tankonyvtar.hu · web viewegy ilyen modul az sh2-domén, amely foszfotirozint tartalmazó...

Biokémia II.Biokémiai szabályozás

Szarka, András

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

TartalomBiokémia II. - Biokémiai szabályozás ................................................................................................. 8Előszó ................................................................................................................................................... 91. Bevezetés ......................................................................................................................................... 12. Biokatalizátorok – enzimek ............................................................................................................. 4

1. 2.1. Néhány szóban az enzimkinetikáról ............................................................................... 52. 2.2. Az enzimes katalízis háttere ............................................................................................ 7

3. Enzimszabályozás .......................................................................................................................... 101. 3.1. Allosztérikus enzimek ................................................................................................... 13

1.1. 3.1.1. Kooperativitás ................................................................................................ 151.2. 3.1.2. A hemoglobin szerkezete és oxigénkötése ..................................................... 17

2. 3.2. Fehérjék térszerkezetének, aktivitásának befolyásolása foszforiláció/defoszforiláció által ................................................................................................................................................... 233. 3.3. Limitált proteolízis ........................................................................................................ 27

3.1. 3.3.1. Inaktív zimogének és aktiválódásuk .............................................................. 273.1.1. 3.3.1.1. Pepszinogén ................................................................................... 273.1.2. 3.3.1.2. Enterális proteázok zimogénjei ...................................................... 283.1.3. 3.3.1.3. Proteázinhibitorok .......................................................................... 29

4. Fehérjefolding, fehérjelebontás – ubikvitin-proteaszóma rendszer ............................................... 301. 4.1. Poszttranszlációs módosulások ..................................................................................... 30

1.1. 4.1.1. Fehérjefolding ................................................................................................ 301.1.1. 4.1.1.1. Hősokk-fehérjék – molekuláris chaperonok .................................. 31

2. 4.2. Sérült fehérjék proteolízise ............................................................................................ 322.1. 4.2.1. Proteaszóma ................................................................................................... 32

2.1.1. 4.2.1.1. A proteaszóma felépítése ................................................................ 332.2. 4.2.2. A „halál csókja” – Ubikvitináció ................................................................... 342.3. 4.2.3. Számos fehérje irányított lebontás révén szabályozott ................................. 36

5. A génexpresszió szabályozása ....................................................................................................... 381. 5.1. Génexpresszió, a gén kifejeződése ................................................................................ 38

1.1. 5.1.1. Sejtdifferenciáció ........................................................................................... 381.1.1. 5.1.1.1. Azonosságok és különbségek a sejtek között ................................. 39

1.2. 5.1.2. A génexpresszió szabályozásának szintjei ..................................................... 401.3. 5.1.3. A génszabályozó fehérjék DNS-kötő részei .................................................. 411.4. 5.1.4. DNS-felismerő fehérjeszerkezeti egységek ................................................... 42

1.4.1. 5.1.4.1. Hélix-turn-hélix részletek .............................................................. 431.4.2. 5.1.4.2. DNS-kötő cink-ujj részletek ........................................................... 451.4.3. 5.1.4.3. β-redő ............................................................................................. 461.4.4. 5.1.4.4. Leucin-cipzár ................................................................................. 461.4.5. 5.1.4.5. Hélix-loop-hélix részlet .................................................................. 47

1.5. 5.1.5. DNS-kötő fehérjék detektálása ...................................................................... 492. 5.2. A genetikai kapcsolók munka közben ........................................................................... 50

2.1. 5.2.1. A triptofán-represszor, mint egyszerű génkapcsoló ....................................... 512.2. 5.2.2. A lac-operon: transzkripciós aktiválás/represszálás ...................................... 54

3. 5.3. Az eukarióta génexpresszió szabályozása ..................................................................... 553.1. 5.3.1. Eukarióta génregulációs fehérjék .................................................................. 553.2. 5.3.2. Eukarióta DNS-reguláló szekvenciák ............................................................ 563.3. 5.3.3. Génaktivátor fehérjék és a transzkripció ....................................................... 57

3.3.1. 5.3.3.1. A génregulációs fehérjék szinergikusan dolgoznak ....................... 60


Biokémia II.

3.3.2. 5.3.3.2. Eukarióta represszorok ................................................................... 603.3.3. 5.3.3.3. Inzulátor DNS-szekvenciák ........................................................... 61

4. 5.4. Az X-kromoszóma inaktiválása nőkben ........................................................................ 625. 5.5. DNS-metiláció ............................................................................................................... 64

5.1. 5.5.1. DNS-metiláció a genomi mintázatban ........................................................... 655.2. 5.5.2. CG-szigetek ................................................................................................... 67

6. Sejtkommunikáció ......................................................................................................................... 691. 6.1. Az extracelluláris szignálmolekulák .............................................................................. 70

1.1. 6.1.1. A szignálmolekulák hatótávolsága ................................................................. 712. 6.2. Autokrin szabályozás ..................................................................................................... 733. 6.3. Gap junction .................................................................................................................. 734. 6.4. Plazmamembrán-receptorok .......................................................................................... 73

4.1. 6.4.1. Receptor-ioncsatornák ................................................................................... 744.2. 6.4.2. Hét transzmembrán szegmenssel rendelkező, G-fehérje-kapcsolt receptorok 754.3. 6.4.3. Protein-kinázok, foszfoprotein-foszfatázok ................................................... 78

4.3.1. 6.4.3.1. cAMP-dependens protein-kináz (protein-kináz-A) ....................... 784.3.2. 6.4.3.2. A cGMP-dependens protein-kináz (protein-kináz-G) .................... 804.3.3. 6.4.3.3. Protein kináz-C .............................................................................. 80

4.4. 6.4.4. Transzmembrán protein kinázok: növekedési faktor-receptor ...................... 804.5. 6.4.5. Foszfoprotein-foszfatázok ............................................................................. 81

5. 6.5. A cAMP mediátorrendszer ............................................................................................ 816. 6.6. Inozitol-foszfolipid jelátviteli rendszer ......................................................................... 837. 6.7. A guanilát-cikláz és a cGMP ......................................................................................... 85

7.1. 6.7.1. Nitrogén-monoxid ......................................................................................... 867. Összetett folyamatok szabályozása ................................................................................................ 87

1. 7.1. Éhezés – jól tápláltság ................................................................................................... 871.1. 7.1.1. A glikolízis – glukoneogenezis szabályozása ................................................ 871.2. 7.1.2. A glikogén felépítés – lebontás szabályozása ................................................ 89

2. 7.2. Programozott sejthalál: Apoptózis ................................................................................ 923. 7.3. Sérült fehérjeválasz (UPR) az endoplazmás retikulumban ........................................... 96

8. Utószó .......................................................................................................................................... 1019. Ábraanyag .................................................................................................................................... 10210. Felhasznált és ajánlott irodalom ................................................................................................ 106


Az ábrák listája1.1. A sejt mint vegyipari üzem ............................................................................................................ 12.1. Az enzimek, mint biokatalizátorok ............................................................................................... 42.2. Tipikus Michaelis–Menten-kinetikát követő enzim szubsztrátkoncentráció-sebesség ábrázolása 72.3. Az enzimek legfontosabb katalitikus stratégiái ............................................................................. 82.4. A lizozim katalitikus mechanizmusa ............................................................................................. 82.5. Az egyik leggyakrabban előforduló prosztetikus csoport, a hem, szerkezete ............................... 93.1. A sejtben folyó biokémiai reakciók összessége .......................................................................... 103.2. Feed-back gátlás. A metabolikus út egy korai szakaszán található enzimet a metabolikus út egy későbbi szakaszának terméke gátolja ................................................................................................ 113.3. Többszörösen elágazó (aminosav) metabolikus út szabályozása feed-back gátlással ................ 113.4. Pozitív allosztérikus reguláció .................................................................................................... 133.5. Negatív allosztérikus reguláció ................................................................................................... 143.6. Egy- és több alegységes enzimek inhibitor koncentráció – relatív enzimaktivitás összefüggése 153.7. Két azonos alegységből álló enzim kooperatív-allosztérikus átmenete ...................................... 153.8. A mioglobin monomer szerkezete ............................................................................................... 173.9. A hemoglobin tetramer szerkezete .............................................................................................. 173.10. A hemoglobin és a mioglobin oxigéntelítési (szaturációs) görbéje .......................................... 183.11. A hemoglobin oxigénkötésre elszenvedett térszerkezet-változása ............................................ 193.12. A 2,3-biszfoszfoglicerát ............................................................................................................ 203.13. A hemoglobin és a 2,3-biszfoszfoglicerát kapcsolata ............................................................... 213.14. A hemoglobin oxigéntelítési görbéje különböző pH-értéken (Bohr-effektus) .......................... 223.15. Fehérje foszforiláció/defoszforiláció ........................................................................................ 233.16. Szerin-/treonin- és tirozin-foszforiláció .................................................................................... 243.17. Protein kináz háromdimenziós szerkezete ................................................................................ 243.18. Kináz-kaszkád-erősítő .............................................................................................................. 253.19. Fehérjék aktivitásának befolyásolása foszforilációval/defoszforilációval ............................... 263.20. A pepszinogén aktiválódása limitált proteolízissel ................................................................... 283.21. Az enterolis proteázok zimogénjükből történő aktíválódása limitált proteolízissel ................. 284.1. Fehérjék transzlációjával párhuzamosan zajló folding ............................................................... 304.2. A hsp70-család munka közben .................................................................................................... 314.3. A hsp60 család szerkezeti felépítése és működése ...................................................................... 324.4. Fehérjeminőségi kontroll ............................................................................................................ 324.5. A proteaszóma felépítése ............................................................................................................ 334.6. A fehérjéhez kapcsolt ubikvitinláncok különböző szignaling jelentése ...................................... 344.7. A fehérjék ubikvitinációja ........................................................................................................... 354.8. Az ubikvitin-ligáz szabályozása .................................................................................................. 364.9. Degradációs szignálok kialakulása ............................................................................................. 365.1. A molekuláris biológia centrális dogmája ................................................................................... 385.2. A sejtdifferenciáció a génexpresszió megváltozása, nem a nukleotidszekvenciáé ..................... 395.3. A génkifejeződés szabályozásának szintjei ................................................................................. 405.4. A DNS-kötő fehérjék kapcsolódási helye a DNS-molekula külső felszínén .............................. 415.5. A nagyárok és a kisárok értelmezése a glikozidos kötések egymással bezárt szögei alapján .. . . 425.6. A hélix-turn-hélix fehérjerészlet felépítése és kapcsolódása a DNS-hez .................................... 435.7. A szimmetrikus DNS-regulációs szekvencia és hozzá kötődő DNS-felismerő fehérje dimer . . . 435.8. A homeodomén fehérjecsalád tagjait kódoló géneket érintő mutációk következménye (Drosophila melanogaster) ..................................................................................................................................... 445.9. A cink-ujj fehérjerészletek első csoportjának szerkezeti felépítése, illetve a klaszterképzés ..... 455.10. A leucin-cipzár fehérjerészlet szerkezete és kötődése a DNS-hez ............................................ 47


Biokémia II.

5.11. A hélix-loop-hélix fehérjerészlet szerkezete és kapcsolódása a DNS-hez ................................ 485.12. Hélix-loop-hélix fehérjerészlet aktivitásának szabályozása heterodimerizációval .................. 485.13. A gél mobility shift assay (electrophoretic mobility shift assay, EMSA) működési elve ......... 495.14. A triptofán operon elemei ......................................................................................................... 515.15. A transzkripció lépései (1.promóter felismerése a σ-faktor által, 2.a DNS-szál felnyitása, 3. RNS-szál szintézisének kezdete(iniciáció), 4. az első tíz nukleotid szintézise,5. a σ-faktor leválása a komplexről, RNS-szintézis felgyorsul (elongáció), 6. a szintézis a terminátor régióig folyik, majd a kész RNS-szál leválik a komplexről, 7. a σ-faktor ismét elfoglalja helyét az RNS-polimeráz komplexben) ........... 515.16. A triptofán-represszor fehérje működése .................................................................................. 525.17. A triptofán-represszor fehérje szerkezetének és DNS-kötő képességének megváltozása a két bekötődő triptofánmolekula hatására ................................................................................................. 535.18. A lac-operon kettős szabályozása a lac-represszor fehérje, illetve a CAP–cAMP-komplex által 545.19. A DNS hurokképzése az enhancer- és a promóterrégiók között lehetővé teszi egymástól távoli szekvenciák egymásra hatását ........................................................................................................... 565.20. Az eukarióta gén szabályozási régiójának elemei ..................................................................... 575.21. Nukleoszóma-remodellezés ...................................................................................................... 585.22. Kovalens hisztonmódosítás ....................................................................................................... 595.23. A szabályozó fehérjeelemek összeszerelődése különböző funkciójú regulátorkomplexekké a DNS felületén ............................................................................................................................................. 605.24. Az enhanszoszóma felépítése .................................................................................................... 615.25. Az inzulátorszekvenciák elhelyezkedése és funkciója .............................................................. 625.26. Az X-kromoszóma inaktiválódása (kondenzálódása) a női embrionális testi sejtekben .......... 625.27. Az X-kromoszóma inaktiválódásának mechanizmusa ............................................................. 635.28. A DNS-metiláció mechanizmusa, a fenntartó metilázok működése ......................................... 645.29. A genomi lenyomat hatása a génexpresszióra ........................................................................... 665.30. Az Igf2-gén metilációs lenyomata ............................................................................................ 666.1. A celluláris jelátvitel szintjei ....................................................................................................... 696.2. Sejtfelszíni receptorok ................................................................................................................ 706.3. Intracelluláris magreceptorok ..................................................................................................... 706.4. A szignálmolekulák hatótávolsága .............................................................................................. 716.5. Az extracelluláris jelre adott válasz természete, reakcióideje ..................................................... 726.6. Az acetilkolin-nikotin receptorának izom-altípusa, az alegységek (a), az alegységek transzmembránrégiói(b), illetve az acetilkolin-kötőhelyek felülnézetből(c) ..................................... 746.7. A G-fehérje mint jelátviteli kapcsoló .......................................................................................... 756.8. A G-fehérjék szerkezeti felépítése .............................................................................................. 766.9. A G-fehérjék működés közben .................................................................................................... 776.10. A cAMP-dependens protein-kináz felépítése ............................................................................ 786.11. A cAMP-dependens protein-kináz regulációja ......................................................................... 796.12. A protein kináz C felépítése és aktiválódása ............................................................................. 806.13. Transzmembrán tirozin-kináz (receptor) .................................................................................. 816.14. A cAMP-mediátorrendszer működés közben ........................................................................... 826.15. A cAMP-dependens protein kináz (PKA) szerepe a génszintű szabályozásban ....................... 836.16. A foszfolipáz-C aktiválása és működése ................................................................................... 846.17. Az IP3-jelátviteli útvonal .......................................................................................................... 857.1. A foszfofruktokináz allosztérikus regulátorai ............................................................................. 887.2. A glikolízis/glukogeogenezis hormonális szabályozása: a foszforuktokináz II foszforilációval/defoszforilációval történő szabályozása, a cAMP szint hatása a glikolízis, glukoneogenezis szabályozására ........................................................................................................ 897.3. A glikogénlebontás (felépítés) szabályozása izom- és májsejtekben .......................................... 917.4. A nekrótikus és az apoptotikus sejthalál közötti morfológiai és folyamatbeli különbségek ...... 937.5. A halálligandon – halálreceptoron– keresztül bonyolódó külsődleges (extrinszik), illetve a mitokondrium külső membrán sérülésén, a citokrom c felszabadulásán keresztül zajló, belsődleges (intrinszik) apoptotikus útvonalak ..................................................................................................... 95


Biokémia II.

7.6. Az endoplazmás retikulum stresszt és a következményes sérült fehérjeválaszt kiváltó különböző fiziológiás, patológiás, illetve kísérleti tényezők ............................................................................... 977.7. A sérült fehérjeválasz folyamatai ................................................................................................ 987.8. Az endoplazmás retikulum kiváltotta UPR, illetve az UPR elbukását követő endoplazmás retikulum eredetű apoptózis folyamata .............................................................................................................. 99


Biokémia II. - Biokémiai szabályozásSzarka András

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem, 2014

© Szarka András

Typotex Kiadó, www.typotex.hu

ISBN: 978-963-279-170-8

Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A szerző nevének feltüntetése mellett nem kereskedelmi céllal szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de nem módosítható.

Készült a TÁMOP-4.1.2/A/1-11/1-2011-0079 számú, „Konzorcium a biotechnológia aktív tanulásáért” című projekt keretében.


ElőszóA Biokémia II. – Biokémiai szabályozás című tankönyv másodéves biomérnök hallgatók számára készült, akik a Biokémia I. tantárgy során már elsajátították a biokémiai, molekuláris biológiai alapismereteket. Ezeket alapul véve, ezekre építkezik a tankönyv, amely kiemelten a biokémiai szabályozásokkal foglalkozik. A szabályozástechnika, legyen az biológiai vagy más természetű, mindig a legnagyobb kihívást jelentő területek egyike. A tankönyvet igyekeztünk úgy felépíteni, hogy a részelemek ismertetését követően egyszerűbb, majd egyre összetettebb problémák felé haladjunk. Reméljük, sikerült mindezt világos gondolatmenet mentén megtennünk, és legalább akkora örömet jelent a tankönyv olvasása, a sejtünk titkaiba való bevezetés, mint a tankönyv kigondolása és megírása jelentett a szerző számára.

Budapest, 2013. nyár

Szarka András


1. fejezet - BevezetésA tankönyv elején érdemes tisztázni, hogy mivel is foglalkozik a biokémiai szabályozástechnika.

A kérdés megválaszolásához vegyük a következő példát. Tekintsünk úgy a sejtre, mint egy vegyipari üzemre. Nézzük meg, milyen hasonlóságok és analógiák vonhatók az üzem és a sejt között:

üzem sejt

fal sejtmembrán

különböző specializálódott egységek sejtorganellumok, kompertimentumok

például: energiaellátó központ mitokondrium (kloroplaszt-növényekben)

raktár vakuólum (bizonyos értelemben az ER is)

gépgyártó sor riboszómák

végszerelde endoplazmás retikulum (ER)

központi irányítás, információszolgáltatás, elosztás

sejtmag

1.1. ábra - A sejt mint vegyipari üzem

Az üzemet nyilvánvalóan el kell látni energiával. A sejt esetében ez az energia leggyakrabban a glükózból


Bevezetés

származik. A hulladék anyagokat is el kell távolítani a sejt (üzem) zavartalan működéséhez. Ilyen hulladék a CO2, illetve egyéb toxikus vegyületek, amelyek a sejt működése során keletkeznek.

Az üzem életének szigorúan szabályozott körülmények között kell folynia:

a. Szigorúan meghatározott mennyiségű „gépet”, terméket kell előállítania. Sem a túltermelés, sem a hiány nem megengedett.

b. Az egyes gyártási lépések között sem tolerálható a köztes anyagok hiánya, feleslege.

c. Az energiafelhasználás (anyagfelhasználás) optimalizálására törekszünk.

Ezek együttesen biztosítják az optimális gépmennyiséget.

d. Fontos az egészséges munkakörülmények biztosítása, a külső vagy belső gyártás során keletkező mérgek, szennyezőanyagok eliminálása.

Mindezek biztosításához szigorúan össze kell hangolni a részlépéseket, munkafolyamatokat, az egyes alapanyagok, köztitermékek, késztermékek transzportfolyamatait.

A sejt esetében ezen folyamatokkal foglalkozik a biokémiai szabályozástechnika.

Tanulmányaink során:

1. megismerjük a sejt gépeit, az enzimeket (mi az enzimek szerepe, milyen fontos tulajdonságokkal bírnak)

2. a biokémiai alapfolyamatokat több szinten szabályozhatjuk (a sejt működési hatásfoka [intenzitása], valamint a sejt gépeinek száma is szabályozható)

a. az enzimaktivitás szabályozásának lehetőségei:

i. gátlások

ii. szabályozások

1. allosztérikus enzimek

2. proteolitikus hasítás

3. foszforiláció

a fehérjék születése:

– transzláció

– poszttranszlációs módosulások

a fehérjék aktív állapota

a fehérjék bukása –ubikvitizáció → lebomlások, proteaszóma

b. a gépek számának változtatása – az enzimmennyiségek változtatása, szabályozása

i. sejtdifferenciáció és génexpresszió szabályozása

ii. a génexpresszió szabályozásában résztvevő DNS-t kötő fehérjék:

1. hélix-turn-hélix

2. cink-ujj fehérje

3. leucin-cippzár

4. hélix-loop-hélix


Bevezetés

iii. a DNS-t felismerő fehérjeszakaszok azonosítása

iv. a gének ki- és bekapcsolása

1. lac-operon

2. triptofán-represszor

3. eukarióta sejtek transzkripciós szabályozása

a. transzkripciós faktorok

b. promóterek

c. génregulációs szekvenciák

d. génregulációs fehérjék

v. sejtdifferenciálódás

vi. poszttranszkripciós szabályozások

vii. a sejtszintű információáramlás: szignál-transzdukció

1. általános kitekintés: receptorok, ligandok

2. extracelluláris jeltovábbítás: paraszimpatikus és endokrin lehetőségek

3. sejtmag receptorok: szteroid receptorok

4. sejtfelszíni receptorok:

a. ioncsatorna-kapcsolt

b. G-fehérjéhez kapcsolt

c. enzimkapcsolt

viii. célsejt adaptáció – receptor leszabályozás

ix. összetett folyamatok

1. glikolízis, glikogén lebontás/felépítés, vércukorszint-szabályozás

2. apoptózis, sérült fehérjeválasz (UPR)


2. fejezet - Biokatalizátorok – enzimekAz enzimek szabályozásával kapcsolatos ismeretek megértéséhez szükségünk van bizonyos termodikai alaptudásra.

Nézzük a következő reakciót:

papír + O2 → füst + hamu + hő + CO2 + H2O

A papír elég, hőenergiát juttat az atmoszférába, valamint vizet és széndioxidot, viszont a füst és a hamu ezekkel a dolgokkal és a melegített levegővel sohasem képes papírrá visszaalakulni. Amikor a papír elég, kémiai energiája, mint hőenergia disszipálódik. Ezzel egy időben a papír atomjai, molekulái szétszóródnak, rendezetlenek lesznek. A termodinamika nyelvén mondva szabadenergia-veszteség, szabadenergia-csökkenés következik be. Ezt az energiát használjuk fel munkavégzésre vagy kémiai reakciók végrehajtására.

Általánosan elmondhatjuk: a kémiai reakciók mindig a szabadenergia-csökkenés irányába mennek végbe. Vagyis a reakciók spontán iránya az energetikailag kedvezőbb irány.

Normál körülmények között a szén energetikailag legstabilabb formája a széndioxid és a hidrogéné a víz. Az élő szervezetek mégsem válnak széndioxidköddé és a papír sem kezd el lángolni kezeink között. Ennek oka, hogy az élő szervezet és a füzet molekulái egy viszonylagos stabil állapotban találhatóak és ahhoz, hogy alacsonyabb energiaszintre kerüljenek, energiát kell befektetni. Magyarul a molekuláknak aktivációs energiára van szükségük ahhoz, hogy egy jóval stabilabb (alacsonyabb energiájú) állapotba kerüljenek (2.1. ábra). Az égő füzet (papír) esetében az aktivációs energiát egy meggyújtott gyufa jelenti. A vizes oldatban található molekulák számára az energiagáton történő átjutást a szomszédos molekulákkal történő ütközés teremti meg (amely a hőmérséklet emelkedésével egyre gyakrabban következik be).

2.1. ábra - Az enzimek, mint biokatalizátorok

Az energiagát átugrását az élő szervezetben az enzimek segítik. Ez az energiagát-csökkentés annyira jelentős


Biokatalizátorok – enzimek

mértékű lehet, hogy az enzimek akár (több)milliószorosára is gyorsíthatják a reakciókat. Emiatt szabályozásuk kiemelt fontossággal bír a sejt életében, metabolizmusában. A reakció végén maguk változatlanok maradnak. Ezért tekinthetjük őket biokatalizátoroknak. Hasonlóan bármely katalizátorhoz,

• kizárólag termodinamikailag lehetséges reakciókat katalizálnak, mivel „csak” az aktivációs energiát csökkentik, ezáltal hihetetlenül megnövelve a reakcióba lépő molekulák számát (2.1. ábra);

• tekintve, hogy általában fehérjemolekulák, reakcióra és/vagy szubsztrátra specifikusak;

• (Hasonlóan bármely katalizátorhoz) Maguk nem változnak a reakció során.

A hasonló reakciókat katalizáló enzimeket egyazon funkcionális csoportba soroljuk.

1. Oxidoreduktázok pl.: etanol + NAD+ ↔ acetaldehid + NADH + H+

2. Transzferázok pl.: glukóz + ATP → glukóz-6 foszfát + ADP

3. Hidrolázok pl.: glukóz-6-foszfát + H2O → glukóz + Pi

4. Liázok pl.: 2-foszfoglicerát ↔ foszfoenol-piruvát + H2O

5. Izomerázok pl.: glukóz-6-foszfát ↔ fruktóz-6 foszfát

6. Ligázok pl.: glutamát + NH3 + ATP → glutamin + ADP + Pi

A csoporton belül minden enzim specifikus, csak egy adott reakciót katalizál viszonylag szűk szubsztrát tartományon belül (gyakran csak egyetlen meghatározott molekula [szubsztrát] átalakítására képes).

Például:A hexokináznak a D-glukóz szubsztrátja, de az L-glukóz már nem szubsztrátja.

A trombin a fibrinben csak egy adott arginin és a szomszédos glicin között hasít, máshol nem.

Természetesen ez a specifikusság különböző mértékű lehet, előfordul, hogy egy adott reakciótípusra, vagy adott funkciós csoportra korlátozódik csak, de ismertek kizárólag egyszubsztrátos enzimek is.

Az enzimek hálózatot alkotnak. Az egyik enzim terméke igen gyakran egy másik szubsztrátja és így tovább. Ennek eredménye az anyagcsere utak hálózata, az energiaellátás biztosítása és a különböző molekulák szintézise.

1. 2.1. Néhány szóban az enzimkinetikárólAz enzimes reakciókkal kapcsolatos, alapvető reakciókinetikai összefüggéseket, törvényszerűségeket a következő egyszerű, egyszubsztrátos enzimes reakción szeretnénk bemutatni:

Az adott idő alatt az enzim által megkötött és átalakított szubszrátmolekulák száma behatárolt.

Ha növeljük a szubsztrátok számát, egy maximum értékig növekszik az átalakított szubsztrát/keletkezett termék



mennyisége. Ebben a pontban az enzimünk telítődött szubsztrátjával és a reakció sebessége (Vmax) csak attól függ, hogy milyen gyorsan képes az enzim a szubsztrátot átalakítani. A maximális sebességet az enzim koncentrációjával osztva megkapjuk az enzim átviteli számát, mely az angolszász irodalomban turnover number néven ismeretes. Ennek értéke egy és tízezer között szokott lenni, általában ezer körüli.

Az enzimműködés kvantitatív jellemzése elengedhetetlen az enzimek megismerése során, illetve széleskörű, irányított ipari felhasználásukhoz.

Tekintsük ismételten a következő egyszubsztrátos reakciót:

A reakcióval kapcsolatban a következő egyszerűsítéseket tesszük:

Feltételezzük, hogy az enzim (E) és a termék (P) között annyira ritkán játszódik le enzim-szubsztrát komplexet (ES) eredményező reakció, hogy ezt el is hanyagolhatjuk. Ekkor az EP komplexet nem szükséges megjelenítenünk és a reakció előrehaladását, azaz a sebességét a következőképp fejezhetjük ki:

V = kcat [ES]

Ebben az esetben [ES] az enzim-szubsztrát komplex koncentrációja, kcat, az átviteli szám, ami megadja, hogy egy enzimmolekula egy másodperc alatt hány szubsztrátmolekulát alakít át. Az ES komplex koncentrációja az enzim és szubsztrát molekulák összekeverését követően hirtelen nő, míg el nem éri az egyensúlyi állapotot (steady state). Ebben az állandósult állapotban koncentrációja jó közelítéssel állandónak vehető:

ES fogyás = ES képződés

k-1[ES] + kcat [ES] = k1 [E][S]

A szabad enzim koncentrációja: [E] = [E0] - [ES]

Behelyettesítve:

Vezessük be a Km Michaelis-konstanst:

Ekkor

Illetve visszaírva: V = kcat [ES]

Megkapjuk a híres Michaelis–Menten-egyenletet:

Ha növeljük a szubsztrát mennyiségét, egy maximum értékig növekszik az átalakított szubsztrát/keletkezett termék mennyisége. Ebben a pontban az enzimünk telítődött szubsztrátjával (tehát minden enzimmolekula szubsztrátot köt) és a reakció sebessége Vmax. Ezt a sebességet abban a pontban érjük el, ahol:



V = Vmax = kcat [E0]

Ez alapján a Michaelis–Menten-egyenlet általános formája a következő:

Az egyenletet grafikusan ábrázolva egy hiperbolát kapunk. A grafikus ábrázolás segítségével meghatározhatóak az enzim kinetikai paraméterei a vmax és a Km. A Km értéke egyszerűen megkapható, mint a vmax/2 sebességhez tartozó szubsztrátkoncentráció (2.2. ábra).

2.2. ábra - Tipikus Michaelis–Menten-kinetikát követő enzim szubsztrátkoncentráció-sebesség ábrázolása

2. 2.2. Az enzimes katalízis háttereAz enzimek különösen nagymértékben gyorsítják meg a reakciókat. Ez számos különböző tényezőnek tudható be. Lássuk, melyek ezek:

1. Az enzimek a katalitikus hely környezetében megnövelik a lokális szubsztrátkoncentrációt (azáltal, hogy megkötik őket), valamint a reakció megkívánta helyes orientációban tartják a megfelelő atomokat.

2. Talán a legfontosabb, hogy a kötési energia (szubsztrát kötés) hozzájárul a közvetlen katalízishez. A szubsztrátmolekuláknak számtalan különböző geometriájú és elektron-eloszlású köztes állapoton kell keresztülmenniük, mielőtt a reakció végét jelentő formába jutnak. A legstabilabb átmeneti állapot felvételéhez szükséges szabadenergia-mennyiség az aktivációs energia. Igazából ez határozza meg a reakció sebességét. Az enzimek jóval nagyobb affinitással bírnak az átmeneti állapotú szubsztrát, mint a stabil forma irányába. Ez a szoros kötés nagymértékben csökkenti az aktivációs energiát, így jelentősen meggyorsítja a reakciót.

