mg/L, les monomères étant les principales molécules

(figure 18). Les isomères du resvératrol et du picéide constituent les quatre stilbènes les plus

classiquement retrouvés dans les vins. Les formes trans du picéide et de l'astringine sont

celles dont les concentrations dans les vins peuvent atteindre les teneurs les plus élevées : 26

et 38mg/L respectivement (Landrault et al., 2002 ; Vitrac et al., 2005 ; Guebailia et al., 2006).


32

D'autres aliments contiennent du resvératrol, en très faible quantité, par exemple la cacahuète,

le chocolat, le thé et la bière, mais également certains légumes (le chou rouge, les épinards, la

tomate) et certains fruits à baies (la myrtille, l'airelle, la canneberge, la groseille et la fraise

(Ehala et al., 2005; Ragab et al., 2006 ; Jerkovic et Collin, 2007 ; Hurst et al., 2008 Zamora-

Ros et al., 2008).

Récemment, Zamora-Ros et ses collaborateurs (2008) ont estimé la prise journalière des

isomères du resvératrol et du picéide provenant de l’alimentation sur une population

espagnole de 40 685 adultes. La médiane et la moyenne ont des valeurs de 100 et 933µg/jour

respectivement, avec environ 32% de la population qui ne consomment pas ces stilbènes. Les

formes trans sont les plus consommées, avec 53,6% pour le picéide et 20,9% pour le

resvératrol. Les principales sources de ces polyphénols sont le vin (98,4%), puis le raisin, sous

forme de fruits ou jus (1,6%), tandis que les cacahuètes, les pistaches et les baies contribuent à

moins de 0,01%.

V.A.3. Les plantes utilisées en médecine traditionnelle contenant des

stilbènes

Le trans-resvératrol a été isolé pour la première fois de Veratrum album (Hellébore blanc) en

1940. Cependant, c'est en 1963 qu'il a été identifié dans une plante nommée Polygonum

cuspidatum dont les racines et les rhizomes sont utilisés depuis des siècles en médecines

chinoise et japonaise traditionnelles (Nonomura et al., 1963). D’autres stilbènes ont ensuite

été identifiés dans cette plante : le picéide, qui est aujourd’hui supposé être l’un des

principaux constituants efficaces de cette plante, mais également, le picéatannol et le

resvératroloside (Jayatilake et al., 1993). Les préparations à base de Polygonum cuspidatum

sont utilisées en traitement contre des infections virale ou bactérienne, l’hypertension et le

diabète (Zhang et al., 2012).

D'autres plantes riches en stilbènes sont utilisées en médicine traditionnelle. Ces plantes sont

connues pour leurs activités biologiques bénéfiques, tels que leurs effets anti-oxydant, anti-

inflammatoire, antibactérien, neuroprotecteur, hypoglycémique et hypolipidémique. Le

tableau 1 présente différentes plantes riches en stilbènes utilisées en médicine traditionnelle,

ainsi que les organes des plantes utilisés, leurs effets biologiques, et les pays utilisateurs.


33

V.B. Les effets des stilbènes sur l’inflammation du SNC

Depuis les années 1990, les polyphénols de l'alimentation suscitent un intérêt croissant dans le

domaine de la santé. Des études épidémiologiques ont tout d'abord suggéré qu'une

consommation d'aliments riches en polyphénols (principalement les fruits et les légumes)

serait liée à des effets bénéfiques sur la santé. Puis, de nombreuses équipes ont cherché à

caractériser, in vivo et in vitro, les activités biologiques de ces composés dans différentes

pathologies majeures. Ainsi, des études mettent en évidence que les polyphénols possèdent

des propriétés anti-oxydantes, mais également d’autres activités plus spécifiques, susceptibles

de participer à leurs effets biologiques : modulation d’activités enzymatiques, interaction avec

des récepteurs membranaires, régulation de l’expression génique…

Le resvératrol, un des polyphénols les plus étudiés, présente des activités anti-oxydante, anti-

inflammatoire, antitumorale ce qui lui permettrait de prévenir des patthologies comme les

maladies cardiovasculaires, certains cancers et les maladies neurodégénératives (Baur et

Sinclair, 2006 ; Delmas et al., 2006 ; Harikumar et Aggarwal, 2008 ; Saiko et al., 2008). Ainsi

l'utilisation du resvératrol et d'autres stilbènes pourrait être une approche alternative pour

empêcher ou retarder l'apparition, voire ralentir l’évolution, de certaines maladies.

V.B.1. La consommation du raisin et les maladies neurodégénératives

La source alimentaire principale de stilbènes étant le raisin et ces produits dérivés (jus et vin),

nous nous intéresserons plus particulièrement aux études liées à la consommation de ces

aliments chez l’Homme.

L’origine de l'intérêt pour la consommation de vin dans un contexte d'activités bénéfiques sur

la santé est issue d'un concept, celui du « paradoxe français ». Ce concept découle de

l’observation qu’un faible taux de mortalité par maladie coronaire est observé en France en

dépit d’une consommation élevée de graisses saturées. Renaud et de Lorgeril ont été les

premiers à faire le rapprochement entre ce phénomène et la consommation de vin (1992).

Depuis, de nombreuses études épidémiologiques ont été menées et mettent en évidence une

corrélation négative entre une consommation modérée et régulière de vin rouge et l'incidence


34

des maladies cardiovasculaires, de certains cancers et des maladies neurodégénératives

(Klatsky et al., 1997 ; Renaud et al., 1999 ; Letenneur et al., 2004).

Concernant les maladies neurodégénératives, une étude prospective menée en Aquitaine, sur

4000 sujets âgés de plus de 65 ans, a permis d’analyser les facteurs de risque de la démence

(Orgogozo et al., 1997). Il a été montré que ce risque était divisé par deux chez les buveurs

modérés de vin, consommant entre 1/4 et 1/2 litre par jour, comparativement aux buveurs

légers et aux non consommateurs. Deux autres études, réalisées au Danemark et en Chine, ont

confirmé ces résultats (Truelsen et al., 2002; Deng et al., 2006). De même, une étude menée

en Norvège sur une cohorte de 5033 personnes pendant 7 ans a montré qu’une consommation

faible ou modérée du vin est associée avec une meilleure performance cognitive (mémoire

verbale, coordination et apprentissage) par rapport aux abstinents (Arntzen et al., 2010).

D'autres équipes, au Canada et à New York, ont étudié l’impact de différentes boissons

alcoolisées (vins, bières et spiritueux) sur les fonctions cognitives. Ils montrent qu' un faible

risque de démence est corrélé à une consommation faible ou modérée du vin, mais pas à la

consommation de bières et spiritueux (Lindsay et al., 2002 ; Luchsinger et al., 2004).

Récemment Krikorian et ses collaborateurs (2010) ont réalisé une étude d’intervention

alimentaire sur des personnes dont la moyenne d’âge est 78,2 ans et qui présentent des

troubles cognitifs légers. Ils montrent que la supplémentation en jus des raisins

(6-9mL/Kg/jours) pendant 12 semaines augmente les fonctions mnésiques de ces personnes

âgées.

Ces différentes études d’observation et d'intervention révèlent donc une corrélation entre la

consommation de vin et jus de raisin et l’amélioration des fonctions cognitives.

L’inflammation chronique étant une des causes fondamentales de la plupart des maladies

chroniques du vieillissement, dont les maladies neurodégénératives, il semble donc intéressant

d'évaluer les effets protecteurs de ces aliments face à l'incidence de ces pathologies.

V.B.2. Les effets anti-inflammatoires des stilbènes chez l’animal

Les études de l'impact des aliments riches en stilbènes sur les fonctions cognitives chez

l'Homme ne permettent pas de définir les mécanismes d'actions de ces molécules sur le


35

vieillissement du cerveau (vieillissement normal ou pathologique). C'est pourquoi de

nombreuses recherches ont été réalisées chez l'animal afin de déterminer le potentiel rôle

neuroprotecteur, et plus particulièrement, leurs effets anti-inflammatoires, d'extraits riches en

stilbènes ou de stilbènes.

Par exemple, des rats âgés dont le régime alimentaire est supplémenté en jus de raisin pendant

2 semaines présentent une amélioration comportementale et cognitive par rapport aux

animaux témoin (Shukit-Hale et al., 2006). Sarkaki et son équipe (2007) ont mis en évidence

qu’une administration par gavage de 100 mg d'extrait de pépins de raisin pendant 30 jours

améliore la mémoire spatiale chez les rats âgés en bonne santé. De plus, la même équipe

montre que ce traitement restaure les capacités mnésiques des rats âgés développant une

démence de type Alzheimer (Farbood et al., 2009). En 2009, Wang et ses collaborateurs ont

cherché les effets protecteurs d’extraits de pépins de raisin riches en polyphénols chez des

souris transgéniques atteintes de la maladie d’Alzheimer. Ils montrent que le taux de peptides

βA total (soluble et agrégé) est réduit de 33% dans les cerveaux de souris nourries par ces

extraits pendant 9 mois, par rapport à celui des souris contrôle. De plus, l’activité microgliale

est diminuée de 70% chez les souris traitées.

D'autres travaux ont été réalisés avec un polyphénol pur, le resvératrol, sur des souris âgées.

Les animaux ont reçu une alimentation supplémentée en resvératrol (0,4%) pendant 4

semaines, puis une injection intrapéritonéale de LPS (100 µg/100 µL). Les résultats montrent

que le resvératrol peut diminuer les déficits cognitifs et comportementaux des souris âgées.

De plus, le resvératrol réduit la production d’IL-1β périphérique et l’expression des gènes

codant pour IL-1β dans l’hippocampe des souris traitées par le LPS. Ces derniers résultats

établissent une corrélation entre l'activité anti-inflammatoire d'un stilbène et la diminution des

troubles cognitifs chez l'animal (Abraham et Johnson, 2009).

Plus récemment, un régime comparable (supplémentation de 0,35% en resvératrol pendant 5

semaines) a été administré à des souris âgées transgéniques APP/PS1 (modèle de la déposition

cérébrale du peptide βA). Les résultats montrent une forte diminution du nombre des cellules

microgliales activées autour des plaques amyloïdes (Capiralla et al., 2012). Le resvératrol

peut également prévenir les déficits comportementaux liés à une administration d'éthanol chez

des rats nouveau-nés. Dans cette étude, les auteurs montrent une diminution du taux de NO,


36

de la peroxydation lipidique et des différentes cytokines (TNF-α, IL-1β et TGF-β) et de

l’activation de NF-κB (Tiwari et Chopra, 2011).

Ces différents résultats montrent qu’une supplémentation riche en stilbènes, et plus

particulièrement en resvératrol, peut diminuer les troubles cognitifs liés à l’âge ou à la

pathologie, et ce, en inhibant l’activation des cellules microgliales et la production de

marqueurs inflammatoires.

V.B.3. Les effets anti-inflammatoires des stilbènes in vitro

Afin de comprendre les mécanismes d’action des stilbènes dans le phénomène neuro-

inflammatoire, différents modèles de cellules microgliales in vitro ont été utilisés depuis une

dizaine d'années.

La plupart des études sont réalisées à l'aide de lignées cellulaires microgliales de type N9 ou

BV-2, ou à l'aide de cultures primaires de cellules microgliales de rats ou de souris, mais

également sur des cellules astrocytaires (culture primaire). L’inflammation est mimée par

l'addition de LPS, de cytokines pro-inflammatoires ou du peptide βA dans le milieu de culture

des cellules. Les cellules sont prétraitées ou cotraitées par des stilbènes à différentes

concentrations. Dans ces études, plusieurs marqueurs d’inflammation sont dosés et l’impact

des stilbènes dans les voies de signalisation cellulaire impliquées dans la neuro-inflammation

est recherché.

Le tableau 2 résume les principales études décrivant l'activité anti-inflammatoire de plusieurs

stilbènes.

V.B.3.1. Mécanismes d’action du resvératrol

Parmi les stilbènes, le resvératrol a été largement étudié pour ces effets anti-inflammatoires au

niveau du SNC. Les concentrations en resvératrol utilisées sont très variables (0,1 µM à 100

µM) selon les modèles d'étude. Le temps de contact du composé avec les cellules est

également très différent selon les travaux : de 30 minutes à 1h de prétraitement (i.e. avant

activation des cellules par le LPS), et de 8h à 48h en cotraitement (i.e. stilbène et stimulus).

Dans la majorité des cas, c'est le LPS qui est utilisé comme stimulus des cellules microgliales.


37

Dans un premier temps, les auteurs se sont intéressés à la capacité du resvératrol à inhiber la

production de NO. Sur différents modèles de cellules microgliales (lignée N9, culture

primaire de souris ou de rat), les concentrations inhibitrices de 50% de l’activité (IC50) obtenues

sont comprises entre 15,5 et 30,2 µM. Cette inhibition de production est généralement

associée à la diminution du taux d'iNOS dans les cellules (Lorenz et al., 2003; Bi et al., 2005;

Meng et al., 2008a). Le resvératrol est également capable de diminuer la production de

cytokines pro-inflammatoires par les cellules microgliales activées, notamment, celles du

TNF-α, de l'IL1-β et de l'IL-6 (Bi et al., 2005; Meng et al., 2008b; Abraham et Johnson, 2009;

Lu et al., 2010; Capiralla et al. 2012).

Les différents auteurs suggèrent que l'inhibition de la production de ces marqueurs

d'inflammation (NO et cytokines) est due à l'inhibition de l'activation de Nf-κB. Cette

inhibition est suivie dans la plupart des cas par mesure de l'inhibition de la phosphorylation de

IkBα mais également à l'aide du système rapporteur luciférase (Bi et al., 2005; Meng et al.,

2008a; Lu et al., 2010).

Récemment, des cellules de la lignée BV-2 ont été utilisées pour étudier quelles voies de

signalisation sont modulées par le resvératrol dans des microglies activées par du LPS.

Capiralla et ses collaborateurs (2012) montrent que le resvératrol inhibe la production de

nombreuses cytokines dont le TNF-α, l'IL1-α et l'IL-6, en inhibant l'activation de Nf-κB, via

l'inhibition de mécanismes en amont. En effet, ils mettent en évidence que le stilbène inhibe

l'oligomérisation du récepteur du LPS, TLR-4, et que seule la voie dépendante de Myd88 est

inhibée.

D'autre part, Lu et al., en 2010 ont comparé l'effet du resvératrol sur des cellules microgliales

et sur des astrocytes, deux types de cellules gliales impliquées dans les mécanismes

inflammatoires. Ils montrent que le resvératrol régule la production des molécules pro-

inflammatoires et du NO de différentes façons. Dans les microglies, le resvératrol inhibe les

voies Nf-κB, AP-1, mais n'inhibe pas la voie des MAPK ; alors que dans les astrocytes, le

stilbène agit sur la voie Nf-κB, sur une MAPK parmi les 3 testées (JNK), mais n'inhibe pas la

voie AP-1. Les auteurs concluent que malgré ces différences, le resvératrol est un composé

présentant un potentiel thérapeutique important contre les pathologies liées à la neuro-

inflammation.


38

VB.3.2. Mécanismes d’action des dérivés du resvératrol

D'autres stilbènes que le resvératrol ont été étudiés pour leurs propriétés anti-inflammatoires.

Ce sont des monomères du resvératrol, mais également des molécules de synthèse.

L'oxyresvératrol (figure 18), purifié à partir de murier blanc (Morus alba), diminue la

production de NO induite par le LPS dans des cellules microgliales de type N9. Son IC50 est

plus élevée que celle du resvératrol, 45,31 µM et 22,36 µM, respectivement (Lorenz et al.,

2003). Des résultats similaires ont été observés sur une lignée de macrophages RAW 264.7

(Chung et al., 2003).

Afin d’évaluer l’effet anti-inflammatoire du picéatannol dans des cellules BV-2 activées, Jin

et son équipe (2006) ont quantifié le NO et la PGE2 ainsi que différentes cytokines, après

traitement des cellules microgliales par le stilbène (1h) puis par le LPS (24h). Le picéatannol

inhibe la production de tous les marqueurs d'inflammation et atténue l'expression et la

quantité des protéines iNOS et COX-2, et ce, de façon dépendante de la concentration.

Meng et son équipe ont étudié les effets anti-inflammatoires de dérivés synthétiques du

resvératrol (2008b). Ils ont démontré qu’un de ces dérivés, le RV09, peut diminuer

significativement la production de NO, avec une IC50 de 10,9µM et 11,8µM dans des cellules

N9 et dans des microglies primaires, respectivement. De plus, cette effet passe par l’inhibition

de la voie de signalisation de Nf-κB.

La même équipe a recherché l’activité anti-inflammatoire de vingt-un dérivés du resvératrol.

Ils se sont intéressés à la relation entre la structure des molécules et l’activité anti-

inflammatoire. Ces résultats montrent que les dérivés qui ont un groupe 3,5-diméthoxyl sur

l’anneau A ou qui sont substitué sur l’anneau B par un quinolyl, induisent une forte

diminution da la production de NO avec des IC50 entre 1,9 et 6,1µM, celle du resvératrol

étant de 15,5µM, et une inhibition significative de la production de TNF-α. Ces composés

actifs agissent sur la voie de NF-κB par le blocage de la synthèse de p-IκBα et l’activation de

la synthèse de IκBα (Meng et al., 2008a).

Ces résultats montrent que les stilbènes ont des activités anti-inflammatoires au niveau des

cellules microgliales et suggèrent que ces composés phénoliques peuvent atténuer le


39

phénomène neuro-inflammatoire en agissant sur différentes voies de signalisation. Ces

polyphénols peuvent donc être des molécules prometteuses pour prévenir les maladies

neurodégénératives.

Objectifs

40

Objectifs

Nos objectifs sont d’identifier les mécanismes moléculaires par lesquels certains polyphénols

peuvent prévenir le développement de processus inflammatoires centraux.

Pour ce faire, nous disposons de différents polyphénols dans la chimiothèque de notre équipe.

Une attention particulière sera portée sur les stilbènes, composés présents dans de

nombreuses plantes, et dont la molécule de base, le resvératrol, suscite un intérêt croissant de

part ses nombreuses propriétés biologiques.

Nos travaux seront réalisés sur des cellules microgliales de type BV-2, une lignée cellulaire

de souris reconnue comme modèle valide pour l’étude des mécanismes inflammatoires (Henn

et al., 2009 ; Sheng et al., 2011). Ces cellules seront activées par le LPS qui stimule plusieurs

voies de signalisation intracellulaires impliquées dans la réponse inflammatoire.

Dans un premier temps, nous évaluerons l’effet de différents stilbènes sur la

production, par les cellules microgliales, d'un marqueur d’inflammation : le NO. Les

composés présentant une inhibition non négligeable de la production de NO, sans effet sur la

viabilité cellulaire, feront alors l’objet d’études plus approfondies. En effet, nous

quantifierons les teneurs de la protéine responsable de la libération de NO, l'iNOS, ainsi que

celles de son messager, afin d'évaluer l'effet des composés d'intérêt sur la synthèse de cette

protéine.

D'autre part, le LPS induisant également la synthèse de cytokines inflammatoires et

de PG, nous étudierons le potentiel pouvoir inhibiteur des stilbènes face à la production de ces

molécules. Nous quantifierons les taux de protéines et d'ARNm correspondants du TNFα et

de l'IL1-ß, ainsi que la production de PGE2 et de plusieurs enzymes intervenant dans sa

synthèse (COX-1, COX-2 et mPGES-1).

Objectifs

41

Enfin, nous identifierons les effets des stilbènes sur les différentes voies de

signalisation impliquées dans la réponse inflammatoire, telles que la voie NF-κB, la voie des

MAPK et la voie PI3K/Akt. Nous évaluerons alors la phosphorylation de plusieurs protéines

intervenant dans ces voies : celle d'IκB (sous-unité inhibitrice de NF-κB), celles de p38, de

ERK et de JNK (les 3 principales MAPK), mais également celle d'Akt.

Ces travaux nous permettront de conclure, quant à l'activité anti-inflammatoire de plusieurs

stilbènes dans des cultures de cellules microgliales, mais également de définir les mécanismes

sous-tendant ces effets.

Matériels et Méthodes

42


I. Matériels

I.A. Lignée cellulaire BV-2

Les cellules utilisées sont des microglies de souris de la lignée cellulaire BV2. Ces cellules

sont fréquemment utilisées dans les études sur les fonctions des microglies (Henn A. et al.,

2009). Elles conservent la plupart des propriétés morphologiques, phénotypiques et

fonctionnelles trouvées dans les cellules microgliales fraîchement isolées (Blasi E et al, 1990).

Elles sont fournies par l’ICLC (Interlab Cell Line Collection).

I.B. Les stilbènes

Différents polyphénols de la famille des stilbènes ont été utilisés dans notre travail. Tous les

stilbènes utilisés sont des isomères trans- (E-) sauf les cis-pocéide (Z-picéide). Dans ce

manuscrit lors que nous ne précisons pas les isomères, il s’agira de l’isomère trans-. Ces

composés sont extraits et purifiés sous la direction du Dr. Pierre Waffo Téguo au sein du

Groupe d’Etude des Substances Végétales à Activité Biologique (GESVAB). Les stilbènes

sont extraits de différentes plantes :

la moracine M de Milicia excelsa (Kapche et al., 2007)

l’oxyresvératrol de Morus alba

le gnétol, la gnémonoside D, la gnémonoside A et la gnéafricanine A de Gnetum

africanum

le resvératrol, le picéatannol, le Z-picéide, le picéide, la ω-viniférine, la δ-viniférine,

la ε-viniférine, le pallidol, l’ampélopsine A, la quadrangularine A, le léachianol F, le

léachianol G, le miyabénol C, l’hopéaphenol, l’isohopéaphenol, et la vitisine B de

Vitis vinifera (Waffo-Téguo et al. 1998, 2001 ; Zga et al., 2009)

la vitisine A est obtenue de Vitis Riparia (Bisson et al., 2011).


43

Les polyphénols sont conservés dans le diméthyle sulfoxide (DMSO ; Sigma) à -20°C et

utilisé à une concentration finale de 0,1% (non toxique pour les cellules). La concentration

des solutions mères est 20mM.

I.C. Appareillage

Différents appareils sont utilisés :

- un microscope inversé (Nikon) pour l’observation et le comptage des cellules.

- une microscope à fluorescence (Leica Microsystem) pour détecter et localiser des protéines

marquées par un fluorochrome.

-un spectrophotomètre (Dynex Magellan Biosciences) pour les dosages colorimétriques.

-un système d’électrophorèse horizontale (GeBa, Gene Bio-Application, Intechim) pour

séparer les protéines en fonction de leurs charges électriques et de leur taille.

