1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------

Vƣơng Diệu Linh

NGHIÊN CỨU HIỆN TƢỢNG METHYL HÓA Ở GEN

GSTP1 LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƢ TIỀN LIỆT TUYẾN

Ở BỆNH NHÂN VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60420121

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2017

2

Công trình được hoàn thành tại : Trường Đại học Khoa học tự

nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Võ Thị Thương Lan

Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm

luận án tiến sĩ họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi

giờ ngày tháng năm 20...

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam;

- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

3

ĐẶT VẤN ĐỀ

Di truyền ngoại gen là thông tin di truyền qui định bởi cách

thức methyl hóa DNA và biến đổi histone. Thay đổi mức độ methyl

hóa DNA tham gia kiểm soát tiêu cực, kìm hãm hoạt động của gen.

Do đó mức độ DNA bị methyl hóa trở thành dấu chuẩn phân tử đầy

tiềm năng trong chẩn đoán, tiên lượng và điều trị ung thư.

Ung thư tuyến tiền liệt là ung thư phổ biến, có tỷ lệ tử vong

cao ở nam giới. Methyl hóa DNA tăng cao ở một số gen trong

UTTTL, trong đó, gen được nghiên cứu nhiều nhất là GSTP1 (π-

class glutathione S-transferase gene) mã cho enzym tham gia khử

các độc tố gây ung thư. Ở Việt Nam, nghiên cứu cơ bản về methyl

hóa DNA mới được triển khai. Nghiên cứu và phát triển thế hệ dấu

chuẩn di truyền ngoại gen hỗ trợ chẩn đoán sớm, tiên lượng đúng và

điều trị đích chính xác là nhiệm vụ bất khả kháng của sinh y học hiện

đại. Với những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu

hiện tượng methyl hóa ở gen GSTP1 liên quan ung thư tuyến tiền

liệt ở bệnh nhân Việt Nam” với mục đích:

- Phân tích mức độ methyl hóa promoter GSTP1ở bệnh nhân ung thư

tuyến tiền liệt/phì đại tuyến người Việt Nam,

- Xác định mối tương quan giữa mức độ methyl hóa promoter

GSTP1 với các đặc điểm mô bệnh học, từ đó hoàn thiện kỹ thuật

phát hiện sự methyl hóa làm tiền đề để phát triển bộ sinh phẩm sử

dụng dấu chuẩn methyl hóa GSTP1 để hỗ trợ chẩn đoán UTTTL.

Đóng góp và ý nghĩa thực tiễn của luận án: Lần đầu tiên xây dựng

và tối ưu được điều kiện phản ứng MS-PCR để phát hiện promoter

GSTP1 bị methyl hóa ở bệnh nhân UTTTL và PĐT người Việt Nam;

Tỷ lệ methyl hóa promoter GSTP1 ở bệnh nhân UT/PĐT người Việt

Nam chiếm 66,1 % và 10,8 %. Sự sai khác có ý nghĩa giữa methyl

hóa promoter GSTP1 với UT/PĐT; giữa methyl hóa promoter

GSTP1 với phân độ Gleason; Bước đầu hoàn thiện các tiêu chuẩn cơ

sở của bộ sinh phẩm phát hiện methyl hóa promoter GSTP1; kết hợp

4

MS-PCR với lai điểm để tăng độ nhạy và đảm bảo độ chính xác phát

hiện sản phẩm GSTP1 bị methyl hóa.

Giới thiệu luận án: Luận án gồm 109 trang (3 chương): Đặt vấn đề 3

trang, chương 1 (tổng quan) 28 trang, chương 2 (vật liệu, phương

pháp) 18 trang, chương 3 (kết quả thảo luận) 38 trang, kết luận- kiến

nghị 2 trang. Luận án có 39 hình, 13 bảng, 148 tài liệu tham khảo (3

tiếng việt, 136 tiếng anh, 9 trang web).

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Ung thƣ 1.1.1. Thực trạng ung thƣ

Theo WHO, ước tính đến năm 2030 khả năng mắc UT mới

mỗi năm khoảng 27 triệu người, 17 triệu người chết vì UT. Việt Nam

có khoảng 110000 người mắc UT mới trong đó khoảng 82000 người

tử vong do UT mỗi năm, chiếm tới 73,5 % tổng số bệnh nhân UT.

1.1.2. Cơ sở tế bào học ung thư

Sáu đặc điểm cơ bản của tế bào UT: duy trì tín hiệu tăng sinh,

trốn tránh các yếu tố ức chế khối u, chống lại apotosis, nhân lên bất

tử, cảm ứng tăng sinh mạch máu, xâm lấn và di căn.

1.1.3. Di truyền học ung thư

Các gen liên quan đến sự hình thành tế bào ác tính và phát

triển khối u được phân thành hai nhóm chính là gen ức chế khối u và

gen gây ung thư.

1.2. Di truyền ngoại gen và ung thƣ 1.2.1. Biến đổi histone trong ung thư

Trong các dạng biến đổi, acetyl hóa và methyl hóa là phổ biến

nhất và liên quan tới ung thư.

1.2.2. Methyl hóa DNA bất thường trong ung thư

Methyl hóa DNA là hiện tượng gắn thêm gốc methyl vào

nucleotide trên phân tử DNA. Methyl hóa DNA dưới mức trong UT

xảy ra tại các trình tự lặp lại, yếu tố vận động Alu hay LINE1, vùng

DNA vệ tinh α gần tâm động. Methyl hóa quá mức vùng promoter là

5

gây bất hoạt các gen ức chế khối u và mức độ methyl hóa của mỗi

gen trong từng loại ut cũng khác nhau.