Az enzimek tehát többféle generális stratégiát vetnek be a katalízis során. A legfontosabbak:

a. az enzim megköti és pontosan orientálja egymáshoz a szubsztrátokat



b. a szubsztrát megkötésével az enzim átrendezi annak elektroneloszlását, részlegesen + és - részeket eredményezve

c. az enzim megfeszíti a megkötött szubsztrátmolekulát, ezzel az átmeneti állapot felé tolva

2.3. ábra - Az enzimek legfontosabb katalitikus stratégiái

Katalitikus antitestek

Az orientációs hatás jelentőségét segítenek megérteni az ún. katalitikus antitestek. Ezek, az enzimhez hasonló térszerkezetük révén, stabilizálják az átmeneti állapotú molekulákat, így meggyorsítva az alapreakciót, igaz, nem az enzimhez hasonló mértékben (kb. 10 000- szeresére).

Természetesen az enzimek más úton-módon is hozzájárulnak a reakció minél gyorsabb végbemeneteléhez. Pl. pontosan pozícionált atomokat tartalmaznak, amelyek képesek a szubsztrát (átmeneti állapotú molekula) elektronszerkezetét deformálni.

A következőkben a lizozim segítségével nézzünk meg egy konkrét példát az enzimes katalízisre.

A lizozim tulajdonképpen egy természetes antibiotikum. Megtalálható a tojásfehérjében, a nyálban, a könnyben, illetve egyéb szekrétumokban. A bakteriális sejtfal poliszacharidjait bontja, egészen pontosan az 1-4-es glikozidos kötéseket az N-acetil-muraminsav és az N-acetilglukózamin között. Ennek hatására a baktériumok nem képesek ellenállni a turgornyomásnak és szétdurrannak.

Az enzimet még Fleming fedezte fel és nevezte el 1922-ben. Kisméretű (14602 Da), könnyen izolálható. Így nem csoda, hogy ez volt az első enzim, amelynek röntgendiffrakciós szerkezete ismertté vált.

2.4. ábra - A lizozim katalitikus mechanizmusa

A lizozim által katalizált reakció, poliszacharidláncok hidrolízise, egy energetikailag kedvező, tehát szabadenergia-csökkenéssel járó reakció. Az enzim távollétében azonban vígan elvannak ezek a poliszacharid láncok még vizes közegben (oldatban) is, bármilyen észrevehető bomlás, hidrolízis nélkül. Ez érthető, hisz a korábban említett energiagát jelen esetben is érezteti hatását. A két cukormolekulát összekötő kötés kizárólag abban az esetben hasad fel a hozzá ütköző vízmolekula hatására, ha a poliszacharidlánc adott szerkezeti torzuláson megy keresztül, felveszi az átmeneti állapotot, amelyben a kötés körüli atomok geometriája és elektroneloszlása megváltozik. Ez random módon csak igen ritkán következik be, azonban jelentősen megváltozik a helyzet, amennyiben az oldat lizozimet is tartalmaz. A lizozim aktív helye, tekintve, hogy szubsztrátja egy polimer, egy hosszanti árok, amely egyszerre hat egymáshoz kapcsolt cukrot tud megkötni. A



lizozim sajátságos módon tartja a szubsztrátját, úgy, hogy kifordítsa a kötésben részt vevő cukrok egyikét, kitörve a stabilis konformációjából. A felhasítandó kötést úgy pozícionálja, hogy közel kerüljön az aktív hely két savas karakterű aminosavához (egy glutamáthoz és egy aszpartáthoz) (2.5. ábra). Az enzim az enzim-szubsztrát komplexben a bal oldali cukrot kifeszített, egyenes konformációban tartja, miközben a 35-ös glutamáttal mint savval támadja a cukor-cukor kötést, protont donálva a jobb oldali cukornak, illetve ellensúlyként az 52-es aszpartáttal támadja a C1-szénatomon (2.5. ábra). Ennek következtében kialakul egy kovalans kötés az 52-es aszpartát és a cukormolekula C1-szénatomja között. Mindeközben a 35-ös glutamát egy vízmolekulát (pirossal jelölve) polarizál, hogy annak oxigénatomja megtámadhassa a C1-szénatomot, így kiváltva az 52-es aszpartátot. A vízmolekula (pirossal jelölve) reakciója befejezvén a hidrolízist, visszaállítja az enzim eredeti állapotát, miközben létrejön az enzim-termék komplex (2.5. ábra).

Az enzimek működésükhöz nem fehérje és nem aminosav részeket is igényelnek. Ezek egy része kovalensen kapcsolódik az anya fehérjelánchoz. Ezeket nevezzük prosztetikus csoportoknak. A fehérjeláncokhoz kapcsolódó nem aminosav alkotók lehetnek fémionok vagy szerves molekulák (koenzimek, lipidek, cukrok) (2.6. ábra).

2.5. ábra - Az egyik leggyakrabban előforduló prosztetikus csoport, a hem, szerkezete

Az enzimek megfelelő működésének alapja a szubsztráthoz való megfelelő hozzáférés. Ha egy reakció diffúziólimitálttá válik és/vagy az egyik enzimreakció terméke a másik kiindulási anyaga, multienzim-komplexek jönnek létre. Ez hatékonyabb működést (magasabb szubsztátkoncentrációt) eredményez. Magasabb szubsztátkoncentráció kompartmentalizáció révén is biztosítható.


3. fejezet - EnzimszabályozásA korábbiakban láttuk, hogy egy-egy enzim több milliószorosára, akár milliárdszorosára képes az általa katalizált reakció sebességét megnövelni. Ha figyelembe vesszük, hogy egy élő sejt az enzimek ezreit tartalmazza a kis citoszolban vagy más kis térfogatú kompartimentumban, továbbá, hogy ezek egy összetett metabolikus hálózatot alkotnak, melyben igen gyakran az egyik enzim terméke a másik szubsztrátja, továbbá, hogy ez a hálózat az elágazási pontok tömkelegét tartalmazza, beláthatjuk, hogy mindezek következtében pontos, precíz szabályozásra van szükség a problémamentes anyagcsere, sejtműködés lebonyolításához. Az anyagcsere összetettségéről és a szabályozási feladat által képviselt kihívásról képet kaphatunk, ha a 3.1. ábrára tekintünk, melyen néhány unatkozó biokémikus összefoglalta a sejtben folyó biokémiai reakciókat.

3.1. ábra - A sejtben folyó biokémiai reakciók összessége

A sejt életfolyamatainak szabályozása tehát igen jelentős mértékben az azokat katalizáló enzimek mennyiségének, illetve aktivitásának szabályozására vezethető vissza.

A szabályozás több szinten valósulhat meg:

1. Befolyásolható az enzimmolekulák száma – ez majdnem kizárólagosan a génexpresszió szabályozása révén történik.

2. A sejt specializált kompertimentumokba telepíti a folyamatokat (enzimeket), itt a szubsztrátkoncentrációt a citoszoltól eltérően alakíthatja.

3. Célzott fehérjelebontással az enzim (fehérjék) féléletidejét befolyásolhatja.

4. A leggyorsabb és legáltalánosabb módszer a reakció sebességének befolyásolására az enzimaktivitás közvetlen és reverzibilis befolyásolása speciális molekulák segítségével, amelyek végső soron a fehérje térszerkezetének változásán keresztül fejtik ki hatásukat.

A szabályozási szintek tárgyalását a legáltalánosabb 4. pontban ismertetett esettel, a már elkészült fehérjemolekulák aktivitásának befolyásolásával kezdjük. Kulcsmondatunk a következő lesz: A fehérjék


Enzimszabályozás

térszerkezete és funkciója szinonim fogalom.

Ez a mondat igen jól összefoglalja a fejezet lényegét, amennyiben befolyásoljuk, megváltoztatjuk egy fehérje térszerkezetét, akkor, az maga után vonja annak funkció- és aktivitásváltozását is!

Az ilyen jellegű szabályozás igen gyakran feed-back gátlás formájában valósul meg.

Feed-back gátlás során az enzimet, amely a metabolikus út egy korai szakaszán található, egy a metabolikus út későbbi szakaszának terméke gátolja. Így amikor a termék elkezd felgyülemleni, az gátolja az első enzimet, limitálva (megakadályozva), hogy további szubsztrátmolekulák lépjenek be a metabolikus útvonalba (3.2. ábra).

3.2. ábra - Feed-back gátlás. A metabolikus út egy korai szakaszán található enzimet a metabolikus út egy későbbi szakaszának terméke gátolja

Amikor az útvonalak elágaznak vagy egymást keresztezik, akkor többszörös szabályozópontok alakulnak ki, amelyeket a következő végtermékek kontrollálnak, mindegyik saját szintézisét befolyásolva (3.3. ábra).

3.3. ábra - Többszörösen elágazó (aminosav) metabolikus út szabályozása feed-back gátlással


Enzimszabályozás


Enzimszabályozás

A feed-back inhibíció azonnal működésbe lép és gyorsan megszűnik, amint a termék szintje csökken. Amennyiben ez a típusú szabályozás csökkenti az enzim aktivitását, negatív szabályozásról beszélünk (3.2. ábra).

Amennyiben a szabályozómolekula növeli az enzim aktivitását, pozitív szabályozásról beszélünk. Ebben az esetben a metabolikus útvonal egyik ágának terméke egy másik metabolikus útvonal enzimét aktiválja. Pl. az ADP feldúsulása aktiválja a cukor lebontásában résztvevő enzimeket, hogy az ADP ATP-vé alakulását elősegítse.

Gyakran előfordul, hogy az anyagcsereút elő anyaga aktiválja a belépést katalizáló enzimet.

Egymással ellentétes folyamatok esetén egy bizonyos molekula az egyik út számára allosztérikus aktivátorként, míg a visszafelé folyó út enzime számára allosztérikus inhibitorként viselkedik, így biztosítva az ellentétes utak koordinálását.

1. 3.1. Allosztérikus enzimekA szabályozás elnevezése igen találó magában hordozza, annak lényegét:

Allos= másik

Steros=szilárd vagy háromdimenziós (térbeli)

Egy szubsztráttól különböző molekula az enzim egy regulációs helyéhez kötődik (amely hely nem azonos az aktív hellyel), ezáltal befolyásolva annak aktivitását. A szabályozómolekula alakja gyakran teljesen eltérő a szubsztráthoz képest. Tehát az aktív helyhez kötődik a szubsztrát, a regulátormolekula pedig a regulációs helyhez. A két kitüntetett helynek kommunikálnia kell, hogy a regulátormolekula bekötése befolyásolhassa az aktív helyet.

Ez a kommunikáció a fehérje térszerkezet-változásán keresztül valósul meg. A bekötődő szabályozómolekula konformáció változást, ez pedig aktivitásváltozást eredményez.

Úgy gondoljuk, hogy a fehérjék jelentős része allosztérikus:

• enzimek,

• receptorok,

• szerkezeti fehérjék,

• motorfehérjék.

A ligandok azt a konformációt stabilizálják, amelyikhez a legerősebben kötődnek, így kellően magas ligandkoncentrációnál a fehérje ezen konformációja lesz „bekapcsolva”.

Az alaposabb megértéshez vegyük a következő példát.

Adott egy fehérje, amelynek két kötőhelye van elkülönülten. Az egyikkel a szubsztrátját, a glukózt, a másikkal egy regulátormolekulát, X-et köt.

Ha a glukóz bekötődése megváltoztatja az X-kötőhely alakját, akkor a két kötőhely kapcsolt.

Ha mindkét ligand ugyanazon fehérje konformációt részesíti előnyben, akkor bármelyik bekötése növeli a fehérje másik irányába mutatott affinitását. Tehát ha a zárt forma köti legjobban a glukózt és ez a zárt forma szintén kedvezőbb az X-kötőhely számára, hogy X-et kössön, akkor a fehérje szorosabban köti a glukózt, ha X jelen van, mintsem ha nincs. A szabályozás ebben az esetben pozitív szabályozás (3.4. ábra).

3.4. ábra - Pozitív allosztérikus reguláció


Enzimszabályozás

Következésképpen a kötőhelyek összekötöttsége negatívan befolyásolja a kötődést, ha a két különböző molekula a különböző konformációkhoz szeret jobban kötődni. Ebben az esetben az első ligand bekötődése csökkenti a második (másik) ligand bekötődésének valószínűségét (3.5. ábra).

3.5. ábra - Negatív allosztérikus reguláció

A kötöttség mértéke mennyiségileg oda-visszaható. Ha a glukóznak nagy hatása van X kötődésére, akkor X-nek is nagy hatása van a glukóz bekötődésére. Mivel X-molekula nem a katalitikus (aktív) helyhez kötődik, nem szükségszerű, hogy bármilyen kémiai kapcsolat legyen közte és a glukóz vagy bármelyik másik ligand között, amely az aktív helyhez kötődik. Ahogy láttuk az X-molekula egyszerűen képes bekapcsolni (+ reguláció) vagy kikapcsolni (- reguláció) az enzimet.

Ezáltal az allosztérikus fehérjék általános kapcsolóként működnek, amelyek megteremtik a lehetőséget, hogy egy molekula egy másik molekula sorsát meghatározza a sejten belül.


Enzimszabályozás

1.1. 3.1.1. KooperativitásEgy alegységes enzim feed-back inhibíciója során 90% aktivitásról 10%-ra szabályozódik vissza, ha az inhibitor koncentráció 100-szorosára nő.

Ez nem ad lehetőséget éles szabályozásra. A legtöbb ligand által be- és kikapcsolható enzim több egymással megegyező enzimatikus alegységből áll. Ebben az elrendeződésben, ha egy ligand beköt az egyik alegységen levő kötőhelyre, kivált egy allosztérikus változást az alegységen belül, amely később átterjedhet a szomszédos alegységekre, elősegítve őket, hogy ugyanezt a ligandot megkössék. Ennek eredményeképp egy kooperatív allosztérikus átalakulás jön létre (3.6. ábrán kék vonallal jelölve), lehetővé téve, hogy a sejtben bekövetkező kisarányú ligand koncentráció-változás teljesen aktiválja, vagy teljesen inaktiválja az egész apparátust (enzimet, fehérjét).

3.6. ábra - Egy- és több alegységes enzimek inhibitor koncentráció – relatív enzimaktivitás összefüggése

Az első ligand bekötése nehezebb, mivel ennek során egy energetikailag kedvező kapcsolat bomlik fel az alegységek között, viszont a második ligand bekötődése jóval könnyebb, mivel ez visszaállítja a szimmetrikus molekula monomer-monomer kapcsolatát (és ezzel egyidejűleg teljesen inaktiválja az enzimet) (3.7. ábra).

3.7. ábra - Két azonos alegységből álló enzim kooperatív-allosztérikus átmenete


Enzimszabályozás


Enzimszabályozás

Jóval élesebb hatás érhető el, ha a ligand egy nagyobb szerkezethez, mondjuk egy 12 polipeptid láncból álló enzimhez kötődik.

A szubsztrátétól eltérő szerkezetű allosztérikus effektor hatását heterotróp hatásnak nevezzük. Több azonos alegységből álló fehérje (enzim) esetén figyelték meg az allosztéria egy sajátos változatát, a homotróp hatást. Ebben az esetben egyetlen molekula, enzimek esetén maga a szubsztrát, képes betölteni az allosztérikus ligand szerepét.

Az élesebb hatás alapja ez esetben is az lesz, hogy az első ligand (szubsztrát) bekötődése nehezebb, majd a bekötéssel együtt járó konformáció változás hatására a második, harmadik, negyedik szubsztráté már sokkal könnyebb lesz.

A pozitív homotróp hatás érvényesülése esetén a hiperbolikus telítési görbe torzul: szigmoid lesz. Kis szubsztrát koncentráció esetén kicsi a kötődés valószínűsége, a szubsztrát koncentráció növekedtével (és a konformáció változással) a kötődési esély megnő. Ennek eredménye lesz a szubsztrát koncentráció emelkedésével meredeken emelkedő telítési görbe.

A kooperativitás egyértelmű előnye tehát a szűkebb ligand/szubsztrát koncentráció-tartományban bekövetkező éles aktivitásváltozás. Ez pedig igen komoly regulációs előnyt jelent.

A kooperativitás és az allosztérikus szabályozás bemutatására a legjobb példát a hemoglobin oxigénkötése adja. Így a következőkben ezzel részletesen is foglalkozni fogunk.

1.2. 3.1.2. A hemoglobin szerkezete és oxigénkötéseA hemoglobin szerkezetét és oxigénkötésének sajátságait, szabályozását egy másik oxigén kötésére képes molekula, a mioglobin szerkezetével, oxigénkötési sajátságaival együtt tárgyaljuk. Tesszük ezt azért, mert a párhuzamos tárgyalási mód igen fontos biokémiai szabályszerűségek megvilágítására ad módot. A két molekula igen hasonló szerkezettel rendelkezik, mindkettő globin fehérjeláncból és a hozzá kovalensen kapcsolódó hem prosztetikus csoportból áll. Igen fontos különbség azonban, hogy míg a mioglobin monomer, addig a hemoglobin tetramer (3.8. és 3.9. ábra).

3.8. ábra - A mioglobin monomer szerkezete

3.9. ábra - A hemoglobin tetramer szerkezete


Enzimszabályozás

Mielőtt a két oxigénkötésre képes molekula szerkezetének mélységeibe merülnénk, ejtsünk néhány szót az oxigéntárolás/szállítás szerepéről. Anyagcserénk oxigén nélkül elképzelhetetlen lenne, ez könnyen belátható, ha csak a terminális oxidáció irdatlan oxigénigényére gondolunk. A hemoglobin vitathatatlan szerepét az oxigénszállításban aláhúzza a megfigyelés, mely szerint a hemoglobinmentes vér oxigénkoncentrációja 5 ml oxigén/liter, mindez hemoglobinnal 250 ml oxigén/liter.

A hemoglobin, mint minden hemoprotein, vasat (Fe[II]) és az azt koordináló protoporfirin-IX vázat tartalmaz. Ez a váz adja a hemoproteinek jellegzetes színét. A vas koordinációs kötései közül 4 a protoporfirin gyűrű N-atomjaival jön létre, 2 további kötés a hem síkjának két oldalán. Egy a globinlánc egy (proximális) hisztidinjével jön létre, ebben az irányban kiemelkedik a dezoxi-hemoglobinban a porfinváz síkjából a vasatom. A másik oldalon található az oxigén kötőhely. Itt érdemes megjegyeznünk, hogy a szén-monoxid igen veszélyes, mivel 300-szor jobban kötődik a hemoglobinhoz, mint az oxigén. Fontos tudnunk, hogy kizárólag a ferro(II)-hemoglobin köt oxigént, a ferri (III) vagy más néven methemoglobin nem képes oxigént kötni.

Ha végignézzük a hemoproteinek funkcióit, megállapíthatjuk, hogy az oxigénszállítás, kötés (Hb, Mb) Fe (II) állapotban valósul meg, azonban az elektrontranszfer-reakciókban résztvevő hemoproteinek (pl. citokrómok) esetében fontos szerepet kap a Fe (II) – Fe (III) átmenet, hasonlóan a redoxireakciókhoz (pl. citokróm P450 enzimek), ahol a Fe (II) megköti az oxigént majd redukálja, miközben Fe (II) – Fe (III) átmenet következik be.

A rövid kitérőt követően térjünk vissza a két molekula térszerkezetéhez. A hemoglobint tehát 4 polipeptidlánc alkotja, melyek mindegyikéhez egy-egy hem tartozik. Ezekhez egy-egy oxigénmolekula kötődhet. A felnőtt hemoglobin A-t (adult) két alfa és két béta lánc alkotja (3.9. ábra). A magzati hemoglobin F (foetalis) két alfa és két gamma láncból áll. A láncokat ionos és apoláris kötések tartják össze. Ha egy pillantást vetünk a mioglobin és a hemoglobin oxigéntelítési (szaturációs) görbéjére (3.10. ábra) megállapíthatjuk, hogy azok jelentős különbséget mutatnak, míg a mioglobin klasszikus hiperbolikus telítési görbével jellemezhető, addig a hemoglobin telítési görbéje szigmoid.

3.10. ábra - A hemoglobin és a mioglobin oxigéntelítési (szaturációs) görbéje


Enzimszabályozás

Az ábrát figyelmesebben tanulmányozva megállapíthatjuk, hogy a mioglobin alkalmatlan az oxigénszállításra, mivel a szövetekben nem képes leadni azt. Láthatjuk, hogy a hiperbolikus telítési görbe miatt a tüdőre jellemző oxigén parciális nyomáson telítődik (közel 100%-os szaturáció) oxigénnel, azonban a szövetekre jellemző parciális nyomáson még mindig igen magasan halad a görbe. A parciális nyomáskülönbségek csak igen csekély mértékű oxigén leadását tennék lehetővé (3.10. ábrán magenta nyilakkal jelölt). Nagyobb mennyiségű oxigén leadása csak igen csekély oxigén parciális nyomás mellett lehetséges. Ezzel függ össze a mioglobin fiziológiás szerepe: az izmokban történő oxigéntárolás. Oxigén tárolására kifejezetten kedvező ez a karakterisztika.

A mioglobinnal szemben a hemoglobin szigmoid telítési görbével jellemezhető, így a tüdőben telítődik oxigénnel (közel 100%-os a szaturáció ebben az esetben is), a szövetekben tapasztalható alacsonyabb parciális nyomáson pedig leadja azt (3.10. ábrán kék nyíllal jelölve). A hemoglobin így ideális jelölt az oxigén szállítására. Mi állhat az eltérő karakterisztika hátterében? Ahogy azt korábban említettük, a fehérjék szerkezete és funkciója között szoros összefüggés van. A mioglobin monomer, így a szokásos hiperbolikus telítési görbével jellemezhető, a hemoglobin azonban tetramer, melynek láncai között érvényesül a kooperativitás, ami szigmoiddá teszi telítési görbéjét.

Lássuk csak, hogyan támogatja a hemoglobin szerkezete a kooperativitás megvalósulását! Amennyiben a hemoglobin négy alfa vagy négy béta-láncból állna, hiperbolikus oxigéntelítési görbéje lenne. A deoxihemoglobinban (oxigént nem kötő forma) a vasatom 0,06 nm-rel kilóg a porfiringyűrű síkjából (3.11. ábra). Az oxigénkötés megváltoztatja a hemoglobin negyedleges szerkezetét. Az oxigén megkötésével a vasatom behúzódik a gyűrűbe, a vele kovalensen összekötött fehérjelánc szerkezete is megváltozik, ezért megváltoznak az alfa- és béta-láncok közötti H-híd-kötések és apoláris kölcsönhatások, valamint felszakad a deoxihemoglobint stabilizáló 8 ionpár.

3.11. ábra - A hemoglobin oxigénkötésre elszenvedett térszerkezet-változása


Enzimszabályozás

A deoxihemoglobinban tehát ionpárok kötik össze a globinláncokat (Tense forma), míg az oxihemoglobinban (Relaxed forma) ezek felszakadnak. Így már érthető, hogy miért lesz szigmoid a hemoglobin oxigéntelítési görbéje, hisz a feszített deoxi-formát stabilizáló ionpárok akadályozzák az oxigén megkötését. (A deoximioglobin és az oximioglobin szerkezete hasonló.) Felmerül a kérdés, hogy mi stabilizálja a deoxihemoglobin negyedleges szerkezetét?

A válasz megadásában segít a megfigyelés, mely szerint a hemoglobinoldatban nagyobb affinitással köti az oxigént, mint a vörösvértesten belül. Tehát a sejten belül valami lerontja a hemoglobin oxigén iránti affinitását.

Ez a „faktor” egy glikolízis-mellékreakció során képződő, a vörösvértestben nagy mennyiségben termelődő kis molsúlyú anyag, a 2,3-biszfoszfoglicerát (3.12. ábra).

3.12. ábra - A 2,3-biszfoszfoglicerát

Nézzük meg, pontosan milyen szerepet tölt be a 2,3-biszfoszfoglicerát a hemoglobin-oxigénkötés szabályozásában! A 2,3-biszfoszfoglicerát ekvimorális arányban kötődik a deoxihemoglobinhoz, 1 tetramer hemoglobin-molekula 1 molekula 2,3-biszfoszfoglicerátot (2,3-BPG) köt. A 2,3-BPG-nek fiziológiás viszonyok között 5 negatív töltése van (3.12. ábra). A hemoglobin 2,3-BPG kötőhelyét a béta-láncok 4 His, illetve 2 Lys aminosava alakítja ki. A pozitív töltésű aminosav-oldalláncok és a negatív töltésű 2,3-BPG közötti kölcsönhatások olyan kötődést hoznak léte, amely stabilizálja a deoxi-Hb negyedleges szerkezetét (3.13. ábra).


Enzimszabályozás

A 2,3-BPG az oxihemoglobinhoz nem kötődik, az oxigenálódás folyamán a láncok elmozdulása miatt a BPG kötőhely megváltozik, szűk lesz a 2,3-BPG számára. Így az 2,3-BPG tulajdonképpen a hemoglobin allosztérikus regulátora.

3.13. ábra - A hemoglobin és a 2,3-biszfoszfoglicerát kapcsolata

A 2,3-BPG koncentrációja nagyjából 4,5 mM és szabályozott; a szabályozás pontos mechanizmusa jelenleg ismeretlen.

A glikolízisben résztvevő egyes enzimek szintézisének zavarai a vörösvértestekben befolyásolják a 2,3-BPG szintet. Így hexokináz-hiányos állapotokban a 2,3-BPG szint csökken, ezért az oxigéntelítési görbe balra tolódik, a hemoglobin oxigénaffinitása nő.

Piruvát-kináz hiányos állapotokban a görbe jobbra tolódik, mert a 2,3-BPG koncentráció emelkedett, a hemoglobin oxigénaffinitása csökken.

A krónikus hipoxia esetén a 2,3-BPG szint megemelkedik 4,5 mM-ról 8,0 mM-ra. Magaslati levegőn (4500 m) 2 nap alatt 7,0 mM-ra emelkedik. Tulajdonképpen ezt használják ki a hegymászók és ezért építenek akklimatizációs táborokat. Ilyenkor, pár nap alatt megemelkedik a vér 2,3-BPG szintje, aminek hatására a hemoglobin oxigénkötése leromlik, így nagyobb lesz a tüdő és szövetek telítettsége közötti különbség, jobbra tolódik a hemoglobin oxigéntelítési görbéje és jóval nagyobb mennyiségű oxigént tud leadni a szövetekben. Tengerszintre visszatérve a 2,3-BPG szintje viszonylag gyorsan visszaáll.

A tárolt vér 2,3-BPG tartalma folyamatosan csökken, ezért oxigén affinitása nő. Transzfúzió esetén ez előnytelen, ezért a tárolt vérhez inozint adnak, amelynek hatására 2,3-BPG képződik a glikolízis során.


Enzimszabályozás

A hemoglobin F kisebb mértékben köti a 2,3-BPG-t, mint a Hb A, így a Hb F oxigénaffinitása nagyobb, mint a Hb A-é. A Hb F Hb A-nál nagyobb oxigénaffinitása elősegíti az oxigén bejutását az anyai keringésből a magzati vérkeringésbe.

Bohr-effektus

A hemoglobin és a mioglobin között további lényeges különbség az, hogy a hemoglobin protonokat és széndioxidot is köt, illetve szállít. A pH csökkenésével a hemoglobin oxigénaffinitása csökken (pH 7,6 – pO 2= 40 Hgmm értéknél a visszatartott oxigén 80%, míg pH 6,8 – pO 2= 40 Hgmm értéknél a visszatartott oxigén 45%). A keletkezett széndioxid kb. 15%-a a hemoglobinhoz kötődik. Fokozott anyagcsere (pl. izommunka) esetén több széndioxid termelődik, ilyenkor az oxigénszükséglet is fokozódik. A laktáttermelés megemelkedik, a vér pH értéke csökken, a hemoglobin oxigéntelítési görbéje jobbra tolódik (3.14. ábra). A jelenséget Christian Bohr dán fiziológus (Niels Bohr fizikus édesapja) írta le, tiszteletére Bohr-effektusnak nevezték el. A képződött széndioxidot, illetve a protonok egy részét a hemoglobin úgy köti meg, hogy a béta-lánc N-terminális aminocsoportjával karbamátot (OOC-HN-R) képez. További sókötések jönnek létre, ami tovább csökkenti a hemoglobin oxigén affinitását. A tüdőalveolusokban a hemoglobin leadja a felvett széndioxidot, illetve protonokat és oxigént vesz fel. Mindezek eredményeképpen fokozott izommunka során a szövetekben leadható oxigén mennyisége jelentősen megnő.

3.14. ábra - A hemoglobin oxigéntelítési görbéje különböző pH-értéken (Bohr-effektus)


Enzimszabályozás

2. 3.2. Fehérjék térszerkezetének, aktivitásának befolyásolása foszforiláció/defoszforiláció általMíg az előző fejezetben ismertetett allosztérikus szabályozás során a regulátormolekula másodrendű kötésekkel pillanatszerű asszociáció/disszociáció során kapcsolódott a fehérjéhez és így igen gyorsan bekövetkezett a térszerkezet-/aktivitásváltozás, addig a fehérjék foszforilációja kovalens módosításról lévén szó: 1. jóval lassabb, 2. tartósabb, 3. enzim-katalizált (mind a foszforiláció, mind a defoszforiláció) folyamat (3.15. ábra). A kétféle szabályozási mód (allosztérikus, foszforiláció/defoszforilációval történő) kiegészíti egymást az eukarióta sejtekben.

A foszforiláció két módon is érintheti, módosíthatja a fehérjéket:

1. Minden PO4 csoport 2 negatív töltést hordoz. Ennek következtében jelentős szerkezeti változást generálhat: pl. pozitívan töltött aminosav részleteket vonzhat magához. A foszfátcsoportot eltávolítva természetesen visszaáll az eredeti helyzet.

2. A fehérjéhez kapcsolódott foszfátcsoport egy olyan szerkezet része is lehet, amelyet más fehérjék kötőhelye ismer fel. Nagyobb fehérjékben gyakran fordulnak elő olyan kis fehérjedomének, modulok, amelyek kötőhelyül szolgálhatnak más foszforilált fehérjék részére. Egy ilyen modul az SH2-domén, amely foszfotirozint tartalmazó peptidszakaszokhoz köt, de rajta kívül még vagy 10 hasonló fehérjerészlet ismeretes. A foszforiláció ilyeténképp fehérjeszerkezetek össze- és szétszerelésében is fontos tényező.