-un système de transfert à sec l’iBlotTM

Dry Blotting (Invitrogen) pour transférer les

protéines du gel sur la membrane.

-un Imager Infrarouge Odyssey Infrared (LI-COR) pour détecter les anticorps secondaires

marqués par des colorants IRDye infrarouge.

-un Thermocycleur (iCycle, Biorad) pour détecter les niveaux de transcrits par RT-PCR.

II. Méthodes

II.A. Culture cellulaire BV-2 et conditions expérimentales

Composition du milieu de culture

Les cellules sont cultivées dans un milieu qui contient 89% de Roswell Park Memorial

Institute Glutamax (RPMI glutaMax-I 1640 ; Invitrogen), additionné de 10 % (v/v) de sérum

de veau fœtal décomplémenté (SVF ; Sigma) et 1% d’un mélange de pénicilline (100 U/ml) -

streptomycine (100µg/ml ; Sigma). Ce milieu est appelé "milieu complet". Les cellules sont

maintenues dans un incubateur à 37°C, sous une atmosphère humide à 5% de CO2.

Entretien des cellules

Les cellules BV-2 sont mises en culture dans le milieu complet. Les repiquages sont effectués

une fois par semaine. Les cellules sont décollées avec un grattoir stérile. Elles sont ensuite


44

mises en suspension dans le milieu complet (20*104

cellules/ 5ml) et réparties dans des boîtes

de culture de pétri de surface 92x17mm (PolyLabo-Nunc). Les différentes expériences de ce

travail ont été réalisées entre le 12ème

et le 24ème

repiquage des cellules.

Les conditions expérimentales

Les cellules BV-2 sont ensemencées dans des plaques de 24 ou 6 puits à raison de 20*104 ou

10*105 cellules/puits, respectivement, pendant 24h. Puis elles sont traitées avec le LPS à

1µg/ml en présence ou absence des différents polyphénols testés à plusieurs concentrations.

Après le temps nécessaire de traitement, différents dosages sont effectués.

II.B. Les dosages

II.B.1. Mesure de la viabilité cellulaire (test MTT)

La viabilité cellulaire est mesurée par un test colorimétrique. Les cellules vivantes et

métaboliquement actives pourront transformer le 3-[4,5-diméthylethiazol-2-yl]-2,5-diphényl

tetrazolium bromide (MTT) hydrosoluble (jaune) en cristaux de formazan (violet) non

solubles. Cette réaction se fait via une succinate déshydrogénase au niveau des mitochondries

de la cellule. Une fois les cristaux violets obtenus, ils sont dissous dans le DMSO. Une lecture

spectrophotométrique à 595nm est effectuée et l’absorbance obtenue est proportionnelle à la

concentration de cellules vivantes dans l’échantillon.

Après traitement, les cellules préalablement lavées avec une solution de PBS, sont mises en

contact avec 500µl d’une solution de MTT (Sigma) à une concentration de 0,5mg/ml dans le

milieu de culture (RPMI glutaMax-I 1640). Les cellules sont ensuite placées à l’étuve (37°C;

5% de CO2) pendant 3h. Puis, la solution de MTT est remplacée par 1ml de DMSO et les

cellules sont mises à l’abri de la lumière et à température ambiante pendant 30 min. Une

lecture spectrométrique est alors effectuée à 595nm.

II.B.2. Dosage des oxydes nitrique NO2

Pour doser le NO produit par les cellules, nous avons utilisé le test de Griess. Ce test

colorimétrique quantifie le NO libéré dans le milieu de culture. La sulfanilamide, se trouvant

dans le réactif de Griess, réagit avec le nitrite (forme stable du NO) du milieu pour donner un


45

produit azoté, coloré. Une gamme étalon composé de nitrite de sodium (NaNO2) est réalisée à

des concentrations compris entre 10 et 100µM.

Un volume de 50µl de milieu de culture des cellules BV-2 traitées pendant 24h sont ajoutés à

50µl de réactif de Griess. Après 15 min de réaction à l’abri de la lumière et à température

ambiante, une lecture spectrophotométrique à 540nm est effectuée. Les absorbances obtenues

ainsi que l’équation de la droite d’étalonnage permettra de déterminer la quantité de NO

produites par les cellules.

II.B.3. Dosage des cytokines inflammatoires

Le dosage des cytokines pro-inflammatoires TNF-α et IL-1β est réalisé par le test ELISA

(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). La technique ELISA est une technique immuno-

enzymatique de détection qui permet de visualiser une réaction antigène-anticorps grâce à une

réaction colorée produite par l'action sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée à

l'anticorps. Ce dosage est basé sur une technique immuno-enzymatique quantitative en

sandwich.

La quantité des protéines TNF-α et IL-1β est mesurée à l’aide des kits de dosage ELISA selon

les recommandations du fabricant (R&D System Europe). Les puits de la plaque 96 puits du

test sont pré-coatés avec un anticorps monoclonal spécifique au TNF-α et IL-1β de souris. Un

volume de 50µl de surnageant est incubé avec les anticorps pendant 2h à température

ambiante. Après 5 lavages avec 300µl de tampon, 100µl d’un anticorps conjugué à une

enzyme est ajouté dans chaque puits. Il va se lier spécifiquement aux cytokines fixées au

premier anticorps. Après une seconde série de lavages, une solution de substrat est ajoutée

provoquant une coloration bleue. Après 30 min d’incubation, l’ajout de la solution stop

entraîne une coloration jaune dont l’intensité mesurée à 450nm, est proportionnelle à la

quantité de TNF-α et d’IL-1β. Cette concentration est déterminée à l’aide d’une gamme

étalon.

II.B.4. Dosage de la prostaglandine2 (PGE2)

Le dosage de PGE2 est fait en utilisant le test EIA (Enzyme Immuno Assay). La technique

EIA a le même principe que l’ELISA (Lequin, 2005). Ce dosage est basé sur une technique


46

immuno-enzymatique quantitative en compétition entre PGE2 et PGE2-acétylcholinestérase

conjugate (traceur de PGE2) sur une quantité limitée d’anticorps monoclonal de PGE2. Etant

donné que la concentration du traceur de PGE2 est constante et que celle de PGE2 est

variable, la quantité du traceur de PGE2, capable de se lier à l’anticorps monoclonal de PGE2

sera inversement proportionnelle à la concentration de PGE2 dans les puits.

La quantité de PGE2 est mesurée à l’aide du kit de dosage EIA selon les recommandations du

fabricant (Cayman). Les puits de la plaque 96 puits du kit sont pré-coatées avec une IgG

polyclonale anti-souris produite chez la chèvre. Un volume de 50µl de surnageant est incubé

avec le PGE2 traceur et l’anticorps monoclonal anti-PGE2 pendant 18h à 4°C. Après 5

lavages avec 300µl de tampon de lavage, 200µl du réactif d’Ellman sont ajoutés provoquant

une coloration. Après 60 min d’incubation, l’absorbance mesurée à 405nm, est inversement

proportionnelle à la quantité de PGE2 présente. Cette concentration est déterminée à l’aide

d’une gamme étalon.

II.B.5. Analyse de l’expression des protéines par western blot

Stimulation, préparation des extraits cellulaires et dosage des protéines

Les cellules BV2 sont ensemencées dans des plaques de 6 puits (10*105 cellules/ puits) dans

3ml de milieu complet. Après le traitement, les cellules sont rincées au PBS (Phosphate

Buffered Saline) à 4°C avant d’être décollées de leur support par grattage. Elles sont

prélevées et centrifugées pendant 5 min, à 5000rpm et à 4°C. Les culots cellulaires obtenus

sont lysés en utilisant 50µl tampon de lyse (Tris/HCl 30mM, Triton X-100 0.1%, EDTA

1mM, B-mercaptoéthanol 0,1%, Ortovanadate active 1mM et Cocktail anti-protéase 0,1%).

Les culots en suspension sont ensuite centrifugés pendant 10 min, à 12000rpm et à 4°C. Les

surnageants récupérés, contenant les protéines, sont aliquotés et congelés à -80°C. La

quantification des protéines est réalisée par un dosage au réactif de Bradford (Sigma).

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide et transfert

Les protéines se séparent en fonction de leur taille par la technique du sodium dodecyl sulfate

polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), c'est-à-dire une migration des protéines sur

gel d’acrylamide en conditions dénaturantes. Ensuite, les protéines sont transférées sur une

membrane et elles sont détectées par des anticorps spécifiques (Immunoblotting).


47

Soixante µg de protéines, additionnés d’un tampon de charge (β-mercaptoéthanol 2,5% ; Tris

HCl 0,05mM pH 8,3 ; SDS 1% ; bleu de bromophénol 0,01% ; glycérol 30%), sont déposés

sur le gel. Puis, un marqueur de taille 10-170kDa PageRuler (Fermentas) y est également

déposé. La séparation des protéines se fait par SDS-PAGE sur un gel à 10% d’acrylamide

(gels « précoulés » H-8cm x L-7,5cm x E-1,4mm ; Gene Bio-Application, interchim) dans un

tampon de migration (Tris 25mM ; glycine 192mM ; SDS 0,1%). L’électrophorèse s’effectue

à 160V et 20mA à l’aide d’un système horizontale « Pre-Cast GeBaGel Electrophoresis

System » de GeBa, Gene Bio-Application, intechim.

Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose à l’aide du système

iBlot dry blotting (Invitrogen). Le gel de migration est déposé sur la membrane de transfert.

Le transfert est réalisé en 7 min. Puis une coloration des protéines totales est réalisée au rouge

Ponceau (Sigma).

Blocage, incubation avec les anticorps primaires et secondaires

Les sites de fixation aspécifiques des anticorps sont saturés avec un tampon de blocage

Odyssey/PBS (50/50) pendant une heure à 4°C. Après cette étape de blocage, la membrane est

incubée avec de l’anticorps primaire (de lapin) spécifique de la protéine d’intérêt avec une

dilution propre de la protéine d’intérêt (Tableau 3) dans le tampon de blocage toute la nuit à

4°C sous agitation.

La membrane est ensuite lavée six fois pendant 5 min avec du tampon TBS-T, Tris Buffer

Saline Tween 0,1% (TBS : Tris-HCl 50mM pH 7,6 ; Nacl 150mM ; Tween 20). L’anticorps

secondaire marqué à l’IR-Dye (anticorps de chèvre anti-lapin, Odyssey), dirigé contre

l’anticorps primaire dilué au 1/5000ème

dans le tampon TBS-T 0,1%, est ajouté et incubé

pendant 1h à température ambiante. Après 6 lavages successifs de 5 min au TBS-T 0,1% du

lait. Trois lavages sont effectués avec un lavage avec TBS-T 0, 1% puis un lavage de 5 min

du TBS sans Tween.

Révélation

La révélation des protéines est effectuée par immunofluorescence grâce à l’appareil Odyssey

Infrared Imager de chez LI-COR.


48

II.B.6. Analyses de l’expression des gènes par RT-PCR semi-quantitative

L’expression des gènes a été réalisée par RT-PCR semi-quantitative. Les ARN totaux sont

extraits dans un premier temps puis ils sont utilisés comme matrice pour la synthèse de l’ADN

complémentaire (ADNc) par une étape de transcription inverse (RT). Ensuite, les ADNc sont

amplifiés par PCR en utilisant des amorces spécifiques. Les produits d’amplification PCR

sont visualisés par électrophorèse sur un gel d’agarose contenant un agent intercalant (Gel

Red®).

Extraction et dosage des ARN totaux

Les cellules BV2 sont ensemencées dans des plaques de 6 puits (10*105 cellules/ puits) dans

3ml de milieu complet. Après traitement pendant 6h, l’extraction des ARN totaux à partir des

cellules est réalisée en utilisant le TRIzol reagent (Invitrogen). Le protocole utilisé est celui

décrit par le fabricant. 10*105 cellules sont collectées et homogénéisées dans 1ml de TRIzol

en vortexant. Une centrifugation de 5 min à 14 000g est réalisée pour éliminer le matériel

insoluble tel que les débris membranaires ou encore l’ADN de haut poids moléculaire. Le

surnageant est récupéré et laisser 5 min à température ambiante pour permettre la dissociation

des complexes protéiques. Un volume de 0,5ml de chloroforme (Normapur) est ajouté puis le

mélange est vortexé pendant 30sec. Les extraits sont laissés à température ambiante 2 à 15

min. Après une centrifugation de 15 min à 12 000g à 4°C, trois phases sont obtenues. La

phase supérieure aqueuse contient majoritairement les ARN totaux, l’interphase est composée

essentiellement de protéines dénaturées et la phase organique (phénol-chloroforme) de

couleur rose contient l’ADN génomique et les protéines. La phase aqueuse est récupérée dans

un tube propre. Pour précipiter les acides nucléiques, 0,5ml d’isopropanol sont ajoutés. Le

mélange est homogénéisé par inversion et laissé à température ambiante 5 à 10 min. Une

centrifugation de 8 min à 12 000g à 4°C permet de récupérer un culot d’acides nucléiques. Ce

culot est ensuite lavé deux fois en utilisant 1ml d’éthanol 75% dans l’eau traitée au DEPC.

Les ARN totaux sont repris dans 40µl d’eau traitée au DEPC. Un éventuel traitement de 10

min à 55°C favorise la dissolution du culot d’acides nucléiques.

Les acides nucléiques sont ensuite dosés par spectrophotométrie à 260nm. Les absorbances à

280nm et 230nm de l’échantillon sont aussi mesurées afin d’évaluer les contaminations par

des protéines et des sucres, respectivement. L’intégrité des différentes sous-unités des ARN

ribosomiques 28S et 18S, les plus abondants de l’extrait, est vérifiée par électrophorèse sur

gel d’agarose (1,2% p/v) contenant du GelRedTM

(agent intercalant fluorescent Interchim).


49

Elimination des traces d’ADN génomique

Afin d’éliminer toute trace d’ADN génomique de nos échantillons d’ARN totaux, un

traitement systématique à la déoxyribonucléase I (DNase I, Sigma) est effectué. L’extrait

contenant 15µg d’ARN totaux est mélangé à 10 unités de DNase I dans un tampon contenant

200mM de Tris-HCl, 20mg de MgCl2 à pH 8,3. Le volume réactionnel est ajusté à 200µl avec

de l’eau traité au DEPC. Le mélange est incubé à 37°C pendant 30 min puis la réaction

enzymatique est stoppée par ajout de 50µl d’EDTA à 50mM. Une extraction

phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25/24/1 ; v/v/v) est ensuite effectuée afin d’éliminer

les protéines du mélange réactionnel. Le mélange est agité au vortex pendant 5 min puis

centrifugé à 13 000rpm à température ambiante. La phase aqueuse est récupérée dans un tube

propre et le même volume de chloroforme est rajouté pour éliminer toute trace de phénol. La

précipitation des acides nucléiques est réalisée par ajout de 2,5 volumes d’éthanol absolu froid

et de 0,1 volume d’acétate de sodium 3 M pH 5,2. Les échantillons sont placés à -20°C toute

la nuit. Les extraits sont centrifugés à 13 000 rpm pendant 30 min, à 4°C et le culot est ensuite

lavé en ajoutant 1 volume d’éthanol 70% (v/v) puis séché sous hotte et enfin, repris dans 15µl

d’eau traitée au DEPC. Les ARN totaux sont, une nouvelle fois, dosés par spectrophotométrie.

Leur intégrité est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose par l’observation des deux

bandes majoritaires correspondant aux ARN ribosomiques 28S et 18S. Des amplifications par

PCR avec des amorces codant pour la GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate

déshydrogénase) sont réalisées en utilisant comme matrice les ARN totaux afin de s’assurer

qu’aucune contamination d’ADN génomique ne persiste.

Analyse de l’expression des gènes par RT-PCR semi-quantitative

a) Synthèse des ADN complémentaire

La transcription inverse (RT) est effectuée à partir de 2µg d’ARN totaux. Le mélange

réactionnel utilisé contient 0,5mM de chaque dNTP, 0,6µM d’Oligo-dT, 20 unités de Rnasin

(Promega), 2mM de DTT, dutampon 1X de réaction et 400 unités de « Moloney Murine

Leukemia Virus reverse transcriptase» ou M-MLV (Promega). Le mélange est incubé 1h à

42°C suivi d’une étape de dénaturation de la transcriptase inverse d’une durée de 5 min à

80°C.

b) RT-PCR semi-quantitative et révélation au GelRedTM

Les amorces utilisées pour la RT-PCR semi-quantitative ont été définies en utilisant le logiciel

Primer 3 design (http://frodo.wi.mit.edu/). La taille des amorces, la température d’hybridation



50

(Tm 2AT + 4GC), la taille de l’amplifiat obtenu ainsi que les numéros d’accession des

séquences utilisées sont présentées dans le tableau 4.

Les échantillons issus de la reverse transcription « RT » sont dilués au 1/10ème

et utilisés

comme matrice pour les amplifications PCR.

En ce qui concerne les conditions PCR, nous avons utilisé la Green Taq (Thermophilus

aquaticus) (Promega). Chaque réaction est réalisée dans un volume réactionnel final de

50µl et contient du tampon 1X (Green GoTaq®

Reaction Buffer, Tris-HCl 50mM, pH8,5

MgCl2, 7,5mM), 10 pmoles de chaque amorce, 10mM de chaque dNTPs, 1 unité de Taq.

Après une étape initiale de dénaturation de 5 min à 94°C (Hot Start), le programme est le

suivant : 30sec à 94°C (dénaturation) ; 30sec au Tm de chaque couple d’amorces (amorçage)

et 30sec à 72°C (élongation). Ces trois étapes sont répétées 25, 30, 35 voire 40 fois en

fonction du gène considéré. Les PCR sont effectuées sur un thermocycleur iCycler (Biorad).

Le nombre de cycles est ajusté en fonction du gène considéré afin d’obtenir un signal visible

sur gel d’agarose sans pour autant que ce signal soit saturant. Les amplifiats PCR sont

visualisés par électrophorèse sur gel d’agarose 1,2% (p/v) coloré par un agent fluorescent

intercalant, le GelRedTM

.

II.B.7. Détection de la translocation nucléaire de Nf-κB par

immunocytochimie

La technique d'immunocytochimie permet de localiser certaines protéines cellulaires, qu'elles

soient cytoplasmiques, membranaires ou nucléaires, à l'aide d'une réaction antigène-anticorps.

Cette réaction est visualisée par des marqueurs qui sont soit des molécules fluorescentes soit

des enzymes couplés directement ou non à l'anticorps. Dans notre étude nous utilisons un

microscope permettant d'enregistrer l’image de la fluorescence émise.

Les cellules sont ensemencées sur des lamelles de verre, suite à l’activation, le milieu initial

est enlevé et les cellules sont lavées avec du PBS à 0,1 M pH 7,4 froid. Elles sont ensuite

fixées 10 min à 4°C dans du paraformaldéhyde à 4%. Cette étape est suivie de trois lavages

dans du PBS froid. Puis les sites de fixation aspécifiques de l’anticorps sont saturés 45

minutes dans du tampon PBS auquel sont ajoutés 1% d’albumine bovine (BSA) et de 0,3% de

Triton X-100. Ce dernier a pour rôle de rendre perméables les membranes plasmiques,

permettant ensuite aux anticorps d’agir au niveau du cytoplasme et du noyau. Les cellules

sont alors incubées pendant 16h à température ambiante dans l’anticorps primaire dirigé


51

contre le NF-κB/p65 fait chez la chèvre (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Allemagne)

dilué à 1/500ème

dans du tampon PBS/BSA/Triton.

Les cellules sont lavées trois fois 10 min dans du PBS pour enlever l’excès d’anticorps

primaire. Puis elles sont incubées pendant 2h à température ambiante dans l’anticorps

secondaire biotinylé reconnaissant dirigé contre les immunoglobulines de chèvre (Vector

Laboratories, Clinisciences, Nanterre, France) dilué à 1/500ème

dans le tampon

PBS/PSA/Triton. Les cellules sont alors incubées 2h à température ambiante dans l’anticorps

secondaire biotinylé, dilué au 1/500e dans du TBS/BSA/Tx-100 et ensuite les cellules sont

lavées au PBS. Depuis cette étape tous le travail se fait à l’arbi de lumière. Les cellules sont

par la suite incubées pendant 2h à température ambiante avec un complexe avidine Alexa 488

(Molecular Probes, Life Technologies, Saint Aubin, France) dilué à 1/500ème

dans le tampon

PBS. Après 3 lavages successifs de 10 min par le PBS et 2 lavages fois 10 min par le PBS

faible en sel (8,0 g NaC, l0,2 g KCl, 1,44 g, Na2HPO4, 0,2g KH2PO4, pH 7,4). En fin, le

milieu de montage Vectashield contenant DAPI (4',6'-diamidino-2-phénylindole), un

fluorochrome marque l'ADN et fluoresce en bleu, (Vector Laboratories, Clinisciences,

Nanterre, France) est appliqué sur la lame puis déposer la lamelle ou les cellules se trouvent

au côté lame. Les protéines à intérêts sont détectées par un microscope à fluorescence (Leica

Microsystem, Nanterre, France).

II.B.8. Analyses statistiques

Les résultats sont exprimés par les moyens écarts types. Les analyses statistiques sont

réalisées par l’analyse de la variance (ANOVA) suivi d'un test post-hoc (Dunnett’s test). Une

différence entre deux moyennes est considérée comme significative lorsqu'elle est associée à

une probabilité ***P<0,001, **P<0,01 et *P<0,05.

Résultats et Discussion

52


Chapitre 1 : Recherche de stilbènes présentant des propriétés

anti-inflammatoires

Objectifs : Au regard de la littérature, nous savons que quelques stilbènes, et principalement

le resvératrol, présentent des propriétés anti-inflammatoires aussi bien in vitro qu'in vivo.

Nous avons souhaité identifier d'autres stilbènes capables de réguler la production d'un

marqueur d'inflammation, le NO, dans des cellules microgliales activées par le LPS.

I. Production de NO dans les cellules BV-2 activées par le LPS

En 1985, Stuehr et Marletta montrent que des macrophages de souris produisent des nitrites et

des nitrates en réponse au LPS. Quelques années plus tard, le NO produit par les macrophages

est identifié comme étant une molécule cytotoxique (Hibbs et al., 1988). Il est produit en

grande quantité au niveau des sites inflammatoires. De nombreuses recherches utilisent donc

le NO comme un indicateur du niveau d’inflammation périphérique et du SNC (Pacher et al.,

2007).

Aujourd'hui, nous savons que sa production inappropriée est liée à plusieurs maladies neuro-

inflammatoires. Ainsi, les agents qui régulent la concentration de NO présentent une

importante valeur thérapeutique pour la prévention ou le traitement des troubles liés à

l'inflammation du SNC.