1.3. Methyl hóa DNA trong UTTTL 1.3.1. Phân độ trong ung thư tuyến tiền liệt

Hệ thống phân loại Gleason được xem như tiêu chuẩn vàng

cho phân chia các giai đoạn của UTTTL, gồm hai giá trị: độ Gleason

và điểm Gleason.

1.3.2. Methyl hóa DNA trong ung thư tuyến tiền liệt

Hơn 30 gen bị methyl hóa bất thường trong UTTTL, trong đó

methyl hóa promoter gen GSTP1 là phổ biến và rộng rãi nhất.

Methyl hóa GSTP1 có nhiều tiềm năng để phát triển thành dấu chuẩn

hỗ trợ tiên lượng UTTTL.

1.4. Phƣơng pháp phân tích methyl hóa DNA 1.4.1. Phương pháp COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis)

Khi DNA xử lý với bisulfite, các cytosine không bị methyl sẽ

biến đổi thành uracil, sau phản ứng PCR, uracil thành thymine. Sự

thay đổi nucleotide này có thể làm xuất hiện hoặc mất đi vị trí nhận

biết của enzyme giới hạn.

1.4.2. Phương pháp PCR đặc hiệu methyl MS-PCR (Methylation specific Polymerase chain reaction)

MS-PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu thiết kế dựa vào vùng

giàu CpG cho phép phân biệt DNA bị methyl hóa với DNA không

methyl hóa. Kết hợp hai kỹ thuật MS-PCR với lai điểm cho phép

định lượng các cytosine bị methyl hóa không cần điện di.

1.4.3. Phương pháp định lượng qMS-PCR

Để tăng tính chính xác, hạn chế dương tính giả, TaqMan và

các mồi kết hợp với đầu dò được xây dựng và hoàn thiện, trong đó

MethylLight và HeavyLight là hai kỹ thuật định lượng phổ biến.

6

1.5. Dấu chuẩn sinh học hỗ trợ chẩn đoán, tiên lƣợng ung thƣ 1.5.1. Dấu chuẩn sinh học sử dụng cho ung thư

Dấu chuẩn sinh học hỗ trợ chẩn đoán, tiên lượng ung thư đang

được đặc biệt quan tâm và áp dụng phổ biến: dấu chuẩn DNA, dấu

chuẩn RNA và dấu chuẩn protein.

1.5.2. Dấu chuẩn sinh học sử dụng cho ung thư tuyến tiền liệt

PSA (kháng nguyên đặc hiệu của tuyến tiền liệt) là dấu chuẩn

sinh học phổ biến, ngoài ra còn có alpha-methylacyl CoA racemase

(AMACR), kháng nguyên màng đặc hiệu tuyến tiền liệt (PSMA),

protein 3 giàu cystein, Chromogranin A, PCA3…

1.5.3. Triển vọng các bộ kit sử dụng dấu chuẩn methyl hóa DNA

Epi prolung ử dụng dấu chuẩn methyl hóa gen SHOX2 chẩn

đoám sớm ung thư phổi. Epiprocolon dựa trên dấu chuẩn methyl hóa

SEPT9 chẩn đoán sớm ung thư đại tràng. ConfirmMDx phân tích

methyl hóa quá mức trên 3 gen GSTP1, APC và RASSF1A nhằm hạn

chế những trường hợp sinh thiết không cần thiết trong UTTTL.

1.6. Nghiên cứu methyl hóa DNA trong ung thƣ ở Việt Nam

Nghiên cứu của Trinh HT cho thấy 87,5 % mẫu UT đại trực

tràng có sự methyl hóa quá mức ở gen ức chế khối u APC. Tran THT

và cs.; Le NQ và cs. phát hiện tỷ lệ methyl hóa gen ER tương ứng ở

26/28 (92,9 %) và 21/24 (87,5 %) bệnh phẩm UT vú. Vi Thuật

Thắng và cs. nhận thấy 11/20 (55 %) mẫu UT và 2/10 (20 %) mẫu

PĐTTL có RASSF1A bị methyl hóa. Phân tích methyl hóa DNA trên

từng gen riêng rẽ hay phân tích kết hợp sự methyl hóa đồng thời

nhiều gen đối với UT còn rất ít. Vo LT và cs. phân tích đồng thời các

dấu chuẩn methyl hóa trên gen BRCA1, RASSF1A và ER ở các bệnh

nhân UT buồng trứng với tỷ lệ methyl hóa lần lượt là 11/59 (18,6 %)

ở gen BRCA1, 40/59 (67,8 %) ở gen RASSF1A và 15/59 (25,4 %) ở

gen ER. Tác giả cũng chỉ ra 45/59 (78 %) các bệnh nhân bị methyl

hóa quá mức ít nhất một trong ba gen này. Ở Việt Nam, chưa có

công bố nào phân tích sự methyl hóa GSTP1 trong ung thư tuyến tiền

7

liệt. Như vậy, phân tích dấu chuẩn di truyền ngoại gen và dấu chuẩn

methyl hóa GSTP1 nói riêng vẫn là một lĩnh vực mới ở Việt Nam.

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

96 mẫu bệnh phẩm TTL, dòng tế bào PC3, mẫu máu, các

nguyên vật liệu và hóa chất sinh học phân tử.

2.2. Thiết bị chính

Các thiết bị chuyên dụng cho sinh học phân tử.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

- Chuẩn bị mẫu để tách chiết DNA

- Nuôi cấy dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3

- Tách chiết DNA tổng số

- Xử lý DNA tổng số với bisulfite

- Tách dòng

- Phương pháp PCR

- Phương pháp lai điểm

- Phương pháp điện di

- Xác định nồng độ DNA bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ

- Tinh sạch sản phẩm PCR

- Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng MS-PCR

- Xử lý kết quả bằng thống kê sinh học

- Xác định số bản copy

2.4. Sơ đồ thí nghiệm

Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm.