A fehérjefoszforiláció mint szabályozási mechanizmus elterjedtségét mi sem mutatja jobban, mint az a megfigyelés, mely szerint az emlőssejtek 10 000 fehérjéjének mintegy harmada található foszforilált állapotban az adott pillanatban. A PO4

3--csoport az ATP-terminális foszfátcsoportjának terhére történő felvitelét transzferázok, a protein kinázok katalizálják (3.15. ábra).

3.15. ábra - Fehérje foszforiláció/defoszforiláció

Az ATP hidrolízis miatt a reakció egyirányú. A sejtben több száz különböző protein kináz található, amelyek a fehérjék szerin-/treonin- (Ser/Thr kinázok) vagy tirozin (Tyr kinázok) oldalláncainak hidroxilcsoportjára


Enzimszabályozás

transzferálják a foszfátcsoportot (3.16. ábra).

3.16. ábra - Szerin-/treonin- és tirozin-foszforiláció

A foszfátcsoport eltávolítását a foszfoprotein-foszfatázok katalizálják. Hasonlóan a kinázokhoz a sejt foszfoprotein-foszfatázok tömkelegét tartalmazza, amelyek specificitása jelentős különbséget mutat, némelyikük a fehérjék tágabb csoportját képes foszforilálni, vagy defoszforilálni, míg mások kizárólagosan csak egy fehérjével képesek ezt megtenni.

A protein kinázok egy nagy enzimcsalád tagjai, amelynek tagjai egy nagyjából 290 aminosavas-katalitikus (kináz) doménnel rendelkeznek. A fehérjelánc további részei nagyobb változatosságot mutatnak az egyes családtagok között (3.17. ábra). Ezek felelősek a szubsztrát felismerésért, illetve a kinázaktivitás szabályozásáért.

3.17. ábra - Protein kináz háromdimenziós szerkezete


Enzimszabályozás

A kinázok szabályozása elsősorban két módszerrel történik: különböző ligandok indikálta allosztérikus szabályozással (Pl.: cAMP, Ca2+-kalmodulin), illetve másik kináz által. Az utóbbi lehetőséget ad a különböző jelátviteli utak közötti kommunikációra, illetve a foszforilációs kaszkádok által a jel igen nagyarányú felerősítésére (kaszkáderősítő) (3.18. ábra).

3.18. ábra - Kináz-kaszkád-erősítő


Enzimszabályozás

A foszfátcsoport bevitele tehát szerkezetváltozást indukál a fehérjemolekulában, amit eltávolítása függeszt fel. Ezáltal a módszer alkalmas fehérjék/enzimek ki- és bekapcsolására, vagy más fehérjékhez, illetve DNS-hez történő kapcsolódás/lekapcsolódás kiváltására. Hogy a foszforilált, vagy a defoszforilált forma-e az aktív forma, arról általánosságban nem lehet nyilatkozni. Amennyiben a foszfátcsoport bevitele okozta térszerkezet-változás bekapcsolja a fehérjét, akkor a defoszforiláció kikapcsolja. Természetesen ez fordított irányban is lehetséges, a foszforiláció kikapcsolja, a defoszforiláció bekapcsolja az adott fehérjét (3.19. ábra).

3.19. ábra - Fehérjék aktivitásának befolyásolása foszforilációval/defoszforilációval


Enzimszabályozás

3. 3.3. Limitált proteolízisA harmadik (már kész) fehérjék aktivitásának szabályozására alkalmas módszer neve is igen beszédes:

Proteolízis: peptidkötések hasítása,

Limitált: csak jól definiát helyen történik.

A módszer által elérhető, hogy kizárólag a betöltött funkció helyén (erre jó példa az emésztőenzimek aktiválása, amelyek kizárólag a gyomorba/bélbe jutva aktiválódhatnak, nehogy megemésszék az előállító szövetet), illetve bizonyos körülmények között (erre jó példát szolgáltatnak a véralvadási enzimek, amelyek kizárólag érfal sérüléskor aktiválódhatnak) legyenek aktívak. A limitált proteolízissel aktiválódó fehérjék, enzimek előalakként, zimogén formában szintetizálódnak, majd később aktiválódnak, miközben adott helyen hasad a fehérjeláncuk. Fehérjehidrolitikus enzimek másik szabályozási módja a proteázinhibítorokon keresztüli szabályozás. Röviden erről is szólunk.

3.1. 3.3.1. Inaktív zimogének és aktiválódásukA limitált proteolízissel aktiválódó fehérjék két különböző stratégiát választhatnak:

1. Az aktív centrum kialakul a szintézist követően, de a fehérje egy másik része lefedi (erre szolgáltat jó példát a pepszinogén).

2. Az aktív centrum csak a limitált proteolízist követő szerkezetváltozás kapcsán alakul ki (erre szolgáltat jó példát a tripszinogén).

Vegyük szemügyre alaposabban mindkét esetet:

3.1.1. 3.3.1.1. Pepszinogén

A pepszinogént a gyomor fősejtjei termelik, gasztrin stimulusra szekretálódik. Meglehetősen széles


Enzimszabályozás

szubsztrátspecificitással rendelkezik, az aromás aminosavak és dikarbonsavak melletti peptidkötéseket bontja.

A pepszin zimogén előalakjából a pepszinogénből keletkezik. Aktív centruma már a pepszinogénben kialakul, de az aktivitásért felelős két aszpartát ionos kötést létesít az előalak távolabbi részén található argininekkel, lizinekkel. Ezek az ionos kötések savas pH-n (pH<5) megszűnnek, mivel az aszpartát karboxil csoportjának disszociációja visszaszorul. Ekkor a fehérjelánc kinyílik és a térszerkezet-változásnak köszönhetően önemésztődik az előalak és kialakul a teljes aktivitással rendelkező pepszin (3.20. ábra).

3.20. ábra - A pepszinogén aktiválódása limitált proteolízissel

3.1.2. 3.3.1.2. Enterális proteázok zimogénjei

Az enterális proteázok, előalak formájában, a hasnyálmirigyben termelődnek, ahonnan szekretin és kolecisztokinin stimulusra a vékonybélbe választódnak ki. Ezt követően a vékonybélben termelődő enteropeptidáz a tripszinogént limitált proteolízissel tripszinné alakítja, majd ez végzi a többi enzim aktiválását (kimotiszinogén, proelasztáz, prokarboxipeptidáz-A) (3.21. ábra). Amennyiben az enzimek aktiválása hiányt szenved, emésztési gondokkal, amennyiben viszont túlaktiválás (illetve túl korai aktiválás) következik be, nekrotizáló hasnyálmirigy gyulladással (pancreatatis) kell szembenézni.

3.21. ábra - Az enterolis proteázok zimogénjükből történő aktíválódása limitált proteolízissel


Enzimszabályozás

3.1.3. 3.3.1.3. Proteázinhibitorok

A két legismertebb proteázinhibítor a pancreas tripszininhibitor és az α1–proteáz inhibitor.

A Pancreas tripszininhibítor tulajdonképpen egy 6000 Da-os műszubsztrát, amelyet a tripszin nagyon lassan bont a Lys15 – Ala16 aminosavak között több hónapos féléletidővel.

Az α1–proteázinhibítor egy akut fázisfehérje, feltehetően a Ser-proteázokkal behatoló baktériumokkal szembeni védekezés fontos eleme. Elsősorban elasztázinhibitor, de gyakorlatilag bármely szerinproteázt gátolja. Az inhibítor COO--csoportja és a Ser OH-ja között lassan hidrolizáló észterkötés alakul ki.

A Met358 nélkülözhetetlen az enzimkötődésben. Dohányosokban ez a metionin oxidálódik metionin-szulfoxiddá és ezáltal inaktíválódik. Az elégtelen inhibitorfunkció veleszületett is lehet. Ennek következtében az elasztázok kontrollálatlanul működnek, melynek legszembetűnőbb következménye a tüdőtágulás (emphysema).


4. fejezet - Fehérjefolding, fehérjelebontás – ubikvitin-proteaszóma rendszerUgyan a fehérjék végleges, funkcionális térszerkezetének felvétele, a szintézisüket követő feltekeredésük, foldingjuk szorosan nem tartozik a biokémiai szabályozástechnika témakörébe, röviden mégis foglalkozunk vele. Tesszük ezt legalább két ok miatt. Ahogy korábban láttuk, a fehérjék térszerkezete, annak megváltozása direkt kapcsolatban van funkciójuk megváltozásával. A hibásan feltekeredett fehérjék, az ismételten sikertelen feltekeredésüket követően egy központi lebontó apparátus, az ubikvitin-proteaszóma rendszer ügyfelei lesznek. Szintén ennek a fehérjelebontó rendszernek ügyfelei lesznek azok a fehérjék, amelyekre már nincs szükség, így a fehérjék élettartam-szabályozásán keresztül a tématerület végső soron kapcsolódik a sejtben zajló szabályozástechnikai folyamatokhoz. Végül, de nem utolsó sorban, rendkívül érdekes, ezért sem lenne érdemes megfosztani magunkat tárgyalásától.

1. 4.1. Poszttranszlációs módosulásokA transzláció során szintetizált fehérjeláncok jelentős része további reakciók tárgya lesz, hogy elnyerje végső, biológiailag aktív formáját. Ezeket a transzlációt követő, fehérjeláncot érintő reakciókat összefoglalóan poszttranszlációs módosulásoknak nevezzük. Poszttranszlációs módosulásokon mind a prokarióta, mind az eukarióta sejtek fehérjéi keresztülmennek.

1.1. 4.1.1. FehérjefoldingA fehérje foldingja során elnyeri aktív háromdimenziós konformációját. Lezajlanak a poszttranszlációs módosulások, illetve a fehérjelánc hidrofób részeit befelé fordítja, kvázi beburkolja külső hidrofil felszínével, elzárja a vizes közegtől. Így a vizes közegben energetikailag kedvezőbb szerkezetet vesz fel.

A foldingnak viszonylag gyorsan kell lezajlania. Ezt támogatja a kialakult aminosav sorrend is a fehérjékben.

Számos esetben, ahogy az N-terminális megszintetizálódik a riboszómán, elkezdődik a lánc feltekeredése. A több doménnel rendelkező fehérjék néhány másodperccel a riboszómát elhagyva már egy viszonylag kompakt szerkezetet vesznek fel, amely többé-kevésbé tartalmazza a másodlagos szerkezetet (α-hélix, β-redő). A legtöbb fehérje esetében ez a flexibilis és viszonylagosan nyitott szerkezet az „olvadt gombóc” állapot a kiindulópont a további foldinghoz, amely során kialakul a másodlagos kötésekkel stabilizált végleges negyedleges szerkezet.

Egy átalagos fehérje szintézise néhány percen keresztül folyik, számos fehérje esetében a folding jelentős része lezajlik, mire a C-terminális szabaddá válik a riboszómáról (4.1. ábra).

4.1. ábra - Fehérjék transzlációjával párhuzamosan zajló folding


Fehérjefolding, fehérjelebontás – ubikvitin-proteaszóma rendszer

Az „olvadt gombóc” állapotból több lehetséges út vezethet a végleges szerkezetig. Ezen útvonalak intermedierei aggregálódhatnak, ezáltal lekerülhetnek az útvonalról, végső soron mint sikertelen folding-próbálkozások megemésztődhetnek.

Ezeket a részlegesen, vagy nem megfelelő módon feltekert fehérjéket a hősokk-fehérjék tudják megóvni az aggregációtól, illetve segítségükre vannak a helyes térszerkezethez vezető út megtalálásában is.

1.1.1. 4.1.1.1. Hősokk-fehérjék – molekuláris chaperonok

Radioaktív aminosavakkal követett fehérjeszintézis és foldingkísérletek során kimutatták, hogy a fehérjék 20%-a hsp70, 10%-a pedig hsp60 ügyfél. Mindkét fehérje saját segédfehérjék kis csoportjával dolgozik együtt, hogy más fehérjék feltekeredését segítsék.

A hsp70 már a szintézis során, mielőtt az még elhagyná a riboszómát, hozzákapcsolódik a fehérjék nagyjából hét aminosav hosszú hidrofób aminosav részleteihez (4.2. ábra).

4.2. ábra - A hsp70-család munka közben

Ezzel szemben a hsp60-szerű fehérjék egy nagy hordóalakú szerkezetet alkotnak, amelyek a teljes fehérjelánc szintézisét követően lépnek csak működésbe (4.3. ábra). Gyakorlatilag egy „izolációs kamrába” kerül a fehérje, amely megakadályozza aggregációját és kedvező feltételeket teremt a folding újbóli megkísérléséhez. Működésük során a hősokk-fehérjék ATP-t használnak fel, hogy helyes konformációba tekerjék a fehérjeláncokat.



Ugyan most csak két hősokk fehérjéről szóltunk, azt meg kell említenünk, hogy a különböző sejtszervecskékben számtalan ilyen fehérje található és vesz részt a fehérjék megfelelő térszerkezetének kialakításában.

4.3. ábra - A hsp60 család szerkezeti felépítése és működése

Jogosan merül fel bennünk a kérdés, hogyan ismerik fel, választják ki a hősokk fehérjék a helytelen térszerkezettel rendelkező fehérjéket?

A tökéletlen folding miatt a részlegesen, vagy teljesen feltekeredni képtelen fehérjék esetében hidrofób felület marad, ehhez a hősokk fehérje köt. Egyfelől megakadályozza az aggregációját, másfelől segíti a refoldingot.

A fehérjék előtt foldingjukat illetően tehát 4 különböző út állhat:1. kapásból kialakul a megfelelő térszerkezet; 2. hősokk fehérjék segítségével, refoldingot követően alakul ki a helyes térszerkezet; 3. nem alakul ki a megfelelő térszerkezet és a sejt lebontja; 4. aggregálódik (amennyiben ennek mértéke bizonyos határt átlép, az a sejt pusztulását okozhatja) (4.4. ábra).

4.4. ábra - Fehérjeminőségi kontroll

Az első két lehetséges útvonalról már röviden szóltunk, ezt követően vizsgáljuk meg a sérült, nem megfelelő módon feltekert vagy már szükségtelenné vált fehérjék lebontását.

2. 4.2. Sérült fehérjék proteolíziseA folyamat a fehérjék felületén rendellenesen elhelyezkedő hidrofób rész(ek) felismerésével kezdődik, majd a komplex proteolítikus rendszerhez, a proteaszómához történő szállítással folytatódik, ahol legvégül rövid peptidekre történő bontásukkal fejeződik be.

2.1. 4.2.1. ProteaszómaA sejtek meglehetősen gyorsan igyekeznek megszabadulni a transzlációs, illetve folding hulladékfehérjéktől. Az újonnan szintetizált fehérjék mintegy 1/3-át lebontásra ítéli a fehérjeminőségi kontroll.

A fehérjék számára a végállomást egy ATP-dependens proteázkomplex, a proteaszóma jelenti, amely a sejt fehérjéinek mintegy 1 %-át alkotja. A proteaszóma számos kópiában megtalálható a citoszolban és a nukleuszban is. Ezen kívül endoplazmás retikulumba irányított fehérjéket is bont. Amennyiben az endoplazmás retikulum fehérjéinek foldingja, illetve összeszerelése sikertelen, érzékeli egy endoplazmás retikulum



lumenében található minőségellenőrző rendszer. A minőségi kontrollon megbukott fehérjék retrotranszlokációra kerülnek és a citoszolban található proteaszómákon kerülnek lebontásra.

2.1.1. 4.2.1.1. A proteaszóma felépítése

Minden proteaszóma két fő szerkezeti elemből, egy üreges csőből és a hozzá kapcsolódó sapkából áll. Az üreges cső a 20S magi proteaszóma. Több fehérje alegységből épül fel, amelyek 4 heptamerikus gyűrűt alkotnak (4.5. ábra). Alegységeinek egy része különböző proteáz, amelyek aktív helye a cső belseje felé néz. A cső mindkét vége egy nagy fehérjekomplex-szel a 19S sapkával asszociál. A 19S sapka hozzávetőlegesen 20 különböző polipeptidből áll. Ebből 6 ATP hidrolízisére képes, a cső végénél ezek az ATP-ázok kitekerik a fehérjéket és a cső belsejébe juttatják, ahol lezajlik proteolízisük. A proteaszóma kritikus sajátsága és egyben komplexitásának oka, hogy egy sima proteázzal ellentétben az első peptidkötés után is megkötve tartja a fehérjét és csak akkor engedi el, ha már apró darabokra hasogatta. A 19S sapka, mint egy szabályozott kapu működik, eldönti, hogy beengedje-e a proteolítikus bendőbe a fehérjét. Szintén ez a szerkezeti elem felel a célfehérjék proteaszómához kötéséért.

4.5. ábra - A proteaszóma felépítése



2.2. 4.2.2. A „halál csókja” – UbikvitinációKevés kivételtől eltekintve a proteaszóma olyan fehérjéket köt, majd hasít, amelyek egy speciális jellel rendelkeznek. A „halál csókja” egy 76 aminosavból álló polipeptid, az ubikvitin (általában több kópiában), kovalensen kötődik. A sejtben mind szabad formában, mind fehérjéhez kötötten előfordul. A fehérjéhez kapcsolt ubikvitinláncnak többféle jelentése is lehet, attól függően, hogy hány ubikvitinmolekula és milyen módon kapcsolódik össze (4.6. ábra).

4.6. ábra - A fehérjéhez kapcsolt ubikvitinláncok különböző szignaling jelentése



A lebontásra ítélt fehérjéket egy kifinomult ubikvitinkonjugáló rendszer jelöli meg. Az ubikvitint egy ATP-függő ubikvitin aktiváló enzim (E1) teszi alkalmassá a fehérjékhez történő kötődésre, konjugálódásra. A konjugálódásra előkészített ubikvitin az E1-ről szinte azonnal az E2 ubikvitin konjugáló enzimre kerül. Az E2 az E3 kiegészítő fehérjével együtt látja el feladatát. Az E2-E3 komplexet ubikvitin-ligáznak is nevezik. Az E3 a célfehérjén belül specifikus degradációs szignálokhoz kötődik, segítve az E2-t, hogy poliubikvitin-láncot kössön a szubsztrátfehérje egy lizin oldalláncához. Az ubikvitin C-terminálisa az őt megelőző ubikvitin egy lizinéhez kapcsolódik, így létrehozva a poliubikvitin-láncot. Ezt a poliubikvitin-láncot ismeri majd fel a proteaszóma receptora (4.7. ábra).

4.7. ábra - A fehérjék ubikvitinációja

Emlős sejtekben nagyjából 30 strukturálisan hasonló, de különböző E2, illetve több száz különböző E3 található, amelyek mind specifikus E2-enzimekhez kapcsolódnak. A sejtekben tehát több hasonlóan szervezett, de különböző, specifikus ubikvitin-proteoszóma útvonal található. Ezeknek közös a kiindulópontja (E1-enzim) és a végállomása (proteaszóma).

A különböző ubikvitin-ligázok különböző degradációs szignálokat ismernek fel. Degradációs szignál lehet:

• denaturált,

• téves térszerkezetű fehérje,



• oxidált aminosav(ak),

• módosult (károsodott) aminosav(ak).

Normálisan ezek a szignálok a fehérje belsejében helyezkednek el, így nem jelentenek „veszélyt” a megfelelően feltekert fehérjék számára. Felmerül a kérdés, hogy mi a helyzet a készülő/félkész fehérjékkel, amelyek így még a felszínükön degradációs szignálokat tartalmaznak? Úgy tűnik, hogy ezek igen gyakran az ubikvitin-proteaszóma rendszerbe kerülnek és lebontódnak.

2.3. 4.2.3. Számos fehérje irányított lebontás révén szabályozottAz ubikvitin-proteaszóma rendszer lehetőséget ad a rövid féléletidejű fehérjék életidejének szabályozására is. Egyes fehérjék mindig rövid életűek, míg mások életideje függ a sejt állapotától. Bizonyos metabolikus állapotban stabilak, míg egy másikban rövid életidejűek. Ez utóbbiakra jó példát szolgáltatnak a mitotikus ciklinek, amelyek stabilak egészen a mitózis végéig.

Felmerül a kérdés, hogyan kontrollált a fehérjék szabályozott lebontása?

Egyfelől lehetőség van az ubikvitin-ligáz szabályozására bármelyik korábban ismertetett módon: 1. foszforiláció által, 2. allosztétikus ligand által, 3. fehérjemolekula által (4.8. ábra).

4.8. ábra - Az ubikvitin-ligáz szabályozása

Másfelől a folyamat szabályozható a degradációs szignálon keresztül. Intracelluláris vagy környezeti hatásra degradációs szignál keletkezhet a molekulán belül 1. foszforilációval, 2. de/maszkoló fehérje, fehérjealegység disszociációja révén, 3. proteolízissel (4.9. ábra).

4.9. ábra - Degradációs szignálok kialakulása


5. fejezet - A génexpresszió szabályozásaAz előző fejezetek során megvizsgáltuk, miképpen lehet a már elkészült fehérje aktivitását, illetve annak élettartamát befolyásolni. Tekintve, hogy a fehérjeszintézis meglehetősen nagy energiaigénnyel bír, mindenképpen célszerű az adott fehérje iránti igénynek megfelelően, már korábban szabályozni a gének átírását. Így mind az RNS szintézise (transzkripció), mind az azt követő érési folyamatok, a fehérje szintézise, illetve az azt követő érési folyamatok elkerülhetőek, megspórolhatóak (5.1. ábra). Természetesen ez a szabályozási mód jóval hosszabb átfutási idővel rendelkezik, ebben az esetben órák, napok alatt lehetséges az egyes folyamatok aktivitásába beavatkozni.

5.1. ábra - A molekuláris biológia centrális dogmája

A molekuláris biológia centrális dogmája (5.1. ábra) értelmében (néhány RNS-vírus kivételével) minden fehérjeszerkezetre vonatkozó információ, illetve azok kifejeződésének körülményei a sejt DNS-állománya által meghatározott. Természetesen néhány fontos pontosítást, körülményt figyelembe kell vennünk:

Az RNS a nukleuszból történő kilépés előtt érik, illetve a splicing merőben megváltoztathatja az információ jelentését.

1. 5.1. Génexpresszió, a gén kifejeződéseEgy bakteriális DNS-állomány általában néhány millió bázispárból (bp) áll. A mi emberi genomunk mintegy 3*109 bp-t számlál. Bár igen jelentős tudományos siker volt a humán genom szekvenciájának megismerése, a nukleotid sorrend önmagában értelmetlen adathalmaz. A nukleotid szekvenciák ismerete nem tesz minket képessé arra, hogy pusztán rájuk alapozva létrehozzunk egy élőlényt, ahogy angol szavak tömkelege sem tesz képessé minket arra, hogy pusztán rájuk alapozva rekonstruáljuk Shakespeare bármely művét. Hiszen teljes joggal tehetjük fel a következő kérdések bármelyikét: Mikor, milyen körülmények között készül az adott gén terméke és ha elkészült mit tesz?

A következő fejezetben szeretnénk tisztázni a génexpresszió szabályozásának legfontosabb szabályait, illetve mechanizmusát. Mindazokat a szabályokat, amelyek alapján a gének egy alcsoportja szelektíven kifejeződik az egyes sejtekben.

1.1. 5.1.1. SejtdifferenciációA különböző sejttípusok (pl. emlős neuron, hámsejt…) mind szerkezetileg, mind funkcionálisan annyira különböznek, hogy nehéz elképzelni, hogy ugyanazt a genomot tartalmazzák. Ezért, valamint amiatt, hogy a sejtdifferenciáció gyakran irreverzibilis, a biológusok kezdetben azt hitték, hogy a differenciálódás során a gének szelektíven elveszhetnek a sejtből. Ma már tudjuk, hogy a sejtdifferenciáció a génexpresszió megváltozását jelenti, nem pedig a nukleotidszekvencia megváltozását. A háttérben tehát nem a különböző DNS, hanem a különböző RNS, illetve fehérjeállomány áll.

Ez utóbbi kijelentést kísérleti bizonyítékkal is alátámasztották.1958-ban, John Gurdon és munkatársai, az Oxfordi Egyetem kutatója, afrikai karmosbékán (Xenopus laevis) végzett kísérleteik során egy teljesen


A génexpresszió szabályozása

differenciálódott békasejtmagot egy sejtmagtalanított békapetesejtbe ültettek. A beültetett sejtmaggal a petéből egy teljesen életképes, normális ebihal keletkezett. Tekintve, hogy az ebihal a differenciálódott sejtek legkülönbözőbb együttesét tartalmazza, bizonyítottá vált, hogy a differenciálódott (és később beültetett) sejt nem vesztette el egyetlen fontos géndarabját sem (5.2. ábra).

5.2. ábra - A sejtdifferenciáció a génexpresszió megváltozása, nem a nukleotidszekvenciáé

Hasonló eredményeket értek el sárgarépa esetében, mikor sejttenyészetbe vitték az izolált sejtet, majd abból egy sejtet kiválasztottak. A későbbiek során belőle teljes, életképes növény növekedett. Emlősök esetében is számos esetben sikerült a fenti tételt bizonyítani: birka (Dolly), kecske, sertés, egér, illetve madarak (liba) esetében is.

A fenti kijelentés alól néhány kivétel azért akad, így például DNS-átrendeződés történik az egyed fejlődése során, pl. az immunrendszer változatosságának kialakulása során.

A sejtdifferenciáció (génexpresszió) mibenléte talán jobban megérthető, ha szemügyre vesszük a sejtek között fennálló különbségeket, azonosságokat.

1.1.1. 5.1.1.1. Azonosságok és különbségek a sejtek között

1. Számos olyan folyamat van, ami közös az egyes sejtekben. Természetesen ezek közös fehérjeállományt igényelnek, jelentenek. Ilyenek például: strukturális fehérjék kromoszómacsomagoló fehérjék, RNS-, DNS-polimerázok, DNS-reparáló enzimek, riboszómális fehérjék, citoszkeletális fehérjék, központi metabolizmus fehérjéi.

2. Ugyanakkor rendkívül nagy különbségeket is tapasztalhatunk, hiszen sok fehérje csak az adott sejttípusban található meg, erre jó példaa csak vörösvértestekben kifejeződő hemoglobin.

3. Adott időben egy átlag humán sejt 10 000-20 000 gént fejez ki a megközelítőleg 25 000-ből. Ha megnézzük a különböző gének expressziós mintázatát, rendkívül nagy variációt láthatunk a különböző sejttípusok között. A különbségek lehetnek annyira élesek, mint a hemoglobin esetében, de a legtöbbször csak finom eltérések fedezhetők fel.

4. Habár nagy az mRNS-beli különbség a különböző sejttípusok között, ezt jóval meghaladja az eltérés, amely a fehérjék esetében tapasztalható. Elsősorban az alternatív splicing, a poszttranszlációs módosulások tovább növelik a különbségeket.

Itt érdemes megjegyeznünk, hogy a legtöbb sejt képes külsődleges jelek hatására megváltoztatni a génexpressziós mintázatát.

Például a májsejtek glukokortikoid hormonok hatására számos fehérje kifejeződését fokozzák. A glukokortikoid hormonok éhezés, intenzív fizikai munka hatására kerülnek elválasztásra és a májsejtek számára jelként szolgálnak, hogy fokozza a glukóz aminosavakból, illetve más kis molsúlyú anyagokból történő előállítását. Ennek eredményeképpen például megnövekszik a tirozin-aminotranszferáz szintje, amely a tirozinból történő



glukózelőállítás fontos kulcsenzime. Amennyiben a hormon szintje lecsökken, vele együtt ezen fehérjék kifejeződése, szintje is csökken.

Más típusú sejtek máshogy reagálnak a glukokortikoid stimulusra. Példának okáért a zsírsejtekben glukokortikoid hatására lecsökken a tirozin-aminotranszferáz szintje, míg más sejtek sehogy sem reagálnak.

A sejtdifferenciáció egyik általános sajátsága, hogy a különböző sejttípusok máshogy reagálnak az extracelluláris szignálokra. Ezzel, megadva az alapot az extracelluláris szignálok kiváltotta szabályozásra. A génexpressziós mintázatnak azonban számos olyan jellemzője van, amely nem változik meg és ezáltal az egyes sejttípusok számára állandó, megkülönböztető karaktert biztosít.

1.2. 5.1.2. A génexpresszió szabályozásának szintjeiA génexpresszió a DNS-től induló, RNS-en keresztül menő, fehérjékig tartó útvonala során számos ponton szabályozható. Röviden tekintsük át milyen szabályozási szintekről beszélhetünk (5.3. ábra).

1. Transzkripciós kontroll: Mikor és milyen gyakran íródik át mRNS-re az adott gén?

2. RNS-processziós kontroll: Az adott mRNS hogyan érik?

3. RNS-transzport kontroll: Melyik érett, komplett RNS exportálódik a sejtmagból és a citoszólban hol lokalizálódik?

4. Transzlációs kontroll: A citoszólban melyik mRNS fog átíródni fehérjére?

5. RNS-degradációs kontroll: Szelektíven destabilizálódó mRNS, amelyről nem készül fehérjelánc.

6. Fehérjeaktivációs kontroll: Szelektíven aktiválódó, deaktiválódó, degradálódó, kompartmentalizálódó fehérjék.

5.3. ábra - A génkifejeződés szabályozásának szintjei

A legtöbb gén esetében a transzkripciós kontroll kiemelkedően fontos. Ez könnyen belátható, ha belegondolunk, ez az egyetlen lehetőség, hogy a sejt ne gyártson felesleges köztitermékeket (5.3. ábra). Mindenképpen a szabályozás egy gazdaságos módjának nevezhetjük, ellenben korántsem a leggyorsabbnak, hiszen a további öt ponton is át kell jutnia a génnek, majd a fehérjének. A 3. fejezetben ismertetett fehérjeaktivációs kontroll ettől jóval gyorsabb beavatkozásra is lehetőséget ad.

A következő fejezetben megtárgyaljuk azon szabályozó DNS- és fehérjeelemeket, amelyek segítségével a transzkripció befolyásolható.



1.3. 5.1.3. A génszabályozó fehérjék DNS-kötő részeiHogy dönti el a sejt, hogy több ezer génje közül melyiket írja át?