I.A. Cinétique d’accumulation de NO dans les cellules BV-2 après

activation par le LPS

Afin de mesurer un effet potentiel des stilbènes sur l’inflammation, il est nécessaire de se

placer dans des conditions optimales de production des médiateurs. Pour déclencher une

réponse inflammatoire, les cellules microgliales sont activées par du LPS qui est très utilisé

pour mimer une infection et entraîner la production de nombreux marqueurs inflammatoires

dont le NO (Guha et Mackman, 2001).


53

Les cellules BV-2 sont ensemencées à raison de 20*104

cellules/ puits en plaque de 24 puits

pendant 24h puis elles sont traitées par du LPS à 1µg/ml pendant différents temps 0, 3, 6, 9,

12, 18 et 24h. Le NO libéré par les cellules microgliales est ensuite dosé sur les surnageants

par le test de Griess (figure 19).

Sans activation des cellules par le LPS (t=0h), la concentration en NO mesurée dans le milieu

de culture est inférieure à 1µM. Elle augmente à partir de 12h d’activation et ce jusqu’à 24h

où elle atteint une concentration de 34,7 ± 2,9µM.

Au vu de ces résultats, dans les prochaines expériences, le dosage du NO sera réalisé sur les

surnageants prélevés après 24h d’activation par le LPS. En effet, les concentrations obtenues

dans cette condition sont les plus élevées et nous permettront d'étudier un potentiel effet

inhibiteur des polyphénols.

I.B. Effets de différents stilbènes sur la production du NO dans les

cellules BV-2 activées

La publication 1 présente les effets de 25 dérivés du resvératrol sur la production de NO par

des cellules microgliales BV-2 activées par le LPS. Un résumé des résultats de cette

publication est présenté dans ce paragraphe.

Les formules chimiques des stilbènes sont présentées dans la figure 1 de la publication 1 et

leurs origines végétales dans le tableau 5.

Ces composés ont été isolés et purifiés au sein du GESVAB sous la direction du Dr. Pierre

Waffo Téguo. Ces stilbènes sont extraits de différentes plantes : Milicia excelsa, Morus alba,

Gnetum africanum et Vitis vinifera.

Vingt quatre heures après ensemencement, les cellules BV-2 sont cultivées en absence ou

présence de LPS (1µg/ml) ou bien en présence de LPS et de polyphénols (cotraitement)

pendant 24h. Les concentrations testées en polyphénols sont 5 et 10µM.

Dans un premier temps, nous avons mesuré la viabilité des cellules en présence des stilbènes

afin d'évaluer la possible toxicité de ces composés aux concentrations testées.


54

Dans un second temps, nous avons dosé dans le milieu de culture le NO produit par les

cellules. Les IC50 des molécules réduisant la production de NO les plus efficacement sont

calculées.

Les résultats sont exprimés en pourcentage de viabilité cellulaire et de production de NO. Les

100% sont les valeurs relatives aux cellules traitées par le LPS en absence de stilbènes, qui

sera appelé tout au long de ce travail « condition LPS ».

Parmi les 25 stilbènes, seulement 3 tétramères (hopéaphénol, isohopéaphénol et vitisine A) et

un dimère (gnéafricanine A), à la concentration de 10µM, présentent une diminution

significative de la viabilité cellulaire. A 5µM, seuls 2 tétramères (hopéaphénol et

isohopéaphénol) causent une cytotoxicité pour les cellules (tableau 1 de la publication 1).

Concernant la production de NO, nos résultats montrent qu'à 5 et/ou 10µM, 10 stilbènes dont

3 monomères (picéatannol, resvératrol et moracine M), 5 dimères (ε-viniférine, δ-viniférine,

ω-viniférine, scirpusine A et pallidol) et 2 tétramères (vitisine A et vitisine B) diminuent

significativement la production de NO. Les IC50 de ces composés sont compris entre 3,9 ± 0,7

et 23,4 ± 1,0µM (tableau 1 de la publication 1) et ce sont les 2 tétramères, vitisine A et

vitisine B qui sont les plus efficaces à réduire la production de NO dans les microglies avec

des IC50 inférieures à 5µM (figure 20)

II. Synthèse d'iNOS dans les cellules BV-2 activées par le LPS

II.A. Cinétique de l’expression d’iNOS dans les cellules BV-2 après

activation par le LPS

Afin d'étudier la synthèse d'iNOS, l'enzyme responsable de la synthèse de NO dans les

cellules microgliales, nous avons dosé le taux de cette protéine et le niveau de transcrits

codant pour son gène (par Western Blot et RT-PCR semi-quantitative respectivement) après

différents temps d'activation par le LPS.

La synthèse protéique commence par la transcription de l'ADN en ARNm, puis la traduction

de ce dernier en protéine. L’expression du gène étant en amont de la synthèse protéine, les

dosages de l’ARNm sont réalisés entre 0 et 12h, et ceux de la protéine entre 0 et 24h.


55

Les cellules BV-2 sont ensemencées à raison de 10*105

cellules/ puits en plaque de 6 puits

pendant 24h, puis elles sont cultivées en absence ou présence de LPS (1µg/ml) pendant

différents temps.

Les résultats, présentés sur la figure 21A, montrent que le LPS est capable d’induire

l’expression de la protéine iNOS. La synthèse d'iNOS est induite dès 6h d’activation, elle est

maximale à 9h et reste induite jusqu'à 24h. Ces résultats sont corrélés au dosage du NO qui est

présent dans le milieu de culture à partir de 12h de traitement et qui augmente jusqu’à 24h

(figure 20). Le dosage de cette enzyme peut donc être réalisé entre 9 et 24h de traitement.

Concernant le taux de transcrits iNOS, nous observons son induction dès 6h, qui est ensuite

stable entre 9h et 12h (figure 21B).

Afin, de pouvoir comparer nos résultats avec ceux de la littérature, nous nous placerons dans

les conditions les plus communément utilisées. Ainsi les analyses sont effectuées après 24h de

traitement pour le dosage des protéines et 6h pour celui des transcrits.

II.B. Effets des vitisines A et B sur la production de NO et la synthèse

d’iNOS dans les cellules BV-2 activées

Les vitisines A et B étant les stilbènes les plus efficaces pour inhiber la production de NO

parmi les 25 composés étudiés, nous avons cherché un effet de ces composés sur l’expression

d’iNOS au niveau transcriptionnel et traductionnel.

La vitisine A étant cytotoxique à 10µM, nous avons utilisés les concentrations 2,5, 5 et 7,5µM

pour les deux tétramères afin de doser l'expression d'iNOS et du gène iNOS.

Les deux composés sont capables de réduire l'accumulation de la protéine ainsi que celle du

de l'ARNm d'iNOS (figure 22 ; A et B). La vitisine A présente une activité inhibitrice plus

importante que la vitisine B dès 2,5µM. Ces résultats sont en corrélation avec les IC50

calculées pour ces stilbènes, 3,9 ± 0,7 et 4,7 ± 0,5µM pour les vitisines A et B,

respectivement.


56

III. Discussion du chapitre 1

Notre travail nous a permis d'identifier 10 stilbènes, parmi les 25 étudiés, capables d'inhiber la

production de NO dans des microglies en culture.

Concernant les monomères, une relation entre la structure des molécules et leur activité a pu

être mise en évidence. En effet, la glycosylation du resvératrol et du picéatannol, donnant

respectivement le picéide et l'astringine, diminue l'activité de ces molécules. Par contre, la

présence d'un groupement hydroxyle en position ortho sur l’anneau B du picéatannol

augmente l’activité anti-inflammatoire, par rapport à la présence d'un seul groupement en

position R2 sur le resvératrol et par rapport à 2 groupements en position méta sur

l'oxyresvératrol (figure 1 de la publication 1). A l'inverse pour les dimères, les 2 groupements

hydroxyles en position ortho de la scirpusine A n'augmente pas l'effet inhibiteur de cette

molécule sur la production de NO, par rapport à la ε-viniférine qui ne porte qu'un seul

groupement sur ce cycle.

Nos résultats ont également montré qu'une molécule toxique à 10µM, comme la vitisine A,

peut être active à des concentrations inférieures (2,5, 5 et 7,5µM). Nous avons donc recherché

des potentiels effets inhibiteurs d'autres tétramères: l'hopéaphénol et l'isohopéaphénol qui sont

toxiques à 5µM. Ces composés ne présentent pas de toxicité à des concentrations inférieures

ou égales à 1,5µM, mais ne présentent également aucun effet inhibiteur de la production de

NO (résultats non montrés).

Parmi les différentes molécules testées, ce sont 2 tétramères, la vitisine A et la vitisine B, qui

présentent les meilleures IC50, 3,9 ± 0,7 et 4,7 ± 0,5µM respectivement.

D'autres études ont recherché l'effet de tétramères de resvératrol sur la production de NO. Ces

travaux ont été réalisés, non pas sur des cultures de microglies, mais sur des cultures de

macrophages (RAW 264.7) activés par le LPS. Par exemple, Ku et ses collaborateurs en 2008

présentent des résultats similaires aux nôtres, puisqu'ils montrent que ce sont les tétramères

(miyabenol A et vitisine A) qui ont les IC50 les plus faibles, parmi 1 monomère, 2 dimères,

1 trimère et 2 tétramères. De plus, une étude plus complète sur l'effet de la vitisine A sur des

macrophages activés, montre une inhibition de la synthèse de la protéine iNOS dès la

concentration de 1µM et ce, en prétraitement (les cellules sont incubées 30 min en présence

du polyphénol puis 24h en présence du LPS) (Mi Jeong Sung et al., 2009).


57

Dans le but de déterminer les mécanismes d'action des stilbènes sur les cellules microgliales,

nous avons fait le choix de sélectionner un stilbène parmi les 10 actifs définis précédemment.

Les tétramères présentent des inhibitions importantes de la production de NO, et comme nous

venons de le décrire, ces composés présentent des activités anti-inflammatoires. Cependant,

toutes les études sont réalisées avec des modèles de cultures de cellules, et il n'existe pas à

notre connaissance, de travaux sur les effets anti-inflammatoires de tétramères réalisés in vivo.

De plus, de nombreuses études réalisées sur la biodisponibilité des stilbènes, et

principalement du resvératrol, démontrent un métabolisme intestinal et hépatique très

complexe pour les monomères de stilbènes. Nous pouvons supposer des contraintes

supplémentaires à la biodisponibilité des oligomères. C'est pourquoi, nous n'avons pas

souhaité continuer à travailler sur les tétramères.

Concernant les dimères, les quantités purifiées au laboratoire ne sont pas suffisantes pour

réaliser les études mécanistiques souhaitées.

Parmi les 3 monomères actifs, nous n'avons pas retenu le resvératrol et le picéatannol car ces

2 molécules sont commercialisées et plusieurs études ont, d'ores et déjà, étaient réalisées sur

leurs effets anti-inflammatoire au niveau des microglies de type BV-2, principalement pour le

resvératrol (Bi et al., 2005; Meng et al., 2008b; Abraham et Johnson, 2009; Lu et al., 2010;

Capiralla et al., 2012), mais également pour le picéatannol (Jin et al., 2006).

Notre choix s'est donc porté sur la moracine M. Ce composé est, contrairement aux autres

monomères, très peu étudié pour ses activités biologiques potentielles, et il est disponible en

grande quantité au sein du GESVAB.

La suite de notre travail aura donc pour but d'approfondir nos recherches sur les effets anti-

inflammatoires de la moracine M sur les cellules microgliales activées.

58

Publication 1

Inhibitory activity of plant stilbenoids against nitric oxide production by

lipopolysaccharide-activated microglia

Merian Nassra, Stéphanie Krisa, Yorgos Papastamoulis, Gilbert Deccaux Kapche, Jonathan

Bisson, Caroline André, Jan-Pieter Konsman, Jean-Marie Schmitter, Jean-Michel Mérillon,

Pierre Waffo-Téguo

Soumis à Planta Medica en août 2012



Merian Nassra1, Stéphanie Krisa*,1, Yorgos Papastamoulis1, Gilbert Deccaux Kapche1,

Jonathan Bisson1, Caroline André2, Jan-Pieter Konsman2, Jean-Marie Schmitter3, Jean-Michel

Mérillon1, Pierre Waffo-Téguo*,1.

1 Groupe d’Etude des Substances Végétales à Activité Biologique, EA 3675, Université de

Bordeaux, Institut des Sciences de la Vigne et du Vin, 210 Chemin de Leysotte, CS50008,

33882 Villenave d’Ornon, France

2 Psychoneuroimmunologie, Nutrition & Génétique, CNRS UMR 5226-INRA 1286,

Université de Bordeaux, 146, rue Léo Saignat, 33076 Bordeaux Cedex, France

3 Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets, UMR 5248 CNRS, Université de

Bordeaux, 146, rue Léo Saignat, 33076 Bordeaux Cedex, France

* To whom correspondence should be addressed.

Dr. Stéphanie Krisa

Dr. Pierre Waffo-Téguo

Groupe d’Etude des Substances Végétales à Activité Biologique, EA 3675

Université de Bordeaux

Institut des Sciences de la Vigne et du Vin,

210 Chemin de Leysotte, CS50008,

33882 Villenave d’Ornon

France

Tel: +33 5 57 57 59 53

Fax: +33 5 57 57 59 52

Email: [email protected]


Abstract

Microglia-driven inflammatory processes are thought to play an important role in ageing and

several neurological disorders. Since consumption of a diet rich in polyphenols has been

associated with anti-inflammatory and neuroprotective effects, we studied the effects of

twenty five stilbenoids isolated from Milicia excelsa, Morus alba, Gnetum africanum, and

Vitis vinifera. These compounds were tested at 5 and 10 µM on BV-2 microglial cells

stimulated with bacterial lipopolysaccharide (LPS). Ten stilbenoids reduced LPS-induced

nitric oxide (NO) production at 5 and/or 10 µM. Two tetramers, E-vitisin A and E-vitisin B,

were the most effective molecules. Moreover, they attenuated the expression of inducible NO

synthase (iNOS) protein and gene.

Keywords: stilbenoids; nitric oxide; microglia; polyphenol; anti-inflammatory

Abbreviations

iNOS: inducible Nitric Oxide Synthase

LPS: lipopolysaccharide

MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide

NF-κB: nuclear factor-kappa B

NO: nitric oxide

Although considered to be immune-privileged, the nervous system can mount inflammatory

responses to infection or injury. Inflammatory processes within the nervous system are driven

by mononuclear microglial cells that are normally quiescent but can be activated by

environmental stress and exposure to LPS, interferon-γ or amyloid ß [1-3]. When microglial

cells are activated, they produce NO, which is an important biological messenger in

inflammation. However, excessive NO production has been linked to the development of

many neurodegenerative diseases [4, 5].

Hydroxystilbenes have been found in a number of plant species [6]. Grapes and the woody

organs of vine are well known to contain these substances [7]. It has been shown that E-

resveratrol and its derivatives exert an anti-inflammatory effect in peripheral mononuclear

cells and macrophages, respectively [8, 9]. Animal studies indicate that food supplementation

with red wine polyphenols or E-resveratrol reduces amyloid ß or LPS-associated memory

deficits in aged mice [10, 11]. Since in vitro studies show that E-resveratrol inhibits LPS-

induced pro-inflammatory mediators in microglia, it is likely that the beneficial in vivo effects

of this stilbene on brain functioning in aged individuals are at least partly due to its actions on

microglia [12, 13]. The aim of this study was to evaluate the anti-inflammatory effect of

stilbenes from different plants on LPS-activated microglia in vitro.

E-resveratrol and 24 analogues were evaluated for their potential to inhibit NO production by

LPS-activated BV-2 microglial cells at 5 and 10 µM (Table 1). These stilbenoids (Fig. 1)

were isolated from Milicia excelsa (1), Morus alba (7), Gnetum africanum (8-11), and Vitis

vinifera (2-6, 12-25). Ten stilbenoids significantly reduced LPS-induced nitrite production at

5 and/or 10 µM with IC50 ranging from 3.9 to 23.4 µM (Table 1). Interestingly, almost all of

the effective molecules were isolated from Vitis vinifera.

Monomers 1, 3 and 5 significantly decreased LPS-induced NO production at 5 and 10 µM

with the percentage of inhibition ranging from 15.0-62.7%. The inhibitory action of E-

resveratrol and E-piceatannol was not observed with E-piceid and E-astringin. Since these

molecules differ in glycosylation, our findings indicate that glycosylation decreases the

activity of E-resveratrol monomers. Consistent with this result, Lee et al. (2007) showed that

glycosides of flavonoids were less effective than their aglycones in inhibiting LPS-induced

NO production in BV-2 microglia [14]. Moreover, our findings suggest that the position of

two hydroxyl groups on ring B is relevant for monomer activity. Indeed, E-piceatannol with

hydroxyl groups at the ortho position was found to be efficient in inhibiting NO production

while E-oxyresveratrol and E-gnetol had no effect. Taken together, these data indicate that the

presence and position of hydroxyl groups is relevant to the anti-inflammatory activity of

stilbenoids. Similarly, other authors have shown a relationship between the molecular

structure of resveratrol derivatives and inhibition of NO production in murine peritoneal

macrophages [9].

Among the dimers, only viniferins (12-14) had potential effects on reduced NO production at

both concentrations.

Tetramers 22, 23 and 24 were found to be toxic for BV-2 microglial cells at 10 µM. At this

concentration, compound 25 was the most efficient stilbenoid in reducing nitrite

accumulation, and at 5 µM, E-vitisins 24 and 25 both inhibited NO production. The IC50

values of 24 and 25 were 3.9 ± 0.7 µM and 4.7 ± 0.5 µM respectively (Fig. 2 A). It has been

reported that 2 tetramers (miyabenol A and vitisin A) are more effective to inhibit NO

production in RAW264.7 macrophages than resveratrol, two dimers and one trimer of

resveratrol. This result is consistent with our findings [15].

As shown in Fig. 2 A, compounds 24 and 25 significantly suppressed LPS-induced NO

production in a dose-dependent manner. Compound 24 was more efficient in reducing the

release of NO than compound 25. To evaluate whether there effects on NO production were

associated with decreased iNOS expression, we measured the levels of iNOS protein and

iNOS mRNA expression in BV-2 cells. A detectable reduction of iNOS protein expression by

both tetramers (24, 25) was observed from 2.5µM (Fig. 2 B). At 2.5µM, compound 24

reduced the level of iNOS mRNA in BV-2 cells, while a mild effect was observed for

compound 25 (Fig. 2 C). Both vitisins were able to block the LPS-induced expression of

iNOS expression at 7.5µM in BV-2 cells.

Other studies showed that resveratrol and vitisin A decrease the production of pro-

inflammatory mediators in immune cells. These effects are the result of attenuation of NF-κB

activation, which is a major transcription factor involved in the expression of pro-

inflammatory genes such as in iNOS, cyclooxygenase-2 and cytokines [16-18]. Thus, 24 and

25, which reduced NO production and iNOS expression, could exert these anti-inflammatory

effects on BV-2 cells through decreased activation of the NF-κB signaling pathway.

In summary, we evaluated the inhibitory activities of 25 stilbenoids on NO production in

LPS-activated BV-2 microglia. E-vitisin A and E-vitisin B were the most potent. These

tetramers inhibited NO production through the suppression of iNOS protein and gene

expression. These results demonstrate a potent suppressive effect of vitisins on

proinflammatory responses in microglia.

Materials and Methods

The chemical structures of the stilbenoids (1-25) extracted and characterized primarily from

stems of Vitis vinifera (2-6, 12-25), but also from stems and roots of Gnetum africanum (8-

11), stems of Morus alba (7) and stem bark of Milicia excelsa (1), are shown in Fig. 1. The

purities of these compounds were > 95% (HPLC analysis).

BV-2 microglia cells (Interlab Cell Line Collection) were cultured (37 °C and 5% CO2) in

RPMI 1640 containing 2 mM L-glutamine, 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 100

U/mL penicillin and 100 µg/mL streptomycin. Cells were plated onto a 24-well plate

(2x105cells/well) or onto 6-well plate (106cells/well) for 24h. Then cells were stimulated with

1 µg/mL of LPS in presence or absence of stilbenoids.

Cell viability was determined by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium

bromide (MTT) assay. After treatment, the cells were incubated with 0.5 mL of MTT (0.5

mg/mL). After 3h at 37°C, the formazan crystals in the cells were solubilized with 1 mL

dimethyl sulfoxide. The level of formazan was measured at 595 nm.

NO levels in the culture supernatant were measured using the Griess reaction. Fifty µL of

supernatant from each sample were mixed with 50 µL of Griess reagent. After 15 min at room

temperature, absorbance values were read at 540 nm.

Western Blot was performed to ascertain iNOS protein expression. Fifty µg of protein

samples were separated on 10% polyacrylamide gels (GeBaGel Electrohorisis system®).

Proteins were transferred using the iBlotTM dry blotting system (Invitrogen). The membranes

were blocked with Odyssey blocking buffer (1:2 PBS) and were then incubated overnight at

4°C with iNOS primary antibodies (Enzo, 1:1000). The membranes were reprobed β-actin

antibodies (Cell Signaling Technology, 1:2000) to verify the equal loading of proteins in each

lane. The membranes were then incubated with IRDye 800wc secondary antibody

(Sciencetec, 1:5000) for 1 h at room temperature. The blots were detected and analyzed using

the Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR).

Expression gene of iNOS in BV-2 cells was determined by semi-quantitative Reverse

Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) [19]. The following sense and antisense

primers were used: iNOS, forward primer 5'-ACTGGTTTGAAACTTCTCAG-3'; reverse

primer 5'-GGATTCTGGAACATTCTGT-3' and GAPDH, forward primer 5'-

GTGATGGGTGTGAACCAC-3'; reverse primer 5'-GAGTGGGAGTTGCTGTTG-3'.

GAPDH was used as an internal control and as a reference to show equal loading.

L-glutamine, fetal bovine serum, penicillin, streptomycin, LPS, MTT, dexamethasone (purity

≥ 97%) and Griess reagent were purchased from Sigma-Aldrich.

Data are shown as means ± SEM. The statistical tests were performed with one-way ANOVA

followed by Dunnett's multiple comparison post-hoc test. Significance was set at *** P

<0.001, **P<0.01 and *P<0.05.

Acknowledgements

Financial support: Aquitaine Region, CNRS Longevity program.

We are grateful to Dr. Ray Cooke for reading the manuscript.

Supporting Information

Protocols for extraction and purification of compounds 1-25 are available as Supporting

Information.