8

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thu thập và phân loại mẫu

96 mẫu bệnh phẩm TTL đúc paraffin (59 mẫu UT và 37 mẫu

PĐT), được thu thập tại Bệnh viện K Hà Nội. Mẫu máu người khỏe

mạnh chống đông với heparin, cung cấp bởi Viện Huyết học và

Truyền máu Trung ương. Tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 được

nuôi cấy trong môi trường đặc hiệu.

3.2. Tách chiết DNA tổng số

3.2.1. Tách chiết DNA từ mẫu máu và dòng tế bào nuôi cấy PC3

Hình 3.3. (A) Kết quả điện di DNA tổng số tách từ máu (P1) và từ dòng tế

bào PC3 (P2) trên gel agarose 1 %. (B) Kết quả xác định nồng độ DNA

bằng phương pháp đo độ hấp thụ.

Băng DNA tổng số sáng, rõ nét chứng tỏ DNA tách được đạt

chất lượng tốt. Tỷ lệ A260/A280 của các mẫu DNA đạt giá trị 1,8 - 2,0

chứng tỏ DNA có độ tinh sạch đạt yêu cầu.

3.2.2. Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm đúc paraffin

DNA tổng số được tách chiết từ 20 lát cắt/mẫu của 96 mẫu

TTL bằng kit QIAamp DNA FFPE Tissue kit (Qiagen). Mẫu đúc

9

paraffin có nồng độ DNA thấp, bị đứt gãy và lẫn nhiều tạp chất nên

điện di và xác định nồng độ bằng phương pháp đo độ hấp thụ không

chính xác. Trong nghiên cứu, 5 ng và 25 ng DNA tổng số tách từ

dòng tế bào PC3 và 1 µl DNA tổng số mẫu đúc được sử dụng làm

khuôn trong phản ứng PCR để khuếch đại trình tự 268 bp của gen

đơn bản quản gia β-globin để đánh giá lượng DNA tách từ mẫu bệnh

phẩm. Kết quả cho thấy 1 µl DNA tách từ các mẫu đúc có ít nhất 5

ng và hầu hết DNA tách từ mẫu đúc đảm bảo số lượng theo yêu cầu

của kit xử lý bisulfite.

Hình 3.4. (A) Kết quả điện di minh họa DNA tổng số tách từ mẫu đúc nến

UT (P1-P4) và PĐT (B1-B4) trên gel agarose 1 %. (B) Kết quả xác định

nồng độ DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ.

Hình 3.5. Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % minh họa sản phẩm PCR

khuếch đại gen β-globin.

10

3.3. Xử lý DNA tổng số với bisulfite 3.3.1. Đánh giá chất lượng DNA sau xử lý bisulfite

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen β-globin với cặp

mồi đặc hiệu cho DNA không xử lý bisulfite (A) và cho DNA sau xử lý (B)

trên gel acrylamide 8 %.

Quá trình xử lý yêu cầu: (1) DNA được xử lý hoàn toàn đảm bảo không còn DNA nguyên gốc và (2) DNA thu hồi sau xử lý đảm bảo đủ lượng khuôn cho phản ứng MS-PCR. Để đánh giá XL bisulfite xảy ra hoàn toàn, DNA sau XL được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi gen β-globin, cặp mồi đặc hiệu với DNA không XL bisulfite. Gen β-globin không bị methyl hóa nên trình tự nucleotide sau khi XL bisulfite sẽ có tất cả C biến đổi thành U. Do đó, cặp mồi được thiết kế theo trình tự DNA gốc không thể bắt cặp với DNA đã bị XL. Vì vậy nếu quá trình XL xảy ra hoàn toàn thì không có sản phẩm PCR. Ngược lại, những mẫu DNA không được xử lý hết sẽ xuất hiện băng DNA có kích thước 268 bp. Kết quả trên Hình 3.6A cho thấy không thu được băng có kích thước 268 bp cho gen β-globin ở mẫu DNA đã qua XL bisulfite. Băng 268 bp chỉ xuất hiện với DNA không bị xử lý. Điều này chứng tỏ các mẫu DNA đã được XL hoàn toàn. Sau quá trình XL bisulfite, lượng DNA bị hao hụt nhiều do bị biến tính và chịu tác động của các hóa chất xử lý, các bước tinh sạch. Vì vậy cần kiểm tra lượng DNA sau XL có đủ làm khuôn cho phân tích MS-PCR. Quá trình kiểm tra được thực hiện bằng phản ứng PCR với cặp mồi Un – Globin được thiết kế để khuếch đại trình tự gen đơn bản β globin từ DNA đã XL (có tất cả C biến đổi thành U). Kết quả PCR được trình bày trên Hình 3.6B cho thấy băng DNA 244 bp được khuếch đại từ DNA đã XL. Hơn nữa, kết quả âm tính không có sản phẩm PCR với khuôn là DNA chưa được XL chứng tỏ tính đặc hiệu của cặp mồi Un-globin không bắt cặp nhầm với loại DNA này. Như vậy, lượng DNA sau XL đảm bảo cho phản ứng MS-PCR.

11

3.3.2. Xử lý DNA tổng số của các mẫu bệnh phẩm với bisulfite

500 ng DNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm UT/PĐT để

XL với bisulfite. Hình 3.7 minh họa DNA đã được xử lý hoàn toàn

nên không có sản phẩm PCR 268 bp trong khi băng này xuất hiện ở

DNA không xử lý.

Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR minh họa DNA được xử lý

bisulfite hoàn toàn.

3.4. Tối ƣu phản ứng MS-PCR để phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1.

Sau XL bisulfite có 2 loại DNA: DNA bị methyl hóa (mC giữ

nguyên là C) và DNA không bị methyl hóa (C biến đổi thành U).