Az átírni kívánt génszakasz közelében található egy DNS-regulációs szakasz. Ezek között vannak egészen egyszerűek, mint egy külső szignál által bekapcsolt kapcsoló és egész bonyolultak, mint egy kis mikroprocesszor, amelyek többféle szignált vesznek, kombinálnak és be- vagy kikapcsolják a szomszédos gént.

Mindkét fajta kapcsoló alkalmatosság két fő szerkezeti egységből épül fel. Egy rövid irányító DNS-szakaszból és egy (vagy több) génregulációs fehérjéből, melyek az előbbiekhez kötődnek.

A λ-represszor volt az elsőként leírásra került ilyen DNS-kötő, transzkripciós szabályozófehérje. Letompítja a virális géneket, a vírus alszik, de szaporodik.

A fehérjével interakcióra képes DNS-részletek azonosítása 4 lépésben történhet meg:

1. fehérjeizolálás;

2. specifikus kötődés létrehozása (bizonyítása);

3. a fehérjével kötődő DNS szekvenálása;

4. DNS-lenyomatolás.

Természetesen adódik a kérdés, hogy mi módon ismerik fel a fehérjék a jellegzetes DNS-szekvenciákat? Mi hordozza számukra a kötődéshez szükséges információt?

Tekintve, hogy a DNS-ben tárolt információt a bázissorrend jelenti, az első elképzelés szerint a fehérjék a kettősszálú DNS-ben a bázisok közötti H-hidakhoz férkőznének és ily módon ismernék fel a jellegzetes részleteket. Ekkor azonban fel kellene, hogy nyíljék a kettősszálú DNS-lánc.

Jelenleg már ismeretes, hogy a DNS-t felismerő, azokhoz specifikusan kötő fehérjék a DNS külső felszínét ismerik fel. Így nem szükséges, hogy felnyíljék a DNS-kettősszál. Gondoljunk csak bele: a DNS-ben található mindegyik bázispár éle a DNS-kettőshélix felületén van. Így a felületen a bázisoknak megfelelően különböző funkciós csoportok vannak: H-kötés donorok, H-kötés akceptorok, illetve hidrofób csoportok (5.4. ábra). Ezek a csoportok pedig a bázissorrendnek megfelelően szabályosan váltakoznak. Így tulajdonképpen a DNS felülete is kellő információval szolgál (ha nem is annyira specifikusan, mint a bázisok maguk) a DNS-kötő fehérjék számára a kötődés pontos helyéről (5.4. ábra).

5.4. ábra - A DNS-kötő fehérjék kapcsolódási helye a DNS-molekula külső felszínén



A DNS-ben a párokat alkotó bázisok és a hozzájuk tartozó cukoregységek között létrejövő glikozidos kötések nem pontosan egymással szemben helyezkednek el. Az egyik oldalon 180o-nál nagyobb, a másik oldalon ennél kisebb szöget zárnak be egymással. A kettőshélix külső részét képező dezoxiribóz-foszfát váz csavarulatai között elhelyezkedő, szintén helikális árok ennek megfelelően torzul. Azon az oldalon, ahol a bezárt szög nagyobb, található a nagyobb helikális árok (nagyárok), ahol pedig kisebb, ott a kisárok (5.5. ábra).

5.5. ábra - A nagyárok és a kisárok értelmezése a glikozidos kötések egymással bezárt szögei alapján

A fehérjék számára csak a nagyárokban áll rendelkezésre elegendő információ, így a DNS-kötő fehérjék minden esetben a DNS nagyárkába fekszenek be (5.4. ábra).

Ezeken kívül a hélixben foglalt DNS-szekvenciától függően torzul a hélix és ezek a torzulások is információval szolgálnak a fehérjéknek a megfelelő szakasz felismeréséhez. A DNS-ben szabályosan 36 o a szögelfordulás. Ez azt jelenti, hogy 10 nukleotidpárra jut egy 1 hélixfordulat. Az egymást követő sok AAAA azonban ezt torzítja és egy hajlítást visz a DNS-be.

A DNS szerkezete flexibilis, sokszor a kötődő fehérjéhez illeszkedik, így még erősebbé téve a kötődést. Az energianyereség (ami a deformálódásból, kötődésből származik) nukleotidszekvencia-függő.

A „genetikai kapcsolók” fontos részei a 20 bp-nál rövidebb DNS-szekvenciák, amelyeket a kötőhelyek felismernek. Több ezer ilyen DNS-szekvenciát azonosítottak, amelyeket különböző génregulációs fehérjék, vagy génregulációs fehérjeszettek ismernek fel.

1.4. 5.1.4. DNS-felismerő fehérjeszerkezeti egységekA biológiában, a molekuláris felismerés két molekula felületeinek tökéletes illeszkedésén múlik (ilyen például az antigén-antitest illeszkedés, kapcsolat is). Egy további igen kiváló példa a génregulációs fehérjék és a DNS között kialakuló kapcsolat. A génregulációs fehérje felismeri a specifikus DNS-szakaszt, mivel a fehérje felülete



nagymértékben komplementer az adott régióban a kettős hélix speciális felületi sajátságaival. A fehérje nagyszámú kapcsolódást alakít ki a DNS-sel hidrofób, ionos, H-híd kötések révén. Ezek egyenként gyengék, de a kettő vagy több kapcsolódás erős és specifikus kötődést eredményez (5.4. ábra).

A kapcsolódások mindegyike egyedi, mindegyik fehérje tartalmaz egy speciális DNS kötő szakaszt – ezek rendszerint α-hélixet vagy β-redőt jelentenek.

A következőkben tekintsük át milyen DNS-t felismerő fehérjerészleteket, fehérjecsaládokat ismerünk.

1.4.1. 5.1.4.1. Hélix-turn-hélix részletek

Az elsőként leírt DNS-kötő fehérjecsalád. Eredetileg baktériumokban írták le, de eukarióta sejtekben is előfordul. A családot több száz fehérje alkotja. Szerkezetüket tekintve két α-hélixből és az őket összekötő rövid hajlatból állnak. A rövid hajlat a két hélixet fix szögben tartja. A C-terminális a DNS-felismerő hélix, a nagyárokba ez köt be (5.6. ábra). Ennek aminosav egységei minden fehérjében különböznek. A másik hélix szerkezeti feladatokat lát el, irányban tartja, pozícionálja a felismerő hélixet.

5.6. ábra - A hélix-turn-hélix fehérjerészlet felépítése és kapcsolódása a DNS-hez

A hélix-turn-hélix szerkezeten kívül eső részek nagy szerkezeti különbséget mutatnak a fehérjék között. Ezek révén mindegyik fehérje rá jellemző módon képes a hélix-turn-hélix részletét a DNS-hez tartani. Az egyéb részek is képesek a DNS-sel kapcsolatba lépni, mintegy finomra hangolva a DNS és a fehérje közötti kapcsolatot.

Igen gyakran dimer formában kötnek a DNS-hez. A dimerként való kötődés közös tulajdonsága számos szekvencia specifikus DNS-kötő fehérjének. Ennek megfelelően a DNS két oldala is hasonló, szimmetrikus szekvenciájú (5.7. ábra).

5.7. ábra - A szimmetrikus DNS-regulációs szekvencia és hozzá kötődő DNS-felismerő fehérje dimer



Ez az elrendeződés hozzájárul, hogy mindegyik monomer közel azonos kötéseket alakítson ki, ezzel is megnövelve a kötési affinitást. Első megközelítésben a kötések megkettőzésével a kapcsolódás szabadenergia tartalma is a duplájára nő, így az affinitási együttható pedig a négyzetére.

1.4.1.1. 5.1.4.1.1. Homeodoménfehérjecsalád

Homeotic Selector Genes. A gén (fehérje) családot eredetileg Drosophilában fedezték fel. Később kiderült, hogy a magasabb rendű élőlényekben is kulcsszereppel bírnak. A családhoz tartozó génekben bekövetkező mutációk eredményeképpen a légy egy testrésze más testrésszé fejlődött (5.8. ábra).

5.8. ábra - A homeodomén fehérjecsalád tagjait kódoló géneket érintő mutációk következménye (Drosophila melanogaster)

A géncsalád nukleotidszekvenciáját meghatározták. Minden egyes tagja tartalmazott egy homológiával bíró hatvan aminosavból álló részletet. Ezt nevezték el homeodoménnek. A szekvenciarészlet a család meghatározója és névadója lett. A homeodomén háromdimenziós struktúrája a bakteriális szabályozófehérjékhez hasonló hélix-turn-hélix részleteket tartalmaz. Ez a megfigyelés bizonyítékul szolgál, hogy a bakteriális esetben nyert eredmények fejlettebb esetben is relevánsak lehetnek.

A Drosophila genom (proteom) több mint 60 homeodomén fehérjét tartalmaz. A gyümölcslegyeken kívül számos organizmusban írták le a család tagjainak jelenlétét, így például élesztőben, különböző növényekben és az emberben is.

A bakteriális fehérjében a hélix-turn-hélix részlet különböző szerkezeti környezetben található. Ezzel szemben a



homeodomén család tagjaiban hasonlóak a különböző hélix-turn-hélix részeket körülvevő szerkezeti elemek (ezek alkotják a homeodomén fennmaradó részét). Így arra következtethetünk, hogy a hélix-turn-hélix részlet mindig hasonlóan helyezkedik a DNS-hez. Egy drosophila és egy élesztő homeodomén családtagot összehasonlítva megállapították, hogy, bár csak mindössze 17 aminosav egyezett a 60-ból, a konformációjuk és a DNS-felismerés módja nagyon hasonlított egymásra.

1.4.2. 5.1.4.2. DNS-kötő cink-ujj részletek

Míg a hélix-turn-hélix fehérjék kizárólag aminosav részekből épülnek fel, addig a cink-ujj fehérjék egy vagy több strukturális szerepet betöltő cinket is tartalmaznak. Bár az elnevezés azonos minden Zn-et tartalmazó DNS-kötő fehérje esetében, a név eredete az elsőként felfedezett ujj alakú fehérjétől származik.

A később napvilágra került szerkezeti tanulmányok kimutatták, hogy több szerkezeti csoportba lehet a család tagjait osztani. Jelen esetben ezek közül a két legfontosabbat említjük meg:

1. Az elsőt az eukarióta rRNS expresszióját aktiváló fehérjében írták le. Szerkezete rendkívül egyszerű, egy α-hélix és egy β-redő, amelyet egy Zn tart össze (5.9. ábra). Ezek az egységek igen gyakran klasztereket alkotnak, így folyamatosan kitöltve a nagyárkot (egyik DNS kötő α-hélix a másik után) (5.9. ábra). Így egy erős és specifikus fehérje-DNS kapcsolat alakulhat ki a bázisegységek folyamatos ismétlődése révén. A szerveződés előnye, hogy az ismétlődések számának változtatásával változtatható a kötődés erőssége, specifikussága is.

A Zn-ujjak másik családja az intracelluláris receptorokban található (lásd 6. fejezet). Szerkezetük különbözik az előző csoportba tartozó fehérjékétől: két α-hélix pakolódik össze Zn segítségével (hasonló a hélix-turn-hélix szerkezethez). A hélix-turn-hélix szerkezethez hasonlóan dimereket képez, amely lehetővé teszi, hogy az egyik α-hélix a nagyárokba feküdjön.

5.9. ábra - A cink-ujj fehérjerészletek első csoportjának szerkezeti felépítése, illetve a klaszterképzés



Habár különböző szerkezetűek az imént tárgyalt fehérjék, közös vonásuk, hogy Zn-t használnak szerkezeti elemként, illetve egy α-hélix révén ismerik fel a nagyárokban található információt (szekvenciát).

1.4.3. 5.1.4.3. β-redő

Az eddig ismertetésre került DNS-kötő fehérjékben minden esetben az α-hélix szolgált felismerő részletként. A génregulációs fehérjék egy csoportjában β-redő részletek fekszenek a DNS nagyárkába. A kétszálú β-redő szerkezetről az aminosav oldalláncok a DNS irányába lógnak. A felismerés az adott aminosavtól függ, amelyek a β-redő adott részét alkotják.

1.4.4. 5.1.4.4. Leucin-cipzár

Sok génregulációs fehérje homodimer (feltehetően az erős specifikus kötés miatt). Gyakran a dimerizálódásért felelős rész más, mint a DNS-kötésért felelős rész. A leucin-cipzár ötvözi a két funkciót. A cipzár elnevezés a szerkezetéből fakad, mivel a két α-hélix, hidrofób kötései révén egy összecsavarodást hajt végre gyakran a leucinrészleteknél (5.10. ábra).



5.10. ábra - A leucin-cipzár fehérjerészlet szerkezete és kötődése a DNS-hez

Kevéssel a dimerizációs szakaszon túl egy y-t formálva szétválnak, hogy lehetővé tegyék az oldalláncaiknak a nagyárokba kötődést. A dimerek úgy ülnek a DNS-en, mint a ruhacsipesz a ruhaszárító kötélen (5.10. ábra). A lehetőségek sorát bővíti, hogy több DNS-kötő fehérje, így a leucin-cipzár is heterodimereket is képes formálni. Így igen változatos erősségű és specificitású DNS-felismerő fehérje (komplexek) jöhetnek létre. Természetesen a heterodimerek variálódásának, promiszkuitásának, határa van, így elkerülhető a regulációs káosz. Hogy képződik-e két leucin-cipzár rész között heterodimer, az dönti el, hogy a két α-hélix hidrofób felülete mennyire passzol egymáshoz. Ez végső soron az aminosav sorrendtől függ. Így egy adott leucin-cipzár fehérje csak viszonylag szűk leucin-cipzár partnerállományból válogathat az adott sejten belül.

A heterodimerizáció jó példa a kombinatorikus kontrollra, amikor nem egy különálló, önálló fehérje, hanem különböző fehérjék kombinációja felügyeli a sejt folyamatait.

1.4.5. 5.1.4.5. Hélix-loop-hélix részlet



Egy rövidebb és egy hosszabb α-hélix szakaszból és az őket összekötő hurokból áll. A hurok flexibilitása lehetővé teszi, hogy az egyik hélix visszakanyarodjon és a másikkal átellenben csomagolódjon. Az 5.11. ábrán jól látható, hogy ez a duplahélix-szerkezet a DNS-hez kapcsolódik, egy másik hélix-loop-hélix szerkezethez hasonlóan, mint a leucin-cipzár.

5.11. ábra - A hélix-loop-hélix fehérjerészlet szerkezete és kapcsolódása a DNS-hez

A leucin-cipzárhoz hasonlóan képezhet homo- és heterodimereket. Sok hélix-loop-hélix fehérje elveszti a DNS-hez kötő α-hélixét, ezek a csonka fehérjék teljes hosszúságú hélix-loop-hélix fehérjékkel heterodimereket alkotnak, azonban a kötődés a DNS-hez ebben az esetben lazább, mint a teljes hosszúságú fehérjék esetében. Ez tulajdonképpen egy szabályozási lehetőség, mivel a csonka fehérje azáltal, hogy egy teljes fehérjéhez kapcsolódik, megakadályozza azt, hogy egy másik teljes hosszúságú fehérjével homodimerizálódjon és aktív legyen (5.12. ábra).

5.12. ábra - Hélix-loop-hélix fehérjerészlet aktivitásának szabályozása heterodimerizációval



Nyílván több olvasóban is felmerült a kérdés, hogy vajon melyik fehérjerészlet melyik DNS-szekvenciát ismeri fel? A tárgyalt DNS-felismerő részletek szerkezeti keretet biztosítanak, hogy az adott aminosavak adott DNS-szakaszokat ismerjenek fel. De vajon van-e pontos fehérje-bázis megfeleltetés? Példának okáért a G-C párost milyen aminosav ismeri fel? A válasz, hogy nincs, bár adott bázis-aminosavpárosítások gyakoribbak, mint mások. 20 aminosavból kombinálódnak, több lehetőség is van, hogy az adott szekvenciának megfelelő felületet kialakítsák. Talán a közeljövőben lehet majd adott DNS-szekvenciát felismerő fehérjét tervezni. A probléma megoldása hihetetlen távlatokat nyitna a molekuláris biotechnológia és a molekuláris biológiai terápia terén.

1.5. 5.1.5. DNS-kötő fehérjék detektálásaA biokémiai szabályozások részletesebb megismeréséhez elengedhetetlen a DNS-kötő fehérjék izolálása, szerkezetük megismerése. A továbbiakban néhány gyakran használatos gyakorlati módszert ismertetünk a DNS-kötő fehérjék tisztítására.

1. Gél-mobility shift assay

Az első lépés a kérdéses DNS-szakasz klónozásos vagy kémiai úton történő előállítása, majd radioaktív jelölése. Az így elkészített DNS-preparátumhoz adjuk a sejtlizátumot, majd megfuttatjuk poliakrilamid gélen. Amennyiben a DNS-szál fehérjét kötött, lassabban vándorol (5.13 ábra).

5.13. ábra - A gél mobility shift assay (electrophoretic mobility shift assay, EMSA) működési elve



2. DNS-affinitás kromatográfia

Ha a génregulációs fehérje által felismert DNS-szakasz ismert, egy porózus mátrixhoz kötik a kémiai úton előállított kettősszálú DNS-t. Ez megköti, gyakorlatilag „kiválogatja” a kötésre képes fehérjét. Ha a teljes genom szekvenciája ismert, a fehérjerészlet aminosav szekvenciájából kiindulva megkereshető a regulációs fehérje génje. Az RNS meghatározható, így klónozható.

3. A felismert DNS-szekvencia meghatározása

A génregulációs fehérjék egy része izolálható a megváltozott mutáns egyedekből, például a homeodomén fehérjék génjeit is így sikerült fejlődési rendellenességgel rendelkező Drosophilákból izolálni. Ezeket túltermeltetik, majd izolálják a fehérjét. Rövid DNS-szakaszokkal párosítják (csak amelyiket szorosan köti); sok ilyen kör után meghatározzák a DNS-szakasz szekvenciáját, a konszenzus-szekvenciát. Adatbázisokkal vetik össze és megnézik, hogy melyik génben lehet az adott szekvencia. A módszer hátránya, hogy nem teljesen megbízható; sok szervezet termel hasonló génregulációs fehérjéket, amelyek közel azonos DNS-szekvenciákat ismernek fel.

4. Kromatin-immunoprecipitációs technika

A DNS-hez kötött fehérjéket formaldehid segítségével kovalensen keresztkötik (a DNS-sel), majd lizálják a sejteket. Az izolált DNS-t kis fragmentumokra szeletelik. Ezt követően az adott génregulációs fehérje ellen termeltetett antitesttel kihalásszák a DNS-fehérje komplexeket. Így azokat a DNS-részleteket határozhatjuk meg, amelyekhez a sejtben a regulációs fehérje kötődik.

2. 5.2. A genetikai kapcsolók munka közbenA genetikai kapcsolók szerkezetének megismerését követően itt az ideje, hogy végre megismerjük működésüket. A megismerés legjobb eszköze, ha végignézünk egy egyszerűbb és egy valamivel komplikáltabb prokarióta génexpressziós szabályozást, majd a bakteriális analógia segítségével áttérünk a jóval összetettebb eukarióta szabályozásra.



2.1. 5.2.1. A triptofán-represszor, mint egyszerű génkapcsolóHa pusztán mennyiségi szempontból vizsgáljuk meg az Escherichia Coli genomját, illetve proteomját, megállapíthatjuk, hogy azt 4,6 * 106bp és 4 300 fehérje alkotja. Egy adott időpontban azonban mindössze csak egy részük íródik át, készül el. A baktérium életében kiemelkedő szereppel bír a tápanyaghoz való hozzáférés (rendkívül sok hasonlóságot mutatva jó néhány embertársunkkal). Számos gén kifejeződése a rendelkezésre álló táplálékoktól függ. Erre igen jó példa a triptofán szintéziséhez szükséges 5 gén. A bioszintetikus útvonal enzimeit kódoló gének egy operonba rendeződtek. Az operon struktúrgének (fehérjéket kódoló gének) egy kisebb csoportjából áll, amelyek igen gyakran egy bioszintetikus, metabolikus útvonal egymást követő lépéseinek katalíziséért felelős fehérjéket kódolnak (egyik gén a másik után), illetve az operon részét képezi a gének szabályozásáért felelős DNS-szakasz (regulátor szakasz és promóter). Mindezen gének egy promóterről íródnak át, egyetlen hosszú mRNS-t eredményezve (5.14. ábra).

5.14. ábra - A triptofán operon elemei

Amennyiben a triptofán a baktérium számára készen rendelkezésére áll (mondjuk, ha egy emlős belében található, amelyik megeszi a fehérjét tartalmazó táplálékot), a sejt kikapcsolja a triptofán szintéziséhez szükséges enzimek génjeit.

A transzkripció iniciációja kiemelt fontosságú, hiszen a sejt ekkor dönti el, hogy melyik fehérjét és milyen arányban (túlsúllyal) fejezze ki. A bakteriális RNS-polimeráz egy több alegységes komplex. A komplex egyik tagja, a különálló, de a komplexhez asszociáló alegység, a σ-faktor (5.15. ábra). A σ-faktornak kiemelt szerepe van abban, hogy az RNS-polimeráz felismerje a DNS-en a transzkripció megkezdéséért felelős szignált (azaz a promóter szekvenciát).

Az RNS-polimeráz csak lazán kötődik a DNS-hez, gyorsan végigszalad (csúszik) a DNS-molekulán, majd ledisszociál róla. Ha azonban a polimeráz a promóter régióra csúszik, amely tehát egy speciális DNS-szekvencia, amely kijelöli az RNS-polimeráz számára, hogy itt kell az RNS-szintézist elkezdeni, akkor szorosan hozzáköt. A polimeráz a σ-faktor segítségével ismeri fel a promótert. A faktor, az előző fejezetben részletezett módon specifikus kötéseket alakít ki a DNS külső felszínén a bázisokkal. Ezt követően az RNS-polimeráz felnyitja a DNS-kettőshélixet (5.15. ábra). Egy rövidke szakasz kinyitásával megkezdődik az RNS szintézise. A kitekeredést a polimeráz és a DNS-lánc komformációváltozása stabilizálja, a folyamat (a replikációval ellentétben) ATP-t nem igényel.

Az első tíz nukleotid összekapcsolódása után az RNS-polimerázról leválik a σ-faktor (5.15. ábra). A polomeráz konformációja megváltozik, ennek következtében a szintézis sebessége megváltozik, beindul a gyors RNS-szintézis. Ez egészen a második szignálig, a terminátor szekvenciáig tart, itt az RNS-polimeráz elengedi mind a DNS-t, mind a frissen szintetizált RNS-t (5.15. ábra).

5.15. ábra - A transzkripció lépései (1.promóter felismerése a σ-faktor által, 2.a DNS-szál felnyitása, 3. RNS-szál szintézisének kezdete(iniciáció), 4. az első tíz nukleotid szintézise,5. a σ-faktor leválása a komplexről, RNS-szintézis felgyorsul (elongáció), 6. a szintézis a terminátor régióig folyik, majd a kész RNS-szál leválik a komplexről, 7. a σ-



faktor ismét elfoglalja helyét az RNS-polimeráz komplexben)

A triptofán szintéziséért felelős gének promóterében található egy operátornak nevezett szabályozó. Ez tulajdonképpen egy rövidke (jól definiált nukleotidsorrenddel rendelkező), szabályozó DNS-szakasz, melyet egy génszabályozó fehérje, a triptofán-represszor ismer fel. A triptofán-represszor, egy hélix-turn-hélix családba tartozó fehérje (lásd előző fejezet). A promóter és az operátor szakaszok úgy helyezkednek el, hogy ha a triptofán-represszor beköt az operátor szakaszhoz, az megakadályozza (az átlapoló elhelyezkedés révén) az RNS-polimeráz bekötődését a promóterhez, így a triptofánt szintetizáló enzimek nem tudnak átíródni (5.16. ábra).

5.16. ábra - A triptofán-represszor fehérje működése



A gén átíródását, a triptofán jelenlétének detektálását, igen ötletesen valósítja meg a baktérium. Ahhoz, hogy a triptofán-represszor az operátorhoz kötődjék, két triptofánt kell magának is kötnie. A triptofánok megkötése térszerkezet változást, egy hajlást eredményez a hélix-turn-hélix szerkezetben, amely ezt követően már tökéletesen illik a DNS nagyárkába (a promóterrel átlapoló) operátorrégiónál (5.17. ábra). A triptofán megkötése nélkül a DNS-kötésre alkalmas részlet a fehérje belsejében marad, így nem képes a DNS-kötésre a fehérje. Tulajdonképpen a triptofán-represszor egy allosztérikusan szabályozott fehérje, amely esetében a regulátormolekula maga a triptofán. Így a triptofán-represszor és operon egy egyszerű alkalmatosságot formál, amely a triptofán jelenlététől függően be- vagy kikapcsolja a triptofán bioszintézisének enzimeit. Tekintve, hogy a fehérje aktív, DNS-kötő formája, kikapcsolja a gént, a szabályozást negatív kontrollnak, a fehérjét pedig transzkripciós vagy génrepresszor fehérjének nevezzük.

5.17. ábra - A triptofán-represszor fehérje szerkezetének és DNS-kötő képességének megváltozása a két bekötődő triptofánmolekula hatására

Néhány bakteriális promóter szekvencia csak alacsony hatásfokkal működik, mivel az RNS-polimeráz csak alacsony hatásfokkal ismeri fel és/vagy az RNS-polimeráznak nehézségei adódnak a DNS-kettős hélix felnyitásával és a transzkripció megindításával.

Mindkét esetben, az alacsony hatásfokkal működő promóterek esetében is, elindulhat a transzkripció, amennyiben egy génregulációs fehérje kapcsolódik a promóter közelébe a DNS-lánchoz és kapcsolatba lép az RNS-polimerázzal. Így a transzkripció megindításának valószínűsége jelentős mértékben megnő. Tekintve, hogy



ezen fehérjék aktív DNS-kötő formája bekapcsolja a gént, a folyamatot pozitív kontrollnak, a fehérjéket pedig transzkripciós vagy génaktivátor fehérjéknek nevezik.

Az esetek egy részében a génaktivátor fehérjék oly módon segítenek az RNS-polimeráz promóterhez kötődésében, hogy egy újabb kapcsolódó felületet biztosítanak a polimeráznak. Más esetekben a polimeráz transzkripciós állapotba alakulását segítik elő azáltal, hogy stabilizálják a DNS-kötő forma és a transzkripciós forma közti átmeneti állapotot.

Ahogy a negatív kontroll (a transzkripciós represszor) esetében láttuk, úgy a pozitív szabályozás esetében is a transzkripciós aktivátorfehérje képes egyszerű genetikai kapcsolóként működni.

A pozitív kontrollra jó példát szolgáltat a bakteriális katabolit aktivátor fehérje (catabolit activator protein: CAP). A CAP képessé teszi az E. colit arra, hogy alternatív szénforrásokat használjon fel, ha az egyébként preferált szénforrása, a glukóz, nem áll rendelkezésre (azáltal, hogy különböző géneket kapcsol be).

A glukózszint csökkenése elindítja az intracelluláris szignálmolekula, a cAMP szintjének emelkedését, amely képes a CAP-vel történő összekapcsolódásra. A kapcsolat létrejöttét követő térszerkezet-változásnak köszönhetően (allosztérikus reguláció) a CAP alkalmassá válik, hogy a célpromóterek mellett specifikus DNS-szakaszokhoz kössön, így bekapcsolva a megfelelő géneket. A kérdéses gén be- vagy kikapcsolása tehát attól függ, hogy a cAMP szintje miként alakul a sejtben.

Sok esetben a represszorok és az aktivátorok felépítése hasonló. Pl.: a triptofán-represszor és a CAP-aktivátor is hélix-turn-hélixrészletet tartalmaz és egy kis kofaktort igényel a DNS-hez kötődéshez. Igazság szerint néhány bakteriális fehérje (CAP, bakteriofág λ-represszor) mind aktivátorként, mind represszorként képes viselkedni attól függően, hogy az általuk felismert DNS-szekvencia hogyan helyezkedik el a promóterhez képest. Ha a fehérje kötőhely átlapol a promóterrel, a polimeráz nem tud kötődni és a fehérje mint represszor hat. Ha azonban a fehérje a promóterszekvencia mellett kötődik, mint egy jelzőbója segíti az RNS-polimeráz bekötődését, a transzkripció megindulását. Ebben az esetben mint aktívátor viselkedik.

2.2. 5.2.2. A lac-operon: transzkripciós aktiválás/represszálásA pozitív és a negatív szabályozás kombinációjára jó példát szolgáltat a CAP- és lac-represszor által megvalósított szabályozás, mely révén a baktérium alkalmazkodni tud, képessé válik glukóz hiányában más alternatív szén- és energiaforrások (pl. laktóz) felhasználására. A laktóz sejtbe juttatásáért, illetve lebontásáért felelős géneket és szabályozó részleteket a lac-operon tartalmazza. Ahogy korábban láttuk, a glukózszint csökkenésével megemelkedő cAMP-szint emelkedésével és CAP-fehérjével való kapcsolat révén a CAP képessé válik a DNS-hez való kötődésre és elősegíti az alternatív szén/energiaforrások (pl.: laktóz) felhasználását célzó fehérjék átírását. Az azonban komoly veszteséggel járna, ha a CAP laktóz távollétében is kifejezné a fehérjéket, ezért a lac-represszor ezeket, laktóz távollétében, kikapcsolja. Így tulajdonképpen két szignál integrálása történik meg és a lac-operon magas szinten csak akkor expresszált ha: 1. nincs jelen glukóz, 2. és jelen van laktóz.

Minden más esetben a gének ki vannak kapcsolva.

Nézzük meg, hogyan történik mindez a gyakorlatban. Laktóz adagolására a kevés jelenlévő laktóz-permeázon keresztül kis mennyiségű laktóz képes a sejtbe jutni és ott a kevés β-galaktozidáz segítségével a laktóz egy izomerévé, allolaktózzá alakul. Az allolaktóz fog tulajdonképpen induktorként viselkedni, mivel hozzáköt a lac-represszorhoz, amely allolaktózt nem kötő formája képes a DNS-hez kötni, a lac-promóterrel átlapoló DNS-szekvenciához. Az allolaktóz bekötődése térszerkezet-változást eredményez a lac-represszor fehérjében, amelynek hatására az már nem képes a DNS-hez kötődni, így felszabadul a gátlás alól a lac-operon (5.18. ábra).

