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Vero毒 素産生性大腸菌0111:H-に よる集団下痢症 の細菌学的研究

愛媛県立衛生研究所

田中 博*大 瀬戸 光 明 山下 育孝

篠原 信之 井上 博雄

(*現 愛媛県伊予保健所)

愛媛県立中央病院検査部

佐 々木 嘉 忠 柿 原 良 俊

大阪府立公衆衛生研究所

塚 本 定 三

東京大学医科学研究所

湯通 堂 隆 奥 裕 一 竹 田 美文

(平成1年3月6日 受付)

(平成1年4月11日 受理)

Key words: Escherichia coli 0111: H-, Hemorrhagic colitis,

Hemolytic uremic syndrome

要 旨

1986年6月,松 山市 内の某 乳児 院 にお いて,乳 幼児23名 中22名 が発症 す る集 団下 痢症 が発 生 した.下

痢 は,患 者 のす べ てに認 め られ,9名 の患者 は,血 便 を呈 した.発 熱,嘔 吐 が認 め られた患 者 は,比 較

的 少数 で あ った.1名 の患者 は,溶 血 性尿毒 症 症候群(hemolytic uremic syndrome,HUS)を 続 発 し,

死 亡 した.細 菌 学的 検査 の結 果,7名 の患者 か らVero細 胞 に細 胞毒 性 を示す毒 素(Vero毒 素,VT)

を産生 す る大腸 菌0111:H-が 分離 された.さ らに,動 物試 験 にお いて,本 毒 素 は,ウ サ ギ結 紮腸 管 ル ー

プ試験 陽性 で,マ ウスに対 して も致死 毒性 を示 した.分 離 した大 腸菌0111二H一 が産 生す るVero毒 素 に

つ い て,抗 志賀 毒素 血 清,抗VT1血 清,抗VT2血 清 を用 いたbead-ELISAで 調べ た結 果,VT2とVT1

の両毒 素産 生株 で あ る ことがわ か った.VT2の 産 生量 は,VT1の 約10倍 であ った.VT2の 産 生 は,抗VT2

血 清 を用 いた マ ウス致死 毒素 の 中和 とOuchterlonyの ゲル 内沈 降反応 に よって も確 認 した.

は じめ に

ヒ トに下 痢 を お こす 大 腸 菌 と して,従 来,病 原

性 大 腸 菌(enteropathogenic Escherichia col4

EPEC),細 胞 侵 入 性 大 腸 菌(enteroinvasive E.

coli,EIEC),毒 素 原 性 大 腸 菌(enterotoxigenicE.

coli,ETEC)が 区 別 され て い た1).1977年,Kon-

owalchukら2)は,ETECが 産 生 す るheat-1abile

enterotoxin(LT),heat-stable enterotoxin (ST)

以 外 にVero細 胞 に 毒 性 を示 す 毒 素 を 産 生 す る大

腸 菌 を 報 告 し,そ の 毒 素 をVero毒 素(VT)と 呼

ん だ.一 方,1982年Rileyら3)は,ア メ リカの オ レ

ゴ ン州 と ミシ ガ ン州 に お い て 発 生 した 食 中 毒 事 件

か ら原 因 菌 と し てVero毒 素 を 産 生 す るE.coli

O157:H7を 分 離 した.Rileyら3)は,臨 床 症 状 か ら

このE.coli O157:H7に よ る下 痢 を 出血 性 大 腸

炎(hemorrhagic colitis)と 呼 ん だ.O'Brienら4)

