UTILIZAÇÃO DE RECURSOS DA ENGENHARIA BIOMÉDICA APLI CADOS À METABOLÔMICA

Laíse Oliveira Resende1, Foued Salmen Espindola2, Adriano Oliveira Andrade1

Universidade Federal de Uberlândia, Faculdade de Engenharia Elétrica/ Laboratório de Engenharia Biomédica, Uberlândia – MG, E-mail: laiseresende@yahoo.com.br, aoandrade@yahoo.com.br

Universidade Federal de Uberlândia, Instituto de Genética e Bioquímica, Uberlândia – MG, E-mail: fsespindola@gmail.com

Resumo - A metabolômica consiste no isolamento e caracterização de metabólitos, que são pequenas moléculas de uma célula, fluido corporal ou organismo. Para a obtenção de resultados precisos em pesquisas que utilizem esta ciência ômica, é necessário o desenvolvimento de plataformas tecnológicas que permitam a avaliação e sistematização dos dados. Deste modo, a engenharia biomédica é estritamente relacionada à metabolômica. As ferramentas que permitem a mensuração dos metabólitos mais utilizadas são a espectrometria de massa (EM) e a ressonância magnética nuclear (RMN). Sendo assim, a interação entre as ômicas e a utilização de ferramentas adequadas colaboram para o desenvolvimento de biomarcadores clínicos eficazes para diversas patologias, com métodos menos invasivos, os quais possibilitam melhor diagnóstico e prognóstico dos pacientes. O objetivo deste artigo é apresentar uma abordagem dos recursos da engenharia biomédica relacionados à metabolômica, além de aplicações e resultados destes obtidos na prática clínica.

Palavras-Chave – biomarcadores, engenharia

biomédica, metabolômica. USE OF PROCEEDS OF BIOMEDICAL

ENGINEERING APPLIED TO METABOLOMICS

Abstract - The metabolomics is the isolation and

characterization of metabolites, which are small molecules in a cell, body fluid or organism. To obtain accurate results in studies using this science it is necessary to develop technology platforms that allow the evaluation and systematization of data. Thus, biomedical engineering is closely related to metabolomics. The tools that enable the measurement of metabolites are most used mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR). Thus, the interaction between the omics and use of appropriate tools contribute to the development of effective clinical biomarkers for various diseases, with less invasive methods, which enable better diagnosis and prognosis. The aim of this paper is to present a discussion of features related to biomedical engineering metabolomics, and applications and these results obtained in clinical practice.

Keywords – biomarkers, biomedical engineering, metabolomics.

NOMENCLATURA

DNA Ácidos desoxirribonucléicos. EM Espectrometria de massa. GABA Ácido gama-aminobutírico. HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência. RNA Ácidos ribonucléicos. RMN Ressonância magnética nuclear. SNC Sistema nervoso central.

I. INTRODUÇÃO

A metabolômica é uma plataforma tecnológica

relacionada ao isolamento e caracterização de metabólitos. Além desta, existem outras “ômicas” relacionadas à caracterização do maior número possível de biomoléculas de um mesmo grupo, tais como genômica, transcriptômica e proteômica, as quais se referem ao DNA (ácidos desoxirribonucléicos), RNA (ácidos ribonucléicos) e proteínas respectivamente.

O conjunto de todas essas pequenas moléculas (metabólitos) de uma dada célula, fluido corporal ou organismo é conhecido como metaboloma [1]. Uma vez conhecida a composição do metaboloma, pode-se prever que genes e rotas metabólicas estão ativos naquele momento na célula.

Após a descoberta dos metabólitos de uma amostra qualquer e a identificação de algum composto de interesse (farmacêutico, por exemplo), é possível iniciar os estudos de engenharia de metabolismo. Tais estudos primam por identificar os genes e as rotas metabólicas desses compostos, visando aumentar ou diminuir a sua produção. Além disso, a engenharia de metabolismo pode ser aplicada na modificação genética de um outro organismo, para que este possa produzir o metabólito em questão [2].

Através do aumento do número de pesquisas relacionadas à metabolômica, a partir de uma padronização dos procedimentos a serem realizados, por meio de protocolos, torna-se possível a validação dos experimentos, com a reprodutibilidade e repetibilidade dos mesmos.

As ferramentas da engenharia biomédica propiciam a sistematização e avaliação dos dados dos compostos em estudo. É possível assim, a partir do isolamento de um composto, obter a estrutura deste. A análise espectral detalhada de um único espectro de hidrogênio pode fornecer informações sobre a estrutura e a composição química dos principais constituintes químicos majoritários presentes na amostra [3].