Conflict of Interest

No authors report any conflict of interest and agree to publish this paper.

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Figure Legends

Table 1: Cell viability and inhibitory activity of stilbenoids on NO production induced by LPS

in BV-2 microglial cells.

Figure 1: Chemical structures of stilbene compounds (1-25) tested on LPS-activated microglia

cells.

Figure 2: Effect of compounds 24 and 25 on NO production and iNOS protein and mRNA

expression in LPS-activated BV-2 microglial cells.

BV-2 cells were treated with compounds 24 and 25 (2.5-7.5 µM) in the presence or absence

of LPS (1 µg/mL). (A) After 24 h of treatment, NO production was measured using Griess

reaction. The results are expressed as mean ± SEM. The NO production (%) is relative to the

LPS control. Significance was set at ***P<0.001, **P<0.01 and *P<0.05. (B) After 24 h of

treatment, iNOS protein expression was measured by Western blot. The experiment was

performed in triplicate and similar results were obtained. (C) After 6 h of treatment, the level

of iNOS mRNA was determined by semi-quantitative RT-PCR analysis. The experiment was

performed in triplicate and similar results were obtained.

Table 1

5 µM 10 µM IC50 (µM)

Viability (%)a Relative NO (%)b Viability (%)a Relative NO (%)b

Monomers Compound 1 moracin M 97.7 ± 11.7 77.5 ± 6.6** 111.2 ± 11.5 66.8 ± 8.7*** 17.2 ± 1.2 2 Z-piceid 92.8 ± 6.4 95.4 ± 8.1 101.1 ± 10.6 98.3 ± 16.1 3 E-resveratrol 100.1 ± 5.1 85.0 ± 5.0** 93.7 ± 10.7 58.1 ± 13.8*** 13.1 ± 1.3 4 E-piceid 87.5 ± 9.6 94.4 ± 4.1 95.1 ± 7.4 94.4 ± 12.7 5 E-piceatannol 103.0 ± 8.6 56.0 ± 9.5*** 104.4 ± 10.3 37.3 ± 10.6*** 7.7 ± 1.6 6 E-astringin 86.5 ± 7.4 90.5 ± 5.9 101.4 ± 7.7 84.7 ± 17.6 7 E-oxyresveratrol 102.5 ± 9.7 108.9 ± 12.1 105.5 ± 13.0 96.8 ± 9.8 8 E-gnetol 97.3 ± 6.9 97.1 ± 2.3 107.7 ± 11.6 85.8 ± 12.2 Dimers 9 E-gnemonoside D 102.9 ± 3.5 106.4 ± 2.7 108.2 ± 8.5 87.1 ± 16.5 10 E-gnemonoside A 99.5 ± 5.5 100.4 ± 7.9 107.3 ± 8.8 92.8 ± 13.6 11 E-gneafricanin A 107.4 ± 9.0 98.8 ± 4.0 62.2 ± 10.3** nd 12 E-δ-viniferin 112.1 ± 19.6 85.7 ± 8.9* 117.7 ± 14.6 64.2 ± 7.2*** 12.3 ± 0.4 13 E-ε-viniferin 103.1 ± 8.8 74.7 ± 10.3*** 88.8 ± 1.5 50.3 ± 16.0*** 8.6 ± 0.5 14 E-ω-viniferin 112.0 ± 10.6 81.3 ± 5.0* 115.2 ± 12,9 65.8 ± 10.3** 19.0 ± 0.4 15 E-scirpusin A 114.9 ± 10.7 94.0 ± 8.4 112.3 ± 11.7 73.8 ± 9.2*** 16.6 ± 0.8 16 pallidol 111.9 ± 5.4 95.4 ± 6.2 108.4 ± 13.1 75.5 ± 16.7** 23.4 ± 1.0 17 ampelopsin A 97.2 ± 6.3 111.2 ± 1.5 112.3 ± 1.5 95.9 ± 14.5 18 quadrangularin A 98.3 ± 7.3 101.5 ± 8.5 97.8 ± 15.1 94.3 ± 12.5 19 leachianol F 103.5 ± 11.0 93.0 ± 9.4 102.7 ± 5.1 101.5 ± 16.3 20 leachianol G 94.5 ± 9.6 96.1 ± 2.9 101.7 ± 6.5 100.5 ± 5.3 Trimers 21 E-miyabenol C 97.2 ± 5.2 112.8 ± 5.1 91.4 ± 6.7 101.1 ± 9.2 Tetramers 22 hopeaphenol 29.9 ± 4.2*** nd 37.3 ± 4.9*** nd 23 isohopeaphenol 45.3 ± 12.1*** nd 29.3 ± 8.6*** nd 24 E-vitisin A 104.2 ± 6.0 30.9 ± 9.3*** 58.2 ± 10.0*** nd 3.9 ± 0.7 25 E-vitisin B 109.6 ± 7.2 39.8 ± 10.0*** 96.7 ± 12.8 10.9 ± 3.9*** 4.7 ± 0.5 Positive control

Dexamethasone 98.2 ± 4.3 64.0 ± 5.2*** 96.5 ± 4.0 67.8 ± 1.9***

BV-2 cells were treated with LPS at 1 µg/mL and stilbenes at 5 and 10 µM for 24h. a means

the cell viability (%) relative to the LPS control. LPS did not reduce the viability of BV-2

cells at 1 µg/mL concentration. b means the NO production (%) relative to the LPS control.

Concentration of NO production in cells alone was 1.0±0.5 µM and was 20.3±4.1 µM in cells

activated with 1µg/mL of LPS (LPS control). nd means not determined when the compound

was toxic at this concentration.

*** P <0.001, **P<0.01 and *P<0.05 are significantly different from the value in BV-2

treated with 1 µg/mL of LPS. All compounds were examined in a set of experiments repeated

at least 4 times.

Figure 1

Figure 2

Supporting Information



Merian Nassra1, Stéphanie Krisa*,1, Yorgos Papastamoulis1, Gilbert Deccaux Kapche1,

Jonathan Bisson1, Caroline André2, Jan-Pieter Konsman2, Jean-Marie Schmitter3, Jean-Michel

Mérillon1, Pierre Waffo-Téguo*,1.

1 Groupe d’Etude des Substances Végétales à Activité Biologique, EA 3675, Université de

Bordeaux, Institut des Sciences de la Vigne et du Vin, 210 Chemin de Leysotte, CS50008,

33882 Villenave d’Ornon, France

2 Psychoneuroimmunologie, Nutrition & Génétique, CNRS UMR 5226-INRA 1286,

Université de Bordeaux, 146, rue Léo Saignat, 33076 Bordeaux Cedex, France

3 Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets, UMR 5248 CNRS, Université de

Bordeaux, 146, rue Léo Saignat, 33076 Bordeaux Cedex, France

* To whom correspondence should be addressed.

Dr. Stéphanie Krisa

Dr. Pierre Waffo-Téguo

Groupe d’Etude des Substances Végétales à Activité Biologique, EA 3675

Université de Bordeaux

Institut des Sciences de la Vigne et du Vin,

210 Chemin de Leysotte, CS50008,

33882 Villenave d’Ornon

France

Tel: +33 5 57 57 59 51

Fax: +33 5 57 57 59 52



The stilbenoids (1-25) were isolated from Milicia excelsa (Moraceae), Morus alba

(Moraceae), Gnetum africanum (Gnetaceae), and Vitis vinifera (Vitaceae) as follow:

The stem barks of Milicia excelsa known as Iroko were collected in Yaoundé Cameroon in

2006 and identified by Mr Victor Nana at the National Herbarium, where a voucher specimen

(N° 1702/SRFK) is deposited. The air-dried and finely powdered stem barks (1.5 kg) was

macerated in methanol for 48 h at room temperature, followed by filtration and concentration

to yield a crude MeOH extract (70 g) which was washed with hexane and extracted with ethyl

acetate. The ethyl acetate extract (25 g) was separated over silica gel (100.0 g, 0.040-0.063

mm) chromatographic column (ø = 4 cm) using a gradient of CHCl3-MeOH as eluent. Fifty

fractions of 200 mL each were collected, concentrated, monitored by TLC and similar

fractions were combined. Moracin M (1, 200 mg) was directly obtained after filtration as

white amorphous powder from fractions (10-15) obtained with CHCl3-MeOH 95/5. Other

isolated compounds were identified as triterpenes and flavonoids and were not tested.

The roots of Gnetum africanum were collected in Cameroon in November 2006 and identified

by Mr Victor Nana at the National Herbarium, where a voucher specimen (N° 21165/SFRK)

is deposited.

The air-dried and powdered roots (500 g) were extracted with MeOH for 48 h at room

temperature. The methanolic extract was concentrated under reduced pressure to give a brown

residue (40 g). This extract, was successively extracted with n-hexane and ethyl acetate.

Removal of the solvents gave 15.0 and 23.0 g of residues, respectively. 20 g of the EtOAc

extract were subjected to chromatographic column (ø = 4 cm) over silica gel 60 (100.0 g,

0.040-0.063 mm) and eluted with CHCl3-MeOH of increasing polarity. Forty fractions of 150

mL each were collected, concentrated, monitored by TLC and similar fractions were

combined. Fractions 1-10 (4.1g, CHCl3-MeOH 100/0 - 95/5, v/v) contained mostly

hydrocarbons and were not investigated further. Fractions 11-15 (1.2 g, CHCl3-MeOH

92.5/7.5 - 90/10, v/v) and 16-20 (1.0 g, CHCl3-MeOH 87.5/2.55 - 85/15, v/v) were passed

through Sephadex LH-20 (1.5 x 20 cm) and eluted with CHCl3-MeOH (70/30) to give

respectively E-gnetol (8, 100 mg, white amorphous powder) and gneafricanin A (12, 15 mg,

brown oil). Fractions 21-35 (9.0 g, CHCl3-MeOH 82.5/17.5- 70/30) were subjected to

chromatographic column (ø=4cm) over silica gel 60 (40.0 g, 0.025-0.040 mm) eluting with

CHCl3-MeOH (97/3, 94/6, 90/10, 85/15, 80/20, 75/25, v/v) to give 6 fractions (D1-D6). D2

(1.2 g), D3 (1.1 g) and D6 (1.5 g) were purified on Sephadex LH-20 (1.5 x 20 cm) eluting with

CHCl3-MeOH (7:3) to give E-gnemonoside D (9, 150 mg, white amorphous powder) from

D2, E-gnemonoside C (10, 40 mg, white amorphous powder) from D3 and E-gnemonoside A

(11, 1.0 g, dark red oil) from D6. Other fractions (36-40, 2.3 g) were found to contain mostly

tannins and were not investigated further.

Compounds 2, 4, 12, and 16 were purified from Vitis vinifera cell suspension cultures [1,2].

Compounds 3, 5, 13, 17, and 25 were isolated from the Vitis vinifera (Chardonnay) stem [3].

Compound 24 was obtained from the root of V. Riparia x V [4].

Dried powdered stems of Vitis vinifera collected at Domaine de Merlet Pessac Leognan

appelation were extracted with acetone/water as previously described [4, 5]. Aqueous mixture

was partitioned with methyl tert-butyl ether (MtBE). The MtBE extract was then fractionated

and purified by centrifugal partition chromatography After testing the “Arizona” [5] solvent

system, system K (n-heptane/ethyl acetate/methanol/water 1/2/1/2 v/v) was finally chosen for

a first partition of the MTBE extract. After the CPC separation of MTBE extract (7.86 g), 16

fractions were obtained, eight in the ascending mode and eight in the descending mode [3].

Fraction 3 were fractionated with a second CPC step using Arizona solvent system L (n-

heptane/ethyl acetate/methanol/water 2/3/2/3 v/v). The major stilbene E–piceatannol (5) and

E-scirpusin A (15) were purified in ascending mode whereas E-miyabenol C (21) was

separated in descending and purified by Semi-prep. HPLC using C18 reversed phase column

(Prontosil, 250 mm x 8.0 mm 5.0µm, Bischoff) was used for purification. The mobile phase

was composed of two solvents: A, 0.025% TFA in water and B, MeCN. The UV absorption

was monitored with a Varian 345 dual wavelength UV-Vis detector simultaneously at 280 and

306 nm. The elution program at 3 mL/min, was 20% B (0–5 min), 20–26% B (5–10 min),

26% B (10–22 min), 26-50% B (22–52 min), 50% B (52–55 min) and 50-100% B (55–56

min), 100% B (56–64 min), 100-20% B (64–65 min), 20% B (65–72 min). Fraction 14

(descending mode), issued from the first CPC separation, contained a multitude of phenolic

compounds, especially stilbenes. The Arizona J system (n-heptane / ethyl acetate / methanol /

water 2:5:2:5 v/v) proved to be the most adequate for this fraction’s purification. 131 tubes

were collected, 117 in the ascending mode and 14 in the descending, grouped in ten fractions.

From the tubes 84-107 of the ascending mode, flavanoids: (+)-catechin, (-)-epicatechin,

epicatechin-3-O-Gallate, astilbin and stilbenoids: leachianol F (19) and G (20),

quadrangularin A (18), hopeaphenol (22) and Isohopeaphenol (23) were purified by semi-

preparative HPLC using the same conditions as above. The elution program at 3 mL/min, was

5-10% B (0–5 min), 10% B (5–13 min), 10–20% B (13–26 min), 20% B (26–30 min), 20–

26% B (30–37 min), 26% B (37–49 min), 26–100% B (49–56 min). The air-dried stem barks

of Morus alba (registration number TAL 19910036) were extracted with acetone/water as

above. The Aqueous mixture was washed with CHCl3 and extracted with MtBE. The MtBE

extract was then purified by centrifugal partition chromatography using Arizona H system [5]

in descending mode to give compound 7.

1 Waffo-Téguo P., Fauconneau B., Deffieux G., Huguet F., Vercauteren J., Mérillon J.M.

Isolation, Identification and antioxidant activity of three stilbene glucosides newly

extracted from Vitis vinifera cell cultures., J Nat Prod 1998; 61: 655-657.

2 Waffo-Teguo P., Lee D., Cuendet M., Merillon J.M.,. Pezzuto J.M, Kinghorn A.D. Two new

stilbene dimer glucosides from grape (Vitis vinifera) cell cultures, J Nat Prod 2001; 64:

136-138.

3 Zga N, Papastamoulis Y, Toribio A, Richard T, Delaunay J, Jeandet P, Renault J., Monti J-

P, Mérillon J-M, Waffo-Téguo P. Preparative purification of antiamyloidogenic stilbenoids

from Vitis vinifera (Chardonnay) stems by centrifugal partition chromatography. J

Chromatogr B 2009; 877 : 1000-1004.

4 Bisson J., Poupard P., Pawlus A.D., Pons A., Darriet P., Mérillon J.-M., Waffo-Teguo P.

Development of hybrid elution systems for efficient purification of stilbenoids using

centrifugal partition chromatography coupled to mass spectrometry., J Chromatogr A

2011; 1218: 6079-6084.

5 Foucault A, Chevolot L, Counter-current chromatography: Instrumentation, solent selection

and some recent applications to natural product purification, J Chromatogr A 1998; 808 :

3-22.


59

Chapitre 2 : L’effet anti-inflammatoire de la moracine M

Objectifs : Parmi 25 stilbènes, nous avons donc sélectionné la moracine M comme ayant

potentiellement un effet molécule anti-inflammatoire au niveau du SNC. Afin de conforter nos

résultats, nous évaluerons la capacité de cette molécule à inhiber la production de différents

médiateurs impliqués dans le processus neuro-inflammatoire.

I. La moracine M

Le 2-(3’,5’-dihydroxyphenyl)-6-benzofuran ou moracine M est un stilbène, monomère du

resvératrol (figure 23). Chez les plantes, ce stilbène est présent principalement dans la famille

des Moraceae, mais également dans la famille des Melanthiaceae (Rivière et al., 2012). Parmi

les Moraceae, il apparaît dans plusieurs espèces, dont Morus alba, Morus yunanensis, Morus

nigra, Morus mesozygia, Morus wittiorum (Zhang et al., 2009 ; Cui et al., 2008 ; Wang et al.,

2010 ; Fozing et al., 2012 ; Tan et al., 2008), Milicia excelsa (Kapche et al., 2007) et

Artocarpus dadah (Su et al., 2002).

Parmi ces différentes espèces, Morus alba est la plus fréquemment étudiée de part son

utilisation importante dans la médecine traditionnelle asiatique et particulièrement la

médecine chinoise. Cette plante est utilisée pour ces propriétés antibactérienne,

hypolipidémique, anti-oxydante, neuroprotectrice, hypoglycémique, antidiabétique (Mei et

al., 2011). La quantité de moracine M extraite et purifiée des écorces de racine de Morus alba

est comprise entre 12,5 et 25mg/Kg (Zhang et al., 2009 ; Chen et al., 2012).

La moracine M, en temps que composé pur, n'a été que très peu étudié pour ces propriétés

biologiques. Néanmoins, en 2009, Zhang et son équipe ont étudié les propriétés

hypoglycémiantes de la moracine M extrait de Morus alba, ils montrent que ce polyphénol

possède une tendance à inhiber le taux élevé de glycémie à jeun. La moracine M présente

également des activités anti-oxydantes (Cui et al., 2008; Tan et al., 2008).

Dans notre travail, nous utilisons la moracine M extraite et purifiée au GESVAB à partir

d'écorces de Milicia excelsa (10mg/Kg) selon Kapche et al. (2007).


60

II. Effets de la moracine M sur la production des médiateurs

inflammatoires dans les cellules microgliales activées

II.A. Les conditions expérimentales

Dans la suite de notre travail, nous exposerons les résultats concernant la production de

différents médiateurs de l'inflammation : le NO, le TNF-α, l’IL-1β et la PGE2.

Pour chacun des marqueurs d'inflammation, nous réaliserons 2 études :

- tout d'abord, nous étudierons les cinétiques de production des marqueurs et de synthèse des

protéines nécessaires à l'accumulation de ces marqueurs (quantité de protéines et/ou de

transcrits) dans le but de définir les conditions expérimentales optimales,

- puis, nous évaluerons l'action de la moracine M en fonction de sa concentration, sur la

synthèse des différents marqueurs précédemment cités. Pour ce faire, nous utiliserons

différentes conditions de culture pour les cellules microgliales BV-2 :

- la "condition témoin" sans traitement

- la "condition témoin moracine M" : traitement avec la moracine M à la plus forte

concentration utilisée de l'expérience

- la "condition LPS" : les cellules sont activées par le LPS (1µg/ml)

- les différentes conditions où les cellules sont activées par le LPS (1µg/ml) en

présence de moracine M à différentes concentrations.

II.B. Effet de la moracine M sur la viabilité des cellules BV-2 activées

Afin de définir le seuil de toxicité de la moracine M sur les cellules BV-2 activées par le LPS,

la viabilité cellulaire est mesurée à l'aide du test MTT. Les cellules sont mises en contact avec

ce stilbène à des concentrations comprises entre 10 et 100µM et en présence de LPS (1µg/ml).

Les résultats montrent qu’à partir de 70µM, la moracine M entraîne une faible différence

significative de la viabilité cellulaire (figure 24). Cette toxicité augmente jusqu'à la plus

élevée des concentrations testées (100µM).

Dans nos futures expériences, nous utiliserons la moracine M à des concentrations comprises

entre 5 et 40µM.


61

II.C. Effets de la moracine M sur la production de NO et la synthèse

d’iNOS dans les cellules BV-2 activées

Dans le but de rechercher un effet de la moracine M sur la production de NO dans les cellules

microgliales activées, la concentration en NO dans le milieu de culture, la quantité de la

protéine iNOS ainsi que le niveau des transcrits codant le gène d’iNOS dans les cellules ont

été mesurés. Les dosages sont effectués, après traitement des cellules avec le LPS en présence

de moracine M aux différents temps d’incubation définis dans le chapitre 1.

La figure 25 présente le pourcentage de production de NO par rapport à la "condition LPS".

Nous observons une diminution de l'accumulation de ce marqueur en fonction de la

concentration en moracine M. Dès 5µM, la moracine M diminue significativement de 20% la

concentration en NO. Cette inhibition atteint 82,5% à 40µM. L’IC50 de la moracine M sur la

production de NO est de 17,2 ± 2,9µM.

Nos résultats mettent également en évidence une forte diminution de la quantité de la protéine

iNOS et du taux d’ARNm de son gène dès 10µM (figure 26 ; A et B).

Etant établi depuis 1993 (Corradin et al., 1993) que le LPS induit une importante production

de NO dans les cellules microgliales par l'intermédiaire de la synthèse de novo d'iNOS,

l'ensemble de nos résultats montre que l'action de la moracine M sur l'accumulation de NO, se

fait en partie par l'intermédiaire de la diminution des ARNm d'iNOS qui est suivie par une

réduction de la production de la protéine.


62

II.D. Effets de la moracine M sur la production de TNF-α et d’IL-1β

dans les microglies activées

II.D.1. Cinétique d’accumulation de deux cytokines pro-inflammatoires et

suivi des gènes codant pour ces cytokines dans les cellules BV-2 activées

L’inflammation est accompagnée d'une forte production de cytokines pro-inflammatoires

telles que le TNF-α et l’IL-1β. Ces peptides sont produits par les microglies suite à leur

activation, puis excrétés dans le milieu de culture.

Dans un premier temps, une cinétique d'accumulation de ces deux cytokines est réalisée en

dosant les concentrations de TNF-α et d’IL-1β dans le milieu de culture des cellules BV-2

après différents temps de traitement par le LPS (0, 3, 6, 9, 12, 18 et 24h).

La concentration en TNF-α augmente rapidement dès 3h d’activation (5380pg/ml versus

150pg/ml pour la "condition témoin"). Elle est maximale à 12h et ne varie ensuite que très peu

jusqu'à 24h de traitement. La production d’IL-1β est plus tardive. En effet, elle n'apparaît

qu'après 12h de traitement. Sa concentration maximale est de 245pg/ml à 24h, alors qu’elle

est inférieure à 1pg/ml dans les cellules non activées au temps = 0 (figure 27A).

Au vu de ces résultats, les dosages du TNF-α et de l’IL-1β seront réalisés dans les surnageants

prélevés après 24h d’activation dans les prochaines expériences. Dans cette condition, les

concentrations obtenues sont suffisamment importantes pour rechercher les effets des

polyphénols sur la production des cytokines pro-inflammatoires.

Dans un second temps, nous avons mesuré les niveaux de transcrits des ARNm de TNF-α et

d’IL-1β dans les cellules BV-2 cultivées en présence de LPS (1µg/ml) pendant différents

temps (0, 3, 6, 9, 12h).