は,こ のVero毒 素 の 活 性 が,す で に報 告 して い た

E,coli O26の 産 生 す るVero毒 素5)と 同 じ よ うに

抗 志 賀 毒 素 抗 体 に よ っ て 中 和 さ れ る こ とを 見 出

し,こ の 毒 素 をShiga-like toxinと 名 づ け た.そ

別刷請求先:(〒799-31)愛 媛 県伊予市米湊269

伊予保健所 田中 博

平成元年10月20日

1188 田中 博 他

の後,Vero毒 素(Shiga-like toxin)を 産 生 す る

大 腸 菌 は,ア メ リカや カ ナ ダ の 散 発 下 痢 患 者,食

中毒 事 例 か ら続 々 と分 離 さ れ,出 血 性 大 腸 炎 の 原

因 と な る こ とが 報 告 され6)～8),腸 管 出 血 性 大 腸 菌

(enterohemorrhagic E.coli, EHEC)と い う呼

称 が提 案 され た9).わ が 国 にお い て も,本 菌 に よ る

下 痢 症 は,小 林 ら10)が1985年 に報 告 した の を は じ

め と して,小 林 と原 田11)や佐 久 ら12)が散 発 例 を,伊

藤 ら13)14)が集 団食 中 毒 事 例 を報 告 し て い る.

EHECが 産 生 す るVero毒 素(Shiga-like

toxin)と して は,現 在 まで に2種 類 が 報 告 され て

い る.1つ は,抗 志 賀 毒 素 に よ っ て 活 性 が 中和 さ

れ る毒 素 で,そ の 分 子 構 造 が 志 賀 毒 素 と全 く同一

で あ る こ とが わ か っ て い る15).も う1つ は,生 物 学

的 性 状 は志 賀 毒 素 とほ ぼ 同 じで あ る が,活 性 が抗

志 賀 毒 素 に よ って 中 和 され な い 毒 素 で,遺 伝 子 の

塩 基 配 列 か ら推 定 した ア ミノ酸 配 列 が 志 賀 毒 素 と

約56%の 相 同性 が あ る こ とが わ か って い る16).前

者 はVero toxin 1 (VT1)17)ま た はShiga-like

toxin I18),後 者 はVero toxin 2 (VT2)17)ま た は

Shiga-liketoxinII18)と 呼 ぼ れ て い る.

今 回,わ れ わ れ は,松 山市 内 の 某 乳 児 院 で 発 生

し た 集 団 下 痢 症 か ら,主 と し てVT2を 産 生 す る

EHECを 原 因 菌 と して 分 離 した.こ の 事 例 の 臨 床

症 状 の詳 細 は,高 山 と松 本19)に よ って 報 告 され て

い るが,本 報 で は,分 離 した 大 腸 菌 の 細 菌 学 的 検

査 成 績 と分 離 菌 が 産 生 す るVero毒 素 の性 状 を 中

心 に 報 告 す る.な お,こ の 論 文 の要 旨は,第61回

日本 感 染 症 学 会 総 会(昭 和62年4月,東 京)に お

い て 発 表 した20).

材 料 お よ び方 法

(1)患 者

患 者 の 発 生 状 況 お よ び性 状 は,病 院 に お い て,

患 者,乳 児 院 の職 員 か ら問 診 に よ り調 査 した.

(2)病 原 菌 の検 索

15名 の 患 者 か ら糞 便 を 採 取 した.細 菌 検 査 で は,

赤 痢 菌,サ ル モ ネ ラ,下 痢 原 性 大 腸 菌(EPEC,

EIECお よ びETEC),病 原 ビ ブ リオ,カ ン ピ ロバ

ク タ ー,エ ル シ ニ ア を対 象 と し,常 法21)に よ り分 離

を試 み た.さ ら に,電 子 顕 微 鏡 に よ る ウ イ ル ス粒

子 の 検 索 と培 養 細 胞(初 代 サ ル 腎 細 胞,MA104細

胞)に よ る ウ イ ル ス の 分 離 も試 み た.

(3)大 腸 菌 の 性 状 検 査

大 腸 菌 の 生 化 学 的 性 状 は,Edwards and Ewing

の 記 載22)に も とづ き行 った.ま た,薬 剤 感 受 性 に つ

い て は,1濃 度 法(日 水,昭 和 デ ィ ス ク)に よ っ

て 検 査 した.薬 剤 は,ampicillin, cephaloridine,

chloramphenicol, tetracycline, streptomycin,

kanamycin, gentamicin, fosfomycin, polymyxin

B, nalidixic acid, sulfamethoxazol-trimethoprim,

enoxacinを 用いた.