Tekintve, hogy a lac-operon promótere egy gyenge promóter, a megfelelő mértékű génexpresszióhoz szükséges a glukóz távollétében megemelkedő cAMP-szint hatására bekötődő CAP DNS-hez kötése. A kikapcsolás természetesen éppen fordított módon történik meg: a glukóz adagolása csökkenti a sejtben a cAMP-szintjét, mivel így a cAMP nem tud a CAP-hoz kötődni, leválik a DNS-ről, ennek eredménye a gén kikapcsolása lesz (5.18. ábra).

5.18. ábra - A lac-operon kettős szabályozása a lac-represszor fehérje, illetve a CAP–cAMP-komplex által



3. 5.3. Az eukarióta génexpresszió szabályozásaA bakteriális génexpresszió szabályozása, ahogy láttuk, viszonylag egyszerű, de korlátozásokat tartalmaz. A promóter szomszédságában egész egyszerűen nincs elegendő hely, hogy elég legyen a nagyobb számú DNS-regulációs szekvencia számára. Éppen ezen korlátok miatt a szignálok tucatjainak kezelésére alkalmatlan.

Vajon, mi módon képesek az eukarióta sejtek ezen korlátokon felülemelkedni?

Az eukarióta transzkripció szabályozása három fő részletben is különbözik a bakteriálistól:

1. Olyan génregulációs fehérjéket alkalmaznak, amelyek képesek akár a több ezer bázispárnyira lévő promóter befolyásolására, így tehát egy promótert gyakorlatilag számtalan DNS-szakasz regulálhat a teljes DNS-állományon belül.

2. Az eukarióta RNS-polimeráz-II (amely az összes fehérjét kódoló gén transzkripciójáért felelős) önmaga nem képes elindítani a transzkripciót. Fehérjék egy csoportjának közreműködését igényli, melyeket általános transzkripciós faktoroknak nevezünk. Ezen fehérjék transzkripciós iniciációs komplexszé történő összeszerelése a transzkripció megindulásának (iniciáció) előfeltétele. Ezek teljesen általános (konzervált) fehérjék minden egyes sejtben azonosak, amelyben RNS-polimeráz-II van, nem specifikusak, mint a génregulációs fehérjék. Ezen fehérjék összeszerelésének befolyásolása egy jó szabályozási lehetőség, sok eukarióta génregulációs fehérje a különböző regulációs szignálok eredményeképpen ezen a ponton fejti ki hatását.

3. Az eukarióta DNS kromatinba csomagolódása miatt a bakteriális szabályozási lehetőségek nem alkalmazhatók ebben az esetben.

3.1. 5.3.1. Eukarióta génregulációs fehérjékAz eukarióta sejtek is, a prokariótákhoz hasonlóan, génregulációs fehérjéket alkalmaznak, melyek közt aktivátorok és represszorok egyaránt megtalálhatók.



A DNS-szakaszt, melyhez a regulációs fehérjék kötnek, enhancereknek nevezzük. Az elnevezés alapja az a megfigyelés volt, mely szerint ezek jelentős mértékben megnövelik a transzkripciót.

1979-ben került leírásra az a megfigyelés, mely szerint az aktivátorfehérje a promótertől akár több ezer bp távolságra is köthet, illetve attól függetlenül képes génexpressziót befolyásoló hatását kifejteni, hogy a génhez képest upstream vagy downstream kötődik. Természetesen adódik a kérdés, hogyan képesek így a promóterrel kommunikálni? A leggyakrabban alkalmazott módszer, hogy a DNS az enhancer és a promóter között egy hurkot formál, így az enhancerhez kapcsolódott aktívátorfehérjék és a promóterhez kapcsolódott fehérjék (RNS-polimeráz, általános transzkripciós faktorok) egymással kapcsolatot teremthessenek.

A DNS mint egy kötél viselkedik, segítve a két fehérjecsoportosulás találkozását (5.19. ábra). Baktériumokban is ismeretes ez a módszer, azonban sokkal ritkábban és rövidebb DNS-szakaszokkal valósul meg.

5.19. ábra - A DNS hurokképzése az enhancer- és a promóterrégiók között lehetővé teszi egymástól távoli szekvenciák egymásra hatását

3.2. 5.3.2. Eukarióta DNS-reguláló szekvenciákTekintve, hogy az eukarióta génregulációs fehérjék a promótertől igen távol a DNS-hez kötődve befolyásolni képesek a transzkripciót, a transzkripciót befolyásoló génregulációs régió igen nagy lehet (5.20. ábra). A kiterjedt génregulációs szakaszok miatt benne foglaltatik a promóter (a hozzá kapcsolódó fehérjék: RNS-



polimeráz, általános transzkripciós faktor), illetve a regulációs szekvenciák (a hozzá kapcsolódó fehérjék: regulációs fehérjék) (5.20. ábra).

A magasabb szintű eukarióta sejtekben akár 50 000 bp távolságra is lehet a regulációs szekvencia, illetve fehérje a promótertől. A köztük lévő flexibilis DNS-szakasz segíti a promóter és enhancer összehangolását (5.19. és 5.20. ábra). Szintén fontos megemlítenünk, hogy az eukarióta DNS nukleoszómákba és kromatinba pakolódik, ezáltal is lecsökkentve a távolságot a két DNS-szakasz (regulációs és promóter) között (5.21. ábra).

A következőkben tekintsük át röviden a két nagyobb DNS-hez kötődő fehérjecsoport sajátságait:

Általános transzkripciós faktorok Génregulációs fehérjékNagy mennyiségben előforduló, Kis változatosságot mutató fehérjék, Ahol RNS-polimeráz II van.

Több ezer fajta, a 25 000 humán gén 5-10%-a ilyet kódol, egyik génregulációs szakaszról a másikra változnak, kis mennyiségben (általában kevesebb, mint 0,01%-a a sejt teljes fehérjeállományának). A megfelelő DNS-szakaszt ismerik fel a korábban tárgyalt fehérjerészletek segítségével, illetve más DNS-felismerő fehérjék felépítésében vesznek részt.

A génregulációs fehérjék egy organizmus egyes génjeit kapcsolják ki vagy be. Ahogy korábban említésre került, a különböző sejttípusok a génregulációs fehérjék egyedi összeállítását tartalmazzák. Így génexpressziós mintázatuk is egyedi, eltérő sajátosságot adva az egyes sejttípusoknak.

Az eukarióta sejt minden egyes génje különbözőképpen regulálódik. Ez meglehetősen nagy szabályozási diverzitást jelent. Éppen ezért igen nehéz általános érvényű szabályokat felállítani a szabályozásukról, azonban a főbb irányvonalak megállapíthatóak.

5.20. ábra - Az eukarióta gén szabályozási régiójának elemei

3.3. 5.3.3. Génaktivátor fehérjék és a transzkripció



A legtöbb génregulációs fehérje moduláris felépítéssel rendelkezik. Két fő domén különböztethető meg: a DNS-felismerő részlet (ezeket már korábban tárgyaltuk), illetve az aktivációs domén. Ez utóbbi felelős a transzkripció gyorsításáért. A moduláris szerkezet leírása hibridfehérjék segítségével történt, melyekben az egyik fehérje DNS-felismerő részét fuzionáltatták a másik fehérje aktivációs részével.

Lássuk, hogyan működhetnek a génaktivátor fehérjék!

Tulajdonképpen két fő hatásmódozatot különböztethetünk meg:

1. Vonzzák, pozícionálják, módosítják az általános transzkripciós faktorokat és az RNS-polimeráz II-t a promóteren. Mindezek hatására elindulhat a transzkripció (5.20. ábra);

2. Ezen direkt hatáson kívül megváltoztathatják a kromatinszerkezetet a promóter körül (5.21. ábra).

1. A direkt hatás két módon érvényesülhet: Az RNS-polimeráz lépésenként állhat össze aktív holoenzimmé, in vitro leírt sorrendben, de ismeretesek olyan sejtek is, amelyekben már összeállt formában kerül a promóterre az RNS-polimeráz holokomplex. Az RNS-polimeráz holoenzim az általános transzkripciós faktorokon és az RNS-polimerázon kívül egy 20 fehérjéből álló, mediátornak is nevezett komplexet is tartalmaz.

Számos aktivátor fehérje kölcsönhat a holoenzim-komplexszel, energetikailag (még) kedvezőbbé téve a promóterhez kötődést. Tulajdonképpen az egész folyamat úgy fogható fel, mintha az aktivátorok a holoenzimet vonzanák, pozícionálnák a promóterhez (5.20. ábra).

Ezt az elképzelést természetesen kísérleti úton is bizonyították.

Egy szekvencia specifikus (DNS-felismerő) részletet fúzionáltattak közvetlenül a mediátor egyik komponenséhez (teljes transzkripciós RNS-polimeráz-komplex). Ez a hibridfehérje, amelyből az aktivációs domén hiányzott, jelentős mértékben elősegítette a transzkripció megkezdését, ha a DNS-szekvencia, amelyhez kötődött, a promóter-szekvencia szomszédságában volt. Habár a holoenzim-komplex promóterhez irányítása látványos, egyszerű módja az aktiválás folyamatának szemléltetésére, valószínűleg az aktivátorok működése ennél jóval bonyolultabb. Ilyen lehet egyes esetekben az általános transzkripciós faktorok lépésenkénti összeszerelése a promóteren. Más esetekben a megkötődést követő átrendeződésük szükséges. A legtöbb holoenzim-komplexből hiányoznak az általános transzkripciós faktorok (elsősorban a TFIID és a TFIIA), amelyeknek a promóteren kell külön beépülniük.

Ezen lépések bármelyike egy-egy lassú (sebesség meghatározó) lépés lehet a transzkripció megkezdése során. Az aktivátorok hozzájárulhatnak a teljes forma kialakításához, lehetőséget adva a szabályozásra.

Számos aktivációs fehérjéről kimutatták, hogy kapcsolatba lép általános transzkripciós faktorokkal és számos direkt módon is segíti a promóteren történő összeszerelésüket.

2. A lokális kromatinszerkezet megváltoztatása

A regulációs és a promóter részek kromatinszerkezetének megváltoztatása révén is kitűnően befolyásolható a génexpresszió.

A leggyakoribb két lokális kromatinszerkezet-változás: a nukleoszóma-remodellezés és a kovalens hisztonmódosítás (5.21. és 5.22. ábra). Számos génszabályozó fehérje használja mindkét módszert, az enzimek két csoportjához, a hiszton-acetiltranszferázhoz (hiszton-acetilázt) és az ATP-dependens kromatin-remodellező komplexhez kötve és ezáltal létrehozva aktív, funkcióképes formájukat (5.21. és 5.22. ábra).

Általánosságban elmondhatjuk, hogy a kromatinszerkezetben bekövetkező változás nagyobb hozzáférhetőséget biztosít az alapjául szolgáló DNS-nek. Ez a jobb hozzáférhetőség hozzájárul, hogy az általános transzkripciós faktorok és az RNS-polimeráz holoenzim összeszerelődjön a promóteren és ahhoz, hogy további génregulációs fehérjék kapcsolódjanak a regulációs szakaszhoz.

5.21. ábra - Nukleoszóma-remodellezés



5.22. ábra - Kovalens hisztonmódosítás

Az általános transzkripciós faktorok láthatólag nem képesek a konvencionális nukleoszómába pakolt promóteren összeállni. Ez a szoros, kompakt csomagolás lehet az egyik oka, hogy alapesetben nem történik meg a transzkripció iniciációja. Szintén ez biztosítja részben a leaky (szivárgó, lötyögős) transzkripció elkerülését. (A



kromatin azon formáját, amely transzkripciórezisztens hetereokromatinnak nevezzük.)

A hiszton acetiláció jellegzetes formája figyelhető meg a transzkripciósan aktív kromatin esetében. Ez részben jobban hozzáférhetővé teszi, részben egy jellegzetes, szignálszerű acetilációs mintázatot jelent. Ezt a mintázatot ismeri fel az egyik általános transzkripciós faktor (TFIID) alegység. Így tehát a következő láncolat alakulhat ki, amelynek eredményeképpen megindulhat a transzkripció:

Génregulációs fehérjék → aktiválják a hiszton-acetilázokat → közvetetten segítik az általános transzkripciós faktorok összeszerelését a promóteren → transzkripció.

3.3.1. 5.3.3.1. A génregulációs fehérjék szinergikusan dolgoznak

A génregulációs fehérjék több különböző lépést képesek a transzkripció inicializációja végett befolyásolni. Amennyiben egyszerre több faktor hatása érvényesül a reakciósebesség megnövelése érdekében, a reakciósebesség növekménye nem csupán az egyes hatások összege, hanem ennél jelentősebb. Példának tekinthetjük a következő esetet, amikor A-faktor hatására 1-szeres energiagát-csökkentés következik be, melynek eredménye 100-szoros reakciósebesség-növekedés. Amennyiben B-faktorral, melynek ugyanolyan mértékű hatása van külön, mint az A-faktornak külön, egyszerre hatnak, annak 2-szeres energiagát-csökkentés lesz az eredménye, amely 10 000-szeres reakciósebesség-növekedést fog eredményezni. Ez a szinergia a transzkripció megkezdését illetően is érvényes, különös tekintettel arra, hogy a génaktivátor fehérjék számos lépést befolyásolnak.

3.3.2. 5.3.3.2. Eukarióta represszorok

Az eukarióta génregulációs fehérjék legtöbbje, több (néha egész sok) alegységből álló komplexet alkotnak a DNS-en. Ezen alegységek különböző funkciókkal rendelkeznek. A komplexek igen gyakran csak a megfelelő DNS-szekvencia jelenlétében állnak össze. Néhány alaposan tanulmányozott esetben például két egymás iránt kis affinitást mutató génregulációs fehérje kooperál, hogy hozzákössön egy DNS-szekvenciához. Önállóan egyik fehérje sem rendelkezik elegendő affinitással az effektív DNS-hez kötődéshez. A DNS-kötődést követően egy olyan felületet alkot a dimer, amelyet egy harmadik fehérje ismer fel, amelyik egy aktivációs domént hordoz. Az így létrejött komplex már elindíthatja a transzkripciót.

Mindezek alapján a következő általános megállapítást tehetjük: azok a fehérje-fehérje kapcsolatok, amelyek az oldatban túl gyengének bizonyulnak, hogy a fehérje összeállását eredményezzék, elegendőnek bizonyulnak a DNS felületén. A DNS ez esetben mint egy kristálygóc vagy összeszerelési mag szerepel.

Egy adott génregulációs fehérje több regulációs komplexben is részt vehet. A fehérje egyik esetben egy aktivátor része lehet, míg más esetben egy represszorban szerepelhet (5.23. ábra). Így nem igazán lehet a különálló génregulációs fehérjéket aktivátornak vagy represszornak nevezni. Ehelyett mint regulációs egységek szerepelnek, melyek végső sorsa a különálló egységekből szerveződő komplexekben dől el. Ez a sors (összeszerelődés) a regulációs DNS-szekvenciától, illetve a sejtben éppen jelenlévő regulációs fehérjéktől függ.

A DNS-hez nem kötő, de DNS-kötő regulációs fehérjékben részt vevő génregulációs fehérjéket koaktivátoroknak, vagy korepresszoroknak nevezzük. Ugyanazon koaktivátorok vagy korepresszorok különböző DNS-kötő fehérjékre épülhetnek (5.23. ábra). A koaktivátorok, korepresszorok különböző feladatokat láthatnak el: kromatin remodellező komplexekkel, hiszton-módosító enzimekkel, RNS-polimeráz holoenzimekkel, általános transzkripciós faktorokkal kapcsolódhatnak.

5.23. ábra - A szabályozó fehérjeelemek összeszerelődése különböző funkciójú regulátorkomplexekké a DNS felületén



Néhány esetben a DNS-szekvencia, melyhez a génregulátor fehérjék kötődnek, megváltoztatja a konformációjukat, ezáltal befolyásolva a következő transzkripciós aktivitását.

Például, ha egyfajta DNS-szekvenciához kötődik egy szteroid humán receptor, akkor az egy korepresszorral kapcsolódik és kikapcsolja a transzkripciót. Ha egy másik, kismértékben különböző DNS-szekvenciához, akkor más konformációt felvéve egy koaktivátorhoz kapcsolódik és bekapcsolja a transzkripciót. Általában egy génregulációs komplex szerveződését rövidke DNS-szakaszok vezérlik (5.23. ábra), azonban van arra példa, hogy egy jóval kiterjedtebb DNS-fehérje komplex szerveződjék, melyet enhanszoszómának nevezünk. Az enhanszoszómák ismertetőjegyei az építőfehérjék (5.24. ábra), amelyek egy jól definiált szögben hajlítják a DNS-t és ezáltal elősegítik a többi enhanszoszómafehérje beépülését. Tekintve, hogy az enhanszoszóma felépítéséhez számos fehérje szükségeltetik, ez biztosítja, hogy csak akkor fejeződik ki a gén, ha ezen fehérjék mindegyike jelen van a sejtben. Ez a felállás egyben magas fokú kombinációs kontrollra is lehetőséget ad.

5.24. ábra - Az enhanszoszóma felépítése

3.3.3. 5.3.3.3. Inzulátor DNS-szekvenciák

Bizonyára még mindenki emlékszik rá, hogy az eukarióta génkifejeződés szabályozása során a regulációs fehérjék a promórhez képest mind upstream, mind downstream beköthetnek az enhancer szekvenciához. Így egyértelműen adódik a kérdés, hogy mi biztosítja azt, hogy ha egy génregulációs fehérje beköt a helyére, az a



szomszédos gének átíródását nem befolyásolja?

A legismertebb megoldás, amellyel az eukarióta sejt a probléma megoldása érdekében előállt, az inzulátor (határoló) elemek (5.25. ábra). Az inzulátor elemek DNS-szakaszok, melyek specializálódott fehérjéket kötnek és két speciális tulajdonsággal rendelkeznek: 1. pufferelik a géneket a heterokromatin represszáló hatásától; 2. képesek az enhancerek blokkolására. Ahhoz, hogy erre képesek legyenek, a promóter és az enhancer rész között kell lokalizálódniuk. Mindazonáltal az inzulátorok pontos működési mechanizmusa jelenleg ismeretlen és könnyen elképzelhető, hogy a különböző inzulátorok eltérő mechanizmusok révén fejtik ki hatásukat.

5.25. ábra - Az inzulátorszekvenciák elhelyezkedése és funkciója

4. 5.4. Az X-kromoszóma inaktiválása nőkbenAz előző fejezetben láttuk, hogy a kromatinszerkezet befolyásolhatja a génexpressziót. Emlőssejtek esetében akár egy teljes kromoszóma minden egyes génjének átírására is kiterjedhet.

A férfiak és a nők (többek között) a nemi kromoszómáikban térnek el egymástól. A férfiak XY, a nők XX nemi kromoszómákkal rendelkeznek. A nőkben tehát kétszer annyi kópia található az X-kromoszóma génjeiből, mint a férfiakban. Ez igen jelentős különbséget eredményez, különösen akkor, ha figyelembe vesszük, hogy az X-kromoszóma jóval nagyobb, több mint 1000 gént tartalmaz, mint a kevesebb mint 100 gént tartalmazó Y.

A férfiak és a nők között tehát jelentős különbség alakult ki az X-génen található gének mennyiségében. Az emlősökben egy kompenzációs mechanizmus alakult ki, amely révén a férfiakban és a nőkben az X-kromoszóma géntermékei között levő különbség kiegyenlíthető.

Azok az esetek, ahol a mennyiségi kompenzációban mutáció következik be letálisak, jól szemléltetve, hogy milyen fontos fenntartani a megfelelő nemi/autoszomális génarányt, gén-termékarányt.

Lássuk csak, mi módon kerül megvalósításra a kompenzáció! A nők szomatikus (testi) sejtjeiben az egyik X-kromoszóma transzkripciósan inaktiválódik. A transzkripciós lecsendesülésre a női embrió fejlődésének korai szakaszában kerül sor, amikor még csak néhány ezer sejtből áll. Ekkor az X-kromoszómák egyike minden egyes testi sejtben jelentős mértékben kondenzálódik – heterokromatin struktúrát vesz fel. A kondenzálódott X-kromoszóma fénymikroszkóppal is jól látható az interfázisban lévő sejtekben. Ezt a mikroszkóppal is jól látható, kondenzálódott kromoszómát Barr-testnek nevezték el. Az X-inaktiválódásnak köszönhetően két X-kromoszóma létezhet egyszerre egyazon sejtmagban ugyanazoknak (a szignáloknak kitéve) a transzkripciós regulátor fehérjéknek kitéve, mégis teljesen különböző mértékű génexpressziót mutatva.

Az, hogy az apai vagy az anyai X-kromoszóma inaktiválódik, teljesen random dől el. Ha már egyszer az egyik inaktiválódott, akkor az, változatlan marad a sejt további osztódása során is benne és utódaiban is, hűen megőrizve azt, DNS replikációkon és mitozisokon keresztül.

Tekintve, hogy az X-inaktiválódás random megy végbe, amikor már néhány ezer sejtből áll az embrió, minden egyes nő különböző sejtek mozaikja, melyek egyikében az apai, másikében az anyai X-kromoszóma csendes, inaktiválódott. Ezen sejtek kisebb klasztereket alkotnak a felnőttben, mivel a testvérsejtek egymás közelében maradnak sejtosztódást követően a későbbi fejlődés során (5.26. ábra).

5.26. ábra - Az X-kromoszóma inaktiválódása (kondenzálódása) a női embrionális testi sejtekben



Erre kitűnő szemmel látható példát is találhatunk, hiszen a macskák esetében ez okozza a vörös-fekete teknőspáncélszerű bundamintázatot a nőstény macskák esetében. Az egyik X-kromoszómán található a gén, amely a vörös szőrért felelős. A másik X-kromoszómán ugyanazon gén másik allélja, amelyik a fekete szőrzetért felelős. A random X-inaktiváció miatt alakul ki az érdekes foltos szőrzetmintázat. A hím macskák vagy teljesen vörösek, vagy teljesen feketék lesznek attól függően, hogy az anyjuktól melyik színt kódoló X-kromoszómát örökölték. Habár az X-kromoszóma inaktiváció ezer és ezer sejtosztódáson keresztül megtartott, nem mindig állandó. Nevezetesen visszafordítható az ivarsejtek kialakulásakor, vagyis minden egyes haploid petesejt egy aktív X-kromoszómát tartalmaz és képes az X-kromoszómához kötött termékek kifejezésére.

Hogyan következik be a transzkripciós inaktiválódás egy egész kromoszómán?

Az X-kromoszóma inaktiválódása az X-kromoszóma közepéről, egy pontról kiindulva indul és terjed tova. Ezt a helyet X-inaktivációs központnak (XIC) nevezik. Ezt a központot (106 bp-nyi DNS-szakasz) egy nagy szabályozó elemnek tekinthetjük, amely a heterokromatin kiindulási magja és segíti annak tovaterjedését mindkét irányban a teljes kromoszóma mentén (5.27. ábra). Az XIC-on belül kódolva található egy szokatlan RNS-molekula: az X inaktivációs specifikus transzkript (XIST), amely kizárólag az inaktivált X-kromoszómáról expresszálódik. Ezen RNS expressziója elengedhetetlen az X-inaktivációhoz. Egy igen érdekes RNS-ről van szó, amely nem íródik át fehérjévé, a sejtmagban marad és bebiztosítja az inaktív X-kromoszómát. Az XIST-RNS tovaterjedése a kromoszómán jól korrelál a gének elcsendesülésével, jól mutatja, hogy az XIST-RNS részt vesz a heterokromatin formálásában, valamint terjedésében (5.27. ábra).

5.27. ábra - Az X-kromoszóma inaktiválódásának mechanizmusa



X-kromoszóma heterokromatin számos sajátsággal rendelkezik, amelyek mindegyike hozzájárul a kromoszóma transzkripciós csendességéhez. Ezek a XIST, a hiszton-2A, az alacsony szinten acetilált H3-, H4-hisztonok és végül a specifikus helyen metilált H3-hiszton és DNS.

Az X-kromoszómával kapcsolatos tudásunk még meglehetősen hiányos.

Még megválaszolásra vár :

1. Hogyan dől el, hogy melyik (az apai, vagy az anyai) X-kromoszóma inaktiválódik?

2. Milyen mechanizmus védi a másik X-kromoszómát az inaktiválódástól?

3. Hogyan koordinálja az XIST-RNS a heterokromatin szerveződését?

4. Hogyan marad inaktív a kromoszóma a sejtosztódások tömkelegén keresztül?

5. 5.5. DNS-metilációA regulációs fehérjéken kívül maga a DNS is fontos szabályozóelemként szerepelhet, kovalensen módosítható. Gerincesekben a citozin metilálásának van fontos szerepe a gének (in)aktiválásában. A citozin metilálása nem befolyásolja a bázispárok kialakulását. A gerincesek DNS-ében a metiláció kizárólag a citozin nukleotidokat érinti, ott is a CG-báziskettősben találhatókat, melyek ugyanazzal a szekvenciával párosodnak természetesen ellentétes orientációval: a CG-vel szemben lévő DNS-szálon GC-báziskettős található (5.28. ábra).

Egy viszonylag egyszerű módszer biztosítja, hogy a meglévő DNS-metilációs mintázat öröklődjék tovább a DNS-leányszálakba. A metiltranszferáz enzimek azokon a CG-bázispárokon dolgoznak, amelyek már metilált CG-bázispárokkal vannak párban. A szülői szálakon található metilációs mintázat mintegy mintául szolgál a leányszálak metilációs mintázatához, ezáltal az direkt módon továbböröklődik (5.28. ábra). A DNS-metilációs mintázat ilyeténképp történő stabil továbböröklődéséért a DNS-metiltranszferázok felelősek.

5.28. ábra - A DNS-metiláció mechanizmusa, a fenntartó metilázok működése



Fontos megjegyeznünk, hogy a DNS-metilációs mintázat a gerincesek fejlődése alatt dinamikus változást mutat. Kevéssel a megtermékenyítést követően egy demetilációs hullám vonul végig a teljes genomon, amely során a metilcsoportok jelentős többsége eltűnik a DNS-ről. Ez a demetilálódás bekövetkezhet egyrészről a metiltranszferázok szupressziója miatt, replikációról replikációra történő passzív demetilációval, vagy egy specifikus demetiláló enzim által. A fejlődés egy későbbi szakaszában, amikor a magzat a méh falába ágyazódik be, egy új metilációs mintázat alakul ki. Az új metilációs mintázat kialakulásáért a de novo DNS-metiltranszferázok felelősek, amelyek a metilálatlan CG-párosokat veszik kezelésbe. Ha már egyszer kialakult a metilációs mintázat, annak fenntartásáért a fenntartó DNS-metiltranszferázok felelősek. Mind a fenntartó, mind a de novo metiltranszferázokban bekövetkezett mutáció korai embrionális halált eredményezett egerekben, ami egyértelműen arra utal, hogy a megfelelő metilációs mintázat sorsdöntő a normális fejlődésben.

Gerincesekben a DNS-metiláció elsősorban transzkripciósan inaktív régiókban található, úgy, mint az inaktív X-kromoszóma, vagy az adott szövetben inaktivált gének esetében.

Ez a megfigyelés arra enged következtetni, hogy a gének inaktiválásában lehet szerepe. A gerincesek sejtjeiben számos fehérje ismeri fel a metilált DNS-t és köt hozzá. Ezen DNS-kötő fehérjék ezt követően kapcsolatba kerülnek kromatin remodellező komplexekkel, illetve hiszton deacetiláló enzimekkel, amelyek kondenzálják a kromatint, transzkripciósan inaktívvá téve azt. Igen ám, de a DNS-metilálás önmagában nem elegendő, hogy transzkripciósan inaktív legyen a DNS.

Ezt egy ötletes kísérlettel bizonyították is, mely során teljes mértékben metilált, illetve teljes mértékben demetilált izomspecifikus aktint tartalmazó plazmidot hoztak létre. Amikor ezeket izomsejt tenyészetbe vitték, a teljes mértékben metilált plazmid ugyanolyan magas mértékben kifejeződött, mint a nem metilált változat.

Ezen kívül, ha bekapcsolnak egy csendes gént, a metiláció csak később, jó néhány transzkripciót követően kerül le róla. Valamint az X-kromoszóma inaktivációja még jóval a detektálható metilációja előtt bekövetkezik. Mindezek arra utalnak, ha egyszer kikapcsoltak egy gént, a metiláció csak megerősíti annak represszióját. A primer mechanizmus nem a metiláció, az csak egy további biztosíték. Két különböző típusú gerinces sejtben egy adott gén expressziója 106-szorosa lehet a másikénak. Baktériumban egy expresszált és egy nem expresszált gén transzkripciója között mindössze 1000-szeres különbség lehet. Gerincesekben a DNS metiláció is hozzájárulhat (a kromatinban bekövetkező változásán keresztül) ehhez a nagy különbséghez. A több ezer gén (amelyek normális körülmények között ki vannak kapcsolva) lötyögős transzkripciója is szerepet játszhat, hogy a DNS-metiltranszferáz mutáns egérembriók életképtelenek.

A baktériumokban lötyögős a transzkripciós szabályozása, vagyis a nem expresszált gének is transzkripcióra kerülnek bizonyos százalékban. Ez a kontroll gerincesekben, emlősökben sokkal szigorúbb, amelyhez a DNS metilációja is hozzájárulhat. Nagyobb különbség van az expresszált és a nem expresszált transzkript szintjében.

Gerincesekben a transzkripciós csend szintén fontos szerepet játszik az ugráló elemek (transzpozonok) proliferációjának visszaszorításában. Amíg a kódoló rész csak néhány százaléka a teljes genomnak, addig az ugráló elemek majdnem a felét alkothatják. Ezek elkészíthetik saját maguk kópiáját és ezeket bárhová beilleszthetik a genomon belül, képesek lévén géneket és regulációs szakaszokat megszakítani. A metiláció révén visszaszorítható ezen elemek transzkripciója, így elősegítvén a genom integritásának megőrzését.

5.1. 5.5.1. DNS-metiláció a genomi mintázatban



Az emlőssejtek, diploidok tartalmaznak egy génszettet az apától és egyet az anyától. Néhány esetben a gén expressziója attól függ, hogy az az anyától vagy az apától származik (5.29.ábra). A jelenséget genomi lenyomatnak nevezik.

