USO DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE ANINHADA (PCR ANINHADA) PARA O DIAGNÓSTICO PRECOCE DA INFECÇÃO PELO HISTOPLASMA CAPSULATUM NO SORO E NO SANGUE TOTAL DE PACIENTES HIV POSITIVOS

A Histoplasmose (HP) é causada pelo fundo Histoplasma capsulatum, conhecido como um dos principais indicadores de infecção por HIV. Em áreas endêmicas HP é a primeira manifestação da AIDS em 50%-70% dos pacientes, ocorrendo em 2%-5% dos pacientes em áreas não endêmicas. As altas letalidades, com uma incidência acentuada das lesões mucocutâneas, podem ser semelhantes à tuberculose miliar, uma patologia frequente no Brasil, o que levou os médicos a supor que a HP é a segunda infecção, sem considerar sinais de HP no diagnóstico diferencial, e, portanto, atrasar o início da terapia antifúngica apropriada.

Os métodos utilizados para o diagnóstico têm baixa sensibilidade e especificidade e, portanto, são menos eficientes. Isso enfatiza a necessidade de implementação de técnicas de diagnóstico de resposta altamente precisas e rápidas. Exame microscópico direto e cultura em meios Sabourand são os métodos padrão-ouro do diagnóstico. O exame microscópico exige, contudo, um bom nível de especialização. O método de cultura também é muito lento (até 4 meses) e perigosos (devido a presença de esporos). A sensibilidade do exame microscópico de fluidos e tecidos é muito baixa. Métodos serológicos são significativamente limitados, uma vez que a serologia negativa em até 50% dos pacientes que sofrem de histoplasmose imunossuprimidos, especialmente aqueles com síndrome da imunodeficiência (AIDS). Além disso, o melhor para a detecção do antígeno na urina e/ou soro não é acessível na maioria das áreas não endêmicas. Este estudo teve por objetivo detectar sequências do rDNA e as suas regiões do H. capsulatum (Hc), o que pode ser considerado específico em espécies e criar uma ferramenta de ativação, tais como diagnósticos moleculares.

No estudo foram obtidas 40 amostras de sangue total e soro de indivíduos com suspeita de histoplasmose. Estes foram posteriormente agrupados de acordo com os aspectos clínicos de pacientes: Grupo I (GI): 12 pacientes co-infectados com H. capsulatum/AIDS; Grupo II (GII): 8 pacientes portadores de HP associados com outras imunodeficiências; Grupo III (GIII): 10 cepas isoladas de lesões fúngicas de pacientes; Grupo IV (GIV): 10 pacientes com AIDS e outras infecções; Grupo V (GV): 10 pessoas ao infectadas com o HIV e com suspeita de pneumonia causada por bactéria; Grupo VI (controle positivo) consistiu em 9 isolados de H. capsulatum a partir de pacientes com/sem AIDS. A análise de amostras de cada grupo foi realizada por métodos convencionais (micológico, testes serológicos, molecular), utilizando: (i) controle de cepas (para determinar a sensibilidade de ambas as técnicas de laboratório convencionais e métodos moleculares); (ii) o exame micológico, exame microscópico de comunicação, tais como Agar Sabourand-Dextrose; A infusão cérebro-coração (DIFCO), Detroit, MI, USA); Ágar-ágar de triptona de soja (oxóide, Londres, Inglaterra) incubadas a 30°C e 35°C, e o crescimento de agentes patogênicos durante 60 dias, e (iii) métodos serológicos: imunodifusão dupla (ID) e imunotransferência (IB) de acordo com o método modificado utilizado por Davis et al. A análise molecular foi realizada por PCR aninhada com sequências específicas (“primers”) para H. capsulatum: regiões 18S rDNA (HC18), sequência 100 kDa (HC100), usando um método modificado de Bialek et al. e a sequência 5.8 S rDNA-ITS (HC5.8) pelo método modificado de Fungita et al.