(4)大 腸菌の血清型別

大腸菌の血清型別は,市販の診断用免疫血清(デ

ンカ生研)を 用いて生菌によるスライ ド凝集反応

および100℃60分 加熱菌に よる試験管内凝集反応

によ り行った.

(5)ETECの 検査

常法23)に従い,LTはBikenテ ス ト,STは 乳飲

みマウス試験を行 った.

(6)Vero毒 素の生物学的性状試験

試料の調整:分 離 した大腸菌 をbrainheart

infusion (Difco)に 接種 し,37℃ で20時 間,振 盟

培養を行った.培 養後,遠 心分離を行い,上 清を

メンブランブイルターでろ過,ろ 液を試料 とした.

培養細胞に対する毒性試験:Vero細 胞,CHO

細胞,HeLa細 胞,MA104細 胞を用いた.試 験法

は,CHO細 胞法23)に準 じて行い,細 胞の変性効果

を5日 間観察 した.

マウスに対する致死毒性試験:試 料を1群2匹

のマウスの腹腔内に接種(0.5ml/匹)し,生 存す

るか どうかを7日 間観察した.さ らに,60℃30分

および80℃10分 間加熱処理 した試料を同時に接種

し,加熱による毒素の不活性化の有無を観察 した.

結紮腸管ループ試験:ウ サギの結紮腸管ループ

試験 を常法23)に従 って行 った.試 料0.5mlを 接種

し,翌 日,剖 検 し,浸 出液の貯留量を測定 した.

(7)Vero毒 素の免疫学的性状

精製志賀毒素24),VT125),VT226)を ウサギに免疫

して得た抗志賀毒素血清,抗VT1血 清,抗VT2血

清を用いて,分 離菌の産生す る毒素の免疫学的性

状を以下の方法によって調べた.

マウス致死毒性の中和試験:分 離菌の培養上清

感染症学雑誌 第63巻 第10号

Vero毒 素産生性大腸菌による集団下痢症の細菌学的研究 1189

0.25mlと 各抗毒素血清0.25m1を 混和 し,37℃ で

1時 間反応 させた後,混 合液0.5mlを マウスに腹

腔内接種 し,7日 間生存を観察 した.

Ouchterlonyの ゲル内沈降反応:分 離菌の培養

上清を硫安沈殿 と限外ろ過により濃縮 し,各 抗毒

素血清 との反応を常法27)に従って調べた.

培養細胞を用いた中和試験:分 離菌の培養上清

20μlと各抗毒素血清20μlを 混和 し,37℃ で30分 間

反応 させた後,混 合液10μlをVero細 胞 とともに

培養 し,培 養細胞のカラーチェソジ法28)により細

胞の生存を判定 した.

bead-ELISAに よる毒素の定量:培 養上清中の

毒素量 と菌体内に存在す る毒素量を高感度bead-

ELISA29)に より定量した.す なわち,分 離菌を2ml

のtryptic soy broth (Difco)を 含む小試験管で

37℃16時 間振盗培養後,遠 心分離により上清と菌

体に分離 した.菌 体は遠心分離後,培 養上清と同

量のTris-HCI緩 衝液に懸濁 し,ポ リミキシンB

と超音波により処理 した後,さ らに遠心分離を行

い,上 清を採取 し,菌 体内に存在する毒素の定量

に用いた.

結 果

(1)集 団下痢症の発生状況

1986年6月10日 から23日 にかけて,松 山市内の

某乳児院(乳 幼児数23名)で,集 団下痢症が発生

した.発 症 した乳幼児数は,22名(年 齢1ヵ 月～33

ヵ月)で,5名 が入院した.1名 の患者(年 齢33

ヵ月)は,溶 血性尿毒症症候群(hemolytic uremic

syndrome,HUS)を 続発 し,2週 間後に死亡 した.

なお,乳 児院の職員には,発症者は認め られなかっ

た.