5.29. ábra - A genomi lenyomat hatása a génexpresszióra

Jó példa a lenyomat génre az inzulinszerű növekedési faktor 2 génje: Igf2. Az Igf2 szükséges a prenatális fejlődéshez, azok az egerek, amelyek nem expresszálják az Igf2-t, a normál egér fele súlyával, méretével születnek meg. Kizárólag az apai Igf2 kerül transzkripcióra. Ez azt eredményezi, hogy ha az apai Igf2 mutálódik, az egerek satnyák lesznek, ugyanakkor azon egerek, amelyek hibás anyai eredetű Igf2-vel rendelkeznek, normális méretűek. Az ivarsejtek kialakulása során, a lenyomatolásnak kitett gének annak függvényében metilálódnak, hogy azok a spermiumban vagy a petesejtben vannak-e jelen. Így tehát a szülői gén eredete nyomon követhető a későbbiekben az embrióban. A DNS-metiláció ilyeténképpen felhasználható az egyébként teljesen megegyező két génkópia azonosítására. Tekintve, hogy a lenyomatgéneket nem érinti a megtermékenyítést követő demetilációs hullám, ez a jelzés képessé teszi a szomatikus sejteket arra, hogy emlékezzenek mindkét gén szülői eredetére és ennek megfelelően szabályozódjanak. Az esetek többségében a metilációs lenyomat a gén csendességét okozza. Néhány esetben azonban a metiláció a gén expressziójának aktiválását jelenti (okozza). Így például az Igf2 esetében az inzulátorszakasz metilációja az apai eredetű kromoszómán blokkolja azt működésében és lehetővé teszi, hogy egy távoli enhancer elindítsa az Igf2 transzkripcióját. Az anyai eredetű kromoszómán az inzulátor nem metilálódik és így az Igf2 nem íródik át (5.30. ábra).

5.30. ábra - Az Igf2-gén metilációs lenyomata



A lenyomat jelensége az epigenetikus változat egy példája, ami a fenotípus örökölhető változata, ami nem a DNS nukleotid szekvenciájában megírt, kódolt változat eredménye. Hogy miért létezik, teljességgel rejtély. Gerincesekben ez a méhlepényes emlősök sajátja és az összes lenyomat gén a fötális fejlődésben játszik szerepet. A DNS-nek tehát nemcsak a szekvenciája örökíthető.

5.2. 5.5.2. CG-szigetekA DNS-reparáló enzimek miatt a metilált citozin-részletek az evolúció folyamán szépen lassan kivesznek a genomból. A nem metilált citozin esetleges dezaminálása uracilt eredményez, ami normálisan nem fordul elő a DNS-ben és így a DNS-reparáló uracil DNS-glikoziláz felismeri és kivágja, majd citozinnal pótolja. Igen ám, de a metilált citozin esetleges dezaminációja timint eredményez, ami így ugyebár nem felismerhető, nem megkülönböztethető az egyébként nem mutáns normális timintől. Habár erre is létezik egy javító mechanizmus, hogy eltávolítsa ezen timineket, mégis sok ilyen dezaminált mutáció nem kerül felismerésre, így ezek a metilált citozin-részletek szépen lassan timinné alakulnak az evolúció alatt. Az evolúció alatt négy CG-párosból több mint három elveszett ilyetén módon, a gerincesekben tátongó CG-űrt hagyva maga után. A megmaradt CG-nukleotidpárosok meglehetősen egyenlőtlenül oszlanak el a genomban. A genom 1000, 2000 bp-os részleteiben 10-20-szor gyakrabban találhatók, mint átlagosan. Ezeket a részeket CG-szigeteknek nevezik. Ezen részletek egy-két fontos kivételtől eltekintve nem metilált CG-részleteket tartalmaznak minden sejttípusban. Gyakran helyezkednek el a house-keeping gének promóterei körül. A house-keeping gének, azok a gének, amelyek kiemelt fontossággal bírnak (átírásuk elengedhetetlen) a sejt életképességét tekintve, ezért majd minden sejt expresszálja őket (pl. rRNS-ek, citoszkeletális fehérjék, glikolízis enzimeinek génjei stb). Továbbá néhány szövetspecifikus gén (amelyek csak az adott sejttípusban expresszálódnak, de azokban szinte állandó módon) környékén is fellelhetők.

A CG-szigetek eloszlását megérthetjük, hogyha figyelembe vesszük, hogy a CG metilációval a DNS inaktiválása a cél. Gerincesekben a metil-citozin – timin mutáció csak akkor örökíthető tovább, ha az még az ivari vonalon bekövetkezik. A legtöbb gerinces ivarsejtben található gén metilált, tehát inaktív. A hosszú evolúciós idő alatt ezek a metilált CG-részletek spontán dezaminálódtak és elvesztek. Azonban az aktív állapotban tartott gének (és így nyilvánvalóan a fontos életfontosságú housekeeping gének) aktívak maradnak és így nem is metilálódnak. Tehát ha mutáció történik, ez javítódik is egyből. Így a modern időkre ezek mint CG-szigetek megőrződtek. Továbbá bármely olyan CG-mutáció, amely egy gén funkcióját vagy regulációját elrontja, kiszelektálódik, így néhány CG-sziget egyszerűen csak a normálisnál nagyobb sűrűségű kritikus CG-szekvencia szám eredménye. Az emlősgenom nagyjából 20 000 CG-szigetet tartalmaz. Ezek a szigetek nagyrészt a transzkripciós egység 5’ végét, tehát egyben a gén végét is jelölik. Ily módon a CG-szigetek az



emlősgenomban felhasználhatók a DNS-szekvencián belül a gének azonosítására.


6. fejezet - SejtkommunikációAz eukarióta sejtekkel megjelent a bonyolult több kompartimentumos felépítés is, ezzel együtt pedig, az ezek közti, majd később a többsejtű élőlényekkel a sejtek közötti kommunikáció igénye. Egyes vélemények szerint ezzel indokolható, hogy mintegy 2,5 milliárd évvel a prokarióták után jelentek csak meg az első többsejtű élőlények.

Szomszédos vagy távoli sejtek között megvalósuló kommunikáció igen jelentős mértékben különböző szignálmolekulákon múlik, a kommunikáció egyéb igen fontos elemei a sejt saját fehérjéi, melyek a szignálokra reagálnak.

Amint az extracelluláris szignál eléri a sejtet, a kommunikáció (a jelátvitel) a következő szinteken folyik (6.1. ábra):

• sejtfelszíni receptorfehérjék: kötik az extracelluláris szignálokat, ligandjaikat és elindítják a sejtbeli folyamatokat;

• intracelluláris szignálfehérjék: a szignál szortírozása a sejtben (pl.: kinázok, foszfatázok, GTP-kötő fehérjék);

• célfehérjék: aktiválás, sejt viselkedésének megváltozása;

• génregulációs fehérjék, ioncsatornák, metabolikus utak egységei, citoszkeleton részletei.

6.1. ábra - A celluláris jelátvitel szintjei


Sejtkommunikáció

1. 6.1. Az extracelluláris szignálmolekulákAz állati sejtek szignálmolekulák százai segítségével kommunikál. Milyen anyagok tölthetnek be ilyen feladatot? Az extracelluláris szignálmolekulák meglehetősen heterogén csoportot alkotnak. Ismertek köztük: fehérjék, peptidek, aminosavak, nukleotidok, szteroidok, retinoidok, zsírsavak, oldott gázok (pl.: NO, CO).

Ezek jelentős része a szignált kibocsátó sejtből exocitózissal az extracelluláris térbe ürül. Azonban erre más lehetőségek is rendelkezésre állnak, mint például: diffúzió a sejtmembránon keresztül; a szignálmolekula a szignált kibocsátó sejthez kapcsolódva a felszínén marad kötve, de az extracelluláris térben található, arra néz. A szignál az őt kibocsátó sejtből tehát exocitózissal, diffúzióval és sejtfelszíni kötődés révén kerülhet ki, mutathatja be a célsejtnek.

A szignál természetétől függetlenül a célsejt egy fehérjemolekula, a receptor segítségével képes a jeleket fogni és a további feldolgozást, eseményeket elindítani. A receptor rendkívül specifikusan köti ligandját (a szignálmolekulát). Az extracelluláris szignálmolekulák általában rendkívül alacsony koncentrációban (≤ 10 -8 M) vannak jelen, viszont az őket felismerő receptor rendkívül nagy affinitással köti őket (Kα ≥ 108 l/mol).

A jeleket fogó receptorokat elhelyezkedésüknek (illetve az általuk megkötött szignálnak) megfelelően két nagy csoportra osztjuk.

Sejtfelszíni receptorok : az esetek nagy részében ezen transzmembrán fehérjék kötik a szignálmolekulát és egy intracelluláris szignálkaszkádot indítanak el, ami megváltoztatja a sejt viselkedését (6.2. ábra).

6.2. ábra - Sejtfelszíni receptorok

Magreceptorok : intracelluláris receptorok – a szignálnak a sejtbe kell jutnia, hogy aktiválhassa őket. Ez esetben a kisméretű, hidrofób szignál átjut a membránon (6.3. ábra).

6.3. ábra - Intracelluláris magreceptorok


Sejtkommunikáció

1.1. 6.1.1. A szignálmolekulák hatótávolságaAz egyes szignálmolekulák kommunikációs távolsága igen eltérő lehet.

1. Egyes szignálmolekulák a szignált kibocsátó sejthez tapadva maradnak, így csak a velük kapcsolatba lépő sejtekre hatnak (6.4. A ábra). Ilyen kapcsolatfüggő szignalizáció valósul meg a fejlődés és az immunválasz során. Ez egy meglehetősen ritka kommunikációs forma. A legtöbb esetben a szignálok szekretálódnak.

2. Parakrin

A szekretált molekulák ebben az esetben, mint lokális mediátorok csak a közvetlen környezetben található sejtekre fejtik ki hatásukat (6.4. B ábra). Az, hogy a parakrin szignál csak a megfelelő célsejthez jusson el azt igényli, hogy ne diffundáljon messze. A gyakorlatban ez úgy valósulhat meg, hogy a szomszédos sejtek gyorsan felveszik, vagy az extracelluláris mátrix lehorgonyozza őket.

3. Idegsejtek, szinapszis

Egy nagyméretű többsejtes élőlénynek a rövidtávú kommunikáció nem elegendő sejtjei irányításához. A periféria irányítására az idegsejtek a legmegfelelőbbek (hosszú axonnyúlványok). Ha aktiválódnak (külső szignál, vagy másik idegsejt által) egy elektromos impulzus fut rajtuk végig, majd ha eléri a végéüket, akkor kémiai szignálokat, neurotranszmittereket bocsátanak ki. Ezek az anyagok egy specifikus sejtkapcsolatba, a kémiai szinapszisba kerülnek, mely biztosítja, hogy azok csak a posztszinaptikus célsejtet érjék (6.4.C ábra).

4. A másik nagy kiterjedésű irányítási lehetőség az endokrin szabályozás. A szervezetet, mint egy egészet szabályozza. Az endokrinsejtek szignálmolekuláikat, a hormonokat a véráramba juttatják, amely az egész testbe eljuttatja azokat (6.4.D ábra). Az endokrin szállító közeg a vér, a folyamat tehát diffúziólimitált (viszonylag lassú). A szignálhormon felhígul a vérben, interstíciumban. Alacsony koncentrációban is hatnia kell (<10-8 M)

6.4. ábra - A szignálmolekulák hatótávolsága


Sejtkommunikáció

Ezzel szemben az idegi (szinaptikus) jeltovábbítás, az idegsejtek elektromos impulzusa, gyorsabb, precízebb. Gyors (> 100 m/s) elektromos impulzusterjedés. A szinapszisokra jellemző 100 nm távolságot msec-os nagyságrend alatt teszi meg. A neurotranszmitter alig hígul, magas lokális koncentráció jellemzi (pl.: az acetilkolin koncentráció 5x10-4 Ma neuromuszkuláris résben). Ennek következtében viszonylag alacsony a neurotranszmitter receptor affinitása. Így a neurotranszmitter viszonylag könnyen (gyorsan) disszociálhat a receptorról, gyorsan megszüntetve a kiváltott választ. Az idegsejtből történt kibocsátását követően nem sokkal eltávolítható (enzimes degradáció) a szinapszisból. Visszatranszportálódik az idegsejtbe vagy a szomszédos glia sejtekbe. Mind időben, mind térben precízebb, mint az endokrin szabályozás.

A kiváltott válasz reakcióideje attól is függ, hogy mi az a válasz (6.5. ábra):

1. már meglévő fehérjében bekövetkező változás, ez igen gyors, s, msec-os nagyságrendű;

2. génexpresszió szinten bekövetkező válasz, ez lassabb, több órás nagyságrendű.

6.5. ábra - Az extracelluláris jelre adott válasz természete, reakcióideje


Sejtkommunikáció

2. 6.2. Autokrin szabályozásAz eddig tárgyalt esetekben egy sejt más sejteket befolyásolt, más volt a szignált kibocsátó és a célsejt. Sejtek, amelyek ugyanazon típusú sejteknek küldenek szignálokat, képesek saját maguknak is. Ezt a jelenséget autokrin szignalizációnak nevezzük. A sejt szignálmolekulákat szekretál, amelyek saját receptorához képesek bekötődni. Erre jó példa, ha a fejlődés során egy adott sejt elkötelezte magát egy bizonyos differenciálódás útján, akkor az elkezdhet autokrin szignálokat szekretálni saját maga számára, az adott fejlődési irányt megerősítendő. A folyamat azonos sejttípusú szomszédos sejtek által még hatékonyabb, alkalmas arra, hogy azonos sejttípusú sejtek azonos fejlődési döntést hozzanak. Így az autokrin szignalizáció feltehetően egy lehetséges mechanizmus a molekuláris „csordaszellem” vagy „közösségi hatás” megvalósítására, amelyet a fejlődés korai szakaszában tapasztalnak, amely során az azonos sejttípusú sejtek csoportja képes a differenciálódást kiváltó szignálra reagálni, az egyedül lévő, izolált viszont nem.

3. 6.3. Gap junctionSpecializált sejt-sejt kapcsolatok a szomszédos sejtek között. Tulajdonképpen a szomszédos sejtek citoplazmái között létesült vízzel kitöltött csatornák. A csatornák megteremtik a lehetőséget, hogy kisméretű hírvivő molekulák (intracelluláris mediátorok), mint a Ca2+ és a ciklikus AMP (cAMP), kicserélődjenek a két sejt között, azonban a nagyobb méretű makromolekulák, mint a fehérjék, nukleinsavak számára határt képezzenek. Így a sejtek a réskapcsolatok révén direkt módon kommunikálhatnak egymással, anélkül, hogy a köztük levő plazmamembrán megakadályozná őket ebben. Néhány véglegesen differenciálódott sejt kivételével, mint a vázizom sejtek és a vérsejtek, minden állati sejt kommunikál szomszédos sejtjeivel, ilyen réskapcsolaton keresztül.

A következőkben tekintsük át a receptorok különböző fajtáit egy-egy jellemző példa bemutatásával.

4. 6.4. Plazmamembrán-receptorok


Sejtkommunikáció

Integráns membránfehérjék (általában glikoproteinek), egy vagy több transzmembrán szakasszal, monomer vagy polimer szerkezettel. A plazmamembrán receptorokat a receptor-fehérje szerkezete, illetve a jelátviteli mechanizmus alapján három különböző csoportra osztjuk. A következőkben ezen három csoportot tárgyaljuk meg kicsit részletesebben.

4.1. 6.4.1. Receptor-ioncsatornákA receptort alkotó fehérje alegységek több transzmembrán szakasszal rendelkeznek, a membránban egy pórus, vagy csatorna köré rendeződnek. A ligand megkötésekor térszerkezetük megváltozik és átjárhatóvá válnak. Ekkor a csatornákon keresztül kationok, vagy anionok jutnak át, az extracelluláris jelek hatását ezek fogják közvetíteni az intracelluláris szereplők felé. Általában neurotranszmitterek receptorai, neurotranszmitterek hatásait közvetítik. Ideg és ideg, ideg és célszerv (sejtjei) közötti kommunikáció valósul meg a segítségükkel.

A receptor aktiválásának következményei attól függnek, hogy milyen ion számára nyit kaput. Depolarizációt, azaz stimulációt, vagy ellenkezőleg: gátló hatást eredményezhetnek.

Például, ha

Na+ csatornát nyit → depolarizáció, stimuláció,

Cl- csatornát nyit → depolarizáció gátlása lesz az eredmény.

Mindkét folyamat rendkívül gyors, msec nagyságrendű, ellentétben például a G-fehérje kapcsolt receptorokkal, ahol a reakcióidő néhány másodperces.

A receptor-ioncsatornák elsőként megtisztított és legjobban tanulmányozott példánya az acetilkolin-nikotin receptora. Ezért ennek működésén keresztül mutatjuk be a receptorcsaládot.

Két altípusa ismeretes: az izom, amely egy pentamer (α2-,β-,γ-,δ-alegységekkel), illetve a neuronális altípus, amely kétféle alegységből áll (α és β). Tekintsük át az izom-altípus működését (6.6. ábra). Az alegységek egy alapesetben nem átjárható csatorna köré rendeződnek (6.6. A ábra). Mindegyik alegység négy transzmembránrégióval rendelkezik (6.6. B ábra). 2 db acetilkolin-kötőhely található receptoronként, egy az α- és γ- és egy az α- és δ-alegységek között (6.6. C ábra). Az agonisták és az antagonisták is ide kötődnek.

Az acetilkolin bekötése megváltoztatja a kötőhely szerkezetét, ami az alegységek elmozdulását okozza. A csatorna citoplazmatikus oldalán található „kapu” kinyílik. Az így megnyílt átjáró egy 0,65 nm átmérőjű, kationokra permeábilis csatorna (6.6. ábra). A nikotinreceptor nem szelektív kationcsatorna, a méretük alapján jutnak át a különböző kationok az elektrokémiai gradiens irányába: Na+> K+> Ca2+.

A neuronális csatorna Ca2+-ionokra áteresztőbb, permeabilitása nagyobb.

6.6. ábra - Az acetilkolin-nikotin receptorának izom-altípusa, az alegységek (a), az alegységek transzmembránrégiói(b), illetve az acetilkolin-kötőhelyek felülnézetből(c)


Sejtkommunikáció

4.2. 6.4.2. Hét transzmembrán szegmenssel rendelkező, G-fehérje-kapcsolt receptorokSzámos hormon, neurotranszmitter ilyen receptorokon keresztül befolyásolja a sejt működését, ezeken kívül ide tartoznak a látás és szaglás folyamatában részt vevő receptorok is.

Adódhat a kérdés, hogy mely fehérjéket nevezzük G-fehérjéknek. A fehérjék egy jelentős része GTP kötésére képes. A GTP-kötő fehérjék között találunk transzlációs faktorokat, ras-fehérjéket, kis moltömegű GTP-kötő fehérjéket és heterotrimer GTP-kötő fehérjéket. Ez utóbbi csoportot szoktuk nemes egyszerűséggel G-fehérjéknek nevezni.

Közös jellemzőjük, hogy GTP-t kötnek, ami aktiválja a G-fehérjét, beindítja a jel közvetítését, majd végül a GTP GDP-vé történő hidrolízise leállítja a működést. Tulajdonképpen egyszerű kapcsolóként is felfoghatjuk őket, amelyben a GDP GTP-re történő cseréjével bekapcsoljuk, a GTP GDP-re történő hidrolízisével kikapcsoljuk a jelátviteli útvonalat (6.7. ábra). Külön érdekes, hogy maga a G-fehérje hidrolizálja a GTP-t, GTPáz aktivitással rendelkezik.

6.7. ábra - A G-fehérje mint jelátviteli kapcsoló


Sejtkommunikáció

A G-fehérjék szerkezeti felépítése

A G-fehérjék 3 alegységből állnak: α-alegység (39-51 kDa), β-alegység (35-36 kDa) és a γ-alegységből (7-10 kDa). A β és γ-alegységek szorosan kapcsolódnak egymáshoz, míg az α-alegység disszociábilis. Ez utóbbi köti a GDP-t vagy GTP-t (6.8. ábra).

6.8. ábra - A G-fehérjék szerkezeti felépítése

Működési ciklusuk


Sejtkommunikáció

Az extracelluláris agonista kötődik a hét transzmembrán szegmenssel rendelkező receptorához, amelyhez intracellulárisan G-fehérje asszociál. A receptor-ligand kapcsolat kialakulásakor megváltozik a komplex térszerkezete, amely ily módon kiterjed az intracelluláris régióra is. Ennek következtében a G-fehérje α-alegységéhez kötődött GDP disszociálódik és GTP-re cserélődik. A már GTP-t kötő α-alegység disszociál a βγ-alegységről és kölcsönhatásba lép az effektorával (ez például lehet az adenilát-cikláz, a foszfolipáz C, sőt különböző ioncsatornák is). Az effektor működését módosítja, melynek hatására a különböző intracelluláris mediátorok (pl cAMP, Ca2+) szintje megváltozik (6.9. ábra). Az α-alegység enzimaktivitása révén a GTP-t GDT-vé hidrolizálja, aminek hatására az α-alegység disszociál az effektorról és ismét a βγ-alegységhez kötődik, kialakul az inaktív GDP-αβγ komplex. Természetesen egy következő ciklus során újfent aktiválódhat és az egész folyamat kezdődhet az elejéről.

6.9. ábra - A G-fehérjék működés közben

Csoportosításuk

A G-fehérjék csoportba osztása az α-alegység szekvencia hasonlósága alapján történik. Jelenleg 20 különböző α-alegységet ismerünk, amelyek legalább 9 gén és alternatív splicing eredményei. Ezeket 4 nagyobb családba soroljuk:

1. Gs-család: A legjobban ismert, számos hormon és neurotranszmitter, illetve a szaglás receptorához kapcsolódik. Stimulálja (a család nevét is innen kapta) az adenilát ciklázt, működése megnöveli a cAMP-szintet.

2. Gq-család: Szerkezete eltér a Gs-családétól, csaknem minden szövettípusban megtalálható. A foszfolipáz C enzimet aktíválja.

3. Gi-család: Közös tulajdonságuk, hogy pertussis-toxin érzékenyek. Egyik alcsoportjuk az adenilát cikláz gátlását (a név eredete: inhibeáló) okozza. Másik alcsoportjuk ioncsatornákkal létesít kapcsolatot: Go. Ebbe a csoportba tartoznak a látás folyamatában részt vevő G t-fehérjék, amelyek a retinapálcikákban találhatók. Szintén fontos az a Gi-fehérje, amely a szívizomsejtekben közvetlenül aktiválja a K+-csatornákat és hiperpolarizációt hoz létre.

4. G12-család: Szinte minden szövetben előfordulnak a család tagjai, funkciójuk azonban többnyire még ismeretlen.

Az α-alegységek több doménből épülnek fel. Az egyes doménokhoz különböző funkció társítható:

• specifikus receptor felismerése

• guanin nukleotidkötés

• GTP hidrolízis

• βγ-alegységek kötése

• effektor kapcsolat.


Sejtkommunikáció

βγ-alegységek

Szerepük kevésbé tisztázott, mint az α-alegységé. Az α-alegységet a membránhoz rögzítik, egyes esetekben közvetlenül az effektorral is kapcsolatba lépnek.

Patobiokémiai vonatkozások

Egyes bakteriális toxinok az α-alegységet adott helyen ADP-ribozilálhatják. A folyamat során a NAD-ról ADP-ribóz egység kerül a toxin hatására az α-alegységre, miközben a nikotinsav rész felszabadul. A toxin hatása attól függ, hogy az α-alegység mely doménjére kerül az ADP-ribóz részlet, mely domén funkciója esik ki ezáltal.

A Vibrio cholerae toxinja a Gsα-alegységét ADP ribozilálja a GTPáz-funkcióért felelős doménen. Így a módosítás hatására kiesik a GTPáz-aktivitás, aminek következtében a G-fehérje nem tud kikapcsolni. A folyton aktív G-fehérje pedig megállás nélkül aktív állapotban tartja effektorát, az adenilát-ciklázt. A kontrollálatlan adenilát-cikláz aktivitás következtében pedig jelentős mértékben megnő a cAMP-szintje és vele együtt minden olyan folyamat kontroll nélkül felerősödik, amelyet a cAMP-szint regulál. Tekintve, hogy a cholera-toxin a gyomor, bélcsatorna sejtjeivel kerül kapcsolatba, az adenilát-cikláz állandó aktivitása is ezeket a sejteket érinti és alakít ki súlyos elektrolit- és folyadékfelszívódási zavarokat.

A Bordatella pertussis toxinja a pertussis-toxin a Gi-α-alegységeket C-terminálisukhoz közel, a receptor felismerésért, kötésért felelős részen ADP-ribozilálja. Így ADP-riboziláció esetén a G-fehérje és a receptor nem asszociálnak. A toxin jelenlétében így kiesnek az ezen fehérjék által közvetítette folyamatok.

G-fehérjék és jelerősítés

A G-fehérjék effektorai tehát igen gyakran enzimek, amelyek intracelluláris mediátorok képződését katalizálják. Ez rendkívül jó lehetőséget ad a jel felerősítésére, hisz az effektor enzim aktiválása több katalitikus ciklusban is fokozza az intracelluláris mediátorok képződését. Ezen kívül fontos szem előtt tartanunk azt is, hogy egy receptor többféle G-fehérjével is kölcsönhatásba léphet, amely szintén hozzájárulhat a jel felerősítéséhez.

4.3. 6.4.3. Protein-kinázok, foszfoprotein-foszfatázokAz extracelluláris jelre cellulárisan igen gyakran adott válasz a reverzibilis fehérjefoszforiláció. Milyen stimulus válthat ki reverzibilis fehérjefoszforilációt?

1. kiválthatja valamilyen másodlagos hírvivőmolekula, mint például a már említett cAMP;

2. elképzelhető, hogy a receptor-ligand komplex közvetlenül (másodlagos hírvivőmolekula képződése nélkül) fehérjefoszforilációval aktiválja a jelpályáját. Ez utóbbi esetre jó példa az egyes növekedési faktor receptorok és a hozzájuk kapcsolódó jelpályák.

Az eltérő extracelluláris jelek által aktivált jelpálya rendszerek között szoros kölcsönhatás (crosstalk, párbeszéd) van, mely igen gyakran foszforilációs lépéseken keresztül valósul meg.

A fehérjék foszforilációját végző kinázok és a defoszforilációt végző foszfoprotein- foszfatázok részletesebb ismertetését korábban a 3.2. fejezetben már megtettük, jelen esetben ennek ismétlésétől eltekintünk. A következőkben szeretnénk néhány, jelátviteli, szabályozási szempontból fontos kinázt és a közreműködésükkel létrejövő jelpályát bemutatni.

4.3.1. 6.4.3.1. cAMP-dependens protein-kináz (protein-kináz-A)

A legrégebben és a legalaposabban ismert, tanulmányozott fehérje-kináz. Szerkezetét tekintve inaktív formában tetramer. Két egyforma regulációs és két egyforma katalitikus részből, alegységből áll (6.10. ábra). A regulációs rész a katalitikus alegységgel asszociált formában gátolja annak működését.

6.10. ábra - A cAMP-dependens protein-kináz felépítése


Sejtkommunikáció

A regulációs alegységen, alegységenként két-két cAMP-kötőhely található (regulációs alegység dimerenként 2*2). A cAMP-szint növekedésével bekötnek a regulációs alegység cAMP-kötőhelyére, melynek térszerkezete ennek hatására megváltozik (allosztérikus reguláció) és a regulációs alegység dimer szabadon engedi a katalitikus alegység monomereket, melyek így aktív állapotba kerülnek (6.11. ábra). Természetesen a cAMP-szint csökkenésével azok ledisszociálnak a regulátor-alegységről, majd begyűjtenek két katalitikus alegységet, így inaktív állapotba hozva őket (6.11. ábra).

6.11. ábra - A cAMP-dependens protein-kináz regulációja

Kétféle regulátor-alegység izotípust írtak le ezidáig: R’ és R”. Az R” targettáló szereppel is rendelkezik, ugyanis képes az inaktív tetramert szubsztrátjának közelében lehorgonyozni, így annak foszforilációja meggyorsítható a kináz aktiválódásakor.


Sejtkommunikáció

4.3.2. 6.4.3.2. A cGMP-dependens protein-kináz (protein-kináz-G)

Szerkezete nagymértékben hasonló a cAMP-dependens protein-kinázéhoz. Ez a fehérje azonban két azonos polipeptid láncból áll, a regulátor és a katalitikus rész nem alkot külön fehérjét, egyazon polipeptid lánc két doménjeként helyezkednek el. Ebben az esetben a cGMP-regulátor doménhez történő kötése nem okozza az alegység disszociációját, hanem a szerkezet megváltozásához vezet, aminek a hatására a katalitikus rész felszabadul a gátlás alól.

4.3.3. 6.4.3.3. Protein kináz-C

Tulajdonképpen ebben az esetben nem egy adott enzimről van szó, hanem egy egymásra nagymértékben hasonlító enzimcsaládról, amelynek jelenleg 12 tagja ismert. A család klasszikus tagjai Ca 2+/foszfolipid-dependens protein kinázok (α, β’, β” és γ protein kináz). A család többi atípusos tagja Ca2+-independens. Az izoenzimek szöveti expressziója igen eltérő. Egyetlen több doménből álló fehérjeláncból állnak. Az N-terminálison helyezkedik el a regulációs domén, a C-terminálison pedig a katalitikus domén (6.12. ábra). A regulátor doménhez kötődő allosztérikus ligandok együttes hatására szabadul fel a katalitikus domén a gátlás alól. Az aktiváláshoz Ca2+-ra és foszfatidilszerinre van szükség. Fontos megjegyeznünk, hogy az enzim Ca2+

iránti affinitását nagymértékben növeli a diacil-glicerol. Mind a protein kináz A, mind a protein kináz C széles szubsztrát specificitású protein kinázok. Specificitásdeterminánsukban bázikus aminosavak jelenléte szerepel a foszforilálandó szerin/treonin-csoportok közelében.