Nguyên tắc của các cặp mồi trong kỹ thuật MS-PCR là có trình tự bổ

sung với từng loại DNA xuất hiện sau XL, nhờ đó phản ứng MS-

PCR sẽ phân biệt được 2 loại DNA này. Đầu tiên, các cặp mồi tham

khảo từ công bố quốc tế được sử dụng trong phản ứng MS-PCR với

DNA tách từ PC3 và từ máu đã được xử lý. Trong tế bào PC3,

promoter GSTP1 chỉ bị methyl hóa trên 1 allen; do đó, phản ứng

MS-PCR sẽ có sản phẩm GSTP1 bị methyl hóa và GSTP1 không bị

methyl hóa. Trong tế bào máu tất cả DNA không bị methyl hóa nên

phản ứng MS-PCR chỉ có sản phẩm GSTP1 không bị methyl hóa.

Tham khảo các nghiên cứu đã công bố, cặp mồi phát hiện methyl

hóa promoter GSTP1 được thiết kế từ vị trí -200 đến +50. Chúng tôi

thiết kế các mồi mới cho kỹ thuật MS-PCR hai vòng (nested MS-

PCR) nhằm làm giàu khuôn và tăng tính đặc hiệu cho phản ứng. Các

mồi thiết kế bao gồm: GS Me-F1/R, GS Me-F2/R khuếch đại đoạn

DNA kích thước 155 bp đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa; các mồi

12

GS Un-F1/R, GS Un-F2/R khuếch đại đoạn DNA kích thước 149 bp

đặc hiệu cho GSTP1 không bị methyl hóa.

Hình 3.8. Vị trí các mồi đặc hiệu cho phản ứng nested MS-PCR phát hiện

methyl hóa promoter gen GSTP1 do đề tài thiết kế.

Sử dụng các cặp mồi thiết kế, phản ứng nested MS-PCR được

thực hiện với DNA dòng tế bào PC3 và DNA từ mẫu máu đã được

XL bisulfite. Sản phẩm MS-PCR là băng DNA rõ nét có kích thước

155 bp đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa và băng DNA 149 bp đặc

hiệu cho GSTP1 không bị methyl hóa. Tính đặc hiệu của cặp mồi

MS-PCR cần được thể hiện ở 2 tiêu chí: (1) không khuếch đại trình

tự GSTP1 chưa XL bisulfite và (2) cặp mồi đặc hiệu cho GSTP1 bị

methyl hóa sẽ không khuếch đại nhầm GSTP1 không bị methyl hóa.

Do đó, các cặp mồi được sử dụng để khuếch đại DNA trước và sau

XL bisulfite, các loại DNA này tách từ tế bào PC3 và từ mẫu máu.

Hình 3.10 cho thấy DNA không XL cho kết quả âm tính trong phản

ứng MS-PCR, như vậy đáp ứng tiêu chí đầu tiên. Cặp mồi đặc hiệu

GSTP1 bị methyl hóa cho kết quả âm tính với DNA mẫu máu đã xử

lý có GSTP1 không bị methyl hóa, như vậy đáp ứng tiêu chí thứ hai.

Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện GSTP1 bị methyl

hóa (A) và GSTP1 không bị methyl hóa (B) trên gel acrylamide 8 %.

13

Hình 3.10. Kết quả xác định tính đặc hiệu của các cặp mồi MS-PCR phát

hiện GSTP1 không bị methyl hóa (149 bp) (A) và GSTP1 bị methyl hóa

(155 bp) (B).

3.5. Kiểm tra sản phẩm MS-PCR đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa 3.5.1. Kiểm tra sản phẩm đặc hiệu bằng phản ứng cắt với enzym giới hạn

Trình tự nucleotide promoter GSTP1 ở vùng thiết kế các mồi

MS-PCR có chứa 2 vị trí CGCG nhận biết bởi enzym giới hạn BstUI.

Khi GSTP1 bị methyl hóa thì CGCG được giữ nguyên, ngược lại sẽ

biến đổi thành TGTG. Vì vậy, sử dụng enzym giới hạn có vị trí nhận

biết chứa CG cho phép phân biệt trình tự bị methyl hóa/không bị

methyl hóa. Phản ứng cắt BstUI xảy ra theo nguyên tắc: khi cả 2 vị

trí đều bị methyl hóa thì trình tự 155 bp sẽ bị cắt tạo nên ba đoạn có

kích thước lần lượt là 90 bp, 40 bp và 25 bp. Khi chỉ có một trong

hai vị trí CGCG bị methyl hóa thì sẽ thu được tổ hợp của các đoạn có

kích thước 115 bp, 40 bp hoặc 130 bp, 25 bp. Ngược lại, nếu cả hai

vị trí nhận biết của BstUI đều không bị methyl hóa (trình tự 149 bp)

thì sẽ không có sản phẩm cắt bởi enzyme giới hạn. Kết quả trên Hình

3.11B cho thấy sản phẩm 155 bp khuếch đại từ PC3 bị methyl hóa

hoàn toàn ở 2 vị trí nhận biết của BstUI. Trong khi đó, sản phẩm 149

bp khuếch đại từ mẫu máu đặc hiệu cho GSTP1 không bị methyl hóa

đều không bị cắt ở cả hai vị trí này.

14

Hình 3.11. (A) Sơ đồ vị trí nhận biết của BstUI trên trình tự GSTP1

bị methyl hóa có kích thước 155 bp được khuếch đại trong phản ứng MS-

PCR. (B) Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR cắt với enzyme BstUI trên gel

acrylamide 10 %.