A metabolômica tem aplicações em diversas áreas, tais como, na farmacologia e toxicologia. Destaca-se pesquisas para seleção de fármacos efetivos e seguros, a identificação de marcadores biológicos de toxicidade e o entendimento dos mecanismos de toxicidade.

A interação entre as ômicas e a utilização de ferramentas adequadas colabora para o desenvolvimento de biomarcadores clínicos eficazes, com métodos menos invasivos. Como exemplo da utilização da metabolômica, observa-se trabalhos relacionados à cardiologia e neurologia, por exemplo.

Destaca-se a aplicação da metabolômica ao desenvolvimento de biomarcadores cardiovasculares. Porém, para isto, é necessário a interação entre a genômica (com a genética e perfil da expressão gênica), proteômica e metabolômica. Um estudo recente relaciona metabolômica e proteômica para a caracterização metabólica de perfis de tecido atrial que predispõem ao desenvolvimento de fibrilação atrial [4]. A genômica tem fundamental importância neste processo. Pode-se verificar como exemplo, a identificação de um alelo comum no cromossomo 9p21, associado ao início precoce do infarto do miocárdio [5]. As regiões cromossômicas identificadas até o momento não contém genes reconhecidamente associados com os fatores de risco das doenças coronarianas, como as lipoproteínas plasmáticas. No entanto, a integração dos metabólicos e dados de proteômica desses mesmos pacientes podem fornecer indícios de como as variantes modulam o processo aterosclerótico [6].

Devido à variabilidade interindividual e considerando os ruídos contidos no sinal, os quais podem ocasionar uma interpretação menos precisa, testes em grupos com maior quantidade de sujeitos de pesquisa são indicados, e não grupos pequenos, como utilizado no referido trabalho, com 18 pacientes para o grupo controle e 18 para o grupo com isquemia [6].

Torna-se possível assim, a realização de uma análise metabólica com maior exatidão e a obtenção de resultados não observados ou verificados de forma errônea em grupos menores.

Além disso, na pesquisa em questão, utizou-se plasma fracionado por HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência, em inglês: high performance liquide chromatography). O perfil metabólico de soro ou plasma oferece a vantagem da coleta das amostras simples, e pode refletir a soma das alterações metabólicas que ocorrem em todo o corpo. Entretanto, pode ser mais adequada a análise metabólica de perfis de amostras de urina para os metabólitos que são rapidamente eliminados da circulação [6].

A metabolômica pode ser utilizada também para o desenvolvimento de biomarcadores para doenças neurológicas. Ferramentas de bioinformática estão sendo utilizadas para biomarcadores relacionados à uma infinidade de distúrbios, incluindo aqueles do sistema nervoso central (SNC), os quais estão associados a distúrbios nas vias metabólicas relacionadas aos neurotransmissores (dopamina, serotonina, glutamato e GABA - ácido gama-aminobutírico), ácidos graxos, estresse oxidativo e função mitocondrial [7].

As ferramentas da metabolômica permitem a obtenção de maiores detalhes bioquímicos, possbilitando a obtenção de informações relevantes para o desenvolvimento de

biomarcadores para esquizofrenia, transtorno bipolar, esclerose lateral amiotrófica e doença de Parkinson, por exemplo.

As ferramentas para análise dos dados incluem a aplicação de softwares para identificação e classificação dos grupos de interesse, como o software Mestre C. Posteriormente, o conjunto de dados pode ser analisado através de softwares estatísticos.

Na metabolômica aplicada no estudo de doenças do SNC, a utilização de plataformas tecnológicas permite uma análise integrada das vias bioquímicas e metabólicas que ocorrem em um transtorno. Utilizando-se a HPLC, realizou-se estudo com plasma sanguíneo de 28 pacientes com doenças do neurônio motor e 30 do grupo controle, constituído por indivíduos saudáveis. De 317 metabólitos, 50 estavam elevados nos pacientes doentes e mais de 70 estavam diminuídos (p > 0,05) [7]. Estes resultados sugerem que estudos de metabolômica podem ser utilizados para verificar perfis metabólicos relacionados às patologias, utilizando amostras facilmente acessíveis, como o plasma.

Com o desenvolvimento da metabolômica, torna-se possível então, avaliar com precisão centenas ou milhares de pequenas moléculas em amostras biológicas, possibilitando o avanço da compreensão acerca da fisiopatologia de várias doenças, permitindo assim, o desenvolvimento dos biomarcadores e a relação direta com a engenharia biomédica, tanto para o desenvolvimento de ferramentas para a análise dos dados, quanto para a aplicação final destas.