6.12. ábra - A protein kináz C felépítése és aktiválódása

4.4. 6.4.4. Transzmembrán protein kinázok: növekedési faktor-receptorTulajdonképpen a protein kinázokkal megszakítottuk az eddig (remélhetően) logikus fejezet felépítést. Hisz megtárgyaltuk a plazmamambrán receptorok két nagy családját, a plazmamembrán ioncsatornákat és a 7 transzmembrán szegmenssel rendelkező G-fehérje asszociált receptorokat. Ezen pontok után következett volna a harmadik nagy csoport tárgyalása, amely nem más, mint a transzmembrán protein kinázoké. A tárgyalás menetének megszakítása indokolt volt és remélhetően logikus is. Gondoljunk csak bele a korábban tárgyalt


Sejtkommunikáció

ioncsatorna-receptorok jelentős része például a Ca2+-ionok (mint másodlagos hírvivő) szintjének emelkedésén keresztül, vagy a hét transzmembrán szegmenssel rendelkező receptorok a cAMP (mint másodlagos hírvivő) szintjének változtatásán keresztül fejtik ki a hatásukat. Ez a hatás pedig mindkét esetben protein kinázok aktivitásának befolyásolása (Protein kináz C a Ca2+ esetében és cAMP-függő protein kináz a cAMP esetében). Ezért logikusnak tartottuk a receptorokat követő folyamatokat rögtön a receptorok tárgyalása után ismertetni. Ez a tárgyalási mód egyben megteremtette a lehetőséget, hogy ily módon eljussunk a receptorok harmadik nagy csoportjához a transzmembrán protein-tirozin-kinázokhoz.

Esetükben egyetlen transzmembrán domén található. A fehérje extracelluláris részén, az N-terminálison helyezkedik el az extracelluláris jel (pl.: növekedési hormon) megkötéséért felelős receptor domén (6.13. ábra). Az intracelluláris részen, a fehérje C-terminálisán pedig a kináz domén található (6.13. ábra). Szintén ezen a részen találhatóak azok a tirozin oldalláncok, amelyeket az enzimfehérje saját magán foszforilálni képes (autofoszforiláció). Az extracellulárisan kötődő növekedési faktor hatására intracellulárisan foszforilálódó tirozin oldalláncok indítják el a jelpálya működését.

6.13. ábra - Transzmembrán tirozin-kináz (receptor)

Léteznek nem receptor protein-tirozin-kinázok is. Ezen fehérjék nem a plazmamembrán integráns alkotói, a citoplazmában, illetve a sejtmembránhoz kihorgonyozva találhatóak. Az extracelluláris jelre (pl.: növekedési faktor, citokinek) a jelet felfogó receptor intracelluláris részéhez képesek kötni, majd aktiválódva foszforilációs hatásukat kifejtve elindítani (tovább adni) a jelátvitelt.

4.5. 6.4.5. Foszfoprotein-foszfatázokA jel lecsengése a fehérjék defoszforilációja révén történik meg, melyért a foszfoprotein-foszfatázok felelősek. Ahogy korábban említettük, csoportosításuk a kinázokéhoz hasonló, két nagy csoportba a szerin-/treonin- és a tirozin-oldalláncokról hasító foszfatázokról beszélhetünk. Ismert néhány enzim, amely mind szerin-/treonin-, mind tirozin-oldalláncokról képes a foszfátcsoport eltávolítására.

A fehérjék foszforiláltsági állapota mindig (legalább) kétkomponensű folyamat eredménye, az illetékes protein kinázok és a hidrolízist végző foszfoprotein-foszfatázok pillanatnyi aktivitásától függ.

5. 6.5. A cAMP mediátorrendszerA cAMP-mediátorrendszer működése egyértelműen a hét transzmembrán régióval rendelkező receptorok működéséhez köthető (6.14. ábra). Ezek közül is két csoport vesz részt a mediátorrendszer működésében:

1. Azok a receptorok, amelyek heterotrimer Gs-fehérjékkel állnak kapcsolatban. Ezen ligand-receptor


Sejtkommunikáció

komplexek aktiválják az adenilát-ciklázt és az intracelluláris cAMP-szint emelkedését idézik elő.

2. Azon receptorok, amelyek Gi-fehérjékkel állnak kapcsolatban. Ezen ligand-receptor komplexek gátolják az adenilát-ciklázt és az intracelluláris cAMP-szint csökkenését idézik elő.

Az adenilát-cikláz enzim az ATP β és γ helyzetű foszfátját pirofoszfátként hasítja le a cAMP képződésekor (6.14. ábra). A folyamatot a pirofoszfát anorganikus foszfátra történő hidrolízise teszi irreverzibilissé. Az intracelluláris cAMP szint a cAMP-t előállító, adenilát-cikláz és a cAMP-t hasító ciklikus nukleotid-foszfodiészteráz aktivitásának függvénye. Az adenilát-cikláz átmeneti aktiválódását követően az aktiváló extracelluláris jel csökkenésekor a nyugalmi cAMP-szintet a ciklikus nukleotid-foszfodiészterázok állítják vissza.

A ciklikus nukleotid-foszfodiészterázoknak több típusa ismert. Nem minden sejttípusban fordul elő az enzim mindegyik típusa. A legáltalánosabban elterjedt az alacsony Km értékű (Km ~ 10-6 M), illetve a magas Km értékű (Km ~ 10-4) enzimtípus.

A cAMP mediátorrendszer működését más jelpályák is befolyásolják (igen gyakran a ciklikus nukleotid foszfodiészteráz-aktivitások befolyásolásán keresztül).

6.14. ábra - A cAMP-mediátorrendszer működés közben

A cAMP mediátorrendszer tulajdonképpen az eukarióta sejtek legegyszerűbb ismert jelpályája, mivel minden hatásáért a cAMP-dependens protein kináz (protein kináz A) a felelős. A cAMP felszabadítja a protein kináz A katalitikus alegységét a regulációs alegység okozta gátlás alól. Az aktivált katalitikus alegység különböző fehérjéket foszforilál, ezáltal aktíválja vagy inaktiválja azokat (6.11. ábra). Számos szubsztrát fehérjéje ismert, köztük megtalálható metabolikus utak eznimei, de akár ioncsatorna fehérjerészletek is. A mediátorrendszer így képes például a Ca2+ jelpálya működését is befolyásolni.

A különböző extracelluláris jelek, különböző sejtekben ugyanazon jelpályákat használják, az extracelluláris jelre adott válasz mégis sejtspecifikus, mivel különbözőképpen differenciálódott sejtekben a protein kináz A különböző, a sejt differenciáltságának megfelelő fehérjéket képes foszforilálni. Tehát a sejt differencilódási módja szabja meg, hogy milyen fehérjéket képes foszforilálni, ezáltal aktivitását befolyásolni a cAMP-


Sejtkommunikáció

dependens protein kináz.

A cAMP-dependens protein kináz (PKA) a génszintű regulációban

A CRE, vagy cisz regulációs elem, egy rövidke DNS-szakasz (enhancer), amelyhez egy cAMP-dependens protein kináz által foszforilált CREB nevű fehérje képes kötni. A CRE egy rövid palindróm DNS-szekvencia, amely a cAMP által szabályozott gének promóterén helyezkedik el. A CREB-dimer foszforilációja szükséges, hogy a CBP-nek nevezett koaktivátor fehérje a CREB-hez kötődjék. A CBP segítségével alakul ki a komplex fehérjeszerkezet, amely segít az RNS-polimeráz II bekötődésében, az iniciációs komplex kialakulásában. A CBP hisztonacetiláló aktivitással is rendelkezik, ezáltal is tovább segítve a transzkripció megindulását (6.15. ábra).

6.15. ábra - A cAMP-dependens protein kináz (PKA) szerepe a génszintű szabályozásban

6. 6.6. Inozitol-foszfolipid jelátviteli rendszerA receptorok egy jelentős részének aktiválása a sejtekben foszfatidilinozitol-származékok hidrolízisét fokozza. Az intracelluláris mediátorok a foszfatidilinozitolokra specifikus foszfolipáz-C hatására keletkeznek. Az enzim legfontosabb szubsztrátja a plazmamembrán-lipid kettős rétegében elhelyezkedő foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát (PIP2). A foszfolipáz C hatására végbemenő hidrolízis eredménye a diacil-glicerol és az inozitol-1,4,5-trizfoszfát. Ez a két vegyület a jelpálya mediátora. A sejten belül a jelátvitelt két különböző irányba viszik tovább.

A foszfolipáz C kétféle receptor hatására aktiválódhat: 1. Hét transzmembrán szegmenssel rendelkező receptorok aktiválhatják, G-fehérjéken keresztül, illetve 2. tirozin kináz aktivitású receptorok aktiválhatják. A két receptorcsalád eltérő foszfolipáz C izoenzimeket aktivál.

Foszfolipáz C

A foszfolipáz C aktivitásához Ca2+-t igényel. Háromféle izoformája van a β, δ, γ foszfolipáz C, amelyek közül a β és a γ jelátviteli szerepet tölt be, a δ szerepe egyelőre ismeretlen.


Sejtkommunikáció

Izoformái közül a foszfolipáz-β1 a legtöbb szövetben megtalálható, G-fehérjék hatására aktiválódik. A Gq a-alegysége kölcsönhatásba lép az enzimmel és megnöveli annak vmax értékét. A δ és a γ izoforma aktivitását a Gq a nem befolyásolja. Azon hormonok, neurotranszmitterek és más szignálok, amelyek receptora a membránban G q-fehérjéhez kapcsolódik, foszfolipáz C β aktiválást okoznak.

A foszfolipáz C γ-t a tirozin kináz receptorok aktiválják. A receptorral való kölcsönhatás során az enzim foszforilálódik. Az aktiválódással egyidejűleg az enzim a citoplazmából a membránhoz, a szubsztrátjához (a plazmamembrán egyik alkotója: a foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát) közel lokalizálódik.

Ahogy láttuk, az eltérő receptorok eltérő izoenzimeket aktiválnak, a végeredmény azonban mindig ugyanaz: IP3

és diacil glicerol keletkezése foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfátból (6.16. ábra).

6.16. ábra - A foszfolipáz-C aktiválása és működése

Az IP3 hatására megemelkedik a citoszol szabad Ca2+-koncentrációja. Az IP3 vízoldható molekula lévén eljut az intracelluláris Ca2+ raktárakhoz, ahonnan aztán Ca2+-t szabadít fel. Ilyen intracelluláris Ca2+ raktár az endoplazmás retikulum, illetve izomsejtekben a szarkoplazmás retikulum (6.17. ábra). Ezekben a Ca2+

raktárakban, a Ca2+ különböző fehérjékhez kötve található. A módszer előnye, hogy nem csapódik ki a magas (mM-os) koncentráció ellenére sem. A harántcsíkolt, a szív és a simaizmok legfontosabb Ca 2+-kötő fehérjéje a kalszekvesztrin (63 kDa), a legtöbb sejtben megtalálható Ca2+-kötő, -raktározó fehérje pedig kalretikulin (46 kDa).

Ezen fehérjék nagy kapacitással (~ 50 Ca2+ kötőhely/molekula) és kis affinitással (Kd ~ 1 mM) kötik a Ca2+-t. Így valósulhat meg a Ca2+ raktárakból történő felszabadulása. A felszabadulás 2 különböző ioncsatornán keresztül valósulhat meg:

1. Az endoplazmás retikulum membránjában található IP3-receptoron keresztül. A folyamat a következőképpen alakul: az extracelluláris szignál dokkol a plazmamembránban található receptorán (7 transzmembrán szegmenssel rendelkező Gq-fehérjével asszociált, vagy tirozin kináz aktivitással rendelkező receptor), ezt követően megtörténik a foszfolipáz C intracelluláris aktivációja, amely a plazmamembránban található szubsztrátjának hasítása révén IP3 képződését eredményezi. Az IP3 vízoldható molekula lévén eljut az endoplazmás retikulum membránban található receptorához, ahol dokkol. A receptor egyben egy Ca 2+


Sejtkommunikáció

csatorna is. A receptor szerkezetét tekintve 4 alegységből áll, az IP3 dokkolása megváltoztatja a tetramer térszerkezetét. A konformáció változás előidézi a Ca2+ mobilizációját.

2. Rianodin-receptor. Ez a receptor is az endoplazmás retikulum, illetve szív-, harántcsíkolt- és simaizmok esetében a szarkoplazmás retikulum membránjában található. Mind szerkezetét, mind funkcióját tekintve hasonlít az IP3-receptorhoz. Nevét onnan kapta, hogy egy rianodin nevű növényi alkaloida is aktíválja. Harántcsíkolt izomban a szarkoplazmás retikulum rianodin receptorai a depolarizáció hatására aktiválódnak, majd rajtuk keresztül Ca2+ kiáramlás történik, ami aztán előidézi az izomkontrakciót. A szívizomban a feszültségfüggő plazmamembrán depolarizáció következtében a feszültségfüggő Ca2+ csatornákon keresztül az extracelluláris térből a sejtbe lépő Ca2+ váltja ki az intracelluláris Ca2+ raktárból történő Ca2+ mobilizálást.

Az agonisták hatására bekövetkező intracelluláris Ca2+ felszabadulást az IP3 váltja ki az IP3-receptorcsatornát aktiválva (6.17. ábra).

6.17. ábra - Az IP3-jelátviteli útvonal

Az IP3 két különböző úton metabolizálódik, vagy foszfatázok direkt módon inozitollá alakítják, vagy első lépésben egy kináz IP4-gyé alakítja és ezt követően az előző esethez hasonlatosan foszfatázok inozitollá alakítják. Összefoglalásul elmondhatjuk, hogy az IP3 közvetítette folyamatok jelentős része a Ca2+-szint változásán keresztül regulálódik.

A foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát foszfolipáz C által történő hasításának (IP 3 melletti) másik terméke a diacil-glicerol. A diacil-glicerol a sejtmembránban marad és aktiválja a membrán közelében, de a citoplazmában található protein kináz C-t, ami ennek hatására membránhoz kötődik. Az aktiválás átmeneti, mivela diacil-glicerol metabolizmus gyors és a membránban foszfatidsavvá alakul, hogy aztán újra felhasználódhasson foszfatidil-inozitolok szintézisére.

7. 6.7. A guanilát-cikláz és a cGMPA cGMP és szerepe kevésbé ismert, mint a rokon vegyület cAMP. Feltehetően ezen molekula is intracelluláris mediátor szerepét tölti be. A cGMP GTP-ből keletkezik guanilát-cikláz hatására. Két különböző guanilát-cikláz enzim ismert jelenleg.

1. Az úgy nevezett partikuláris enzim a plazmamembránban található és egyúttal receptorként is funkcionál.


Sejtkommunikáció

Jelenleg ismert kevés extracelluláris szignáljainak egyike a pitvari nátriumürítő faktor, mely vazodilatációt, diurézist, nátriurézist és az aldoszteron szintézis gátlását okozza.

2. A másik ismert enzim a szolubilis guanilát-cikláz, a citoplazmában található. Az enzim két, egy 77 és egy 70 kDa-os, alegységből álló heterodimer. Fontos megjegyeznünk, hogy hem prosztetikus csoportot tartalmaz. A NO és minden olyan anyag, amelyből NO keletkezik, a szolubilis guanilát ciklázt aktiválja. A NO a hem csoporttal lép reakcióba és nitrozohem képződik, mely hatására az enzim aktiválódik, ennek hatására pedig megemelkedik a cGMP szintje.

7.1. 6.7.1. Nitrogén-monoxidA teljes kép alkotásához feltétlenül szót kell ejtenünk erről a gáz halmazállapotú szignálmolekuláról. A NO a sejtekben in vivo keletkezik argininből nitrogén-oxid-szintáz (NOS) hatására. Az enzim konstitutív és indukálható formában fordul elő. A NO a keletkezés helyéről diffúzióval jut el a környező sejtekhez. Hatásának erőssége és tartama attól függ, hogy milyen messze diffundál. Féléletideje általában 10-30 sec között van, mivel a sejtekben és a keringésben gyorsan átalakul.

Az előzőekben ismertetett jelátviteli útvonalak működését egy példán keresztül érthetjük meg jobban. A példa legyen az érfal simaizom relaxációja NO hatására. Az endotél sejtek érlumen felöli felszínén különböző extracelluláris szignálok, mint például acetilkolin, bradikinin, trombin, vagy adenin-nukleotidok dokkolhatnak receptorukon, amelynek hatására megnő az intracelluláris Ca2+-koncentráció. Ez az emelkedett Ca2+-koncentráció aktiválja a nitrogén-oxid-szintázt, aminek hatására az argininből NO-t állít elő. A keletkezett NO átdiffundál a szomszédos simaizom sejtekbe és ott a szolubilis guanilát-cikláz hem prosztetikus csoportját nitrozo-hemmé alakítja, aminek hatására az aktiválódik és megemelkedik az intracelluláris cGMP szinte. A megemelkedő cGMP aktiválja a cGMP-dependens protein kinázt, amely hatására csökken az intracelluláris Ca 2+-szint és ez utóbbi a simaizom sejtek relaxációját (vazodilatációt) eredményezi. Ezen hatásmechanizmus mentén működik a szívkoszorús erek szűkületében szenvedők által szedett érfal tágító nitroglicerin tabletta is.


7. fejezet - Összetett folyamatok szabályozásaA könyv vége felé járva az író megenged magának egy ugyancsak nagyképű hasonlatot. Ahogy a nagy Jókai megjutalmazza a kitartó olvasót és a kevésbé izgalmas, cselekménydús, de a történet megértése szempontjából nem mellékes, sőt megértéséhez szükséges leíró részeket követően kibontakozik a valódi eseménysodor, úgy a biokémiai szabályozási folyamatokban szerepet játszó részegységek kevésbé izgalmas leírását követően itt az ideje a komplex, rendkívül izgalmas szabályozási útvonalak ismertetésének, a szabályozási eseménysodor főáramába kerülni.

1. 7.1. Éhezés – jól tápláltságArra már korábban is utaltunk, hogy nemcsak a prokarióta élőlények számára fontos a táplálék megszerzése, a kiegyensúlyozott anyagcsere. Vegyük példának saját magunkat (rendkívül praktikus biológiai, biokémiai alanyok vagyunk, hisz mindig saját magunk rendelkezésére állhatunk).

Mi történik, ha felkelést követően elfelejtünk reggelizni, rohanunk az egyetemre és ott csak később az első órát követően jut időnk a Ch büfé nagyszerű választékából valamilyen táplálékot magunkhoz venni?

A kérdés megválaszolásához vissza kell nyúlni alap biokémiai ismereteinkhez. A felkelést követően éhezni fogunk, megvonjuk szervezetünktől az alapvető szén- és energiaforrást, a glükózt. Ekkor tehát a feladat a következő: a glükózt felhasználó folyamatok (legfőképp a glikolízis) lassítása (gátlása), a glükózt felépítő, eredményező folyamatok gyorsítása (ezek közül elsősorban a glukoneogenezist és a glikogén mobilizációját érdemes megemlíteni). Első körben tehát a glikolízis és a glukoneogenezis, majd a glikogén felépítés és lebontás szabályozásával érdemes foglalkoznunk a probléma megértéséhez.

1.1. 7.1.1. A glikolízis – glukoneogenezis szabályozásaAhogy ezt az előbbiek során megállapítottuk, a glükózt lebontó glikolízis és a glükózt felépítő glukoneogenezis egymással szorosan összefüggő folyamatok. Tekintve, hogy a két reakcióút egymás inverze, a szoros kapcsolat megjelenik a közös intermedierek és az inverz reakciókat katalizáló enzimek révén. Ha belegondolunk, hogy egy glukózmolekula glikolízis során történő lebontása mindössze 2 ATP molekulát eredményez és egy glukóz molekula glukoneogenezis során történő felépítése 6 ATP molekulát igényel, beláthatjuk, hogy a szervezetünk, (máj)sejtjeink rendkívül logikusan működnek, amennyiben elkerülik a párhuzamos glukóz-lebontó és - felépítő folyamatok működtetését. Így nem meglepő, hogy az egyik folyamat gátlása egyszersmind a másik folyamat stimulációját eredményezi. Ha csökken a glikolízis sebessége, akkor megnő a glukoneogenezisé és vica versa. Mindkét folyamat szabályozása az irreverzibilis lépéseket katalizáló enzimek aktivitásának befolyásolásán keresztül történik. A glikolízis során szabályozott enzimek: a hexokináz, a foszfofruktokináz I és a piruvát-kináz. A glukoneogenezisben pedig a piruvát-karboxiláz és a fruktóz-1,6-biszfoszfatáz. A folyamatok szabályozása során három tényező kap fontos szerepet. Ezek közül csak egy lesz az általunk kiválasztott éhezés – jól tápláltság, de a teljes kép érdekében a másik kettővel is foglalkozunk.

1. Milyen az adott sejt energiaállapota? Mit is jelent ez pontosan? Tulajdonképpen ez esetben a sejt ATP-, AMP- és citrát-szintje bír fontos szabályozó szereppel. Logikus, hogy amennyiben a sejt energetikailag jól töltött, tehát az ATP-szint magas, akkor ne bontson le több cukormolekulát újabb ATP molekula nyerése érdekében. Az ATP, így nem meglepő módon allosztérikus gátlószere a glikolízis legfontosabb szabályozópontját jelentő foszfofruktokináz I enzimnek (7.1. ábra). Tekintve, hogy a sejtben az ATP szint jelentősen meghaladja az AMP-ét (ATP>>ADP>>AMP) viszonylag kis relatív ATP szint csökkenés viszonylag nagy relatív AMP szint emelkedést eredményez. Az AMP viszont allosztérikus aktivátora a foszfrofruktokináz I enzimnek, ezáltal az AMP szint emelkedése stimulálja a glikolízist, ezzel egyidejűleg gátolja a glukoneogenezist, mivel az AMP allosztérikus inhibitora az inverz reakciót katalizáló fruktóz-1,6-biszfoszfatáznak (7.1. ábra). Az AMP szint emelkedése (ATP szint csökkenése) így biztosítja a reakciók glikolízis irányába történő eltolását.

A citrát szintén allosztérikusan gátolja a foszfofruktokináz I enzimet (7.1. ábra). Ezáltal a zsírsavak, vagy ketontestek oxidációja során keletkező citrát glukózt képes „megmenteni” az igen erős glükóz függésben élő agysejtek számára. Ugyanakkor a zsírsavak oxidációja során keletkező acetil-KoA allosztérikus aktivátora a


Összetett folyamatok szabályozása

glukoneogenezis első lépését katalizáló piruvát-karboxiláznak, így serkenti a glukoneogenezist. A piruvát-kináz egyidejű gátlása révén viszont visszaszorítja a glikolízist (7.1. ábra).

7.1. ábra - A foszfofruktokináz allosztérikus regulátorai

2. Az intracelluláris pH igen fontos szabályozó szereppel bír, ugyanis a H+-koncentráció emelkedése a foszfofruktokináz I gátlását okozza. Az anaerob glikolízis így a fokozott laktát (H+) felszaporodás révén csökkenti a glikolízis sebességét.

3. Elértünk igazi célunkig, a glikolízis, glukoneogenezis hormonális szabályozásáig. A szabályozás a biokémiai szabályozások egyik legszebb példája, ugyanis elemei között szinte minden eddig ismertetésre került részlet megtalálható és mesteri módon áll össze egy egésszé. A glikolízis és a glukoneogenezis hormonális szabályozásában a glukagon és az inzulin játszik szerepet. Elérkezett az idő, hogy visszatérjünk főhősünkhöz, a reggelijét nélkülöző egyetemistához. Tekintsük végig, hogy mi történik a szervezetében! A vércukorszint csökkenés hatására a hasnyálmirigy α-sejtjeiben glukagon választódik el és kerül a vérkeringésbe. Az extracelluláris szignálmolekula tehát ez esetben a glukagon lesz, amely hét transzmembrán szegmenssel rendelkező receptorai megtalálhatók a májsejtek plazmamembránjában. Az éhezés (vércukorszint csökkenés) hatására elválasztásra került glukagon dokkol receptorain, amelyekhez intracellulárisan G-fehérjék asszociálnak. A ligandkötés hatására a Gsα-alegység ledisszociál a βγ alegységekről és effektorát, az adenilát ciklázt stimulálja. A stimuláció révén megnövekszik az intracelluláris mediátor, a cAMP szintje. A megemelkedett cAMP szint hatására a cAMP-dependens protein kináz allosztérikusan aktiválódik és foszforilálni fogja a májsejtekben kifejezésre került szubsztrátjait.



Az első – egyetemistánk szempontjából – említésre érdemes szubsztrátja a foszfofruktokináz II enzim lesz. A foszfofruktokináz II egy érdekes kettős funkciójú enzim, amely mind kinázként, mind foszfatázként képes működni. Az, hogy kinázként, vagy foszfatázként működik, egyedül foszforiláltsági állapotán múlik (7.2. ábra). Amennyiben az enzim foszforilált állapotban van, foszfatázként működik és szubsztrátjából a fruktóz-2,6-biszfoszfátból fruktóz-6-foszfátot állít elő (7.2. ábra). Amennyiben defoszforilált állapotban van, kinázként működik és szubsztrátjából a fruktóz-6-foszfátból fruktóz-2,6-biszfoszfátot állít elő (7.2. ábra). A foszfátcsoport okozta térszerkezet váltás tehát egyféle kapcsolóként működik a foszfatáz és a kinázaktivitás között.

7.2. ábra - A glikolízis/glukogeogenezis hormonális szabályozása: a foszforuktokináz II foszforilációval/defoszforilációval történő szabályozása, a cAMP szint hatása a glikolízis, glukoneogenezis szabályozására

Lássuk csak, miként kapcsolódik mindez egyetemistánkhoz. Az előzőekben ismertetett mechanizmus révén éhezésben megnő az intracelluláris cAMP szint, ami aktiválja a cAMP-dependens protein kinázt, amely foszforilálni fogja a foszfofruktokináz II enzimet, amely ennek hatására foszfatázként fog működni és a fruktóz-2,6-biszfoszfátot fruktóz-6-foszfáttá és szervetlen foszfáttá hasítja (7.2. ábra). Tehát jelentősen lecsökken a sejt fruktóz-2,6-biszfoszfát szintje, ami viszont a glikolízis legfontosabb szabályozópontjának, a foszfofruktokináz I enzimnek legfontosabb allosztérikus aktivátora (és az inverz lépést katalizáló fruktóz-1,6-biszfoszfatáz allosztérikus inhibitora) (7.2. ábra). A folyamat eredményeként tehát lényegesen lelassul a glikolízis sebessége és meggyorsul a glukoneogenezisé. A folyamatot kiegészíti, hogy a cAMP dependens protein kináz a glikolízis utolsó lépését katalizáló enzimet, a piruvát-kinázt is foszforilálja, ami ennek hatására inaktíválódik.

Mindezen folyamatok hatására főhősünk májsejtjeiben lelassul a glikolízis és megindul a glükóz de novo szintézise, a glukoneogenezis révén.

1.2. 7.1.2. A glikogén felépítés – lebontás szabályozásaA glikolízis fékezése és a glukoneogenezis beindítása, stimulálása csak egy módja a vércukorszint állandó szinten tartásának. Elsősorban a máj- és izomsejtek képesek a glükózt polimerként, glikogén formájában raktározni. A glikogénben történő raktározás nagy előnye, hogy igény esetén rendkívül gyorsan glükózként mobilizálható a benne tárolt glükóz. Hátránya, hogy meglehetősen nagy a helyigénye, jóval nagyobb, mint amikor a glükózból zsírsavak képződnek és a tárolás lipid formájában történik, viszont ez utóbbi esetben a mobilizálás során képződő termékek nem glukoplasztikus anyagok, általuk a vércukorszint nem tartható állandó



szinten.

Lássuk csak, hogy egyetemistánk szervezetében miként épül fel a glikogén, miként bomlik le és hogyan szabályozódik e két folyamat. Jól táplált állapotban, amikor bővében vagyunk a glükóznak, a sejtbe lépő glükóz glükóz-6-foszfáttá alakul, amelyet a foszfoglukomutáz enzim glükóz-1-foszfáttá alakít. A keletkezett glükóz-1-foszfát UTP-vel (uridil-trifoszfát) aktíválódik az UDP-glükóz-pirofoszforiláz enzim által katalizált reakcióban. Az UDP-glükóz képződése mellett pirofoszfát szabadul fel, amely szervetlen foszfátra hasad, így a reakció során két nagyenergiájú kötés használódik fel, erősen exergonikussá téve azt. A következő lépésben a glikogén-szintáz által katalizált reakcióban az UDP-glukózról a glikogén láncvégi glukózához kapcsolódik az újabb glükóz molekula, eggyel megnövelve a glikogénláncot alkotó glükóz molekulák számát. A glikogén-szintáz egy legalább négy glükózból álló láncot képes csak tovább hosszabbítani. Az első glükóz molekula egy glikogenin nevű fehérjetirozin oldalláncához kapcsolódik. A glikogén több ezer kDa molekulatömegű hatalmas polimer számos elágazással. Az elágazásoknak igen fontos szerepe van, mert általuk egyszerre több glükózszálon tud elindulni a polimer lebontása, a glükóz molekulák visszanyerése, szükség esetén jelentősen meggyorsítva a cukorhoz jutás sebességét. A glikogén-szintáz mellett így igen fontos szerepe van a szintézis során az elágazásokat kialakító glikozil-4-6-transzferáz enzimnek. Amennyiben egy legalább 11 glükóz egységből álló lánc elkészült, az enzim egy nagyjából 7 glükóz egységből álló láncrészt áthelyez és α 1-6 kötésekkel a glükóz lánchoz kapcsolja.

Az ellentétes folyamatot, a glikogén lebontását, a glikogén-foszforiláz katalizálja. A reakció szervetlen foszfátot igényel, ugyanis a lehasadó glükóz molekula foszforilálódik és glükóz-1-foszfátként szabadul fel. Az elágazásokat külön enzim az oligo-6-4-glukán-transzferáz enzim bontja. A képződött glukóz-1-foszfátból glukóz-6-foszfát lesz, amely vagy a glikolízisben alakul tovább (izomsejtek esetében), vagy a glükóz-6-foszfatáz által katalizált reakcióban glükózzá alakul (májsejtek esetében) és a keringésbe kerülve segít állandó szinten tartani a vércukorszintet.