La figure 27B montre un taux de transcrits maximal du gène TNF-α dès 3h d’activation, ce

taux a tendance à diminuer mais reste important jusqu'à 9h de traitement. Concernant l'IL1- β,

la quantité d'ARNm est faible à 3h, augmente jusqu'à 9h, puis diminue à 12h.

Le temps optimal pour extrait les ARNm de ces cytokines se situe entre 6h et 9h d'activation

des cellules.


63

Ainsi, nous remarquons que la stimulation des microglies par le LPS entraîne une réponse

différente selon les médiateurs. En effet, le TNF-α est synthétisé précocement (dès 3h) par

rapport à l'IL-1β (à partir de 12h). D'autre part, nous observons une bonne corrélation entre les

taux de transcrits et la quantité de protéines correspondantes aussi bien pour le TNF-α que

pour l'IL-1β.

II.D.2. Effets de la moracine M sur la production des cytokines pro-

inflammatoires et suivi des gènes codant pour ces cytokines dans les

microglies activées

Afin de déterminer l'action d'un traitement par la moracine M sur la production de cytokines

pro-inflammatoires dans les cellules BV-2, nous avons dosé le TNF-α et de l’IL-1β après 24h

de cotraitement LPS/moracine M, et les transcrits de ces protéines près 6h de cotraitement.

TNF-α

Nous observons, sur la figure 28A, une augmentation de la concentration de TNF-α aux plus

faibles concentrations de moracine M (5 et 10µM). Par contre, à 20µM, la moracine M inhibe

la production de la cytokine de 22%, puis entre 20 et 40µM, la quantité de TNF-α produite est

inversement proportionnelle à la concentration en moracine M. L'IC50 du stilbène pour la

production de TNF-α est de 33,4 ± 1,3µM.

D'autre part, nous pouvons remarquer que dans les conditions sans traitement au LPS, la

moracine M à 40µM induit une diminution de la concentration basale de TNF-α dans la

"condition témoin".

Concernant le niveau de transcrits de TNF-α, nous n'observons pas de diminution significative

en présence de 10 et 20µM de moracine M. Par contre, une diminution est notée pour les

deux concentrations les plus élevées (figure 28B)

Speciale et ses collaborateurs (2011) suggèrent que plusieurs molécules d'origine

phytochimique ayant des activités biologiques présentent des effets hormétiques. Ainsi, ces

molécules agissent comme des stimulants à faibles concentrations et préparent les cellules

pour résister contre un stress à venir plus important. Cette hypothèse pourrait expliquer l’effet

inducteur de la moracine M aux concentrations inférieures à 20µM.


64

IL-1β

Le stilbène inhibe significativement la production d’IL-1β dès 5µM, la concentration d’IL-1β

représente alors 48% de celle de la "condition LPS". À partir de 20µM, la production d’IL-1β

est presque totalement inhibée par la moracine M, elle est inférieure à 7%. L'IC50 est de 5,4 ±

0,7µM (figure 29A).

Au niveau transcriptionnel, la moracine M tend à inhiber l’expression de l’ARNm d’IL-1β à

partir de 20µM. Cette tendance s'intensifie pour des concentrations en moracine M

supérieures (figure 29B).

II.E. Effets de la moracine M sur la synthèse de PGE2 dans les

microglies activées

II.E.1. Cinétique d’accumulation de PGE2 dans les BV-2 activées

Le dosage de PGE2 est réalisé dans le milieu de culture des cellules BV-2 activées par le LPS

pendant différents temps.

Nous observons une augmentation rapide de l'accumulation de la PG, avec une concentration

maximale dès 3h. Celle-ci reste ensuite stable jusqu'à 24h (figure 30).

II.E.2. Effets de la moracine M sur la production de PGE2 dans les


L'effet de la moracine M sur l'accumulation de PGE2 est présenté sur la figure 31. Dès 10µM,

la moracine M inhibe de 86% la production en PGE2 par rapport à la condition LPS. La

production de ce médiateur avec un traitement de 40µM en stilbène est de 3% par rapport à

celle de la condition LPS (97% d'inhibition).

Dans la condition témoin, nous pouvons remarquer que la production basale en PGE2 est

inhibée par la moracine M à la concentration de 40µM (90% d’inhibition).


65

II.E.3. Effets de la moracine M sur la synthèse d'enzymes impliquées dans

la production de PGE2 au niveau traductionnel et transcriptionnel

La production de PGE2 est régulée par plusieurs enzymes, dont celle de la famille des COX.

Parmi celles-ci, il est établie que la COX-1 est constitutive et la COX-2 est induite en réponse

aux stimuli inflammatoires (Jouzeau et al., 2004). Cependant, depuis quelques années,

différents chercheurs ont mis en évidence que la COX-1 peut jouer un rôle dans la réponse

inflammatoire au niveau du SNC, elle serait ainsi induite face à un stimulus inflammatoire

(Choi et al., 2009 ; Calvello et al., 2012). De plus, nous suggérons que la production de PGE2

dans la "condition témoin" est due à la COX-1 constitutive, et que la moracine M est capable

de diminuer la synthèse de cette enzyme, puisqu'elle diminue la production basale de PG.

Nous avons donc recherché l’effet de la moracine M sur l'accumulation de ces deux protéines,

COX-1 et COX-2 (figure 32). Après 24h de traitement, le LPS semble diminuer la synthèse de

COX-1, par rapport aux conditions témoins ("condition témoin" et "condition témoin

moracine M"). Cependant, nous n’observons aucune différence du taux de COX-1 dans les

microglies traitées par la moracine M. Concernant la COX-2, la protéine n’est pas exprimée

dans les 2 conditions témoins, par contre, le LPS induit fortement la synthèse de cette

enzyme. La moracine M ne présente aucun effet sur la production de COX-2 en présence de

LPS.

L’analyse de l’expression des gènes après 6h de traitement ne montre que peu de différence

entre les conditions LPS et les conditions en cotraitement LPS/moracine M pour la COX-1.

Le taux de transcrits codant pour la COX-2 est fortement augmenté dans les cellules activées

par rapport aux cellules dans les conditions témoins. Nous observons une faible diminution

des transcrits en présence de moracine M à toutes les concentrations (figure 33).

Nous avons également étudié l’impact du stilbène sur la production de la mPGES-1, enzyme

intervenant dans la synthèse de la PGE2 en aval des COX (figure 7). La quantité de protéines

mesurée par Western Blot augmente en présence de LPS, et diminue en cotraitement de

LPS/moracine M à 30 et 40µM. Le niveau d’ARNm codant pour mPGES-1 est plus important

lorsque les cellules sont activées par le LPS, mais il ne varie pas en présence de moracine M.


66

III. Discussion du chapitre 2

Dans cette partie, nous avons étudié l'effet de la moracine M sur la production des marqueurs

inflammatoires et sur la synthèse des protéines responsables de ces productions dans des

microglies activées.

Dans ce modèle de culture in vitro, les cellules BV-2 produisent un niveau basal de NO,

PGE2, TNF-α et IL-1β dans la "condition témoin". Le LPS est capable d'augmenter

significativement les concentrations de ces médiateurs inflammatoires.

Nous avons montré que la moracine M inhibe la production des quatre marqueurs

d'inflammation étudiés et ceci sans effet toxique pour les cellules. Ce stilbène est très efficace

dès les plus faibles concentrations sur l'accumulation d'une cytokine l’IL-1β et de la PGE2,

avec des IC50 de 5,4 ± 0,7µM et 5,8 ± 0,5µM, respectivement. Il réduit de façon dose

dépendante la production de NO, avec une IC50 de 17,2 ± 2,9µM et inhibe significativement la

synthèse de TNF-α à partir de 20µM.

Nos résultats montrent que la moracine M est capable de diminuer l'accumulation du NO

produit par des cellules microgliales activées in vitro. Cette observation peut s’expliquer par

différents mécanismes. En effet, Le NO étant un radical libre, cette inhibition pourrait en

partie être due aux propriétés anti-oxydantes de la moracine M, communes à la plupart des

polyphénols (Lu et al., 2005). La moracine M pourrait également capter le NO libéré comme

l’ont montré Ciz et ses collaborateurs pour le resvératrol sur le NO produit par des

macrophages de rat (2008). Cependant, aux vues de nos résultats, nous suggérons que la

diminution de l'accumulation de NO en présence de moracine M est principalement liée à

l'inhibition de la synthèse d'iNOS (ARNm et protéines) par cette molécule.

Les cytokines produites par les microglies activées, TNF-α et IL-1β, jouent un rôle

important dans les maladies neuro-inflammatoires. L'IL-1β est une cytokine pro-

inflammatoire puissante, qui agit par l'intermédiaire de récepteurs présents sur de nombreux

types de cellules, dont les neurones et les microglies. Le TNF-α, quand à lui, peut induire la

mort neuronale soit directement en se liant à des récepteurs neuronaux qui activent les

mécanismes apoptotiques (Zhao et al., 2001), soit indirectement en potentialisant la libération

de glutamate, augmentant ainsi l'excitotoxicité (Zou et Crews, 2005). Ainsi l'inhibition de la


67

production de ces enzymes semble être un mécanisme clé dans le contrôle de l'inflammation.

Nous avons montré que la moracine M est une molécule capable de diminuer la libération de

ces protéines et la quantité de leurs transcrits, et avec une efficacité plus importante sur la

production d'l'IL-1β que sur celle du TNF-α.

Meng et ses collaborateurs (2008a) ont également mis en évidence une différence importante

entre les efficacités du ptérostilbène à inhiber la production de NO et de TNF-α. Ce stilbène

inhibe 50 % de la production de NO à 1,9µM, et de celle de TNF-α à plus de 30µM dans des

cultures primaires de microglies de rat. Par contre, une étude réalisée sur le picéatannol

montre que cet autre stilbène diminue de 50% la production des 4 marqueurs que nous avons

étudiés, à des concentrations proches, comprises entre 20 et 25µM.

Ces résultats différents pour les 3 monomères de resvératrol suggèrent que ces composés

présentent des propriétés anti-inflammatoires, mais que les mécanismes d'action pourraient

être différents selon les molécules.

Dans le souci de mieux comprendre l'effet de la moracine M sur la synthèse de la PGE2,

nous avons étudié la synthèse de 3 enzymes intervenant dans la production de cette PG (figure

7). Nous montrons que dans notre modèle d'étude (lignée de cellules BV-2 activées par du

LPS), le stimulus ne présente pas d'effet inductible sur la synthèse de COX-1 (ARNm et

protéines). Par contre, le LPS induit la synthèse de COX-2 et celle de mPGES-1. Ces résultats

sont en accord avec ceux de De Oliveira et ses collaborateurs qui ont montré en 2008 que

mPGES-1 est une protéine inductible, contrairement à mPGES-2 et cPGES.

De façon surprenante, nous observons que la moracine M est capable de moduler faiblement

la transcription de la COX-2, mais n'a pas d'effet sur le taux de protéines COX-2.

Concernant la mPGES-1, la moracine M n'a pas d'effet sur la quantité de transcrits, mais

inhibe l'accumulation de la protéine. Ces résultats suggèrent que la moracine M présente une

régulation négative post-transcriptionnelle. En effet, une régulation au niveau transcriptionnel

et aussi au niveau post-transcriptionnel a été démontrée pour d'autres enzymes de la

biosynthèse des PGE2, comme la COX-2 (Jouzeau et al., 2004).

De façon similaire, le resvératrol ne présente pas d'effet sur la synthèse protéique des deux

COX, mais il agit sur l'activité de COX-1 et l'activité totale des COX (Candelario-Jalil et al.,

2007).


68

Chapitre 3 : Les mécanismes d’action de la moracine M sur les

voies de signalisation impliquées dans l’inflammation

Objectifs : Les voies de signalisation jouent un rôle majeur dans la régulation de la réponse

inflammatoire et coordonnent l’expression de nombreux gènes codant pour des médiateurs

inflammatoires. La moracine M, étant un inhibiteur de la production de plusieurs de ces

médiateurs, nous chercherons à déterminer sa capacité à moduler certaines de ces voies dans

les cellules microgliales.

I. La voie de signalisation NF-κB et la moracine M

La principale voie de signalisation impliquée dans les processus inflammatoires est la voie de

NF-κB régulant l’expression de gènes codant pour de nombreux médiateurs. Dans des

conditions physiologiques normales, NF-κB est inactif car séquestré dans le cytoplasme par

son inhibiteur IB. Lorsque la microglie est activée, IB est phosphorylé par IKK puis

dégradée par le protéasome, libérant ainsi NF-κB. Ce dernier peut alors migrer dans le noyau

et activer la transcription des gènes cibles (Hayden et Ghosh, 2008).

Afin de rechercher l'effet de la moracine M sur cette voie de signalisation, nous avons ciblé

deux évènements de cette voie : la phosphorylation/dégradation d'IB et la translocation

nucléaire de la sous-unité p65 de NF-κB, par Western Blot et immunocytochimie,

respectivement.

I.A. Effet du LPS sur la voie NF-κB au cours du temps

L’activation des voies de signalisation est un phénomène précoce dans le processus

inflammatoire. Nous avons donc suivi l'impact du LPS sur la voie NF-κB à des temps courts

de traitement compris entre 15 et 60 min.

La figure 34 montre une présence importante d’IB dans les cellules non activées (au temps

0 min). Cette quantité diminue dès 15 min de traitement, pour être minimale à 30 min, mettant

en évidence la dégradation d’IB dans le cytoplasme par le protéasome. Après 45 min de

traitement le signal augmente, mettant en évidence la néo-synthèse d'IB.


69

La translocation nucléaire de NF-κB a été évaluée par microscopie en fluorescence : cette

technique permet de visualiser le noyau des cellules microgliales (coloration en bleu) et la

sous-unité p65 de NF-κB (coloration en vert). Les photographies de la figure 35 montrent une

localisation de p65 majoritairement cytoplasmique dans les cellules non traitées par le LPS

(t=0). Après 30 min, on ne distingue plus un contour net de la couleur verte au niveau des

cytoplasmes et la couleur des noyaux est turquoise, indiquant la translocation de NF-κB.

Après 60 min, les noyaux et les cytoplasmes reprennent leurs couleurs initiales. Ce qui

indique que la sous-unité p65 du facteur de transcription se retrouve à nouveau principalement

dans le cytoplasme.

Ces images nous montrent que la translocation de NF-κB est rapide suite au signal LPS

(30 min), et qu'elle est transitoire, puisque dès 60 min, nous n'observons plus de sous-unités

dans le noyau.

Le temps de traitement avec le LPS de 30 minutes semble donc être le temps approprié à la

recherche d’une potentielle inhibition de la translocation de p65 par la moracine M. Par

ailleurs, différents auteurs ont réalisé des cinétiques de phosphorylation des MAPK et d’Akt

dans les cellules BV-2 en présence de LPS. Les phosphorylations de ces protéines sont

maximales à 30 min, et donc, ce temps semble optimal pour étudier l’effet d’inhibiteurs (Park

et al., 2011 ; Saponaro et al., 2012). Ce temps sera donc également utilisé pour l'étude des

voies de signalisation MAPK et de PI3K/Akt.

I.B. Effet de la moracine M sur la voie de signalisation NF-κB

Nous avons recherché l'effet de la moracine M sur la voie NF-κB. Nous observons dans la

figure 36 que la moracine M seule ne modifie ni la phosphorylation de protéine IB, ni la

quantité de celle-ci, par rapport à la "condition témoin". Par contre, le LPS augmente de 50%

l'intensité du signal de p-IB et diminue d'un tiers celui d'IB.

Concernant la moracine M en cotraitement avec le LPS, nos résultats sont contradictoires

puisque le stilbène atténue la phosphorylation d'IB, mais n'a pas d'effet sur la dégradation

d'IB dans les microglies.


70

L'activation des cellules BV-2 par le LPS induit la migration de la sous-unité p65 de NF-κB

vers le noyau. Cependant, la moracine M à 40µM, en présence de LPS, ne présente aucun

effet sur ce phénomène (Figure 37).

II. Effet de la moracine M sur les MAPK

L’implication des MAPK au niveau de l’expression des gènes associés à l’inflammation dans

des microglies activées a été montrée par de nombreux auteurs. Ces protéines kinases

pourraient donc être des cibles d’une action inhibitrice de la moracine M. En effet, la

moracine M est capable d’inhiber la production des facteurs inflammatoires mais pourtant ne

semble pas agir sur la voie du facteur de transcription NF-B. L'inhibition d'autres voies de

signalisation pourrait donc être une raison expliquant ses propriétés anti-inflammatoires. De

plus, plusieurs travaux ont montré que l’action inhibitrice de certains polyphénols, notamment

le resvératrol, était liée à leur capacité à inhiber les voies MAPK dans des cellules

microgliales (Bi et al., 2005 ; Mi Jeong Sung et al., 2009 ; Zhong et al., 2012).

Ainsi, les phosphorylations de plusieurs MAPK, telles que p38, ERK1/2, JNK, sont étudiées

par analyse Western Blot. Nous observons que la moracine M n'a pas d'effet sur la

phosphorylation de p38 induite par le LPS. Par contre, la moracine M tend à diminuer la

phosphorylation de JNK à la plus forte concentration testée, et, est capable de diminuer

l'activation de ERK1/2. En effet, dès la concentration de 20µM, la phosphorylation de

ERK1/2 revient à son état basal, c'est à dire qu'elle est similaire à celle de la "condition

témoin" (figure 38).

III. Effet de la moracine M sur l'activation d'Akt

Dans les cellules microgliales, la voie PI3K/Akt est activée par différents stimuli dont le LPS

(Guha et Mackman, 2002 ; Saponaro et al., 2012). Les résultats présentés sur la figure 39

montrent que dans notre modèle de cellules BV-2, le LPS augmente l'intensité du signal p-

Akt, suggérant l'activation de la voie PI3K/Akt.

La moracine M inhibe cette phosphorylation dès la concentration de 10µM et à partir de

20µM, l'intensité du signal de la p-Akt est réduite de plus de 60% pour atteindre ainsi le

niveau basal de protéines phosphorylées.


71

IV. Effet de la moracine M sur l'expression de TLR4

Au niveau d'une cellule, des cascades de signalisation sont déclenchées suite à l'interaction

d'un stimulus avec ses récepteurs. Dans les cellules microgliales, la protéine TLR4 étant le

principal récepteur du LPS, nous avons souhaité déterminer si la moracine M peut moduler

l'effet du LPS sur son récepteur. L'analyse de l'expression des transcrits de TLR4 montre que

le LPS induit une augmentation de la quantité d'ARNm de TLR4. La moracine M inhibe cette

induction de façon proportionnelle à sa concentration. De plus, dans les conditions où les

cellules microgliales ne sont pas activées par le LPS, la moracine M diminue également les

transcrits de TLR4 (figure 40).

V. Discussion du chapitre 3

Dans ce chapitre, nous montrons que le LPS est capable d’activer les cellules BV-2 dans les

conditions expérimentales utilisées, en activant différentes voies de signalisation. En effet, le

LPS active la sous-unité inhibitrice de NF-κB (phosphorylation/dégradation), ainsi que la

translocation nucléaire de ce facteur de transcription. De plus, ce stimulus induit la

phosphorylation de différentes kinases de la voie MAPK et d’Akt, mais également, la

stimulation de l'expression de son propre récepteur, TLR4 (figure 41).

La voie NF-κB étant une cascade de signalisation impliquée dans l’inflammation, la

plupart des travaux visant à identifier des inhibiteurs de l'inflammation, s’intéressent à cette

voie. Par exemple, différents stilbènes, comme le resvératrol, le picéatannol, le miyabénol A

(tétramère du resvératrol) agissent négativement sur cette voie de signalisation dans différents

types de cellules immunitaires (Bi et al., 2005 ; Jin et al., 2006 ; Ku et al., 2008).

Dans notre travail, la moracine M inhibe la phosphorylation d’IB, mais nous n’observons

pas d’effet sur la dégradation de cette protéine, ni sur la translocation de la sous-unité de

NF-κB. Aux vues de l'action de cette molécule sur les différents médiateurs de l'inflammation

étudiés précédemment, nous nous attendions à une diminution de l'activation de NF-κB par la

moracine M.


72

Ainsi, nos résultats ne nous permettent pas de conclure quand à l'effet de la moracine M sur la

voie NF-κB. Cependant, nous envisageons deux hypothèses :

- soit, la moracine M n'a pas d'impact sur la cascade d'activation de ce facteur de transduction

- soit nos conditions expérimentales ne sont pas optimisées pour la recherche d'un effet

inhibiteur sur la voie NF-κB. En effet, les études précédemment citées ont été réalisées dans

des conditions différentes des nôtres, puisque les cellules sont prétraitées pendant 1h par les

stilbènes, puis activées par le LPS, alors que dans notre travail nous utilisons un cotraitement

stilbène/LPS de 30 min.

Dans les cellules immunitaires, certains polyphénols peuvent inhiber la phosphorylation

d'une ou de plusieurs MAPK. Par exemple, différents auteurs s'intéressent aux

phosphorylations de p38, ERK1/2, JNK dans des macrophages en culture in vitro en présence

de polyphénols. Ku et ses collaborateurs (2008) montrent que le miyabénol A inhibe

l'activation de p38, ainsi que le ptérostilbène qui de plus inhibe celle de ERK1/2 (Pan et al.,

2008). Dans des cellules microgliales BV-2, la chrysine (un flavonoïde) inhibe la

phosphorylation de JNK (Ha et al., 2010). Concernant le resvératrol dans des microglies de la

lignée N9, Bi et ses collaborateurs (2005) montrent une inhibition de la phosphorylation de

p38 par ce composé, alors que Lu et son équipe (2010) n'observent aucun effet de ce stilbène

sur l'activation de cette voie, tout comme au niveau des voies ERK1/2 et JNK. Dans les

cellules microgliales de type BV-2, ce même stilbène inhibe la phosphorylation de ces 3 voies

MAPK (Zhong et al., 2012). Notre étude met en évidence une inhibition de la

phosphorylation d'ERK1/2 par la moracine M et une tendance à atténuer celle de JNK. L'effet

des différents stilbènes sur les MAPK est donc très variable selon les molécules testées, les

lignées cellulaires utilisées, mais également selon les conditions de traitement.

Le facteur de transcription AP-1 est formé par dimérisation de protéines Jun ou par

hétérodimérisation d'une protéine Jun avec une protéine Fos. ERK1/2 et JNK sont capables de

phosphoryler la sous-unité c-Jun dans les cellules BV-2, et donc d'activer AP-1 (Kaminska et

al., 2009 ; Deng et al., 2012). Ainsi, la moracine M en inhibant la phosphorylation d’ERK1/2

et de JNK pourrait entrainer indirectement l’inhibition du facteur de transcription AP-1 et par

voie de conséquence l'expression de ses gènes cibles (iNOS, TNF-α, IL-1β et COX-2).