Os resultados da coloração micológica GIEMSA não foram conclusivos suficientes para sugerir HP em amostras de sangue total de doentes nos Grupos I e IV, 40% da amostra GI foram isoladas H. capsulatum (30% no Grupo II), mas H. capsulatum não foi isolado nos grupos IV e V.A análise mostrou que os pacientes da imunodifusão em GI e II mostraram 20% e 40% da circulação de anticorpos anti-H. capsulatum, enquanto que os doentes em GV e GVI não apresentou reatividade por “imunotransferência” revelou que os GI (30%) e GII (70%) sujeitos apresentaram reatividade para as frações de H e M do H. capsulatum.Os pacientes

no GIV e GV não apresentaram reatividade para as frações de H e M. A reação de PCR aninhada em amostras de soro a partir de GI mostrou positiva em 87% (HC18), 92% (HC100) e 95% (HC5.8), e GII apresentou um resultado positivo em 70% (HC18), 85% (HC100) e 90% (HC5.8). As amostras de sangue total de doentes GI apresentou um resultado positivo em 89% (18S rDNA), 95% (HC100) e 98% (HC5.8), GII apresentou um resultado positivo em 70% (18S rDNA), 80% (HC100) e 92% (HC5.8).Avaliação de PCR aninhada mostrou uma maior sensibilidade em amostras de sangue total em relação ao soro. Os resultados da detectação de H. capsulatum no soro e no sangue mostrou uma maior especificidade para o iniciador de sequência HC5.8 (98%, sangue total, 88% - soro). Os resultados da análise de PCR aninhada com as sequências (HC18, HC100 e HC5.8) em grupos III (culturas heterólogas), V (não há outras infecções fúngicas, não ao HIV positivo) mostrou 100% de especificidade. O exame direito de amostras coradas por GIEMSA pode ser sugestiva, mas não conclusiva. Apesar do isolamento do H. capsulatum, o sangue total a ser consideradas provas para o diagnóstico da HP apresentou baixa sensibilidade no resultado dos pacientes imunocomprometidos. Os resultados obtidos micológicos, serológicos e análise de imunoreatividade demonstrou a necessidade de ensaios moleculares, devido à sua maior especificidade e sensibilidade. Isto poderia ser muito adequado para o monitoramento terapêutico de pacientes com HP disseminada pulmonar e cerebral.

THE USE OF NESTED POLYMERASE CHAIN REACTION (NESTED PCR) FOR THE EARLY DIAGNOSIS OF HISTOPLASMA CAPSULATUM INFECTION IN SERUM AND WHOLE BLOOD OF HIV-POSITIVE PATIENTS*

Histoplasmosis (HP) is caused by the fungusHistoplasma capsulatum, known as a leading indicatorof HIV infection. In endemic areas HP is the firstmanifestation of AIDS in 50%-70% of patients, occurringin 2%-5% of patients in non-endemic areas.1 Thehigh lethality, with a marked incidence of mucocutaneouslesions, may be similar to miliary tuberculosis,a frequently encountered pathology in Brazil, promptingdoctors to assume that HP is the latter infection,without considering the signs of HP in the differentialdiagnosis, and therefore delaying the initiation ofappropriate antifungal therapy.2,3The methods used for diagnosis have low sensitivityand specificity and are therefore less efficient.This emphasises the need for implementing highlyaccurate and quick turnaround diagnostic techniques.Direct microscopic examination and culture onSabouraud media are the gold standard method ofdiagnosis. Microscopic examination however requiresa good level of expertise. The culture method is alsovery slow (up to 4 months) and hazardous (due to thepresence of spores). The sensitivity of microscopicexamination of fluids and tissues is too low. Serologicaltechniques are significantly limited since serology isnegative in up to 50% of immunosuppressed patientssuffering from histoplasmosis, especially those withacquired immunodeficiency syndrome (AIDS).Furthermore, the test for antigen detection in urine