3.5.2. Kiểm tra sản phẩm MS-PCR đặc hiệu bằng giải trình tự

Sản phẩm 258 bp của promoter cùng với sản phẩm 155 bp đặc

hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa trong tế bào PC3 và sản phẩm 149

bp đặc hiệu cho GSTP1 không bị methyl hóa trong tế bào máu được

tinh sạch, được tách dòng trong plasmid và biến nạp vào tế bào vi

khuẩn E. coli DH5α. Kết quả sàng lọc trên Hình 3.12 cho thấy các

trình tự này đã được tách dòng thành công.

Plasmid gK2 mang đoạn chèn GSTP1 không XL bisulfite,

plasmid mK1 mang đoạn chèn GSTP1 bị methyl hóa, và plasmid

uK6 mang đoạn chèn GSTP1 không bị methyl hóa được xác định

trình tự. Trình tự GSTP1 khuếch đại từ DNA không XL bisulfite có

mức độ tương đồng 100 % so với trình tự GSTP1 (NC_000011.9)

trong ngân hàng dữ liệu (Hình 3.13A). Kết quả Hình 3.13B cho thấy

19 vị trí C biến đổi thành T ở trình tự GSTP1 không bị methyl hóa,

chứng tỏ XL bisulfite xảy ra hoàn toàn. Tuy nhiên trình tự GSTP1 bị

methyl hóa ở PC3 có 17 C bị methyl hóa ở phức CpG (trong khi các

C này đều bị biến đổi thành T ở trình tự GSTP1 không bị methyl hóa

của mẫu máu). Điều này chứng tỏ các C trong phức CpG bị methyl

hóa. Như vậy, các cặp mồi MS-PCR đã khuếch đại đặc hiệu và cho

phép phân biệt trình tự GSTP1 bị methyl hóa với trình tự không bị

methyl hóa.

15

Hình 3.12. Kết quả kiểm tra sự có mặt của trình tự GSTP1 không xử lý

bisulfite (A), của GSTP1 bị methyl hóa (B) và GSTP1 không bị methyl hóa

(C) trong các plasmid tái tổ hợp.

Hình 3.13. (A). Kết quả so sánh trình tự promoter gen GSTP1 với ngân hàng dữ liệu. (B). Kết quả giải trình tự trình tự GSTP1 không XL bisulfite, GSTP1 bị methyl hóa và không bị methyl hóa.

3.6. Xác định sự methyl hóa promoter gen GSTP1 ở các mẫu bệnh phẩm ung thƣ tuyến tiền liệt và phì đại tuyến

Methyl hóa GSTP1 được phân tích đối với 59 mẫu ung thư

tuyến tiền liệt và 37 mẫu phì đại tuyến.

Kết quả MS-PCR cho thấy 39/59 mẫu UTTTL và 4/37 mẫu

PĐT có GSTP1 bị methyl hóa, với tỷ lệ tương ứng 66,1 % và 10,8 %.

tỷ lệ methyl hóa GSTP1 khác nhau giữa các tộc người.

Yegnasubramanian & cs. (2004) nghiên cứu trên các bệnh nhân

UTTTL ở Mỹ phát hiện được tỷ lệ methyl hóa GSTP1 đạt 94,0 %.

16

Enokida & cs. (2005) phát hiện được sự methyl hóa GSTP1 ở 92/170

mẫu đạt 54,0 % trong 170 mẫu UTTTL của bệnh nhân Nhật Bản.

Nghiên cứu của Syeed & cs. (2010) ở bệnh nhân Ấn Độ đã phát hiện

tỷ lệ methyl hóa GSTP1 ở 29/50 trường hợp UTTTL đạt 58,0 %.

Hình 3.14. Kết quả minh họa sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa

promoter gen GSTP1 trên các mẫu bệnh phẩm tuyến tiền liệt.

Bên cạnh mẫu ung thư TTL, mẫu PĐT cũng phát hiện được

methyl hóa gen GSTP1. Trong nghiên cứu, mẫu PĐT đạt tỷ lệ

methyl hóa 10,8 %. Kết quả phù hợp với các nghiên cứu đã công bố.

Enokida & cs. (2005), Syeed & cs. (2010) phát hiện được methyl hóa

quá mức GSTP1 lần lượt ở 4/69 (5,8 %) và 12/45 (26,6 %) mẫu

PĐT. Tỷ lệ methyl hóa ở các bệnh nhân UT cao hơn rất nhiều so với

các bệnh nhân PĐT. Vì vậy, bệnh nhân TTL Việt Nam có thể sử

dụng bộ kit thương mại hỗ trợ phân biệt ung thư/phì đại tuyến tiền

liệt bằng dấu chuẩn methyl hóa GSTP1.

17

3.7. Phân tích tình trạng methyl hóa của promoter gen GSTP1 và các đặc điểm mô bệnh học

Kết quả cho thấy sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa tỷ lệ

methyl hóa GSTP1 ở mẫu UT và PĐT (p< 0.0001). Sử dụng phần

mềm thống kê sinh học Medcalc, phân tích mối tương quan giữa sự

methyl hóa GSTP1 với các đặc điểm mô bệnh học cho thấy mối

tương quan giữa methyl hóa GSTP1 với loại mẫu và phân độ

Gleason có ý nghĩa thống kê với xác suất p <0,05, đạt độ nhạy trên

90 % và độ đặc hiệu xấp xỉ 65 %. Yegnasubramanian và cs. (2004),

Yoon và cs. (2012) phân tích dấu chuẩn methyl hóa GSTP1 có độ

nhạy lần lượt là 93 % và 85 %, độ đặc hiệu lên đến 100 %. Ở bệnh

nhân gốc Mỹ, sử dụng kỹ thuật MS-PCR hoặc MS-PCR định lượng

xác định được tỷ lệ methyl hóa GSTP1 đạt tương ứng 94 % (68/73)

và 95 % (112/118). Như vậy, kết quả này hoàn toàn phù hợp với các

công bố trước đó. Tuy nhiên, sự khác biệt giữa đặc điểm này với yếu

tố tuổi bệnh nhân là ngẫu nhiên, không có ý nghĩa thống kê với p>

0,05. Kết quả này cho phép khẳng định dấu ấn methyl hóa GSTP1

đặc thù cho UTTTL, khác biệt ở các mẫu PĐT.