73

Le rôle de la voie PI3K/Akt dans la réponse inflammatoire n'est pas encore été

complètement défini. En effet, certains auteurs confèrent à Akt un rôle de régulateur négatif

de la production de médiateurs inflammatoires, tels que le TNF-α et le NO dans des

monocytes et des macrophages, respectivement (Park et al., 1997 ; Guha et Mackman, 2002).

De même, l'inhibition d'Akt par le LY294002 (un inhibiteur spécifique de la PI3K) augmente

l'activation des MAPK par le LPS dans les monocytes (Schabbauer et al., 2004). Au contraire,

Hwang et ses collaborateurs (2004) montrent que ce même inhibiteur diminue la production

de NO induite par IFN-γ dans des cellules BV-2. Et récemment, Saporano et son équipe

(2012) mettent en évidence sur des cultures primaires de microglies de poussins, que

l'activation de la voie PI3K/Akt est impliquée dans la réponse inflammatoire induite par le

LPS.

Ces différents auteurs soulignent tous, la complexité du rôle d'Akt dans la régulation de

l'inflammation. Certains suggèrent que ces variations peuvent être dues aux différences de

régulation des MAPK et NF-κB par Akt, et d'autres proposent que la protéine mTOR, une des

cibles d'Akt, est responsable de cette variabilité de réponse puisqu'elle présente des rôles

opposés dans le système immunitaire (Thomson et al., 2009).

En 2012, deux équipes recherchent l'effet du resvératrol sur l'inflammation induite par le LPS

dans des cellules microgliales de type BV-2 (Capiralla et al, 2012 ; Zhong et al., 2012). Les

auteurs de ces 2 équipes montrent que ce stilbène diminue les productions de cytokines

(TNF-α et IL-1β) ainsi que des enzymes responsables de leurs synthèses. Ils mettent en

évidence que le resvératrol inhibe l’activation de Nf-κB. Cependant, concernant l'inhibition de

la phosphorylation d'Akt, ils présentent des résultats contraires. L’équipe de Capiralla montre

que le LPS augmente la phosphorylation d’Akt, et que celle ci est atténuée par le resvératrol,

alors que Zhong et ses collaborateurs mettent en évidence une induction de l'activation d'Akt

par ce stilbène. Ils aboutissent pourtant aux mêmes conclusions : le resvératrol est

potentiellement anti-inflammatoire au niveau du SNC.

Plusieurs études mettent en évidence les effets anti-inflammatoires d'autres polyphénols

(kaempferol, sauchinone, miyabenol, ptérostilbène), en démontrant qu'ils agissent en inhibant

la production de médiateurs d'inflammation et les voies de signalisation telles que NF-κB et

MAPK (Ku et al., 2008 ; Pan et al., 2008 ; Park et al., 2011 ; Jang et al., 2012 ). Dans ces

travaux, les auteurs montrent également que ces composés diminuent la phosphorylation


74

d'Akt induite par le LPS. Ils concluent que l'inhibition de la voie PI3K/Akt est bénéfique pour

atténuer la réponse inflammatoire.

De plus, deux études récentes de De Oliveira et de ses collaborateurs (2008; 2012) montrent

une relation entre la voie PI3K/Akt et la voie de biosynthèse des PG. Ils mettent en contact

des cellules microgliales de rat avec des inhibiteurs spécifiques d'Akt et montrent que ces

inhibiteurs induisent la synthèse protéique de COX-2 et inhibent celle de mPGES-1.

Dans notre travail, le LPS induit la phosphorylation d'Akt et la moracine M inhibe cette voie.

De plus, nous avons vu précédemment que ce stilbène peut diminuer la quantité de protéines

mPGES-1, sans avoir d'effet sur la COX-2. Ces résultats suggèrent donc que la moracine M,

en inhibant la voie Akt, peut atténuer la réponse inflammatoire et plus particulièrement

diminuer la production de PGE2.

Lors d'une réponse inflammatoire, une augmentation de la biosynthèse de TLR est

observée dans les cellules microgliales (Takeda et Akira, 2004 ; Kettenmann et al., 2011).

Cette synthèse est régulée entre autre par l'activation du facteur de transcription AP-1 (Roger

et al., 2005). Dans des cellules BV-2, Cheong et ses collaborateurs (2011) ont montré que la

quantité de TLR4 augmente au cours du temps en présence de LPS, et ce, jusqu'à 24h de

traitement. Sur la même lignée cellulaire, nous montrons que la moracine M est capable

d'inhiber l'expression de ce récepteur, et pourrait donc agir au début de la cascade de

signalisation induite par le LPS.

La signalisation intracellulaire de la réponse inflammatoire est complexe, elle fait intervenir

plusieurs voies de signalisation qui interagissent entre elles. De plus, des stimuli différents

peuvent activer la même voie. Par exemple, dans notre modèle d'étude, le LPS, mais

également les cytokines produites en réponse au LPS, peuvent stimuler une même cascade de

signalisation. Dans ce contexte, une molécule anti-inflammatoire qui agit sur un ou plusieurs

évènements atténuera, plus ou moins, la réponse inflammatoire dans sa globalité.

Nous montrons que la moracine M régule négativement les voies PI3K/Akt et MAPK

(ERK1/2 et JNK) suggérant principalement une inactivation du facteur transcriptionnel AP-1.

Conclusions générales et Perspectives

75

Conclusions générales et

Perspectives

Le GESVAB concentre ses activités de recherche sur la thématique "Polyphénols et Santé"

depuis plus de 10 ans, et plus particulièrement depuis 2010 sur « Polyphénols de la Vigne et

Neuroprotection ». C'est dans ce contexte que mon travail de thèse intitulé " Effets anti-

inflammatoires des stilbènes sur des cultures de cellules microgliales et mécanismes

d'action " s'inscrit.

Ainsi, nous avons dans un premier temps mis en place la culture de cellules microgliales

BV-2 et les différentes techniques de dosage nécessaires à ce travail (Western Blot, RT-PCR,

immunocytochimie).

Grâce au savoir faire du laboratoire concernant l'extraction et l'identification de nombreux

polyphénols, nous avons eu accès à un grand nombre de stilbènes, principalement isolés de

Vitis vinifera, mais également de Milicia excelsa, Morus alba et Gnetum africanum. Nous

avons alors procédé au criblage de ces molécules en déterminant leur effet inhibiteur de la

production d'un marqueur d'inflammation dans des cellules microgliales activées en culture.

Enfin, nous avons détaillé les mécanismes moléculaires par lesquels un stilbène peut prévenir

le développement de processus inflammatoires centraux.

Parmi 25 stilbènes, nous avons montré que 10 molécules peuvent inhiber la

production de NO dans un modèle de cellules microgliales en culture. Les IC50 de ces

composés actifs sont comprises entre 3,9 ± 0,7 et 23,4 ± 1,0µM. L'effet de ces dérivés du

resvératrol n'est pas spécifique du degré d'oligomérisation. En effet, 3 monomères

(picéatannol, resvératrol et moracine M), 5 dimères (ε-viniférine, δ-viniférine, ω-viniférine,

scirpusine A et pallidol) et 2 tétramères (vitisine A et vitisine B) diminuent significativement

la production de NO.


76

Pour la moracine M et les vitisines A et B, l'inhibition de l'accumulation de NO dans les

microglies est due en partie à l'inhibition de la synthèse d'iNOS au niveau transcriptionnel et

traductionnel.

Dans cette étude, les cellules microgliales sont activées par le LPS. L'interaction

avec son récepteur, le TLR4, induit les voies de signalisation dépendante et indépendante de

MyD88. Le résultat de cette induction est l'activation de plusieurs voies de signalisation,

NF-κB, MAPK et PI3K/Akt. De plus, ces deux dernières peuvent également activer NF-κB

et un autre facteur de transcription, le complexe AP-1. Ainsi ces évènements induisent la

sécrétion de NO, de ROS, de cytokines, de PGE2, mais également de TLR4. Ces marqueurs

d'inflammation sont eux-mêmes capables d'induire une réponse inflammatoire (figure 41).

Ainsi, l'inhibition d'un des mécanismes de cette boucle d'amplification aura des répercutions

sur le reste du signal.

C'est dans ce contexte que nous avons déterminé les effets anti-inflammatoires de la

moracine M sur des cellules microgliales activées par le LPS in vitro.

Nous avons montré que la moracine M inhibe l'expression de TLR4 dans les cellules

activées par le LPS, atténuant ainsi l'effet du LPS sur son récepteur. Dans le futur, le dosage

de la protéine adaptatrice MyD88 est envisagé pour déterminer si l’inhibition du signal passe

par l'intermédiaire de la voie dépendante ou indépendante de celle-ci.

Les résultats concernant l'étude de la voie NF-κB ne nous permettent pas de conclure quant

à un effet inhibiteur de la moracine M sur cette voie. Cependant, nous observons une

diminution de la phosphorylation de deux MAPK, ERK1/2 et JNK, ainsi que de celle d’Akt.

Ces kinases sont des activateurs de la voie NF-κB, mais également de la voie AP-1. Ainsi,

nous proposons que la moracine M inhibe principalement les voies de signalisation

impliquant le facteur de transcription AP-1. Dans une étude similaire à la notre, la lutéoline,

un flavonoïde, inhibe la production d'IL6 dans des microglies en modulant les voies JNK et

AP-1, mais sans agir sur la voie NF-κB (Jang et al., 2008). Nos résultats pourraient être

confirmés par dosage de phosphorylation de c-Jun, une sous-unité d'AP-1, mais aussi par le

dosage de l'interaction entre le complexe AP-1 et l'ADN par la technique de retard sur gel

(EMSA ou electrophoretic mobility shift assay).


77

Les MAPK et les facteurs de transcription (NF-κB et AP-1) sont différemment impliqués

dans la production des cytokines pro-inflammatoires dans les cellules microgliales activées

par du LPS. Par exemple, Lu et son équipe (2010) ont mis en évidence que dans des cultures

de cellules microgliales de type N9, la synthèse de TNF-α est induite par la phosphorylation

des MAPK et l'activation de NF-κB et de AP-1, alors que celle d'IL-1β est induite par la

phosphorylation des MAPK et l'activation de AP-1.

Nous avons mis en évidence une activité inhibitrice de la production de TNF-α et d'IL-1β par

la moracine M, avec une efficacité plus importante sur l'IL-1β. Puisque les MAPK et AP-1

semblent être les principaux activateurs de la synthèse d'IL-1β, nos résultats concernant cette

protéine semblent être corrélés à l'inhibition d’AP-1 par la moracine M.

La phosphorylation d'Akt est un phénomène important dans les processus inflammatoires.

Par exemple, la voie Akt est liée à la synthèse de mPGES-1 et des PG (De Oliveira et al.,

2008 et 2012). Nos résultats ont montré que la moracine M induit la diminution de la synthèse

de mPGES-1 et donc réduit la quantité de PGE2 sécrétées par les cellules microgliales. Nous

suggérons que cette inhibition est la conséquence de l'inhibition de la phosphorylation d'Akt.

La régulation négative de la moracine M sur la mPGES-1 pourrait expliquer à elle seule la

diminution de la libération de la PGE2 dans les cellules microgliales, puisque la moracine M

ne présente pas d'effet sur les COX. Cependant, il semblerait intéressant de déterminer un

effet inhibiteur potentiel de ce stilbène sur les activités enzymatiques des COX, effet mis en

évidence pour d'autres polyphénols (Candelario et al., 2007).

Afin de compléter notre étude sur l'effet inhibiteur de la moracine M dans les

cellules microgliales, d'autres dosages peuvent être envisagés. Par exemple, l’effet de la

moracine M sur la production d’autres cytokines pro-inflammatoires, comme IL-6, IL-8 et

IFN-γ, pourrait être évalué. Les dosages de ces protéines pourraient être réalisés à l’aide d’un

système Bioplex.

Dans notre travail, nous n’avons pas abordé la notion de stress oxydant, qui est un

phénomène fortement lié au processus inflammatoire dans le SNC, et donc fortement associé

au développement des maladies neurodégénératives. Il serait donc intéressant de rechercher


78

un effet de la moracine M sur l’accumulation des ROS, principaux acteurs du stress oxydant,

dans les cellules microgliales. Nous pourrions également évaluer l’impact de ce stilbène sur la

production d’enzymes anti-oxydantes comme la superoxyde dismutase (SOD) et la hème-

oxygénase (HO-1), ainsi que sur les voies de signalisation induisant la synthèse de ces

enzymes telle que le facteur de transcription nucléaire nuclear factor-erythroid 2-related

factor2 (Nrf2).

Enfin, la principale perspective de ce projet scientifique serait d’évaluer les

activités anti-inflammatoires centrales de la moracine M in vivo. Ces études pourront être

réalisées sur des animaux âgés ou des animaux atteint de la maladie d'Alzheimer. Les

animaux seront nourris avec une alimentation supplémentée en moracine M. Plusieurs

composantes inflammatoires pourront ensuite être mesurées : l’étude de l’activation des

cellules gliales immunocompétentes, la mesure de l’activation du facteur NF-κB, le dosage

des cytokines. De plus, des tests comportementaux évaluant les fonctions cognitives (par

exemple la mémoire spatiale, l’apprentissage) pourront également être réalisés.

Nos résultats mettent en évidence les effets anti-inflammatoires de la moracine M.

Ce composé a principalement été identifié dans Morus alba, une plante dont les brindilles et

les racines sont largement utilisées en médicine traditionnelle asiatique, et dont les fruits

peuvent être utilisés en complément alimentaire.

Récemment, des travaux ont montré que des extraits de Morus alba sont capables de diminuer

la production de NO, PGE2, TNF-α et IL-6 (Choi et Hwang, 2005) par l’inhibition de NF-κB

(Chao et al., 2009) dans des macrophages en culture. Ainsi, l’effet anti-inflammatoire de cette

plante pourrait s'expliquer en partie par la présence de la moracine M, mais également par des

effets synergiques entre ce composé et d’autres de l’extrait. En 2012, Wang et son équipe ont

montré que le resvératrol, extrait des sarments de Vitis thunbergii, est plus efficace à inhiber

l’inflammation en présence d’autres stilbènes du même extrait.

Dans leur ensemble nos résultats sont en faveur d'une activité anti-inflammatoire de

la moracine M au niveau du SNC. Ainsi ce composé pourrait limiter in vivo la dégénérescence

neuronale liée à l'inflammation chronique causée par les médiateurs inflammatoires libérés

par les cellules microgliales. La poursuite de ces travaux devra permettre de préciser les

mécanismes d'action de la moracine M in vitro et de rechercher ses mêmes effets in vivo.

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Publications et Communications Scientifiques

92

Publications et Communications

Scientifiques

Articles dans des journaux internationaux

Publication 1



Merian Nassra, Stéphanie Krisa, Yorgos Papastamoulis, Gilbert Deccaux Kapche, Jonathan

Bisson, Caroline André, Jan-Pieter Konsman, Jean-Marie Schmitter, Jean-Michel Mérillon,

Pierre Waffo-Téguo.

Soumis à Planta Medica en août 2012

Publication 2

Protective effect of ε-viniferin on β-amyloid peptide aggregation investigated by

electrospray ionization mass spectrometry

Tristan Richard, Pascal Poupard, Merian Nassra, Yorgos Papastamoulis, Marie-Laure

Iglésias, Stéphanie Krisa, Pierre Waffo-Teguo, Jean-Michel Mérillon, Jean-Pierre Monti

Bioorganic & Medicinal Chemistry 19 (2011) 3152–3155

Article présenté en annexe

Publications et Communications Scientifiques

93

Communications en congrès international (posters)

Nassra M., Krisa S., Waffo Téguo P., Mérillon J.-M. Effects of stilbenoids on LPS-induced

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Krisa S., Nassra M., Gonthier-Maurin L., Richard T., Waffo Téguo P., Mérillon J.-M.

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Conference on Polyphenols and Health, October 2011, Barcelona, Spain, Abstract P-457.

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L’Institute de Science de la Vigne et du Vin, July 2010 Bordeaux, France, Abstract P-24.

Annexes

94

Annexes

Publication 2

Protective effect of ε-viniferin on β-amyloid peptide aggregation investigated by

electrospray ionization mass spectrometry

Tristan Richard, Pascal Poupard, Merian Nassra, Yorgos Papastamoulis, Marie-Laure

Iglésias, Stéphanie Krisa, Pierre Waffo-Teguo, Jean-Michel Mérillon, Jean-Pierre Monti



Contents lists available at ScienceDirect

Bioorganic & Medicinal Chemistry

journal homepage: www.elsevier .com/locate /bmc

Protective effect of e-viniferin on b-amyloid peptide aggregation investigatedby electrospray ionization mass spectrometry

Tristan Richard ⇑, Pascal Poupard, Merian Nassra, Yorgos Papastamoulis, Marie-Laure Iglésias,Stéphanie Krisa, Pierre Waffo-Teguo, Jean-Michel Mérillon, Jean-Pierre MontiGESVAB (EA 3675), Université de Bordeaux, ISVV Bordeaux-Aquitaine 71, Avenue Edouard Bourleaux, 33883 Villenave d’Ornon Cedex, France

a r t i c l e i n f o

Article history:Received 8 November 2010Revised 2 March 2011Accepted 1 April 2011Available online 6 April 2011

Keywords:Alzheimer’s diseaseb-Amyloid peptidePolyphenolsCytotoxicityMass spectrometry

0968-0896/$ - see front matter � 2011 Elsevier Ltd. Adoi:10.1016/j.bmc.2011.04.001

⇑ Corresponding author.E-mail address: [email protected] (T.

a b s t r a c t

Abnormal b-amyloid peptide accumulation and aggregation is considered to be responsible for the for-mation and cerebral deposition of senile plaques in the brains of patients with Alzheimer’s disease(AD). Inhibition of the formation of b-amyloid (Ab) fibrils would be an attractive therapeutic target forthe treatment of AD. Resveratrol and its derivatives exhibit a broad range of pharmacological propertiessuch as protection against cardiovascular diseases and cancers, as well as promoting antiaging effects. Wereported previously that e-viniferin glucoside (VG), a resveratrol-derived dimer, strongly inhibits Ab (25-35) fibril formation in vitro. In this study, we investigated the effects of VG on the aggregation of the full-length peptides (Ab (1-40) and Ab (1-42)) and on the b-amyloid-induced toxicity in PC12 cells. VGinhibited Ab cytotoxicity and the non-covalent complex between VG and Ab was observed by electro-spray ionization mass spectrometry.

� 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction

Alzheimer’s disease (AD), a progressive neurodegenerative dis-ease of the elderly1, is characterized by the abundance of proteindeposits in neurons that trigger neuronal degeneration. Thesedeposits result in the intracellular accumulation of phosphorylatedtau protein (Ps) and extracellular accumulation of amyloid b-peptides (Ab).2 Ps and Ab accumulation leads to the deposition ofneurofibrillary tangles and amyloid plaques, respectively, whichpromote pro-inflammatory responses and activate the neurotoxicpathway, leading to the dysfunction and death of brain cells.3,4

Despite recent progress in symptomatic therapy, an effectivetherapeutic approach that interferes directly with the neurodegen-erative process in AD, especially the accumulation of Ab, is stillunavailable.5 Recently, numerous studies have suggested that awide range of polyphenols may have neuroprotective effects bothin vitro and in vivo.6–15 Among these polyphenols, resveratroland particularly its derivatives have demonstrated promising neu-rodegenerative activities.8–11,13–15 Some of these studies suggestthat polyphenols exert protective effects through their ability toscavenge reactive oxygen species.6–10 Furthermore, other reportsindicate that polyphenols could prevent the development of AD,

ll rights reserved.

Richard).

not only by scavenging reactive oxygen species but also by directlyinhibiting the formation of Ab fibril deposits in the brain.12–15 In-deed, pathologic and biochemical studies suggest that fibrillar Abare reactive oxygen species generators, whereas monomeric (solu-ble) Ab acts as a natural antioxidant that prevents the neuronal celldeath due to oxidative stress.16–18 Polyphenols are capable ofinhibiting fibril formation in vitro by forming a complex with Ab.This mechanism, which is unrelated to oxidative conditions, ishighly relevant for designing future inhibitors as therapeuticagents for the treatment of AD.

Nevertheless, the exact mechanisms of anti-amyloidogenicactivities are unclear. Mass spectrometry allows the monitoring ofnon-covalent complexes between polyphenols and proteins.19–22

For example, a complex between Ab and oleuropein could be ob-served by means of electrospray ionization mass spectrometry(ESI–MS).21,22

In a previous article, we reported the effect of resveratrol and itsoligomers against Ab (25-35) fibril formation.14 Among the com-pounds tested, e-viniferin glucoside (VG) exhibited the strongestinhibitory activity of Ab (25-35) aggregation in vitro. From theseresults, the inhibitory properties of VG on both Ab (1-40) and Ab(1-42) aggregation were verified. Second, the protective effects ofVG from Ab (25-35), Ab (1-40) and Ab (1-42) toxicity of VG onPC12 cells was investigated. Third, in order to better understandthe formation mechanism of the Ab complex, the non-covalentcomplex between VG and Ab (1-40) was monitored by electrosprayionization mass spectrometry.

http://dx.doi.org/10.1016/j.bmc.2011.04.001

mailto:[email protected]

http://dx.doi.org/10.1016/j.bmc.2011.04.001

http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680896

http://www.elsevier.com/locate/bmc

Table 1Inhibition of Ab (25-35), Ab (1-40) and Ab (1-42) fibril formation

Peptide Inhibition (%)

Resveratrol e-viniferin glucoside

5 lM 10 lM 5 lM 10 lM

Ab (25-35) — 63 ± 8 — 93 ± 3Ab (1-40) 22 ± 7 52 ± 10 59 ± 7 97 ± 13Ab (1-42) — 61 ± 16 70 ± 2 89 ± 9

0

20

40

60

80

100

120

Cel

l via

bilit

y (%

)A ββ 0 0 10 10 10 μM VG 0 10 0 1 10 μM

Aβ (25-35)

Aβ (1-40)

Aβ (1-42)

Figure 2. Protective effects of e-viniferin glucoside on Ab (25-35)-, Ab (1-40)- andAb (1-42)- induced cell death. The experiment was repeated three times.