II. METODOLOGIA

As etapas da metabolômica consistem na seleção do organismo, célula, tecido ou biofluido a ser analisado; preparo da amostra; pré-fracionamento; fracionamento da amostra; conversão dos resultados para uma unidade comum; análise estatística dos dados; elucidação funcional de genes.

Fig. 1. Esquema típico de análises metabolômicas [8].

Qualquer ferramenta que permita mensurar os metabólitos pode ser usada pela metabolômica, tais como, a Espectrometria de Massa (EM) acoplada a Cromatografia líquida, Cromatografia Gasosa ou Eletroforese Capilar, juntamente com a Ressonância Magnética Nuclear (RMN).

A EM é muito mais sensível do que a RMN, muito embora isso nem sempre represente uma vantagem, pois a maior sensibilidade implica em uma menor reprodutibilidade da análise no mesmo equipamento ou em equipamentos equivalentes [9].

A EM e RMN são utilizadas junto à aplicação da transformada de Fourier, as quais podem ser observadas em equipamentos como o “Fourier Transform Ion Ciclotron Ressonance Mass Spectrometry” (FT-ICR-MS), que combina a RMN e a EM, possibilitando a detecção de um maior número de compostos diferentes [9].

A EM consiste possui cinco componentes, conforme a Figura 2.

O primeiro componente é a unidade de entrada da amostra, que traz a amostra do ambiente de laboratório (1 atm) com a menor pressão do espectrômetro de massa. Pressões dentro da faixa espectrômetro de massa de poucos milímetros de mercúrio em uma fonte de ionização química de alguns micrômetros de mercúrio no analisador de massa e detector regiões do instrumento. A entrada da amostra leva para a fonte de íons, onde as moléculas da amostra são transformados em íons em fase gasosa. Os íons são então acelerados por campo eletromagnético. Em seguida, o analisador de massa separa os íons da amostra com base na sua razão massa-carga (m/z). Os íons são então contados pelo detector, e o sinal é gravado e processado pelo sistema de dados. A saída deste é o espectro de massa, um gráfico do número de íons detectados em função da razão m/z.

Fig. 2. Componentes da espectrometria de massa (Modificado de [3]).

A Figura 3 exemplifica um modelo de espectrometria de

massa, neste caso, do álcool benzílico e a estrutura química correspondente.

Na RMN, muitos núcleos atômicos têm uma propriedade chamada spin, na qual que os núcleos comportam-se como se estivessem girando. O momento magnético nuclear é gerado por sua carga e por spin.

Os núcleos ficam alinhados com um campo aplicado e são induzidos a absorver energia e a mudar a orientação de spin em relação ao campo aplicado.

O núcleo gira com influência do campo magnético aplicado, assim, quanto mais intenso o campo magnético, maior a velocidade ou freqüência angular.

Fig. 3. Espectrometria de massa do álcool benzílico [3].

O espectrômetro de RMN possui uma freqüência de 60 MHz. A amostra é girada sobre seu eixo para garantir que todas as partes da solução possuem um campo magnético uniforme.

A bobina é ligada a um gerador. Esta bobina fornece energia eletromagnética utilizada para alterar as orientações de spin dos prótons. Quando a amostra absorve energia, a reorientação dos spins nucleares induz um sinal de ressonância ou pico. Ocorre ressonância com a frequência do próton igual a 60MHz. À medida que a intensidade do campo magnética aumenta, maior é a frequência dos prótons.

Realiza-se uma varredura no sinal, até que todos os núcleos entrem em ressonância. Há um sinal oscilatório, que consiste no ruído, o qual surge, pois os núcleos excitados não têm tempo para retornar ao seu estado de equilíbrio antes do campo magnético. Observa-se na Figura 4, uma representação do sinal e do ruído.

Fig. 4. Representação do ruído [3].

Aplica-se pulsos (FT pulsado), com uma descarga de

potência alta, porém curta. Todos os núcleos de uma molécula são excitados simultaneamente, entrando assim, ao mesmo tempo em ressonância. O campo magnético aplicado é de 1,2 T, o pulso de energia é curto, de 1 a 10 µseg e a frequência é de 90 MHz.

Com a interrupção do pulso, os núcleos excitados perdem a energia de excitação, voltando ao estado de spin original, com relaxamento dos núcleos, conforme observado na Figura 5.

