validering af molekylærbiologiske - danak...•genomisk blodtypebestemmelse •frit føtal dna...
TRANSCRIPT
Validering af molekylærbiologiske
analyser
Marianne Antonius Jakobsen
Afsnitsleder for molekylærbiologisk lab.
Klinisk Immunologisk afdeling, OUH.
Hvordan laver man en god validering?
• Standarden:
• Mere uddybende guideline under DSKB.
Typer af molekylærbiologiske analyser
• Bestemmelse af HLA-vævstyper (SSO-PCR og SSP-PCR)
• Bestemmelse af specifikke HLA-vævstyper (f.eks. HLA-DQ2/8 m. microarrays)
• Genotype bestemmelse (SNP assays)
• Genomisk blodtypebestemmelse
• Frit føtal DNA analyser (RHD bestemmelse)
• Sanger sekventering
• Next Generation sequencing (NGS)
Kvalitative analyser
Hvordan laver man så en god validering af en kvalitativ analyse?
Klinisk Immunologi, OUH
• Produktionsenhed
• Diverse laboratorieafsnit:
o Erytocytlaboratoriet
o HIV/HEP
o Autoimmunlaboratoriet
o Leukocytlaboratoriet
o Molekylærbiologisk
Hvad har vi gjort?
Vores valideringsprotokol
• Formål
• Anvendelsesområde
• Metodebeskrivelse (i drift):
• Målemetode
• Måleenhed
• Udstyr
• Prøvemateriale
• Reagenser/utensilier
• Sporbarhed mht. prøveid
• Svarafgivelse
Prøvemateriale
eller
Sporbarhed mht. prøveid.
Svarafgivelse
• Beskrivelse af hvordan svaret generes og konkluderes
• F.eks. analysesoftware og version
• Procedure omkring analysering, hvem gør hvad?
• Svarafgivelse:
• Simpelt svar
• Mere kompliceret svar og hvilke krav
Vores valideringsprotokol fortsat
• Kriterier for accept:
• Måleområde
• Detektionsgrænse
• Linearitet
• Korrekthed
• Analytisk specificitet
• Præcision/reproducerbarhed
• Afsmitning
• Robusthed/ydre påvirkninger
• Eventuelt
Korrekthed
• Overensstemmelse mellem metode og anden (reference-) metode:
• SNP genotype versus Sanger
• MicroArray versus high resolution HLA
• NGS versus Sanger
Valideringsprotokol
• Valideringsprocedure:
• Anvendt prøvemateriale
• Referencemateriale
• Valideringsbetingelser
• Procedure (punkt for punkt)
Prøvemateriale
• Referencemateriale (kan være rigtig svært at få fat i)
• EQA prøver med kendt svar
• Tidligere kørte patientprøver med kendt diagnose
• F.eks. til HLA-DQ2/8
• Sammenligning med anden standard metode
• Molekylærbiologisk med serologisk
• Prøver fra andre laboratorier
• OBS: hvor sikker er du på den metode, du sammenligner med?
Valideringsprotokol
• Valideringsprocedure:
• Anvendt prøvemateriale
• Referencemateriale
• Valideringsbetingelser
• Procedure (punkt for punkt)
• Indsamling af data:
• Hvilke type data
• Databehandling
Valideringsrapport
• Ændringer i forhold til protokollen
• Resultater (punkt for punkt)
• Kvalitetssikring af metode i drift
• Måleusikkerhed
• Konklusion
• Arbejdsmiljø
• Husk: at skrive rapporten så detaljeret, at du også forstår den om 5 år (og din TA forstår den).
Kvalitetssikring
• Kitkontroller
• Interne kontroller
• Eksterne kontroller
Interne kontroller
• Negativ kontrol (kontaminering)
• Krav til nogle kits
• Rigtig god ide til alle PCR opsæt.
• Positiv kontrol
• Afhænger meget af opsæt:
• Genotypebestemmelse med SNP
• Positiv kontrol til føtal RHD bestemmelse
• Ved 96 brøndsopsæt (marker plades placering)
• Hjemmegjorte kontroller (spikede prøver eller gamle patientprøver)
Eksterne kontroller (EQA)
• Metode- eller sygdomsspecifik
• DEKS
• EMQN
• NEQAS
• INSTAND
• RfB (referenzinstitut für bioanalytik, DAkkS)
• Qualigene
• Udveksling med andre laboratorier
Eksterne kontroller (EQA) • DEKS • EMQN
• Sanger sekventering • NGS • HRF
• NEQAS • Diverse HLA (low resolution, B27, B5701, DQ2/8) • Kimæriseundersøgelse
• INSTAND • Genomiske blodtyper inkl. HPA
• RfB (referenzinstitut für bioanalytik, DAkkS) • IL28B
• Qualigene • MLPA
• Udveksling med andre laboratorier • Føtal RHD bestemmelse
Eksempel på validering 1
• Mannan-bindende lektin (MBL)
• 7 mulige haplotyper (HYPA, LYPA, LYQA, LYPB, LXPA, LYQC og HYPD)
+4
P/Q
Valideringsopsæt
• Metode: Sanger sekventering
• Materiale: Prøver fra Rigshospitalet (SNP assay)
• Fuld overensstemmelse på mulige SNP’s
Hele valideringen er kørt om
• 88 prøver fra SSI (alle SNP’s dækket):
• 80 enslydende
• 3 kunne ikke opformeres
• 5 diskrepans
• Hvilken analyse er så korrekt?
• Tredje metode i brug
• Konklusion har betydet procedureændring
Eksempel på validering 2
• Targeted sekventering af 17 gener med NGS.
• Validering koncentreret om 4 gener, som vi hidtil har Sanger sekventeret.
Ion Torrent:
Opbygning af validering
• Grundig metodebeskrivelse fra prøvehåndtering til dataanalyse
• Anvendt materiale (DNA fra patientprøver og EMQN)
• Korrekthed: • test for kendte varianter i de 4 gener
• Homo/heterozygote
• (Insertioner/deletioner og homopolymer varianter)
• Reproducerbarhed (inter-run) • 2 biblioteker fra samme prøve i 2 forskellige kørsler
• Repeterbarhed (intra-run) • Et bibliotek delt i 2 i samme kørsel
• Robusthed: • Dækning for de enkelte amplikons
• Krydskontaminering
Kriterier for accept
• Kvalitetskrav for selve kørsel
• Total aligned bases
• Alignement kvalitet
• Kvalitetskrav for prøve
• Assigned amplicon reads
• Krav til resultat:
• Genfinde kendte mutationer
• Dækning af kodende regioner eller mulighed for at hurtig identificere ikke-dækkede områder
• Vurdering på krydskontaminering
Hvad valideringen ellers viste
• Heterozygot variant allelfrekvens - 0,42-062
• Homozygot variant allelfrekvens - 0,99-1
• Forward/reverse readfrekvensen - stor variation
Vores erfaring
• NGS har krævet flere tillægsvalideringerne:
• Producent ændrede kittet af flere omgange
• Skiftet apparatur
• Skiftet analysesoftware 2 gange
Vores erfaring
• Fordel med fleksibel akkreditering på både Sanger og NGS
• Validerer metode
• Tilføje gener eller paneler efter behov
• Estimat på usikkerhed
• Ikke udregnet en værdi
• Angiver forbehold i brugerhåndbog og svar:
• Angiver hvis ikke fuld dækning
• Ikke-kodende region ej undersøgt
• Heterozygot deletion af helt exon ej undersøgt
Spørgsmål?