患者の発生状況を図1に 示 した.6月10日 に2

名の初発患者が見 られた.17日 に最も多 くの患者

が発生 し,そ の後減少 した.最 後の患者の発生は,

23日 であった.初 発患者か ら最後の患者の発生ま

での期間は,2週 間で,長 期にわたっていた.

患者の主要症状を表1に 示 した.下 痢は,す べ

ての患者に認め られた.血 便は,22名 中9名 の患

者に認められ,他 の患者の便性は,水 様便,粘 液

便,軟 便であった.発 熱が見 られた患者は,22名

中5名 と比較的少数であった.嘔 吐は,HUSを 続

Fig. 1 Date of the onset of the illness

Table 1 Main clinical symptoms of the patients

* Total number of the patients: 22

発 した1名 の患者にのみ認められた.

(2)病 原菌の検索結果

糞便を採取す ることのできた患者15名 の うち7

名より,表2に 示 したようなすべて同一の生化学

的性状を示す菌を分離 した.こ れらの分離菌は生

化学的性状ならびに大腸菌抗血清を用いた血清学

的性状により大腸菌0111:H-と 同定した.検 査

対象としたその他の腸管感染症原因細菌およびウ

イルスは検出されなかった.表3に 分離菌7株 の

薬剤感受性試験の結果を示 した.cephaloridineに

比較的耐性株が1株,streptomycinに 比較的耐性

株が6株,enoxacinに 比較的耐性株が4株 認め ら

れたが,他 はすべて感受性であった.

(3)培 養上清の生物学的性状

分離した7株 の大腸菌0111:H-の 産生す る毒

素の生物学的性状を表4に 示 した.分 離 したすべ

ての菌株の培養上清は,Vero細 胞に対し,細 胞の

膨化 お よび破 壊を示 した.Vero細 胞 のほか,

MA104に 対して も同様 な変性を示 したが,HeLa

平成元年10月20日

1190 田中 博 他

Table 2 Biochemical characteristics of E. coli

0111: H-strains isolated from the patients

+: positive after l day

+2: positive after 2 days

Table 3 Sensitivity of the isolated E. coli 0111:

H- strains against various antibiotics

+,++,+++:Degree of the sensitivity

細胞やCHO細 胞 には細胞変性を示 さなかった.一方

,培 養上清をマウスの腹腔内に投与 したとこ

ろ,マ ウスは3～4日 後 に死亡 した.も っとも致

死活性の強かったEVT-3株 の培養上清では,512

倍希釈液の投与によってもマウスは死亡した.ま

た,培 養上清を60℃ で30分 間加熱処理しても,マ

ウス致死活性は失活 しなかったが,80℃,10分 間

Table 4 Biological assay of a toxin produced

by the isolated E. coli O111: H- strains

の処理では失活した.さ らに,EVT-3株 の培養上

清について,ウ サギ結紮腸管ループ試験を行 った

ところ,2ml/cmの 液体の貯留を認めた.

以上の結果から,分 離 した7株 のE.coli O111:

H-は,Vero毒 素を産生していると考えた.

(4)Vero毒 素の免疫学的性状

7株 の分離株の うち1株(EVT-3株)に ついて,

培養上清のマウス致死活性が,抗 志賀毒素血清,

抗VT1血 清,抗VT2血 清によって中和 され るか

どうかを調べた結果,抗 志賀毒素血清お よび抗

VT1血 清によっては致死活性が中和されず,マ ウ

スは死亡 した.し かし,抗VT2血 清では毒素の致

死活性が中和され,マ ウスは生存 した.

Ouchterlonyの ゲル内沈降反応 においても,図

2に 示 したように,EVT-4株,EVT-5株,EVT-17

株,EVT-19株,EVT-20株,EVT上21株 の培養上清

を濃縮 した抗原は,抗VT2血 清 と反応 した.し か

も,こ れ ら抗原 と抗VT2血 清 との間に生 じた沈降

線は,精 製VT2と 抗VT2抗 原 との間に生 じた沈

降線 と完全に融合した.