T. Richard et al. / Bioorg. Med. Chem. 19 (2011) 3152–3155 3153

2. Results and discussion

2.1. VG effects on Ab-induced aggregation and toxicity

Using an original routine in vitro assay with UV–visible mea-surements, we recently reported that stilbenoids, which are resve-ratrol-type compounds, inhibit the aggregation of the Ab (25-35)peptide.13,14 In this previous work, we used for practical reasonsthe Ab (25-35) fragment, which retains the properties of neurotox-icity and aggregation of the entire peptide.24,25 Among all the com-pounds tested, the dimeric stilbenoid VG (Fig. 1) exhibited anextremely efficient inhibition of Ab (25-35) aggregation. Stronginhibition of Ab fibril formation by VG led to a very low IC50 of lessthan 1 lM.14 Since the full-length Ab (1-40) and Ab (1-42) peptidesare more biologically relevant, we used the same methodology totest the inhibitory properties of VG against full-length peptide Abfibrilization (Table 1). VG inhibited the fibrillization of both pep-tides with the same order of magnitude as Ab (25-35).

To correlate the fibrillization inhibition properties of VG withthe protective effect against Ab toxicity, the polyphenol-Ab incu-bates were dosed onto PC12 cells. These cells were used as a suit-able model for studying neurotoxic agents like stilbenoids.10 Theresults of the MTT viability assay are shown in Figure 2, wherethe active fragment Ab (25-35) and both full-length peptides weretested. VG alone did not significantly affect the viability in the un-treated cells, with the maximum concentration of 10 lM, and didnot affect MTT reduction alone (result not shown). As previouslyreported by Jang et al.10, submicromolar concentrations of bothAb peptides were sufficient to induce metabolic interruptions inPC12 cells. Incubation of PC12 cells with 10 lM Ab (25-35), Ab(1-40), and Ab (1-42) for 24 h decreased the cell viability comparedto control to 33%, 30%, and 46%, respectively (Fig. 2). VG had astrong protective effect against cell death induced by both of theAb peptides. In the presence of 10 lM VG, the viability of cells trea-ted with Ab (25-35), Ab (1-40), and Ab (1-42) for 24 h was 80%,79%, and 87%, respectively. The data do not show a significant dif-ference between cells treated by Ab (25-35) or full-length peptidesand VG. Thus, VG protected PC12 cells from Ab-induced toxicity.

Much attention has focused on the relationship between apop-tosis and oxidative stress in AD. Concerning stilbenoids, Bastia-

O

OH

O

H

HO

H

HO

H

H

OHH

OH

Figure 1. Molecular structure of

netto et al. showed that red wine polyphenols such as resveratrolare capable of both protecting and rescuing cultured rat hippocam-pal cells against nitric oxide-induced toxicity.8 Jang et al. suggestedthat resveratrol oligomers such as vitisin A prevent Ab-inducedneurotoxicity by attenuating the oxidative ‘stress’ induced by Abin PC12 cell cultures.11 In our study, VG inhibited Ab fibril forma-tion from fresh Ab. Moreover, cell culture experiments with PC12cells showed that VG reduced Ab-induced damage. Thus it mightbe reasonable to speculate that this polyphenol could prevent the

O

OH

HO

OH

e-viniferin glucoside (VG).

3154 T. Richard et al. / Bioorg. Med. Chem. 19 (2011) 3152–3155

development of AD, not only by scavenging reactive oxygen speciesbut also by directly inhibiting the deposition of Ab fibrils in thebrain by complex formation.

2.2. VG / Ab complex formation

However, the exact mechanisms of the anti-amyloidogenicactivity of polyphenols are unclear. To investigate the mechanismof the anti-amyloidogenic activity of VG, ESI–MS was used to ob-serve these non-covalent biomolecular complexes with the full-length peptide Ab (1-40).

ESI mass spectrometric analysis of a Ab (1-40) solution revealeda multiply charged ion envelope including signals at m/z 619.5[M+7H]7+, 722.4 [M+6H]6+, 866.7 [M+5H]5+, 1083.0 [M+4H]4+ and1443.5 [M+3H] 3+ in positive mode as previously observed,21 andsignals at m/z 720.3 [M�6H]6�, 864.7 [M�5H]5�, 1081.0 [M�4H]4� and 1441.2 [M�3H]3� in negative mode (Fig. 3a). ESI–MS anal-ysis of VG gave an abundant MH+ ion at m/z 617.0 and a weakerpotassium adduct [M+K]+ at m/z 655.0 in positive mode and aMH� ion at m/z 615.1 in negative mode (Fig. 3b).

Since the prevalence of non-specific aggregation in the gasphase may be avoided by reducing the concentration of the inter-acting species in solution, the interactions were monitored at a rel-atively low concentration of 10 lM.21 The ESI–MS of the Ab (1-40)solution containing VG was studied by using solvent mixtures con-sisting of methanol/water and acetonitrile/water, since the impor-tance of the solvent mixture in observing these complexes hasbeen previously demonstrated.21 The VG/Ab complex was ob-served in both solvent mixtures methanol/water and acetonitrile/water, even when the organic solvent reached over 50%. Figure

[Aββ – 6H]6-

[Aββ – 5H]5-

[Aββ – 4H]4-

[VG –H]-

3a

3b

[Aββ – 4H]4-

[Aββ + 2 VG – 8H]8-

[VG –H]-

3c

[Aββ + 2 VG – 7H]7-

m/z

% R

elat

ive

Inte

nsit

y

Figure 3. Electrospray ionization mass spectra of (3a) amyloid-b peptide Ab (1-40)at 10 lM; (3b) e-viniferin glucoside and (3c) the mixture of Ab (1-40) and VG (1:1molar ratio, 10 lM) in 35 % methanol.

3c presents the ESI–MS spectrum in negative mode of the Ab solu-tion containing VG (molar ratio 1:1, concentration 10 lM) usingthe solvent mixture methanol/water (35% methanol). Whereasthe spectrum still exhibited ions due to the deprotonated peptideand VG alone, deprotoned VG/Ab molecular complexes wereclearly detected. Thus, the relatively intense peak at m/z 695.0 wasattributed to the 2/1 complex [Ab+2VG�8H]8� and the weaker peakat m/z 792.7 was attributed to the 2/1 complex [Ab+2VG�7H]7�.The VG/Ab molar ratio excess of 5/1 provided identical results, con-firming the specificity of the interaction and not any artifacts of theESI process. Finally, experiments were performed with p-coumaricacid as negative control since a very weak inhibitory property onAb aggregation has already been shown.26 p-coumaric acid gavean MH+ ion at m/z 165.2 and a potassium adduct [M+K]+ at m/z203.1 in positive mode and a MH� ion at m/z 163.1 in negative.The ESI–MS of the Ab (1-40) solution containing p-coumaric acid(molar ratio 1:1, concentration 10 lM) was studied by using sol-vent mixtures methanol/water (35% methanol). No ion derivedfrom the complex p-coumaric acid with Ab could be detected.

Bazoti et al. studied the non-covalent interaction between Ab(1-40) and oleuropein, a potent bioactive polyphenol, againstAD.21,22 They showed that Ab (1-40) interacts with this polyphenolwith 1/1 and 2 oleuropein/1 Ab stochiometries, with the 1/1 non-covalent complex being the most important. In our study, weobserved only the 2 VG/1 Ab complex, the 1/1 complex not beingdetected at an intensity greater than the background. Thus, thespecificity and the binding energies of the interaction betweenoleuropein/Ab and VG/Ab complexes could be quite different.However, these results confirm our previous hypothesis that thefull-length peptide contains multiple binding sites within the pep-tide sequence.26 Moreover, our data indicate that VG interacts withAb at an early stage in the polymerization process. The bindingmay lock the peptide conformation and thus prevent nucleation.Preliminary NMR experiments are in agreement with ESI–MS re-sults with the observation between Ab (1-40) and two VG mole-cules at the N and C termini of the peptide.27 New experimentsusing NMR spectrometry will be conducted to extend the molecu-lar knowledge of this interaction.

In conclusion, VG inhibits Ab (25-35), Ab (1-40) and Ab (1-42)fibrillization in vitro and protects PC12 cells against Ab-inducedinjuries. Apart from potential antioxidant activities, the inhibitoryproperties of VG on Ab peptide aggregation need to be considered.This study confirms the utility of mass spectrometry for studyingthe non-covalent complexes between Ab and polyphenols. Ab (1-40) and VG interact non-covalently at 2 VG/1 Ab stoichiometry,indicating that polyphenols could act on Ab polymerization inthe preliminary stages of aggregation. Therefore, VG may be apromising candidate for novel neuroprotective strategies for treat-ing AD. Nevertheless, many studies have shown wide variability inthe bioavailability and bioefficacy of the polyphenols.28 Futurestudies evaluating both their beneficial and adverse effectsin vivo need to be performed before the development of fortifiedfoods or supplements containing pharmacologic doses of thesecompounds.

3. Material and methods

3.1. Material

VG was extracted from stem of Vitis vinifera using the protocoldescribed by Delaunay et al.23 Briefly, stilbenoid extracts werefractionated by column chromatography followed by centrifugalpartition chromatography. VG was obtained by semipreparativehigh-performance liquid chromatography. Its structure waselucidated by one- and two-dimensional NMR analysis. Polyphenol

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purity was controlled by HPLC–UV and HPLC–UV-ESI-MSspectroscopy.

Ab (25-35), Ab (1-40) and Ab (1-42) peptides were purchasedfrom Bachem (Torrance, USA) and EZBiolab Inc. (Carmel, USA),respectively. Peptides were used without further purification.

MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide] horse serum and fetal bovine serum and p-coumaric acidwere purchased from Sigma–Aldrich (St. Louis, USA). Dulbecco’smodified Eagle’s Medium (DMEM+GlutaMAX-1) was purchasedfrom Invitrogen Ltd (Paisley, UK).

3.2. Antiaggregation assay

The detailed method for measuring the inhibitory activity on Abaggregation was given in a previous report.13 Briefly, UV–visiblemeasurements were used to search for inhibitors of Ab fibril for-mation. Stock solutions of Ab (25-35), Ab (1-40) and Ab (1-42) at1 mM were prepared by solubilizing the lyophilized Ab by brieflyvortexing in sterile water at 4 �C, then by sonicating for 10 min.Polyphenols were solubilized in MeOH solution to a concentrationof 1 mg/mL. Stock solutions were aliquoted and stored at �20 �C.

UV–visible spectrometry was performed on a Cary 300 bio UV–visible spectrophotometer (Varian, USA). To study Ab fibril inhibi-tion, experiments were carried out by using a reaction mixturecontaining 80 lL phosphate buffer (10 mM final concentration),10 lL Ab (25-35) (100 lM final concentration) or 10 lL full-lengthpeptide (50 lM final concentration) and 10 lL polyphenol (5 and10 lM final concentration), pH 7.2.

3.3. Cell culture and MTT assay

PC12 cells were obtained from the American Type CultureCollection (ATCC, Manassas, USA). PC12 cells were maintainedroutinely in DMEM-Glutamax supplemented with 15% heat-inactivated horse serum, 2.5% fetal bovine serum, and 1% penicillin/streptomycin antibiotics at 37 �C in humidified atmosphere of10% CO2/90% air. All cells were cultured in poly-D-lysine-coatedculture dishes.

Cells were harvested from flasks and plated at a density of10,000 cells per well in 96-well plates and incubated at 37 �C for24 h. Ab (25-35) Ab (1-40) or Ab (1-42) preincubated with or with-out VG at 37 �C for 48 h was diluted with fresh DMEM-Glutamaxand added to individual wells. The final concentration of Ab was10 lM. After 24 h of incubation, cell viability was determined bythe conventional MTT reduction assay. Cells were treated withMTT solution (final concentration, 0.5 mg/ml DMEM-Glutamax)for 3 h at 37 �C. The dark blue formazan crystals formed in intactcells were solubilized with dimethylsulfoxide for 0.5 h. The absor-bance was measured at 595 nm with a microplate reader (Dynex,USA). Results were expressed as the percentage of MTT reductionin relation to the absorbance of control cells at 100%.

3.4. Mass spectrometry

A direct infusion-electrospray ionization-mass spectrometry(ESI–MS) Esquire 3000plus Ion Trap mass spectrometer (Bruker Dal-tonics, Germany) was used to study the non-covalent interactions

between VG and Ab (1-40). Sample solutions were infused directlyinto ESI source with a syringe pump (74900 Series, Cole-ParmerInstrument) at a constant flow-rate of 180 lL/h. Mass spectra wererecorded from m/z = 150–2000 in a positive and negative ioniza-tion mode. Normal scan resolution (13,000 m/z s�1) was selected.The source parameters were: +4000 V for negative ion mode and�4000 V for positive ion mode; nebulizer gas (N2), 10 psi; dryinggas (N2), 7 L/min; dry temperature, 300 �C.

Acknowledgments

We are grateful to Dr. Alison D. Pawlus and Ray Cooke for read-ing this manuscript.

References and notes

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Figure 1 : Schéma représentant le système nerveux central.

Figure 2 : Composants de la barrière hémato-encéphalique (Francis et al., 2003).

Figure 3 : Différents types des cellules du système nerveux central.

Figure 4 : Morphologie des cellules microgliales : de gauche à droite, la transformation de

ces cellules activées de la forme ramifiée à la forme amiboïde (Kreutzberg, 1996).

Figure 5 : Transition entre l’état de quiescence (A) et l’état d’activation (B) des cellules

microgliales (Streit et Xue, 2009).

Figure 6 : Biosynthèse du monoxyde d'azote (NO).

Figure 7 : Biosynthèse des prostaglandines (Aïd et Bosetti, 2011, modifiée). AA : Acide arachidonique, COX : cyclooxygénases, PG : Prostaglandine, PLA2 : Phospholipase

A2, TX : Thromboxane.

Figure 8 : Implication des voies de Nf-κB, de MAPK et de PI3K/Akt dans la réponse au

LPS

AP-1 : Activator Protein-1, CD14 : Cluster of Differentiation 14 , ERK1/2 : Extracellular Signal-

Regulated Kinase 1/2, IKK : IB Kinase, IRAK : Interleukin-1 receptor-associated kinase, IRF :

Interferon-Regulatory Protein, JNK : c-Jun Aminoterminal Kinase, LPS : lipopolysaccharide,

MD-2 : Myeloid differentiation 2, MEK 1/2 : Mitogen-activated protein kinase kinase 1/2, NEMO:

NF-κB essential modulator, MKK : Mitogen-activated protein kinase kinase, NF-κB : Nuclear

Factor-kappa B, MyD88 : Myeloid Differentiation Factor 88, NF-κB : Nuclear Factor-kappa B,

TIRAP: MyD88 adapter-like, TLR4 : Toll-Like Receptor4, TRAF : TNF receptor-associated factor,

TRAM : TRIF-Related Adaptor Molecule.TRIF : TIR-domain-containing adaptor-inducing

interferon-β,

Figure 9 : Distribution des récepteurs Toll-Like Receptor 1-9 dans le système nerveux

central (Hanke et Kielian, 2011).

Figure 10 : Différents type de Toll-Like Receptor et leurs ligands spécifiques (Takeda et

Akira, 2004). CPG DNA: Cytosine polyguanine DNA, ds RNA : Double stranded RNA, LPS : lipopolysaccharide,

MD-2 : Myeloid differentiation 2, TLR : Toll-Like Receptor.

Figure 11 : Voies dépendantes ou indépendantes de MyD88 des différents TLR (Takeda et

Akira, 2004).

IFN-β : Interferon-β, IKK : IB Kinase, IRAK : Interleukin-1 receptor-associated kinase,

IRF : Interferon-Regulatory Protein, MD-2 : Myeloid differentiation 2, MyD88 : Myeloid

Differentiation Factor 88, NEMO : NF-κB essential modulator, NF-κB : Nuclear Factor-kappa B,

TIRAP/Mal : MyD88 adapter-like, TLR : Toll-Like Receptor, TRAF : TNF receptor-associated

factor, TRIF : TIR-domain-containing adaptor-inducing interferon-β.

Figure 12 : Voie de signalisation du facteur nucléaire kappa-B, Nf-κB (Mohamed et

McFadden, 2009).

CBP : CREB-binding protein, IκB : Inhibitor of kappa B, IKK : IB Kinase, IRAK : Interleukin-1

receptor-associated kinase, NF-κB : Nuclear Factor-kappa B, NIK : NF-kB-Inducible Kinase,

RIP: Receptor-interacting protein, TAK1 : TGF-beta-activated kinase 1,TLR : Toll-Like Receptor,

TRAF : TNF receptor-associated factor.

Figure 13 : Voies de signalisation des mitogen-activated protein kinases (Spencer et al.,

2012). AP-1 : Activator Protein-1, COX-2 : Cyclooxygénase-2, ERK1/2 : Extracellular Signal-Regulated

Kinase 1/2, iNOS : NO Synthase inductible, JNKs/SAPKs : c-Jun Aminoterminal Kinase, NF-κB :

Nuclear Factor-kappa B, MEK 1/2 : Mitogen-activated protein kinase kinase 1/2, MKK : Mitogen-

activated protein kinase kinase, STAT-1 : Signal Transducers and Activators of Transcription-1.

Figure 14 : Voie de phosphoinositide 3 kinase et d'Akt, (Cortot et al., 2006, modifiée).

GSK 3 : Glycogen Synthase Kinase 3, IKK : IB Kinase, mTOR : mammalian target of rapamycin,

PDK1: phosphoinositide dependent protein kinase1, PI3K : PhosphatIdylinositol 3-Kinase, PIP2 :

PhosphatidylInositol 4,5 diPhosphate, PIP3 : PhosphatidylInositol 3,4,5 triPhosphate.

Figure 15 : Structure chimique des flavonoïdes les plus communs (Crozier et al., 2009).

Figure 16 : Structure chimique des stilbènes les plus communs (Rivière et al., 2012).

HO

OH

OH

Figure 17 : Structure chimique du trans-resvératrol (3,5,4´-trihydroxy-trans-stilbene).

R1 R2 R3 R4 R5

resvératrol OH OH OH H H

picéide OGlc OH OH H H

resvératroloside OH OH OGlc H H

picéatannol OH OH OH OH H

astringine OGlc OH OH OH H

oxyresvératrol OH OH OH H OH

Figure 18 : Structure chimique des principaux monomères de stilbènes du vin.

R3

R4

R5

R1

R2

A

B

R1

R2

R3

A

B

R4

R5

trans cis

Figure 19 : Concentrations de NO à différents temps après l’activation des cellules BV-2 par

le LPS

Les cellules sont ensemencées (20*104 cellules/puits) pendant 24h puis mises en contact avec 1µg/ml

de LPS. Le dosage de la concentration de NO est effectué sur les surnageants prélevés à 0, 3, 6, 9, 12,

18 et 24h à l’aide du réactif de Griess, (n=4, ± écart-type).

Figure 20 : Effets de la vitisine A et de la vitisine B sur la production de NO dans les cellules

BV-2 activées

Les cellules sont traitées avec l’un ou l’autre des deux stilbènes testés à 2,5/5/7,5µM en présence de

LPS (1µg/ml) pendant 24h, puis la concentration en NO est quantifiée à l’aide du réactif de Griess et

les IC50 de ces molécules sont calculées. Les résultats sont exprimés en pourcentage de la condition

LPS. #p < 0,05 vs la condition témoin pour la condition LPS, ***P<0,001, **P<0,01 et *P<0,05 vs

la condition LPS pour les conditions LPS/moracine M, (n=16, ± écart-type).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

NO

(µM

)

Temps (h)

0

20

40

60

80

100

120

NO

(% d

e la

co

nd

itio

n L

PS

)

*

***

***

***

***

- - 2,5 5 7,5 2,5 5 7,5vitisine A (µM) vitisine B (µM)

LPS (1µg/mL)

#

Figure 21 : Expression de la protéine iNOS (A) et le niveau d’ARNm codant pour le gène

iNOS (B) à différents temps après l’activation des cellules BV-2 par le LPS

Les cellules sont ensemencées (106 cellules/puits) pendant 24h puis mises en contact avec 1µg/ml de

LPS pendant différents temps. (A) Les protéines sont ensuite extraites et la quantité d’iNOS est mis en

évidence par Western Blot. La protéine ubiquitaire β-actine est utilisée comme protéine constitutive.

Rapports protéine/β-actine sont présentés. (B) Les niveaux des transcrits de gène iNOS sont analysés

par RT-PCR semi-quantitative et le gène codant la GAPDH comme est utilisé comme gène de ménage.

Les résultats sont ceux d’une des deux expériences indépendantes ayant abouti aux mêmes

conclusions.

Figure 22 : Effets de la vitisine A et de la vitisine B sur l’expression de la protéine iNOS (A)

et du transcrit correspondant (B) dans les cellules BV-2 activées

Les cellules sont traitées avec les stilbènes testés à 2,5/5/7,5µM en présence ou LPS (1µg/ml). (A)

Après 24h, les protéines sont extraites et la quantité d’iNOS est mis en évidence par Western Blot. La

protéine ubiquitaire β-actine est utilisée comme protéine constitutive. Rapports protéine/β-actine sont

présentés et la condition LPS est utilisée comme référence. (B) Les ARNm sont extraits après 6h de

traitement et des analyses par RT-PCR semi-quantitative sont effectuées. Le gène codant la GAPDH a

été utilisé comme gène de ménage. Les résultats sont ceux d’une des trois expériences indépendantes

ayant abouti aux mêmes conclusions.

iNOS

Temps (h) 0 3 6 9 12

B

GAPDH

iNOS

β-actine

A

Temps (h) 0 6 9 12 18 24

1,0 1,3 1,6 1,4 1,3 1,2

A

- - 2,5 5 7,5 2,5 5 7,5

vitisine A (µM) vitisine B (µM)

LPS (1µg/mL)

iNOS

β-actine

iNOS

GAPDH

B

0,02 1,0 0,3 0,3 0,2 0,5 0,3 0,1

Figure 23 : Structure de la moracine M

Figure 24 : Effets des différentes concentrations de moracine M sur la viabilité des cellules

BV-2 activées

Les cellules sont ensemencées pendant 24h puis traitées pendant 24h en présence ou absence de LPS

(1µg/ml) et de la moracine M à des concentrations comprises entre 10 et 100µM. Les résultats sont

exprimés en pourcentage de la condition LPS. La viabilité des cellules BV-2 est évaluée par le test

MTT. #p < 0,05 vs la condition témoin pour la condition LPS, ***P<0,001, **P<0,01 et *P<0,05 vs

la condition LPS pour les conditions LPS/moracine M, (n=8, ± écart-type).