Fig. 5. Decaimento de indução livre do sinal (300MHz) [3].

A Figura 6 representa o sinal no domínio do tempo e da freqüência, com as fases de FID e FFT.

Fig. 6. FID e FFT do sinal [3]. A Figura 6a representa a curva FID dos hidrogênios na acetona (domínio do tempo); a Figura 6b demonstra o decaimento de indução livre; e a Figura 6c apresenta a FFT do sinal (frequência da onda senoidal plotada no domínio da frequência). Utiliza-se o software Mestre-C para análise dos dados, neste é possível após a importação do espectro, a realização do FID (decaimento de indução livre - DIL) e a transformada rápida de Fourier (FFT).

A Figura 7 apresenta o sinal de “Free Induction Decay” (FID) ou Decaimento de Indução Livre (DIL). A amplitude do FID diminui com o tempo por causa do processo de relaxamento, que é o mecanismo pelo qual a magnetização vai voltar lentamente ao estado inicial de equilíbrio.

Fig. 7. Decaimento de indução livre (Software Mestre C).

O FID refere-se ao espectro acumulado do sinal no domínio do tempo. Realiza-se a FFT para obtenção do sinal no domínio da freqüência, conforme observado na Figura 8.

Fig. 8. Transformada rápida de Fourier (Software Mestre C).

Após a importação do espectro, realização do FID e FFT, obtém-se a estrutura do composto em estudo. Neste caso, o 4,6-dimetóxi-5.Z-fenilbutenolídeo (Figura 9).

Fig. 9. Estrutura do composto [3].

III. DISCUSSÃO

Através do aumento do número de pesquisas relacionadas à metabolômica, a partir de uma padronização dos procedimentos a serem realizados, por meio de protocolos, torna-se possível a validação dos experimentos, com a reprodutibilidade e repetibilidade dos mesmos.

As ferramentas de bioinformática propiciam a sistematização e avaliação dos dados dos compostos em estudo. É possível assim, a partir do isolamento de um composto, obter a estrutura deste [10].

A interação entre as ômicas e a utilização de ferramentas adequadas colabora para o desenvolvimento de biomarcadores clínicos eficazes, com métodos menos invasivos.

Análise espectral detalhada de um único espectro de hidrogênio pode fornecer informações sobre a estrutura e a composição química dos principais constituintes químicos majoritários presentes na amostra.

A metabolômica tem aplicações em diversas áreas, tais como, na farmacologia e toxicologia. Destaca-se pesquisas para seleção de fármacos efetivos e seguros, a identificação de marcadores biológicos de toxicidade e o entendimento dos mecanismos de toxicidade [3].

IV. CONCLUSÃO

Dentre as ômicas, a genômica é a mais desenvolvida, pois esta possui protocolos determinados e ferramentas de fracionamento e análise dos resultados bem desenvolvidos. É necessário que haja padronização dos procedimentos relacionados à metabolômica, com a existência de protocolos de preparo e fracionamento das amostras. Além disso, as pesquisas que envolvem metabolômica requerem equipamentos caros e, principalmente, profissionais altamente capacitados para manipulá-los. Estes fatores limitam os trabalhos de metabolômica aos grandes centros de pesquisa.

A integração dessas informações com aquelas obtidas pelas outras plataformas tecnológicas (proteômica, transcriptômica e genômica, principalmente) trará muito mais avanços no que tange relacionar o genótipo e o fenótipo dos organismos.

O desenvolvimento destas plataformas tecnológicas é de fundamental importância para os pesquisadores, pois possibilita que a análise dos resultados seja feita de forma mais rápida e precisa.

No fracionamento, as ferramentas de maior sensibilidade esbarram na baixa resolução dos resultados, enquanto aquelas que primam pela resolução, exigem uma grande quantidade de amostra, limitando a sua utilização.

É preciso o desenvolvimento de ferramentas computacionais para comparar, entender e aplicar o conhecimento gerado pelos experimentos, de uma forma

acessível para os pesquisadores da área biomédica, com uma interface de fácil utilização, com resultados precisos para uma análise satisfatória.

A Engenharia Biomédica possibilita a interação entre a bioquímica e o desenvolvimento de ferramentas que possibilitem melhor análise dos dados, já que é uma área multidisciplinar que possui os dois enfoques, visando a melhoria do desenvolvimento das pesquisas, propiciando bons resultados e melhoria na prática clínica para a população e os pacientes relativos à abordagem em questão, em que haja benefício com a terapia adotada.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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