一方,分 離菌3株(EVT-3株,EVT-5株,EVT

17株)の 培養上清を用いて,Vero細 胞に対す る活

性が抗毒素抗体で中和されるか どうかを調べた結

果,抗 志賀毒素血清と抗VT2血 清を混合して培善

上清に加えた場合にのみVero細 胞毒素は中和 さ

れ,Vero細 胞は生存 した.し かし,ど ちらか一方

の抗血清 と培養上清を反応 させた場合には,毒 素

活性は完全には中和 されず,細 胞は死滅 した.こ

のことから,培 養上清中には,VT1とVT2の2種

感染症学雑誌 第63巻 第10号

Vero毒 素産生性大腸菌に よる集団下痢症 の細菌学的研究 1191

Fig. 2 Ouchterlony double gel diffusion test of the culture supernatants of theisolated E. coli O111: H- strains against anti-VT2 antiserum (aVT2)

Table 5 Titration of VT1 and VT2 produced by

the isolated E. coli O111: H- strains by a bead-

ELISA

類 のVero毒 素 が 存 在 し て い る こ とが 示 唆 さ れ

た.

(5)高 感 度bead-ELISAに よ るVero毒 素 の定

量

bead-ELISAに よ る 毒 素 の定 量 試 験 の結 果 を 表

5に 示 した.7名 の 患 老 か ら分 離 さ れ た す べ て の

菌 株 は,VT1とVT2の 両 毒 素 を 産 生 して い る こ と

が 確 認 され た.毒 素 の 産 生 量 は,VT2がVT1よ り

多 く,VT1の 約10倍 で あ った.ま た,培 養 上 清 中

と菌 体 内 の 毒 素 量 を比 較 した と こ ろ,VT1で は 有

意 差 が 認 め られ な か った が,VT2で は,菌 体 内 よ

り培 養 上 清 中 に3～10倍 と著 し く多 量 の 毒 素 が 産

生 され て い た(p<0.01).

考 察

1945年 にBray30)は,乳 幼 児 下 痢 症 の 患 者 か ら

E.coli O111を 分 離 報 告 した.こ の 血 清 型 に 属 す

る大 腸 菌 の病 原 因 子 は 明 確 に さ れ て い な い も の

の,そ の後 の 疫 学 調 査 に お い て,本 菌 は,下 痢 の

起 因 菌 と考 え ら れ,EPECと し て 分 類 さ れ て い

る1).し か しな が ら,E.coli O157:H7に よ る 出血

性 大 腸 炎 が 注 目を 集 め る よ うに な って 以 来,0157

以 外 に も,従 来 か らEPECに 分 類 さ れ て い た

O26,O111,O128の 血 清 型 に 属 す る大 腸 菌 もVero

毒 素 を 産 生 す る こ とが 明 らか に な っ て きた2)31).ま

た,Karmaliら32)は,HUS患 者 の 便 か ら026,

O111,O157の 血 清 型 を もつ 大 腸 菌 を 分 離 し,こ れ

らの 菌 株 がVero毒 素 を 産 生 す る こ とを 確 認 し て

い る.今 回 の 集 団 下 痢 症 事 例 に お い て は,Vero

毒 素 を 産 生 す る 大 腸 菌0111:H-の 分 離 率 は,

46.7%と 高 い値 で あ った.し か も,患 者 の 半 数 に

血 便 が み られ,患 者 の1人 にHUSが 認 め られ た.

この よ うな臨 床 症 状,毒 性 試 験,そ して上 述 した

報 告 例30)～32)などか ら考 え て,分 離 され た 大 腸 菌

O111:H-が 本 集 団 下 痢 症 の 原 因 菌 で あ った こ と

は 明 らか で あ る.伊 藤 ら13)14)は集 団 食 中 毒 事 例 の

原 因菌 と してE.coli O145:H-を 分 離 し,分 離 菌

がVero毒 素(VT2)を 産 生 す る こ とを 報 告 して い

る.し か し従 来,Vero毒 素 を 産 生 す るE.coli

O111の 集 団 下 痢 症 の 報 告 は見 当 た らず,本 症 例 は

極 め て 特 異 的 で あ り,今 後,乳 幼 児 の下 痢 症 の 原

因 菌 と して も注 意 が必 要 で あ る と思 わ れ る.