0

20

40

60

80

100

120

viab

ilité

ce

llula

ire

(% d

e la

co

nd

itio

n L

PS)

Moracine (µM) 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

LPS (1µg/ml) - - + + + + + + + + + +

* **

* * *

* * *

Figure 25 : Effets de la moracine M sur la production de NO dans les cellules BV-2 activées

Les cellules sont traitées avec la moracine M à 5/10/20/30/40µM en présence ou absence de LPS

(1µg/ml), puis la concentration en NO est quantifiée à l’aide du réactif de Griess et l’IC50 est calculée.

Les résultats sont exprimés en pourcentage de la condition LPS. #p < 0,05 vs la condition témoin pour

la condition témoin moracine M et la condition LPS, ***P<0,001, **P<0,01 et *P<0,05 vs la

condition LPS pour les conditions LPS/moracine M, (n=16, ± écart-type).

Figure 26 : Effets de la moracine M sur l’expression de la protéine iNOS (A) et d’ARNm

codant pour son gène (B) dans les cellules BV-2 activées

Les cellules sont traitées avec la moracine M à 10/20/30/40µM en présence ou absence de LPS

(1µg/ml). (A) la quantité d’iNOS est mis en évidence par Western Blot et la protéine ubiquitaire β-

actine est utilisée comme protéine constitutive. Rapports protéine/β-actine sont présentés et la

condition LPS est utilisée comme référence. (B) Le niveau d’ARNm est analysé par RT-PCR semi-

quantitative. Le gène codant la GAPDH a été utilisé comme gène de ménage. Les résultats sont ceux

d’une des trois expériences indépendantes ayant abouti aux mêmes conclusions.

0

20

40

60

80

100

120

NO

(%

de

la c

on

dit

ion

LP

S)

Moracine (µM) 0 40 0 5 10 20 30 40

LPS (1µg/ml) - - + + + + + +

#

*

***

******

***

#

A

iNOS

β-actin

iNOSB

GAPDH

0,2 0,2 1,0 0,5 0,3 0,2 0,2

LPS (1µg/ml) - - + + + + +

Moracine M (µM) 0 40 0 10 20 30 40

Figure 27 : Concentrations des protéines TNF-α et IL-1β (A) et niveau d’ARNm codant pour

les gènes correspondants (B) après différents temps d’activation des cellules BV-2 par le LPS

Les cellules sont ensemencées pendant 24h puis mises en contact avec 1µg/ml de LPS pendant

différents temps. (A) Les dosages des cytokines sont effectués sur les surnageants à l’aide de kits

ELISA, (n=4, ± écart-type). (B) Les taux d’ARNm sont analysés en utilisant la technique de RT-PCR

semi-quantitative. Le gène codant la GAPDH est utilisé comme gène de ménage. Les résultats sont

ceux d’une des deux expériences indépendantes ayant abouti aux mêmes conclusions.

0

50

100

150

200

250

300

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

0 3 6 9 12 15 18 21 24

IL-1β

(pg/

ml)

TNF-α

(pg/

ml)

Temps (heures)

TNF-α

IL-1β

A

TNF-α

IL-1β

Temps (h) 0 3 6 9 12

B

GAPDH

Figure 28 : Effets de la moracine M sur la production de TNF-α (A) et sur le niveau

d’expression de l’ARNm correspondant (B) dans les cellules BV-2 activées

Les cellules sont traitées avec la moracine M à différentes concentrations en présence ou absence de

LPS (1µg/ml). (A) Les concentrations de TNF-α sont dosées dans les surnageant à l’aide d’un kit

ELISA et l’IC50 est calculée. #p < 0,05 vs la condition témoin pour la condition témoin moracine M et

la condition LPS, ***P<0,001, **P<0,01 et *P<0,05 vs la condition LPS pour les conditions

LPS/moracine M, (n=12,±écart-type). (B) Les niveaux de transcrits codant le gène TNF-α sont

analysés en utilisant la technique de RT-PCR semi-quantitative et le gène codant la GAPDH est utilisé

comme gène de ménage. Les résultats sont ceux d’une des trois expériences indépendantes ayant

abouti aux mêmes conclusions.

0

20

40

60

80

100

120

140

TNF-α

(% d

e la

co

nd

itio

n L

PS)

LPS (1µg/ml) - - + + + + + +

Moracine (µM) 0 40 0 5 10 20 30 40

#

*** ***

***

***

***

A

#

TNF-α

B

GAPDH

LPS (1µg/ml) - - + + + + +

Moracine M (µM) 0 40 0 10 20 30 40

Figure 29 : Effets de la moracine M sur la production d’IL-1β (A) et sur le niveau

d’expression de l’ARNm correspondant (B) dans les cellules BV-2 activées

Les cellules sont traitées avec la moracine M à différentes concentrations en présence ou absence de

LPS (1µg/ml). (A) Les concentrations de IL-1β sont dosées dans les surnageant à l’aide d’un kit

ELISA et l’IC50 est calculée. #p < 0,05 vs la condition témoin pour la condition témoin moracine M et


LPS/moracine M, (n=12,±écart-type). (B) Le niveau de transcrit codant le gène IL-1β est analysé en

utilisant la technique de RT-PCR semi-quantitative et le gène codant la GAPDH est utilisé comme

gène de ménage. Les résultats sont ceux d’une des trois expériences indépendantes ayant abouti aux

mêmes conclusions.

.

0

20

40

60

80

100

120

IL-1β

(% d

e la

co

nd

itio

n L

PS)

LPS (1µg/ml) - - + + + + + +

Moracine (µM) 0 40 0 5 10 20 30 40

#

***

***

*** ******

A#

IL-1β

B

GAPDH

LPS (1µg/ml) - - + + + + +

Moracine M (µM) 0 40 0 10 20 30 40

Figure 30 : Concentrations de PGE2 à différents temps après activation des cellules BV-2 par

le LPS

Les cellules sont ensemencées pendant 24h puis mises en contact avec 1µg/ml de LPS pendant

différents temps. Les concentrations de PGE2 sont dosées dans les surnageant à l’aide d’un kit EIA,

(n=4, ± écart-type

Figure 31 : Effets de la moracine M sur la production de PGE2 dans les cellules BV-2

activées


(1µg/ml) pendant 24h. (A) Les concentrations de PGE2 sont dosées dans les surnageant à l’aide d’un

kit EIA et l’IC50 est calculée. #p < 0,05 vs la condition témoin pour la condition témoin moracine M et


LPS/moracine M, (n=8, ± écart-type).

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27

PG

E2 (p

g/m

l)

Temps (h)

0

20

40

60

80

100

120

PG

E2(%

de

la c

on

dit

ion

LP

S)

LPS (1µg/ml) - - + + + + +

Moracine (µM) 0 40 0 10 20 30 40

***#

#

*********

Figure 32 : Effets de la moracine M sur l’expression des protéines COX-1, COX-2 et

mPGES-1 dans les cellules BV-2 activées


(1µg/ml). (A) L‘expression des protéines (COX-1, COX-2 et mPGES-1) est suivie par Western Blot. La

β-actine est le témoin constitutif. Rapports protéine/β-actine sont présentés et la condition LPS est

utilisée comme référence. (B) L’histogramme représente l’analyse quantitative densitométrique de

l’expression de ces protéines après normalisation de leur quantité par rapport à la β-actine. Les

résultats sont ceux d’une des deux expériences indépendantes ayant abouti aux mêmes conclusions.

Figure 33 : Effets de la moracine M sur les niveaux de transcrits codant les gènes de COX-1

et de COX-2 et mPGES-1 dans les cellules BV-2 activées

Les cellules sont traitées par la moracine M à 10/20/30/40µM en présence ou absence de LPS

(1µg/ml). Les niveaux d’ARNm de COX-1, COX-2 et mPGES-1 sont analysés en utilisant la technique

de RT-PCR semi-quantitative et le gène codant la GAPDH est utilisé comme gène ménage. Les

résultats sont ceux d’une des deux expériences indépendantes ayant abouti aux mêmes conclusions.

LPS (1µg/ml) - - + + + + +

Moracine M (µM) 0 40 0 10 20 30 40

COX-1

β-actin

1,3 1,4 1,0 1,0 0,8 1,0 1,1

COX-2

β-actin

0,1 0,1 1,0 0,9 1,2 0,8 0,9

mPGES-1

β-actin

0,7 0,6 1,0 1,2 1,1 0,7 0,6

A

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Inte

nsi

té r

ela

tive

(pro

téin

e/β

-act

in)

COX-1/β-actine

COX-2/β-actine

mPGES-1/β-actine

LPS (1µg/ml) - - + + + + +

Moracine (µM) 0 40 0 10 20 30 40

B

COX-1

COX-2

GAPDH

LPS (1µg/ml) - - + + + + +

Moracine M (µM) 0 40 0 10 20 30 40

mPGES-1

Figure 34 : Expression de la protéine IκB dans les cellules BV-2 à différents temps aprés

traitement avec du LPS

Les cellules sont ensemencées (106 cellules/puits) pendant 24h puis mises en contact avec 1µg/ml de

LPS pendant différents temps. L‘expression des protéines d’IκB est suivie par Western Blot. La β-

actine est le témoin constitutif. Rapports protéine/β-actine sont présentés. Les résultats sont ceux

d’une des deux expériences indépendantes ayant abouti aux mêmes conclusions.

Figure 35 : Translocation nucléaire de Nf-κB/P65 dans les cellules BV-2 après différents

temps de traitement avec du LPS

Les cellules sont cultivées sur des lamelles de verre pendant 24h puis mises en contact avec 1µg/ml de

LPS pendant 0, 15, 30 et 60 minutes. La translocation nucléaire de la sous unité P65 de Nf-κB est

évaluée par immunocytochimie à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Temps (min) 0 15 30 45 60

IκB

β-actine

1,0 0,8 0,5 0,5 0,6

LPS (1µg/ml)

Temps (min) 0 15 30 60

Figure 36 : Effets de la moracine M sur la phosphorylation et la dégradation d’IκB-α dans des



(1µg/ml). (A) Après 30 minutes du traitement, l‘expression des protéines (p-IκB et IκB) est suivie par

Western Blot. La β-actine est le témoin constitutif. Rapports protéine/β-actine sont présentés et la

condition LPS est utilisée comme référence. (B) L’histogramme représente l’analyse quantitative

densitométrique de l’expression de ces protéines après normalisation de leur quantité par rapport à la

β-actine. Les résultats sont ceux d’une des trois expériences indépendantes ayant abouti aux mêmes

conclusions.

Figure 37 : Effet de la moracine M sur la translocation nucléaire de Nf-κB/P65 dans les


Les cellules sont cultivées sur des lamelles de verre pendant 24h puis mises en contact avec 1µg/ml de

LPS pendant 30 min en présence ou absence de la moracine M à 40µM. La translocation nucléaire de

la sous unité P65 de Nf-κB est évaluée par immunocytochimie à l’aide d’un microscope à

fluorescence.

IκB

β-actin

p-IκB

β-actin

0,5 0,8 1,0 0,7 0,6 0,5 0,6

1,6 1,8 1,0 1,1 0,9 0,8 0,7

A

LPS (1µg/ml) - - + + + + +

Moracine M (µM) 0 40 0 10 20 30 40

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Inte

nsi

té re

lati

ve(p

roté

ine/β

-act

ine)

p-IκB/β-actine

IκB /β-actine

B

LPS (1µg/ml) - - + + + + +

Moracine (µM) 0 40 0 10 20 30 40

LPS

(1µ

g/m

l)

Moracine M (40µM)

- +

-+

Figure 38 : Effets de la moracine M sur la voie des MAPK (p38, JNK et ERK1/2) dans les


Les cellules sont traitées avec la moracine M à 10/20/30/40µM, en présence ou absence de LPS

(1µg/ml). (A) Après 30 minutes du traitement, l‘expression des protéines (p38, p-p38, JNK, p-JNK.

ERK1/2 et p-ERK1/2) est suivie par Western Blot. Rapports p-protéine/protéine sont présentés et la

condition LPS est utilisée comme référence. (B) L’histogramme représente l’analyse quantitative

densitométrique de l’expression de ces protéines phosphorylées après normalisation de leur quantité

par rapport aux protéines non phosphorylées ubiquitaires. Les résultats sont ceux d’une des deux

expériences indépendantes ayant abouti aux mêmes conclusions.

Figure 39 : Effets de la moracine M sur la phosphorylation d’Akt dans les cellules BV-2

activées


(1µg/ml). (A) Après 30 minutes de traitement, l‘expression des protéines (Akt, p-Akt) est suivie par

Western Blot. Rapports p-protéine/protéine sont présentés et la condition LPS est utilisée comme

référence. (B) L’histogramme représente l’analyse quantitative densitométrique de l’expression de ces

protéines phosphorylées après normalisation de leur quantité par rapport aux protéines non

phosphorylées ubiquitaires. Les résultats sont ceux d’une des trois expériences indépendantes ayant

abouti aux mêmes conclusions.

A

p38

p-p38

0,7 0,5 1,0 0,9 0,8 0,8 1,0

ERK1/2

p-ERK1/2

0,6 0,7 1,0 1,2 0,5 0,6 0,4

JNK

p-JNK

0,2 0,2 1,0 1,0 1,0 0,8 0,7

LPS (1µg/ml) - - + + + + +

Moracine M (µM) 0 40 0 10 20 30 40

0

20

40

60

80

100

120

140

Inte

nsi

té r

ela

tiv

e(p

-pro

téin

e/p

roté

ine

)

p-p38 /p38

p-JNK / JNK

p-ERK / ERK

LPS (1µg/ml) - - + + + + +

Moracine (µM) 0 40 0 10 20 30 40

B

LPS (1µg/ml) - - + + + + +

Moracine (µM) 0 40 0 10 20 30 40

Akt

p-Akt

0,4 0,4 1,0 0,6 0,3 0,4 0,3

A

0

20

40

60

80

100

120

Inte

nsi

té re

lati

ve

(p-Aκt

/Aκ

t)

p-Aκt/Aκt

LPS (1µg/ml) - - + + + + +

Moracine (µM) 0 40 0 10 20 30 40

B

Figure 40 : Effets de la moracine M sur les niveaux de transcrits codant le gène de TLR4,

dans les cellules BV-2 activées

Les cellules sont traitées la moracine M à 10/20/30/40µM en présence ou absence de LPS (1µg/ml).

Les niveaux d’ARNm de TLR4 sont analysés en utilisant la technique de RT-PCR semi-quantitative et

le gène codant la GAPDH est utilisé comme gène ménage. Les résultats sont ceux d’une des trois

expériences indépendantes ayant abouti aux mêmes conclusions.

Figure 41 : Schéma des différentes voies de signalisation de la réponse inflammatoire induite

par le LPS dans une cellule microgliale

GAPDH

TLR4

LPS (1µg/ml) - - + + + + +

Moracine M (µM) 0 40 0 10 20 30 40

Po

lygo

nu

m cu

spid

atu

m

La

rix la

ricina

Rh

eum

au

strale

Mo

rus m

esozyg

ia

Mo

rus a

lba

Ph

olid

ota

Ch

inesis

Po

lygo

nu

m m

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rum

Th

un

b

Pla

nte

Les racin

es

Les éco

rces

_

Les éco

rces

Les fru

its (com

plém

ent

alimen

taire)

Les feu

illes, les fruits, les

brin

dilles et les racin

es (méd

icine

traditio

nn

el)

Les p

arties aérienn

es

Les racin

es tub

erculaires

Org

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l’Asie

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e

l’Asie

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Su

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Ch

ine et Jap

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atite B

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n, tro

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les de l'esto

mac,

malad

ies vén

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Malad

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Effets p

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ti-inflam

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xyd

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l.,

20

12

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l.,

20

12

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20

12

Fo

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et al.,

20

12

Mei et a

l., 20

11

Wan

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l.,

20

06

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g et a

l., 200

5

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lantes rich

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09

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Ox

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Lig

née cellu

laire N9

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BV

-2

Lig

née cellu

laire

BV

-2

Lig

née cellu

laire N9

Cu

ltures p

rimaires

de m

icrog

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Tableau 3 : Liste des anticorps primaires spécifiques utilisés pour détecter les protéines

d’intérêt, leurs taux de dilution dans un tampon de blocage Odyssey/PBS (50/50) et leur

fournisseur

Anticrorps primaire Dilution Fournisseurs

iNOS 1/1000 Enzo Life Science

mPGES-1 1/200 Cayman

COX-1 1/1000

Cell signaling

COX-2 1/1000

p-IκBα 1/1000

IκBα 1/1000

β-actin 1/5000

p-AKT 1/1000

AKT 1/1000

p-p38 1/500

P38 1/1000

p-JNK 1/1000

JNK 1/1000

p-ERK1/2 1/1000

ERK1/2 1/1000

Tableau 4: Liste des amorces utilisées pour amplifier les ADNc spécifiques des gènes

étudiés. Les numéros d’accession des séquences utilisées sont notés dans le tableau, ainsi que

la taille des oligonucléotides et la taille de l’amplifiat PCR. La définition des oligonucléotides

a été réalisée en utilisant le logiciel Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/)

Nom Identification Séquence

Taille

oligonucléotides

Taille

produit

Cox-2 fwd NM_011198.3 AGGAGCATGTAATGTGGA 18 525

Cox-2 rev TAATTGGGAACCCTTCTT 18

iNOS fwd NM_010927.2 ACTGGTTTGAAACTTCTCAG 20 357

iNOS rev GGATTCTGGAACATTCTGT 19

TLR4 fwd NM_021297.2 ACTCTGATCATGGCACTG 18 500

TLR4 rev TAGGTTCGTCAGATTGGA 18

IL-1β fwd NM_008361.3 CTGGTACATCAGCACCTC 18 506

IL-1β rev GCTGGTGCTTCATTCATA 18

TNFα fwd NM_013693.2 GACCCCTTTACTCTGACC 18 498

TNFα rev TGTCTGAAGACAGCTTCC 18

GAPDH fwd NM_008084.2 GTGATGGGTGTGAACCAC 18 482

GAPDH rev GAGTGGGAGTTGCTGTTG 18

COX1 fwd NM_008969 GTTGGATCTCTGGGAGTTTGAG 22 331

COX1 rev CACTGAACAGGAAAATGAACCA 22

mPTGES-1 fwd NM_022415 AGGCCGAGGTACCCTTTCTA 20 317

mPTGES-1 rev ATGCAAGAGATGCTGCTGTG 20


Tableau 5 : Tableau récapitulant l’origine des stilbènes étudiés, les organes d’où ils

ont été extraits et leur degré de polymérisation

Plante Organe Stilbène Oligomérisation

Milicia excelsa écorces de sarment moracine M monomère

Morus alba sarments oxyrésveratrol monomère

Gnetum africanum sarments et racines

gnétol monomère

gnémonoside D

dimères gnémonoside A

gnéafricanine A

Vitis vinifera sarments

cis-picéide

monomères

resvératrol

picéide

picéatannol

astringine

δ-viniférine

dimères

ε-viniférine

ω-viniférine

scirpusine A

pallidol

ampelopsine A

quadrangularine A

léachianol F

léachianol G

miyabénol C trimère

hopéaphenol

tétramères isohopéaphenol

vitisine A

Vitis Riparia sarments vitisine B tétramère

Effets anti-inflammatoires des stilbènes sur des cultures cellulaires de

microglies et mécanismes d'action

Les processus neuro-inflammatoires sont observés dans de nombreux troubles neurodégénératifs. Les

cellules microgliales étant les principales cellules immunitaires du système nerveux central, plusieurs

recherches ont été menées afin de déterminer des molécules possédant des propriétés anti-inflammatoires

au niveau de ces cellules. Une famille de polyphénols, les stilbènes (des dérivés du resvératrol),

présentent des activités anti-inflammatoires au niveau périphérique et central.

Dans notre étude, nous avons premièrement évalué les propriétés anti-inflammatoires de 25 stilbènes en

déterminant leur capacité à inhiber la libération de NO dans un modèle de cellules microgliales BV-2

activées par le LPS. Dix stilbènes inhibent significativement cette production avec des IC50 comprises

entre 3,9 ± 0,7 et 23,4 ±1,0 µM. Parmi ces composés, 1 monomère (moracine M) et 2 tétramères du

resvératrol (vitisines A et B) diminuent la synthèse d’iNOS, enzyme responsable à la libération de NO, au

niveau transcriptionnel et traductionnel. Nous avons ensuite mis en évidence que la moracine M inhibe la

phosphorylation d’ERK1/2 et JNK (deux MAPK) et d’Akt (la voie PI3K/Akt) dans des cellules BV-2

activées. Ces enzymes étant impliquées dans la signalisation de la réponse inflammatoire, elles induisent

la production de plusieurs médiateurs inflammatoires. La moracine M inhibe significativement la

production de certains d'entre eux (NO, TNF-α, IL-1β et PGE2). Ce stilbène attenue également la

synthèse de la protéine de mPGEs-1 (enzyme impliquée à la production de PGE2).

Ainsi, la moracine M pourrait être un candidat potentiel pour prévenir l’inflammation impliquée dans les

maladies neurodégénératives.

Mots clés : stilbènes, moracine M, neuro-inflammation, cellules microgliales.

Anti-inflammatory effects of stilbenoids and their mechanisms of action in a

model of cell cultures of microglia

Chronic neuro-inflammatory processes observed in many neurodegenerative disorders. Microglia are

the main immune cells of the central nervous system. Many studies have been conducted to find

molecules with anti-inflammatory properties in the central nervous system. A family of polyphénols,

Stilbenoids (resveratrol derivatives), showed anti-inflammatory effects in peripheral and central levels.

In this study, we have first evaluated anti-inflammatory effects of 25 stilbenes for their potential to

inhibit NO release by LPS-activated BV-2 microglial cells. Ten stilbenes significantly reduced LPS-

induced NO production with IC50 ranging from 3.9 ± 0.7 to 23.4 ±1.0 µM. Among these molecules 1

monomer (moracin M) and two tetramers (vitisins A and B) attenuated the expression of iNOS, a

responsible enzyme for NO release on transcriptional and translational levels.

Then, we have demonstrated that moracin M inhibits ERK1/2 and JNK phosphorylation of MAPK

pathway and Akt phosphorylation of PI3K/Akt pathway, two signaling pathways involved in the

inflammatory response in activated BV-2 cells. Indeed, the activation of these pathways leads to the

production of several inflammatory mediators. We have shown that moracin M significantly inhibits

the production of certain mediators such as NO, TNF-α, IL-1β and PGE2. This stilbene reduces the

synthesis of mPGES-1 protein (an enzyme involved in the production of PGE2).

In conclusion, we suggest that moracine M could be a potential candidate prevents the inflammation

which involved in the progress of neurodegenerative diseases.

Keywords : stilbenes, moracin M, neuro-inflammation, microglial cells.

université bordeaux segalen

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