Hầu hết các nghiên cứu trước đây sử dụng phương pháp MS-

PCR để đánh giá tình trạng methyl hóa của các gen riêng lẻ đơn giản

và hiệu quả. Tuy vậy, phương pháp này vẫn tồn tại một vài hạn chế

như hiện tượng dương tính giả, âm tính giả hay không cho phép định

lượng hay xác định sự methyl hóa một phần đoạn trình tự nghiên

cứu. Để cải tiến độ nhạy, phương pháp MS-PCR định lượng và

pyrosequencing được phát triển, cho phép định lượng từng vị trí

methyl hóa. Như vậy, áp dụng MS-PCR định lượng hay

pyrosequencing là cần thiết để xác định chính xác từng vị trí

Cytosine bị methyl hóa của dấu chuẩn GSTP1 trong hỗ trợ chẩn đoán

và tiên lượng ung thư tuyến tiền liệt.

18

Bảng 3.1. Mối liên quan giữa đặc điểm mô học và sự methyl hóa promoter gen GSTP1 ở các mẫu ung thư tuyến tiền liệt và phì đại tuyến của bệnh nhân Việt Nam.

Hình 3.15. Đường cong ROC thể hiện mối tương quan giữa methyl hóa

promoter gen GSTP1 với loại mẫu ung thư tuyến tiền liệt/ phì đại tuyến (A),

với độ Gleason (B) và độ tuổi bệnh nhân (C).

19

3.8. Xây dựng bộ sinh phẩm phát hiện GSTP1 bị methyl hóa 3.8.1. Xác định độ nhạy phản ứng MS-PCR phát hiện GSTP1 bị methyl hóa

Để xác định độ nhạy, plasmid chuẩn được lựa chọn là plasmid

tái tổ hợp mang đoạn GSTP1 bị methyl hóa, kí hiệu là pG-Me. DNA

plasmid pG-Me tách chiết chủ yếu ở dạng siêu xoắn (Hình 3.16A).

pG-Me được cắt mở vòng với enzyme EcoRI. Sản phẩm cắt được

tinh sạch bằng kit và được xác định nồng độ thông qua giá trị A260.

DNA tổng số tách từ máu (Hình 3.16B) là DNA không bị methyl hóa

và được dùng làm đối chứng âm cho các cặp mồi phát hiện DNA bị

methyl hóa. Trong nghiên cứu này, DNA từ máu trước và sau XL

bisulfite được trộn với DNA plasmid pG-Me để tạo mẫu tương tự

DNA tách từ tế bào. 50 ng DNA tổng số chưa XL (~1500 tế bào)

hoặc 10 ng DNA đã XL được trộn với 10 copy plasmid pG-Me dạng

thẳng. Kết quả Hình 3.17 cho thấy sự có mặt của DNA tổng số tách

từ máu chưa hoặc đã bị xử lý bisulfite không làm ảnh hưởng đến độ

nhạy phát hiện 10 bản copy GSTP1 bị methyl hóa. Như vậy, sử dụng

DNA plasmid dạng thẳng làm đối chứng chuẩn thì độ nhạy phát hiện

trình tự GSTP1 bị methyl hóa đạt 10 bản copy/2000 tế bào (4000

allen) tương đương 0,3 % allen GSTP1 bị methyl hóa.

Hình 3.16. Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp pG-Me (A) và DNA tổng số

tách từ máu (B) trên gel agarose 1 %.

20

Hình 3.17. (A). Kết quả PCR xác định độ nhạy phát hiện GSTP1 từ plasmid pG-Me dạng thẳng. (B). Kết quả PCR khuếch đại GSTP1 bị methyl hóa từ các mẫu DNA khác nhau.

3.8.2. Các thành phần của bộ sinh phẩm

Tương tự bộ sinh phẩm thương mại “CpG WIZ GSTP1

Amplification Kit” phát hiện GSTP1 bị methyl hóa của Hãng

Millipore (Code 7808), chúng tôi xây dựng bộ sinh phẩm “GSTP1-

METHYL Test” gồm 3 loại DNA và các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi

loại DNA: DNA đối chứng cho GSTP1 bị methyl hóa (DNA-Me);

loại DNA đối chứng cho GSTP1 không bị methyl hóa (DNA-Un) và

loại “DNA control” dùng để kiểm tra hóa chất của phản ứng PCR.

Mỗi mẫu DNA (sau XL) có thể được thực hiện cùng với 3 cặp mồi

(GS Me, GS Un và UN-globin). Đồng thời, các DNA đối chứng

được sử dụng với các cặp mồi đặc hiệu tương ứng. DNA-Un được

khuếch đại với các cặp mồi GS Un; DNA-Me được khuếch đại với

các cặp mồi GS Me. DNA-control đối chứng dương cho gen β globin

không bị methyl hóa được khuếch đại bằng cặp mồi UN-globin. Sản

phẩm PCR được điện di trên gel acrylamide 8 %. Sự xuất hiện băng

DNA 155 bp đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa và băng DNA 149

bp đặc hiệu cho GSTP1 không bị methyl hóa. Băng DNA 244 bp đặc

hiệu cho β globin không bị methyl hóa. Đối với các mẫu bệnh phẩm

có thể thu được kết quả: (1) Mẫu chỉ có băng DNA 149 bp chứng tỏ

promoter GSTP1 không bị methyl hóa; (2) Mẫu chỉ có băng DNA

155 bp chứng tỏ promoter gen GSTP1 bị methyl hóa; (3) Mẫu có cả

hai băng 149 bp và 155 bp chứng tỏ promoter GSTP1 bị methyl hóa

trên một allen hoặc còn lẫn các tế bào lành có GSTP1 không bị

methyl hóa; (4) Mẫu DNA cho kết quả âm tính với cả hai cặp mồi

21

GS Me và GS Un cần được phân tích với cặp mồi globin UN; (5)

Mẫu cho kết quả âm tính với cả 3 loại mồi thì phải XL lại.