Karmaliら33)は,O26,O111に 属 す る大 腸 菌 が

VT1とVT2の 両 毒 素 を 産 生 す る こ とを 報 告 して

い る.今 回,わ れ わ れ が 分 離 したE.coli O111:

平成元年10月20日

1192 田中 博 他

H-が 産生するVero毒 素は,マ ウス致死毒性によ

る中和試験でVT2と 推察され,ゲ ル内沈降反応に

おいてもそのことが確認 された.し かし,高 感度

bead-ELISA29)に よる定量試験の結果,分 離菌は

VT2以 外にも,その1/10量 のVT1を 産生している

ことがわかった.VT1とVT2の 物理学的性状,免

疫学的性状は異なっているにもかかわらず,培 養

細胞に対す る毒性,マ ウスに対する致死毒性,ウ

サギ結紮腸管ループ試験での所見などはほぼ同じ

である26).そのため,こ れらの生物学的性状だけで

毒素を同定することは困難である.今 回の分離菌

のように,2種 類のVero毒 素を同時に産生 して

いて,し かも一方の産生量が極めて少量の場合に

は,マ ウス致死毒性による中和試験のような単一

な中和試験だけでは明確な結果を得 ることができ

ず,Vero細 胞 を用いた中和試験や感度 の高い

bead-ELISAな どを併用す る必要性が示唆 され

た.

北米における出血性大腸炎では,ハ ンバーガー

が原因食品となっている事例が多い3)4).今回の事

例では,感 染源究明の調査は行われず,感 染源を

明確にす ることはできなかった.し かし,患 者の

発生が断続的で,初 発患者の発生から最後の患者

の発生まで14日 間 と長期にわたっていること,ミ

ルク栄養のみの乳児 も発症 していることなどか

ら,食 物を媒介 とした単一暴露によるものではな

く,ヒ ト(乳 幼児)か らヒ ト(乳 幼児)へ の感染

もあった ものと考えられる.

稿を終えるにあたり,検体の採取,臨 床症状の調査等に

御協力を賜った愛媛県立中央病院小児科の高山有道先生,

松本修平先生に感謝します.

文 献

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平成元年10月20日

1194 田中 博 他

Bacteriological Investigation on an Outbreak of Acute Enteritis associated withVerotoxin-producing Escherichia coli O111:H-

Hiroshi TANAKA*, Mitsuaki OHSETO, Yasutaka YAMASHITA,

Nobuyuki SHINOHARA & Hiroo INOUE

Ehime Prefectural Institute of Public Health

(*Present address: Iyo Public Health Center, Ehime)Yoshitada SASAKI & Yoshitoshi KAKIHARA

Ehime Prefectural Central Hospital

Teizo TSUKAMOTO

Osaka Prefectural Institute of Public Health

Takashi YUTSUDO, Yuichi OKU & Yoshifumi TAKEDA

The Institute of Medical Seience, The University of Tokyo

An outbreak of acute enteritis in children aged one to thirty-three months occurred from June 10thto 23rd, 1986, at a private orphanage in Matsuyama City. Twenty-two out of 23 children suffered fromdiarrhea. Nine of the 22 children excreted bloody stool. Fever and vomiting were observed with a few

patients. One of them, a 33-month-old girl, developed hemolytic uremic syndrome, and died twelvedays after the admission.

Escherichia coli O111:H- was isolated from fecal specimens of 7 out of 15 patients. The culturefiltrate of the isolate caused fluid accumulation in ligated ileal loops in a rabbit, and was lethal to mice.

It wa found that all isolates produced two kinds of Vero toxins (VT1 and VT2, or shiga-like toxin Iand II). The amount of VT2 produced in vitro was about 10 times more than that of VT1.

感染症学雑誌 第63巻 第10号