vii. resultados y discusiÓn. 7.1. concentraciÓn mÍnima...
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VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
7.1. CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) PARA Escherichia coli .
A continuación, se muestran los efectos de las concentraciones de
extracto de ajo empleadas para la determinación de la CMI de Escherichia
coli, se realizaron las pruebas de disco con las respectivas concentraciones
de extracto de ajo utilizando etanol como solvente. La zona de inhibición se
obtiene por la diferencia de diámetro (in) de papel Whatman impregnado de
extracto de ajo con el diámetro de inhibición (in) marcado en cada uno de
los agares.
Estas concentraciones son aquéllas a las que se obtuvieron zonas de
inhibición detectables y medibles, después de 24 horas de incubación a
36ºC. Se realizaron controles utilizando únicamente etanol en el disco,
resaltando que, para todos los casos, no se detectó zona de inhibición.
En la tabla VIII, se reportan los valores promedio de diámetro de la
zona de inhibición, en agar EMB, con estos datos se elaboró la gráfica
para la determinación de CMI (Figura 2).
Como era de esperarse, al aumentar la concentración de ajo en
el extracto, la zona de inhibición aumenta.
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Tabla VIII . CMI-Valores promedio zona de inhibición. Agar EMB. Escherichia coli.
Agar EMB Concentración(g ajo/ml) Zona-papel (in)
1 4.5085 0.5 1.9558 0.33 1.8478 0.25 1.1811
Agar EMB
00.5
11.5
22.5
33.5
44.5
5
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2concentración (gr/ml)
zona
-pap
el (i
n)
Fig. 2. CMI-Valores promedio zona de inhibición en Agar EMB para Escherichia coli.
En la tabla IX, se reportan los valores promedio de la zona de
inhibición, en agar CASO, datos con los que se elaboró la gráfica para la
determinación de CMI (Figura 3).
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Al igual que en el caso anterior (agar EMB), al aumentar la
concentración de ajo en el extracto, la zona de inhibición aumenta.
Tabla IX. CMI-Valores promedio zona de inhibición. Agar CASO.Escherichia coli. Agar CASO
Concentración Zona-papel (in) 1 6.0325
0.5 0.9144 0.33 0.6096 0.25 0.4064
Agar CASO
0
1
2
3
4
5
6
7
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2concentración(gr/ml)
zona
-pap
el (i
n)
Fig. 3. CMI-Valores promedio zona de inhibición. Agar CASO. Escherichia coli. Los resultados muestran que la concentración más pequeña, a la
que se obtiene una zona de inhibición es 0.25 g ajo/ml etanol, es a ésta a la
que se le denominará CMI para Escherichia coli.
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7.2. DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN MÍNIMA
LETAL (CML), PARA ESCHERICHIA COLI.
Para la determinación de la CML, se realizaron diluciones de los
extractos de ajo obtenidos con agua como disolvente. Se realizó el conteo
de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/ml), después de 24
horas de incubación a 36ºC.
En la tabla X, se reportan los valores promedio de Unidades
Formadoras de Colonias por mililitro, para la elaboración de la gráfica para
la determinación de CML (Figura 4).
Tabla X. Concentración- valores promedio UFC/ml. CML E.coli.
Concentración UFC/ml 0.25 0 0.125 285130
0.0625 453000 0.025 571330
0.0125 151200 0.0025 1176000 0.00125 5040000
0.000625 5544000 0.00025 2688000
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Concentración mínima letal E.Coli
0100000020000003000000400000050000006000000
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3concentración (gr/ml)
UFC
/ml
Fig. 4. Concentración- valores promedio UFC/ml. Determinación CML E.coli. Se encuentra que la Concentración de 0.25g ajo/ml agua, es la
concentración a la cual no se observa crecimiento microbiano, por lo cual,
se le denominará como Concentración Mínima Letal.
Las sucesivas diluciones, tras 24 horas de incubación a 36ºC,
muestran un crecimiento bacteriano considerable, lo que indica, que el
extracto de ajo obtenido con agua como disolvente, muestra una alta
efectividad a concentraciones mayores.
A fin de comparar estos resultados, es necesario realizar el análisis
de la respuesta en escala logarítmica, basado en la población bacteriana
inicial y el número de microorganismos sobrevivientes (Tabla XI, Figura 5).
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Tabla XI. Concentración – crecimiento logarítmico para E. Coli.