Hình 3.18. (A) Kết quả thử nghiệm các mẫu DNA đối chứng trong bộ sinh

phẩm “GSTP1-METHYL Test”. (B) Kết quả xác định GSTP1 bị methyl hóa

bằng bộ sinh phẩm “GSTP1-METHYL Test” trên các mẫu đại diện.

Hình 3.19. Kết quả xác định GSTP1 bị methyl hóa bằng bộ sinh phẩm thử

nghiệm ở các mẫu bệnh phẩm.

Hình 3.20. (A) Bộ sinh phẩm “GSTP1-METHYL Test” được sản xuất thử

nghiệm nhằm phát hiện GSTP1 bị methyl hóa, hỗ trợ chẩn đoán ung thư

tuyến tiền liệt. (B) Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm bảo quản ở - 20 0C sau

6 tháng.

22

3.9. Xây dựng qui trình lai điểm (dot blot) để tăng độ nhạy và độ

chính xác phát hiện sản phẩm GSTP1 bị methyl hóa từ phản ứng

MS-PCR

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng pG-Me để đánh

dấu đầu dò và xây dựng qui trình lai điểm nhằm xác định được sản

phẩm MS-PCR đặc hiệu với GSTP1 bị methyl hóa.

Hình 3.21. Đầu dò GSTP được thiết kế dựa trên trình tự GSTP1 bị methyl

hóa đã tách dòng trong plasmid tái tổ hợp pG-Me.

3.9.1 Đánh dấu đầu dò với biotin

Hình 3.22. Kết quả đánh dấu đầu dò GSTP1 với biotin.

Băng DNA tương ứng với đầu dò đánh dấu biotin P(+) có kích

thước cao hơn so với băng DNA tương ứng với đầu dò không đánh

dấu P(-), chứng tỏ đánh dấu thành công đầu dò cho quá trình lai điểm

3.9.2. Tối ưu điều kiện lai điểm

Trước tiên, chúng tôi tiến hành chuẩn hóa điều kiện khóa

màng để loại trừ các liên kết không đặc hiệu xảy ra trên màng làm

23

ảnh hưởng tới quá trình thu tín hiệu. Kết quả cho thấy điều kiện 5 sử

dụng dung dịch khóa màng U1 (Tris-HCl 1M pH 7,5; NaCl 1,5M) có

bổ sung Tween 20 cho tín hiệu rõ nhất, không có các tín hiệu nhiễu.

Tiếp đó, thay đổi nhiệt độ lai từ 50 0C đến 68

0C cho thấy ở nhiệt độ

lai 65 0C, màng lai cho tín hiệu quan sát cả P(+) và P(-) rõ nét,

không có tín hiệu nhiễu (hình 3.24)

3.9.3. Xác định tính đặc hiệu của kỹ thuật lai điểm phân biệt trình tự GSTP1 bị methyl hóa và không methyl

Để khẳng định tính đặc hiệu của đầu dò thiết kế, chúng tôi

phân biệt đoạn GSTP1 155 bp với đoạn GSTP1 149 bp. Kết quả trên

Hình 3.25 cho thấy vị trí chấm đầu dò P(+) và P(-)cho tín hiệu rõ nét

chứng tỏ quá trình đánh dấu và tương tác giữa streptavidin với biotin

tốt. Vị trí GSTP1 155 bp cho tín hiệu màu rõ ràng chứng tỏ DNA bị

methyl hóa đã lai với đầu dò. Vị trí GSTP1 149 bp không xuất hiện

tín hiệu màu chứng tỏ sau quá trình lai và rửa không có sự bắt cặp bổ

sung giữa trình tự GSTP1 không bị methyl hóa với đầu dò đặc hiệu.

24

Hình 3.25. Kết quả lai điểm phân biệt GSTP1 bị methyl hóa và GSTP1

không methyl hóa

3.9.4. Xác định độ nhạy của kỹ thuật lai điểm

Hình 3.26. Độ nhạy phát hiện GSTP1 bị methyl hóa trong lai điểm.

Kĩ thuật lai phát hiện được 10 copy đoạn GSTP1 bị methyl hóa

trong 10000 đoạn không bị methyl hóa (DNA máu). Độ nhạy của kỹ

thuật lai điểm phát hiện được 0,01 % allen bị methyl hóa. Độ nhạy

này tăng 30 lần so với khi chỉ thực hiện MS-PCR.

3.9.5. Xác định sản phẩm MS-PCR có GSTP1 bị methyl hóa từ các

mẫu ung thư tuyến tiền liệt và mẫu phì đại

Hình 3.27. Kết quả lai điểm phát hiện các sản phẩm MS-PCR có GSTP1 bị

methyl hóa từ 39 mẫu ung thư tuyến tiền liệt

Tất cả 39 vị trí của sản phẩm MS-PCR khuếch đại GSTP1 bị

methyl hóa từ các mẫu UTTTL đều cho tín hiệu rõ nét, đồng nghĩa

phát hiện được GSTP1 bị methyl hóa. Kết quả lai điểm hoàn toàn

25

phù hợp với kết quả MS-PCR. So sánh kết quả lai điểm với kết quả

điện di, chúng tôi nhận thấy kiểm tra sản phẩm MS-PCR bằng lai

điểm tiết kiệm thời gian hơn điện di do giảm thao tác chuẩn bị và

nhuộm gel. Hơn nữa, sản phẩm PCR phải đạt đủ lượng trên gel điện

di mới có thể phát hiện được bằeng phương pháp nhuộm ethidium.