and /or serum is not accessible in the majority of nonendemicareas.4 This study aimed to detect sequencesin the rDNA and ITS regions of H. capsulatum (Hc),which can be considered species-specific and to createan enabling tool, such as molecular diagnostics.In the study we obtained 40 samples of wholeblood and serum from individuals with suspectedhistoplasmosis. These were subsequently groupedaccording to the clinical aspects of patients: Group I(GI): 12 patients co-infected with H. capsulatum /AIDS, Group II (GII): 8 patients with HP associated withother immunodeficiencies; Group III (GIII): 10 strainsisolated from fungal lesions of patients; Group IV(GIV): 10 patients with AIDS and other infections;Group V (GV): 10 individuals not infected with HIV andwith suspected pneumonia caused by bacteria; GroupVI (positive control) consisted of 9 isolates of H. capsulatumfrom patients with/without AIDS. The analysis ofsamples from each group was performed by conventionalmethods (mycological, serological, molecular)using: (i) control strains (to establish the sensitivity ofboth the conventional laboratory techniques andmolecular methods); (ii) mycological examination,direct microscopic examination stained byGiemsa´method; cultures in different media such asSabouraud-Dextrose agar; Infusion heart-brain (DIFCO,Detroit, MI, USA); Agar tryptone soy agar (Oxoid,London, England) incubated at 30 ° C and 35 ° C, andgrowth of the pathogens for 60 days, and (iii) serologicalmethods: double immunodiffusion (ID) andimmunoblotting (IB) according to the modifiedmethod used by Davis et al.5 Molecular analysis was performedby nested PCR with specific sequences(“primers”) for H. capsulatum: 18S rDNA region(HC18), 100 kDa (HC100) sequences, using a modifiedmethod of Bialek et al. and 5.8 S rDNA-ITS (HC5.8)sequence by the modified method of Fugita et al.6,7The results of mycological GIEMSA stainingwere not conclusive enough to suggest HP in wholeblood samples of patients in Groups I and IV, 40% ofsamples GI were isolated H. capsulatum (30% in GII),but H. capsulatum was not isolated in groups IV andV. The immunodiffusion analysis showed that patientsin GI and II showed 20% and 40% of circulating anti -H. capsulatum antibodies, while patients in GV andGIV showed no reactivity to species-specific antigen.Analysis of immunoreactivity by “immunoblotting”revealed that the GI (30%) and GII (70%) subjectsshowed reactivity to the fractions of H and M H. capsulatum.Patients in the GIV and GV showed no reactivityto the fractions H and M. The reaction of nested PCRin serum samples from GI showed positive in 87%

(HC18), 92% (HC100) and 95% (HC5.8), and GIIshowed a positive result in 70% (HC18), 85% (HC100)and 90% (HC5.8). The whole blood samples ofpatients in GI showed a positive result in 89% (18SrDNA), 95% (HC100) and 98% (HC5.8), GII showed apositive result in 70% (18S rDNA), 80% (HC100) and92% (HC5.8). Evaluation of nested PCR showedgreater sensitivity in whole blood samples in relationto the serum. The results of the detection of H. capsulatumin serum and whole blood, by nested PCR G IV(AIDS and multiple infections), showed greater specificityto the sequence initiator HC5.8 (98%, wholeblood, 96% - serum), followed by HC100 ( 97% - wholeblood, 95% - serum) and HC18S (90% - whole blood,88% - serum). The results of the analysis of nested PCRwith the sequences (HC18, HC100 and HC5.8) ingroups III (heterologous cultures), V (no other fungalinfections, not HIV-positive) showed 100% specificity.The direct examination of GIEMSA stained samples canbe suggestive but not conclusive. Despite the isolationof H. capsulatum, the whole blood samples to be consideredevidence for the diagnosis of HP demonstratedlow sensitivity in imunocompromised patients. Theresults obtained in mycological, serological and analysesof immunoreactivity demonstrated the need formolecular assays due to their higher specificity andsensitivity. This could be very suitable for the therapeuticmonitoring of patients with pulmonary, cerebraland disseminated HP.