Concentración log(N/No) 0.25 0 0.125 0.404178
0.0625 0.605228 0.025 0.70602
0.0125 0.128682 0.0025 1.019537 0.00125 1.65156
0.000625 1.6929 0.00025 1.378559
Concentración mínima letal E. coli vs log(N/No)
0
0.5
1
1.5
2
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3concentración (gr/ml)
log(
N/N
o)
Fig. 5. Concentración – crecimiento logarítmico para E. Coli. Se observa que una concentración de 0.25g de ajo/ml agua, tiene
un efecto letal sobre el crecimiento de Escherichia coli, pues no se
detectaron sobrevivientes. Concentraciones superiores a 0.0125g ajo/ml
agua, tienen un efecto inhibitorio pues el número de sobrevivientes es
menor al inicial, sin embargo, se observa que concentraciones menores no
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tienen efecto y promueven el crecimiento bacteriano, resultando en
poblaciones mayores a las iniciales.
7.3. DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN MÍNIMA
INHIBITORIA (CMI) PARA Listeria innocua.
A continuación, se muestran las concentraciones empleadas para la
determinación de la CMI para Listeria innocua, se realizaron las pruebas
de disco con las respectivas concentraciones de extracto de ajo utilizando
etanol como solvente. Estas concentraciones son aquellas a las que se
obtuvieron zonas de inhibición detectables y medibles, después de 24 horas
de incubación a 36ºC. De la misma manera, se realizaron controles en lo
que se utilizó sólo etanol en el disco, detectando una nula zona de
inhibición.
En la tabla XII, se reportan los valores promedio de diámetro de
zona de inhibición en agar CASO, utilizados para la elaboración de la
gráfica para la determinación de CMI de Listeria innocua (Figura 6).
Se observa que las concentraciones mayores proporcionan una
zona de inhibición mayor.
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Tabla XII. Inhibición-diámetro zona de Inhibición. CMI para L.innocua. Concentración zona-papel(in)
0.25 2.9972 0.33 3.53695 0.5 2.66065 1 3.937
Agar CASOY Listeria innocua
00.5
11.5
22.5
33.5
44.5
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2concentración (gr/ml)
zona
-pap
el(in
)
Fig. 6. Inhibición-diámetro zona de Inhibición. CMI para L.innocua.
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7.4. DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN MÍNIMA LETAL
(CML) PARA Listeria innocua.
Para la determinación de la CML, se realizaron diluciones de los
extractos de ajo obtenidos con agua como disolvente. Se realizó el conteo
de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/ml), después de 24
horas de incubación a 36ºC.
Para la elaboración de la gráfica, se utilizan los valores promedio
de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (Figura 7).
Tabla XIII. Concentración-UFC/ml promedio. Determinación de CMI, Listeria innocua.
concentración UFC/ml 0 3544800
0.0003125 2898000 0.000625 2066400 0.00125 2083200
0.003125 2352000 0.00625 1478400 0.0125 1092000 0.03125 1848033 0.0625 588000 0.125 436800
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Concentración mínima letal Listeria innocua
0500000
1000000150000020000002500000300000035000004000000
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14concentración (gr/ml)
UFC
/ml
Fig.7. Concentración-UFC/ml promedio. Determinación de CMI, Listeria innocua. La concentración a la que se encuentra que existe un crecimiento
bacteriano menor es a 0.125 g/ml. Esta concentración, es a la que se
denominará como Concentración Mínima Letal.
Las sucesivas diluciones muestran un crecimiento bacteriano
significativo.
Es necesario realizar el análisis de la respuesta en escala logarítmica,
basada en el número inicial de microorganismos y el número de
sobrevivientes. (Tabla XIV, Figura 8).
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Tabla XIV. Concentración-log(N/No). Determinación de CMI, Listeria innocua.
Concentración log(N/No) 0 0
0.0003125 -8.75E-02 0.000625 -0.2344 0.00125 -0.2308 0.003125 -0.1782 0.00625 -0.3798 0.0125 -0.5113
0.03125 -0.2828 0.0625 -0.7802 0.125 -0.9093
Concentración mínima letal L.innocua vs log(N/No)
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14
concentración(gr/ml)
log(
N/N
o)
Fig. 8. Concentración- crecimiento logarítmico para Listeria innocua.
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7.5.COMPARACIÓN DE CONCENTRACIONES MÍNIMAS
LETALES PARA CADA UNO DE LOS MICROORGANISMOS.
Se considera necesario realizar una comparación entre las
CML para cada uno de los microorganismos estudiados.
Concentración mínima letal comparativa
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
0 0.1 0.2 0.3
concentración
log(
N/N
o)
Listeria innocuaEscherichia coli
Fig. 9. Comparación de CML para cada uno de los microorganismos.