Trong nghiên cứu, sản phẩm MS-PCR thường được điện di ít nhất là

7 µl mới quan sát rõ. Tuy nhiên 2 µl chấm lên màng cũng cho tín

hiệu lai rõ nét. Như vậy, lai điểm thêm một lần khuếch đại tín hiệu

phát hiện DNA đích bị methyl hóa ở những nồng độ rất nhỏ không

quan sát được bằng điện di.

Hình 3.28. (A) Kết quả lai điểm phát hiện các sản phẩm MS-PCR có

GSTP1 bị methyl hóa từ 4 mẫu phì đại tuyến tiền liệt B1-B4. (B) Sản phẩm

PCR khuếch đại trình tự 155 bp từ các mẫu phì đai tuyến B1-B4 có GSTP1

bị methyl hóa. (C) Kết quả giải trình tự sản phẩm MS-PCR từ 4 mẫu phì đại

tuyến tiền liệt B1-B4 (Đánh số các mẫu có GSTP1 bị methyl hóa theo thứ tự

như trong phụ lục 1).

Tất cả 4 vị trí của sản phẩm MS-PCR khuếch đại GSTP1 bị

methyl hóa từ các mẫu phì đại tuyến tiền liệt đều cho tín hiệu, đồng

nghĩa với việc phát hiện được GSTP1 bị methyl hóa. Tuy nhiên, tín

26

hiệu quan sát được từ các mẫu không đồng đều, gợi ý các mẫu có

mức độ methyl hóa khác nhau.

KẾT LUẬN

Với những kết quả thu được trong quá trình thực hiện luận án,

chúng tôi rút ra một số kết luận sau:

1. Thiết kế thành công các cặp mồi đặc hiệu và tối ưu thành phần,

điều kiện cho kỹ thuật MS-PCR để phát hiện tình trạng methyl hóa

promoter gen GSTP1.

2. Tỷ lệ methyl hóa gen GSTP1 ở bệnh nhân Việt Nam chiếm 66,1 %

(39/59 mẫu) đối với trường hợp ung thư tuyến tiền liệt; và 10,8 %

(4/37 mẫu) đối với trường hợp phì đại tuyến.

4. Có mối tương quan có ý nghĩa giữa methyl hóa GSTP1 và mẫu

UTTTL/PĐT, methyl hóa GSTP1 và phân độ Gleason. Methyl hóa

GSTP1 đặc thù cho ung thư tuyến tiền liệt với p < 0,05.

5. Xây dựng được bộ sinh phẩm thử nghiệm xác định GSTP1 bị

methyl hóa dựa trên kỹ thuật MS-PCR với độ nhạy kỹ thuật 0.3 % có

hướng dẫn chi tiết thực hiện phản ứng.

6. Thiết kế được đầu dò và cải tiến kỹ thuật lai điểm để tăng độ nhạy

phát hiện sản phẩm MS-PCR đặc hiệu với GSTP1 bị methyl hóa

không cần điện di; giảm chi phí, thời gian và đơn giản thao tác.

KIẾN NGHỊ

1. Áp dụng kỹ thuật MS-PCR phát hiện dấu chuẩn methyl hóa gen

GSTP1 ở các mẫu dịch của bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt và phì

đại tuyến (máu, nước tiểu…).

2. Bổ sung thêm các dấu chuẩn trong nghiên cứu methyl hóa DNA

trên ung thư tuyến tiền liệt như dấu chuẩn methyl hóa trên gen APC,

MDR1...

3. Tiếp tục hoàn thiện kỹ thuật lai điểm bằng việc thiết kế đầu dò đa

đích phát hiện đồng thời sản phẩm MS-PCR của panel dấu chuẩn

methyl hóa DNA.

27

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Vƣơng Diệu Linh, Tạ Văn Tờ, Đặng Bảo Châu, Võ Thị Thương

Lan (2012), “Nghiên cứu hiện tượng methyl hóa promoter gen

GSTP1 ở bệnh nhân ung thư tiền liệt tuyến tại bệnh viện K”, Tạp chí

ung thư học Việt Nam, số 1, tr 224-229.

2. Nguyễn Thu Trang, Đoàn Thị Hồng Vân, Vƣơng Diệu Linh, Tạ

Văn Tờ, Tạ Bích Thuận, Võ Thị Thương Lan (2014), “Áp dụng kỹ

thuật lai điểm (dot blot) để phát hiện sản phẩm MSP đặc hiệu cho

GSTP1 bị methyl hóa ở bệnh phẩm ung thư tuyến tiền liệt”, Tạp chí

Y dược lâm sàng 108, tập 9, tr 71-76. ISSN 1859-2872.

3. Lan VT, Trang NT, Van DT, Thuan TB, To TV, Linh VD, Uyen

NQ (2015), “A methylation-specific dot blot assay for improving

specificity and sensitivity of methylation-specific PCR on DNA

methylation analysis”, Int J Clin Oncol., 20(4), pp 839-45.

4. Thi Thuong Lan Vo, Bich Thuan Ta, Van To Ta, Dieu Linh

Vuong and Quynh Uyen Nguyen (2016), “Promoter methylation

profile of GSTP1 and RASSF1A in prostate cancer and benign

hyperplasia in Vietnamese men”, Turkish Journal of Medical, 46(1),

pp 228-35.