En la Figura 9, se observa que la CMLde Escherichia coli ,es mayor que la
CML de Listeria innocua. Esto se debe a que se trata de bacterias Gram
negativa y Gram positiva respectivamente. Cada una de ellas posee una
sensibilidad al extracto de ajo diferente.
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7.6.ESTUDIO DE TIEMPO DE EXPOSICIÓN CONTRA UFC/ML
SOBREVIVIENTES. ESCHERICHIA COLI.
Con el fin de comprobar que la CML encontrada para
Escherichia coli, es la adecuada, se realizó un análisis de CML en
función del tiempo de exposición, efectuando los correspondientes
conteos de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro. Los conteos
se realizaron por 72 horas.
En la Tabla XV, se reportan los valores promedio de Unidades
Formadoras de Colonias por mililitro, para cada uno de los tiempos de
exposición (Figura 10).
Tabla XV. CML-tiempo de exposición. UFC/ml (promedio) Escherichia coli.
exposición (min) 1día 2 día 3 día 0 0 151200 420000
15 0 3633.33 233450 30 0 75600 378000 45 0 25550 172000 60 0 700 151200 90 0 400 302400 120 0 1300 126000 150 0 400 52750 180 0 0 201600 240 0 0 100800 300 0 200 800
50
Conc.min.letal E. coli vs tiempo exposición
0
100000
200000
300000
400000
500000
0 15 30 45 60 90 120 150 180 240 300tiempo exposicion (min)
UFC
/ml 24 hrs
48 hrs72 hrs
Figura 10. CML de Escherichia coli respecto al tiempo de exposición. Se observa que los tiempos cortos de exposición, resultan poco
efectivos para evitar el crecimiento bacteriano. Los mejores resultados se
obtienen en los tiempos largos de exposición. Con el fin de comprobar estos
resultados, se prolongan los tiempos de observación; los cuales al
incrementarse muestran un crecimiento bacteriano significativo.
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7.7. ESTUDIO DE TIEMPO DE EXPOSICIÓN CONTRA UFC/ML
SOBREVIVIENTES. LISTERIA INNOCUA.
Tomando a la CML encontrada, se recurre al estudio de Tiempo de
Exposición, realizando los conteos de Unidades Formadoras de Colonias
por mililitro correspondientes.
Para Listeria innocua, el estudio de Tiempo de Exposición, se
llevó a cabo con la CML de 0.125 g/ml, realizando los conteos por 72 horas
El estudio de Tiempo de Exposición, se prolongó con el fin de
comprobar la efectividad de la CML, los conteos de UFC/ml por 120 horas
(Tabla XVI).
Tabla XVI. CML- Tiempo de exposición, valores promedio.120 horas. Listeria innocua.
24 horas 48 horas 72 horas 96 horas 120 horas final tiempo (min) caja #m.o #m.o #m.o #m.o #m.o ufc/ml
480 a 0 0 41 91 211 21100 b 0 0 1 85 185 18500 c 0 0 0 7560 16128 1612800
510 a 0 0 2 11 42 4200 b 0 0 2 73 223 22300 c 0 X X X X X
540 a 0 0 10 28 148 14800 b 0 0 54 104 214 21400 c 0 0 0 46 96 9600
570 a 0 0 70 10080 12600 1260000 b 0 0 0 21 45 4500 c 0 2 30 4032 4032 403200
600 a 0 0 0 10080 10080 1008000 b 0 0 50 6048 10080 1008000 c 0 0 29 5040 7560 756000
630 a 0 0 51 161 261 26100 b 0 0 29 149 199 19900 c 0 0 25 65 75 7500
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660 a 0 0 0 5040 10080 1008000 b 0 3 73 103 153 15300 c 0 0 40 12600 20160 2016000
690 a 0 0 0 15120 22680 2268000 b 0 0 0 17640 20160 2016000 c 0 X X X X X
X=contaminada
Conc. min. letal L.innocua vs tiempo de exposición
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
480 510 540 570 600 630 660 690Tiempo exposición (min)
UFC
/ml
24 horas48 horas72 horas96 horas120 horas
Fig. 11. CML para Listeria innocua respecto al tiempo de exposición. Se observa que la CML para Listeria innocua, muestra una alta
efectividad para tiempos de exposición largos y para las primeras 48 horas
de observaciones. Al prolongar el tiempo de observaciones, se encuentra
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que hay un crecimiento bacteriano significativo que comprueba que el
extracto de ajo a la concentración seleccionada como CML, funciona como
agente bacteriostático.
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