Ennyi felvezetés után megint csak forduljunk kedvenc éhező egyetemistánk irányába és nézzük meg, mi történik szervezetében a glikogénnel. A glikogénszintézis és-lebontás központi enzimei a glikogén-szintáz és a glikogén-foszforiláz. Mindkét enzim aktivitása foszforiláció/defoszforiláció révén szabályozott. Míg a glikogén-szintáz foszforilált formában inaktív (defoszforilált formában aktív), addig a glikogén-foszforiláz foszforilált formában aktív (és defoszforilált formában inaktív). Tehát a foszforiláció (igen ötletes és logikus módon) ellentétesen befolyásolja a glikogén felépítésért és lebontásért felelős kulcsenzimeket, biztosítva, hogy egyszerre glikogén felépítés és lebontás ne folyjon a szervezetünkben (igen hasonlóan a glükóz lebontó és felépítő folyamatokhoz).

Az izom és máj glikogén funkciója eltérő, ennek megfelelően felépítésének és lebontásának szabályozása is eltérő. Ahogy korábban említettük, az izomglikogén az izomsejt energiaraktára, amely fokozott izomműködés esetén a megnövekedett energiaszükségletet hivatott fedezni. Az 1930-as évek második felében Carl és Gerty Cori felfedezték, hogy a vázizom sejtekben található glikogén-foszforiláz két egymásba átalakuló formában létezik, a katalitikusan aktív glikogén-foszforiláz a és a kevésbé aktív glikogén-foszforiláz b formában. Earl Sutherland ezt követő kísérletei kimutatták, hogy a nyugalomban levő izomban a foszforiláz b dominál, azonban erőteljes izomműködés során az epinefrin nevű hormon kiváltja a foszforiláz b specifikus szerin oldalláncának foszforilációját, mely hatására az átalakul az aktív foszforiláz a formába. A foszforiláz b foszforilálásáért (aktiválásáért) felelős enzim, a foszforiláz b kináz maga is foszforiláció révén aktiválódik. A foszforiláz b kinázt aktiváló enzim pedig nem lesz más, mint a már annyit emlegetett cAMP-dependens protein kináz. A cAMP-dependens protein kináz – ahogy korábban azt már megtanultuk – pedig az emelkedő cAMP szint hatására aktíválódik. A cAMP szint emelkedését izomsejtekben az epinefrin, májsejtekben pedig a glukagon hét transzmembrán szegmenssel rendelkező receptorához való kötődése váltja ki, amely aztán egy G sα fehérjén keresztül aktiválja az adenilát-ciklázt (7.3. ábra).

Az izom- és májglikogén-foszforilázok izoenzimek, melyek különböző gének termékei és egymástól eltérő módon regulálódnak. Az izomglikogén-foszforiláz kovalens módosításon (foszforiláción) alapuló szabályozásán kívül még két allosztérikus szabályozási mechanizmus is befolyásolja aktivitását. A Ca 2+, amely az izomkontrakció kiváltója, képes a foszforiláz b kinázhoz kötődni és aktiválni azt, ezáltal az foszforilálja és az inaktív foszforiláz b formából az aktív foszforiláz a formába alakítja (7.3. ábra). A Ca 2+ a foszforiláz b kináz δ alegységéhez kapcsolódik, amely nem más, mint a kalmodulin. A heves izommunka során az ATP lebontásból nagy mennyiségben képződő AMP képes a foszforilázhoz kötődni, allosztérikus regulátor kötőhelyén keresztül és igen gyorsan (allosztérikus reguláció) átalakítani azt a jóval aktívabb formájába (7.3. ábra). Megfelelő ATP szint esetén az ATP képes bekötődni a foszforiláz fehérjére, megakadályozva az AMP kötődését.

Amikor az izomsejt visszatér nyugalmi helyzetébe, a foszforiláz a foszfatáz, vagy más néven a foszfoprotein-foszfatáz 1 eltávolítja a foszfatáz a foszfátcsoportját visszaalakítva a kevésbé aktív foszforiláz b-vé.



7.3. ábra - A glikogénlebontás (felépítés) szabályozása izom- és májsejtekben

Az izom izoformához hasonlatosan a májglikogén-foszforiláz is kettős hormonális és allosztérikus szabályozás alatt áll. A defoszforilált forma az inaktív ez esetben is. Éhező egyetemista főhősünk esetében tapasztalható hasonló alacsony vércukorszint esetén a glukagon (az epinefrinhez hasonlatosan) megemeli a cAMP szintet és az előbb ismertetett foszforilációs kaszkádon keresztül aktiválja a glikogén-foszforilázt (7.3. ábra). Amikor a (a Ch büfé áldásos szolgáltatását kihasználva egyetemistánk) vércukorértéke újra normalizálódik, a cukor bejut a májsejtekbe és ott a foszforiláz az allosztérikus inhibíciós helyéhez kapcsolódik, aminek hatására az térszerkezetet vált és a szerin oldalláncon foszforilált foszforiláz a a foszfatáz szubsztrátja lesz, amely eredményeként az eltávolítja a foszfátcsoportot és ezáltal inaktiválja azt. A glikogén-foszforiláz allosztérikus glükóz kötőhelye révén egyféle glükóz szenzormolekulaként működik, a vércukorszintnek megfelelően szabályozza aktivitását.

A glikogén-szintáz regulációja ezzel pont ellentétes. Az aktív enzim a defoszforilált állapotú glikogén-szintáz a. A cAMP és kalmodulin-dependens protein kinázok hatására foszforilálódik és a kevésbé aktív glikogén-szintáz b-vé alakul. Aktív állapotba (a glikogén-foszforilázt is defoszforiláló, ezáltal inaktíváló) foszfoprotein-foszfatáz 1 által katalizált defoszforáláció által kerül. A foszfoprotein-foszfatáz aktvitását a glikogén-foszforiláz a gátolja. A foszforiláz a foszforiláz b-vé történő átalakulással a gátló hatás is kiesik, így a glukózszint növekedésével nem csak a glikogénlebontás csökken, de megnő a szintézis jelentősége is. A glikogén-szintáz b defoszforilációját a vércukorszint emelkedéssel megemelkedő inzulinszint serkenti. Ez a szabályozás tehát biztosítja, hogy egyszerre ne történjen teles intenzitású glikogénszintézis és lebontás.



Most már mindannyian belegondolhatunk, hogy mi is történik éhező, majd jóllakott, fizikai aktivitást végző, majd pihenő egyetemista főhősünk izom- és májsejtjeiben.

2. 7.2. Programozott sejthalál: ApoptózisTalán első alkalommal a fejezet címére pillantva mindenkit rossz érzés kerít hatalmába, de megígérjük, ez nem lesz tartós. Kezdjük is a jobb kedvre derítést a programozott sejthalál nélkülözhetetlen, élethez szükséges funkcióinak áttekintésével:

1. A többsejtű élőlényekre mint egy jól szervezett közösségre gondolhatunk. Ebben a jól szervezett közösségben a sejtek száma szigorúan szabályozott. Amennyiben egy sejtre már nincs többé szükség, az öngyilkosságot követ el, aktiválva egy intracelluláris halálprogramot. Éppen ezért nevezik ezt a folyamatot programozott sejthalálnak, apoptózisnak, amely egy görög szó és annyit tesz, hogy „lehull”, utalva a falevelek lehullására, amely azért is találó, mert a leveleket tartó száracska sejtjei is apoptózissal halnak el minden ősszel a falevelek lehullásakor. Tehát a celluláris turnover, amely szükséges a folytonos megújuláshoz, az osztódás/sejthalál egyensúlyának megtartásához nélkülözhetetlen folyamat. Erre jó példát szolgáltathat a májsejtek számának szabályozása: amennyiben (különösen, ha induktív hatású) gyógyszert kezdünk el szedni, a májsejtek száma megnő, alkalmazkodva a fokozott biotranszformációs igényhez, azonban ha a gyógyszer szedését befejezzük, a májsejtek számának vissza kell térnie a kiindulás körüli szintre. Ez utóbbi folyamatot programozott sejthalál (apoptózis) révén oldja meg szervezetünk.

2. Igen fontos a nem megfelelően differenciálódott, vagy feleslegben lévő sejtek eltávolításához is. A szervezetében meglepően nagy méretet is ölthet az apotózis révén eltávolításra kerülő sejtek száma. Egy egészséges felnőtt szervezetében sejtek milliárdjai pusztulnak el a csontvelőben és a bélrendszerben minden egyes órában.

3. Nélkülözhetetlen szerepet tölt be az egyedfejlődés során is. Tulajdonképpen a szervezetünk, mint egy „szobrász”, az apoptózist egyféle molekuláris „vésőként” használja. Erre igen jó példa az egérmancs kialakulása, ahol az eredetileg úszóhártya-szerű képződményeket, amelyek összekötik az egérmancs ujjacskáit, apoptózissal „faragja” le a szervezet. Szintén az apoptotikus „véső” áll az ebihal-béka átalakulás, az ebihalra jellemző képletek eltűnésének hátterében. A fejlődő szervezet idegrendszerében az idegsejtek több mint a fele nem sokkal megszületésüket követően elhalálozik.

4. Számos esetben a sejtek funkciójukat csak apoptózisukat követően tudják betölteni. Ilyen funkcióhoz kötött sejtelhalás történik például a szemlencse sejtek esetében a látás folyamatában, vagy a bőr külső felszínét alkotó sejtmag és organellum vesztett sejtek esetében, amelyek a mechanikai védelemért felelősek.

5. Enyhébb sejtkárosító tényezők is kiválthatják. Ez esetben a későbbi, súlyosabb következmények elkerülése végett kerül sor az apotózisra, például vírusfertőzött vagy malignusan transzformált sejtek esetében.

A sejthalál két fő formája, a szép és a csúnya halál: apoptózis vs nekrózis

Az apoptózis szó jelentése, bár utal az elmúlásra, azt könnyedén, kíméletesen teszi, hisz a falevelek lehullása az élet természetes és nem egyértelműen szomorú velejárója. Apoptózis során egy program szerint, különböző stációk során szépen lebontja, majd összecsomagolja magát a halálra elszánt sejt, anélkül, hogy a többi, körülötte levő sejtnek bármiféle baja esnék. Nézzük végig, milyen stációkon megy keresztül apoptózisa során a sejt.

A sejt elkezd zsugorodni, ehhez nagymértékben hozzájárul a citoszkeleton kollapszusa, a citoszkeletális fehérjék lebontása. A felszíne felhólyagosodik (blebbing), a sejtmag kisebbedik, a kromatinállománya kondenzálódik, gyakorlatilag a nukleázok felszeletelik a DNS állományt. A sejtmaghártya redőződik, majd feltöredezik. A nukleáris lamin is hidrolízisre kerül. Nagyon fontos megjegyeznünk, hogy mindezen folyamatok közben a sejtmembrán végig sértetlen és az organellum membránok is épen maradnak. Végül a sejt sejtmembránnal határolt apoptotikus testekre esik szét. ezeket az apoptotikus testeket makrofágok és a szomszédos sejtek veszik fel, kebelezik be (7.4. ábra).

A sejtmembrán végig ép marad, makromolekulák nem jutnak ki az interstíciális térbe, így gyulladásos reakció sem indul be, a környező sejteket semmilyen inzultus sem éri az apoptotizáló sejt részéről. A környező sejtek épen maradnak, az apoptózis tipikusan egy sejtre terjed ki, egy sejtet, különálló sejteket érintő folyamat (ez természetesen nem zárja ki, hogy tömeges legyen, de a sejtek egyenként esnek át rajta).



Az apoptózis tehát egy aktív, energiaigényes (a program végrehajtása, a sejtszervezet „szétszerelése” energiát igényel), gyorsan (néhány óra alatt), csendesen (gyulladásmentesen) lezajló folyamat. Nevezhetjük szép halálnak.

Ezzel szemben a nekrózis a csúnya halál. Ezt már előrevetíti nevének eredete is, hisz a görög nekrosz szóból ered, ami halott, megöl, pusztulás, megölés jelentéssel bír. A nekrózis mindig patológiás folyamat (ellentétben a számos fiziológiás példát felvonultató apoptózissal szemben). Általában erőteljesebb behatások váltják ki az igen erőteljes, tömeges sejtpusztulást. Tipikusan nekrotikus sejthalállal halnak el sejtjeink, ha mondjuk egy jó nagyot rásózunk a kézfejünkre kalapáccsal, vagy ha tömény lúgba mártjuk kezünket, más testrészünket, de nekrotikus sejthalált halnak szív- vagy agysejtjeink is egy esetleges isémia kapcsán.

Az előző példával ellentétben a nekrózist a sejt, a sejtmag, az organellumok duzzadása, a lizoszómák felnyílása és az egész sejt kontrollálatlan szétesése jellemzi. Ennek következtében a sejt tartalma kiáramlik az interstíciális térbe és ott gyulladásos reakciókat vált ki, amely a többi környező sejtet is károsítja (7.4. ábra).

7.4. ábra - A nekrótikus és az apoptotikus sejthalál közötti morfológiai és folyamatbeli különbségek



Már igen korán megfigyelték, hogy a különböző sejttípusok igen sztereotip morfológiai változásokon (melyek hátterében a korábban ismertetett folyamatok állnak) esnek át apoptózisuk során. Mindez arra utalt, hogy konzervatív biokémiai változások és apparátus áll a háttérben.

A morfológiai és sejtbiológiai történésekben főszerepet játszik egy proteáz család, amelyek aktív helyükben cisztein tartalmaznak és szubsztrát fehérjéiket specifikus helyen előforduló aszpartát oldalláncaik mellett hasítják. Elnevezésük is erre a két dologra utal: kaszpázok (cysteinyl aspartate specific protease: caspase). A kaszpázok, előalakként prokaszpáz formában termelődnek és tulajdonképpen minden sejtben megtalálhatóak, magukban hordozva a sejt öngyilkos gépezetét. Aktiválódásuk limitált proteolízissel történik (lásd 3.3 fejezet),



amely folyamat során egy kis és egy nagy alegységre hasadnak, létrehozva a két aktív centrummal rendelkező a2b2 heterotetramert. Tekintve, hogy a kaszpázok több lépcsőben egymás hasítására is képesek, ez a jel kaszkád-szerű erősítésével jár együtt (7.5. ábra). Emlős sejtekben ezidáig 14 különböző kaszpázt írtak le, melyek közül emberben 11 fordul elő (kaszpáz 1-10 és 14).

A kaszpázokat funkciójuk alapján két nagy csoportba sorolhatjuk:

1. Citokin aktivátor gyulladásos kaszpázok. Ebbe a csoportba tartozik a kaszpáz 1, 4, 5, 11.

2. Sejthalál-apoptotikus kaszpázok. Ebbe a csoportba tartozik a kaszpáz 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 12.

A sejthalál-apoptotikuskaszpázokat N-terminális prodoménje és a programozott sejthalál folyamatában betöltött szerepe alapján szintén két alcsoportra oszthatjuk:

1. Effektorkaszpázok: Ezen kaszpázok hasítják a celluláris célmolekulák jelentős részét, rövid N-terminális doménnel rendelkeznek. Ide tartozik a kaszpáz 3, 6, 7.

2. Iniciátorkaszpázok. Ezen kaszpázok aktiválják az effektor kaszpázokat, hosszú N-terminális doménnel rendelkeznek. Ez az úgy nevezett homofil interakciós domén, amely révén adaptorfehérjék hasonló doménjével képes kapcsolatba lépni. Ezen fehérje-fehérje kapcsolatok révén jön létre az apoptoszóma. Az iniciátor kaszpázok ezekben a komplexekben aktiválódnak konformáció változásuk következtében.

Az effektor kaszpázokat, nemcsak az iniciátor kaszpázok, hanem más proteázok is képesek aktiválni, mint például a katepszinek, kalpainok, granzimok. Az aktivált kaszpázok jelenlegi ismereteink szerint ezt követően mintegy 300 ismert magi, citoszolban található fehérjét hasítanak. Az apoptotikus morfológiai változások hátterében ezen proteolítikus események állnak. Így például a kaszpáz aktiválta DNáz (CAD) felelős a DNS fragmentációért. A sejtalak megváltozásának hátterében pedig az aktin, spektrin, citokeratinek, a vimentin, fodrin hasítása áll. A nukleáris laminok hidrolízise pedig a sejtmag zsugorodásához vezet.

Természetesen a kaszpáz aktivitás szigorú kontroll alatt áll, a kaszpázokat különböző fehérjék, mechanizmusok tartják féken. Ilyen apoptózis-inhibitorfehérjék az IAP (inhibitor of apoptozis protein) család tagjai: XIAP, c-IAP1, c-IAP2, survivin, livin és a többiek. A család tagjai kaszpáz 3, 7, 9 gátló hatással bírnak. Minden egyes családtag rendelkezik egy BIR doménnel, amely révén kapcsolódnak a kaszpázokhoz és gátolják azokat. A család néhány tagja rendelkezik egy RING-finger motívummal, egy cink ujj doménnel, amely révén ubikvitin-konjugáló enzimet vonzanak és az ubikvitinálja a kaszpázokat.

A sejthalál folyamatáról önálló könyvek születnek, természetesen jelen fejezetben csak a legfontosabb mozzanatokra, a fő irányvonalakra térhetünk ki. A következőkben szeretnénk felvázolni a programozott sejthalál két főbb útvonalát, az extrinszik, (külsődleges) és az intracelluláris, intrinszik útvonal legfőbb történéseit.

A korábbiaknak megfelelően a prokaszpáz aktiváció folyamatában fontos szerepet kapnak az adaptor fehérjék, amelyek segítenek összegyűjteni és aktív konformációba hozni az iniciátor prokaszpázokat.

A sejten kívüli prokaszpáz aktivációra igen kiváló példa a killer limfociták által iniciált sejthalál. A killer limfociták képesek azáltal sejthalált előidézni, hogy egy Fas ligand nevű fehérjét prezentálnak, amely képes a célsejtek felszínén található halálreceptor fehérjéhez, a Fas-hoz kötődni (7.5. ábra). Az ily módon klaszterekbe tömörült Fas fehérjék intracellulárisan adaptor fehérjéket kötnek, amelyek kötik a prokaszpáz 8 molekulákat. Ezek térszerkezet-változásuk következtében hasítják, aktiválják egymást. Az ily módon aktiválódott kaszpáz 8 molekulák ezt követően hasítják az effektor kaszpázaikat és apoptózist indukálnak (7.5. ábra). Néhány esetben a stresszelt, vagy sérült sejtek mind a Fas ligand, mind a Fas fehérje előállítására képesek, ily módon elindítva az intracelluláris kaszpáz kaszkádot.

7.5. ábra - A halálligandon – halálreceptoron– keresztül bonyolódó külsődleges (extrinszik), illetve a mitokondrium külső membrán sérülésén, a citokrom c felszabadulásán keresztül zajló, belsődleges (intrinszik) apoptotikus útvonalak



A stresszelt és károsodott sejtek esetében legjobban ismert intracelluláris apoptózis útvonal a mitokondriumból kiinduló programozott sejthalál folyamata. A sérült, stresszelt fehérjék mitokondriumának külső membránrepedését követően az elektronátvitelben szerepet játszó fehérje, a citokróm c kikerül a citoplazmába, ahol az Apaf-1 adaptorfehérjéhez köt és aktiválja azt; az ily módon létrejött Apaf-1 klaszterhez köt a prokaszpáz 9. A prokaszpáz aktivációja indítja el a további effektor kaszpáz aktivációt. Az apoptózis legtöbb formája esetén találkozunk ezen mitokondriális prokaszpáz aktivációval, amely nagymértékben hozzájárul a kaszpáz kaszkád elindításához, gyorsításához és felerősítéséhez.

3. 7.3. Sérült fehérjeválasz (UPR) az endoplazmás retikulumbanA transzláció során szintetizált fehérjeláncok jelentős része további reakciók tárgya lesz, hogy elnyerje végső, biológiailag aktív formáját. Ezeket a transzlációt követő, fehérjeláncot érintő reakciókat összefoglalóan poszttranszlációs módosulásoknak nevezzük. Poszttranszlációs módosulásokon mind a prokarióta, mind az eukarióta sejtek fehérjéi keresztülmennek.

Csak felsorolásképp néhány folyamatot ragadjunk ki: egyes fehérjék szerin, treonin és tirozin részletei foszforilálódnak (kofaktorként ATP-t igényelve); több véralvadási faktor aszpartát és glutamát részletei további karboxil-csoportokkal egészülnek ki (kofaktorként K-vitamint igényelve); izomfehérjék és a citokróm c lizin részletei metilálódhatnak (kofaktorként N-adenozil-metionint igényelve). A kollagének fő szerkezetalkotója a hidroxi-prolin, aszkorbinsavat igénylő folyamat során jut hozzá hidroxil csoportjához. A glikoproteinekre is poszttranszlációs módosulásuk során kerül fel szénhidrát oldalláncuk. Több bakteriális és eukarióta fehérje igényel aktivitásához kovalensen kötött prosztetikus csoportot. Ezen csoportok is a fehérjelánc riboszómáról történő távozásakor épülnek be. Példaként említhetjük a kovalensen kötött biotint az acetil-CoA karboxiláz esetében, valamint a hem csoportot a citokróm c esetében.

Az exportra kerülő fehérjékben gyakran alakulnak ki kovalens diszulfid kötések, láncközi és láncok közötti cisztein részletek, között natív konformációjuk kialakulásakor. Az így kialakult diszulfid kötések segítenek a natív fehérjeszerkezet megőrzésében az intracelluláristól oly különböző viszonyok között.

A fehérjék foldingjában résztvevő sejtszervecskékben olyan adaptációs mechanizmusok, programok működnek, amelyek lehetővé teszik a nem megfelelő módon feltekert fehérjék detektálását, illetve a sérült, nem megfelelő térszerkezettel rendelkező fehérjék korrekcióját. Az endoplazmás retikulum lumenében zajlik a sejtfelszíni, illetve a szekrécióra szánt fehérjék poszt-transzlációs módosítása, foldingja. Az endoplazmás retikulum fehérje minőségi kontrollgépezete a folding útvonalakkal szorosan együttműködve, igen szelektíven azon őrködik, hogy



az egész kismértékű elváltozásokat, a folding apparátus enyhe hatásfokzavarait is érzékelje. Az érzékelés eredményeként a naszcens fehérjéket mint tévesen feltekert fehérjéket minősíti, ennek következtében akkumulálja, illetve lebontja. Így nem meglepő, hogy az endoplazmás retikulum olyan fehérjéket is tartalmaz, amelyek elsődleges feladata, hogy a tévesen feltekert, sérült térszerkezetű fehérjéket detektálja és olyan génexpressziós változásokat indítson el, amely komoly hatással van az endoplazmás retikulum foldingkapacitására. Az endoplazmás retikulum stresszre adott válasz jó modellként szolgát egyrészt arra, hogy megértsük, mi módon érzékeli a stresszt az organellum, másrészt arra is, hogy egy adott organellum homeosztázisának felborulása miként hat ki szerteágazó módon a sejt különböző funkcióira, mint a génexpresszió, metabolizmus, jelátvitel és az apoptózis.

Az endoplazmás retikulumban felgyűlt sérült szerkezetű fehérjék egy koordinált adaptációs programot indítanak el a sejtben, ez a sérült fehérjeválasz (az unfolded protein response: UPR). A sérült fehérjeválasz során a sejt csökkenteni igyekszik a stresszt azáltal, hogy a fehérjefolding és degradáció folyamatait erősíti (ezekben a folyamatokban részt vevő fehérjék kifejezését, szintézisét fokozza), valamint igyekszik csökkenteni a fehérjefolding apparátusra nehezedő nyomást oly módon, hogy az általános fehérjeszintézist gátolja.

Lássuk csak, mely folyamatok befolyásolják a fehérjeszintézist! Ezek között akad fiziológiás és patológiás folyamat egyaránt.

Az endoplazmás retikulumban folyó fehérjefolding bármilyen zavara kiváltja a sérült fehérjeválaszt (7.6. ábra). Ezek között számos fiziológiás, normális történés is akad, ilyen például a professzionális szekréciós sejtek, mint az inzulintermelő béta és a plazmasejtek kifejlődése, differenciációja. De kiváltó ok lehet a megváltozó helyzet, mint a glükózhiány, vagy a homociszteinémia és az isémia. Kiválthatja a szekréciós, vagy transzmembrán fehérjék génjében bekövetkező mutáció (amelyek praktikusan az endoplazmás retikulumban érnek). Ide tartoznak például asa-1 antitripszin, az inzulin is. Kiválthatja patogénfertőzés, mint például a hepatitisz C vírus, de kiváltható különböző kísérleti ágensekkel is. Az endoplazmás retikulumban végbemenő N-glikoziláció gátlása, az endoplazmás retikulum Ca2+ raktárainak kiürülése, a reduktív stressz, illetve néhány mutáns, vagy akár vad típusú szekréciós vagy transzmembrán fehérje expressziója is kiválthatja a folding útvonal (túl)telítését és eldugíthatja az endoplazmás retikulum lumenét.

7.6. ábra - Az endoplazmás retikulum stresszt és a következményes sérült fehérjeválaszt kiváltó különböző fiziológiás, patológiás, illetve kísérleti tényezők

Jelenlegi tudásunk szerint három endoplazmás retikulum rezidens fehérje látja el az endoplazmás retikulum stressz szenzor feladatkörét. Ezek az IRE1 (α és β), amely egy kináz és endoribonukleáz, a PERK, amely egy kináz és a bázikus leucin cipzár transzkripciós faktor ATF6 (7.7. ábra).



Mind a PERK, mind az IRE1 (α és β) rendelkezik egy citoplazmatikus szerin/treonin-kináz doménnel. Az endoplazmás retikulum stressz luminális domén vezérelt homodimerizációt, autofoszforilációt és aktiválódást idéz elő (7.7. ábra). A sérült fehérjék endoplazmás retikulumban történő felszaporodása hatására az ATF6 a Golgi komplexbe kerül, ahol az S1P és S2P proteázok hatására elhasad. A proteolízis egy szabad citoplazmatikus domént eredményez, amely tulajdonképpen egy aktív transzkripciós faktor (7.7. ábra). A három fehérjemolekula aktiválódásának eredményeként fokozódik a szekréciós útvonal génjeinek expressziója, így megnő az endoplazmás retikulum rezidens dajkafehérjék, illetve az endoplazmás retikulum asszociált fehérjedegradációban résztvevő fehérjék mennyisége. Ezzel párhuzamosan leszabályozódik a fehérjeszintézis, csökkentve az endoplazmás retikulumra nehezedő folding nyomást.

7.7. ábra - A sérült fehérjeválasz folyamatai

Tekintsük végig, hogy az egyes stressz szenzor molekulák mely történésekért és mi módon felelősek. Az ATF6 által szabályozott gének átírása akkor növekszik meg, amikor az ATF6 citoplazmatikus doménje a sejtmagba kerül (7.7. ábra). Az IRE1 génexpressziót fokozó hatása oly módon érvényesül, hogy az aktív fehérje endoribonukleáz doménje, az X-box binding protein (XBP1) gén, mRNS-ből kihasít egy 26 nukleotid hosszú részletet. Ez a hasítás egy transzlációs frameshiftet eredményez, amelynek hatására létrejön az XBP1 transzkripciós faktor (7.7. ábra). Ez utóbbi transzkripciós faktor a sejtmagba kerülve fokozza a degradációban részt vevő fehérjék kifejeződését. A PERK aktivációja az eIF2 transzlációs iniciációs faktor α-alegységének foszforilációját eredményezi, amely gátolja a funkcióképes 80S riboszóma összeszerelését. A folyamat végeredménye így a fehérjeszintézis általános gátlása lesz.

A nem stresszelt sejtekben mindhárom fehérje a BiP dajkafehérjével asszociáltan található meg. Az IRE1 és az ATF6 kötőhelye már ismert, a PERK BiP kötőhelye még ismeretlen, de az IRE1-hez igen hasonló részlet található ezen molekulában is. A BiP-hez történő asszociáció (normális esetben) bent tartja az ATF6 molekulát az endoplazmás retikulum lumenében, így nem hasadhat és viselkedhet transzkripciós faktorként (magyarul inaktív). Az IRE1 és a PERK pedig a dimerizálódásért felelős doménjével kapcsolódik a BiP-hez, tehát ezen fehérjék is dimerizálódásra képtelenek, azaz aktiválódásra képtelenek lesznek, amennyiben BiP-hez kötődnek. A BiP azon régiója, amellyel az IRE1-hez és a PERK-hez kötődik, pedig nem más, mint amellyel a sérült fehérjék hidrofób régiójához kötődik.

Az UPR aktivációjának folyamata ezek szerint a következőképpen képzelhető el: a sejt normális – nem



stresszelt – állapotában a BiP (az endoplazmás retikulumban legnagyobb mennyiségben előforduló dajkafehérje) az ATF6-hoz, az IRE1-hez és a PERK-hez kötődik. Amennyiben az endoplazmás retikulumban felszaporodnak a sérült, helytelen térszerkezetű fehérjék, akkor ezen fehérjék hidrofób részeihez kötődik és szabadon hagyja a három szenzormolekulát. A szabaddá vált szenzormolekulák közül az ATF6 a Golgi apparátusba kerül, ahol a proteázok által vágódik, aktiválódik. Az IRE1 és a PERK szabaddá válnak és dimerizálódnak, majd autofoszforilálódnak és így ők is aktiválódnak.

Egyelőre megválaszolásra váró kérdés, hogy a három szenzormolekula által vezérelt folyamatok kizárólag egymással párhuzamosan, vagy egymástól függetlenül is végbemennek-e? A kísérletes stressz mindig igen jelentős mennyiségű sérült fehérjét eredményez, így igen nehezen vizsgálható a független aktiválódás kérdésköre.

Sérült fehérjeválasz és apoptózis

A sejt az UPR összehangolt folyamatai révén igyekszik megbirkózni az endoplazmás retikulum stresszel, azonban egy bizonyos szint felett erre képtelen lesz. Ekkor beindul a programozott sejthalál, az endoplazmás retikulum stressz kiváltotta apoptózis folyamata. Az endoplazmás retikulum specifikus kaszpáz 12 képes in vitro a citokróm c-től és az Apaf-1-től függetlenül aktiválni a kaszpáz 9-et. A kaszpáz 12 az IRE1 és az adaptorfehérje TRAF2-vel kialakított kapcsolat révén az endoplazmás retikulum membránjánál található. Az endoplazmás retikulum stressz hatására a TRAF2 disszociál a kaszpáz 12-ről, amely folyamatot a kaszpáz dimerizációja és aktiválódása követ (7.8. ábra). A kaszpáz 12 UPR mediálta apoptózisban betöltött szerepét megerősítette, hogy a kaszpáz 12 dupla hiánymutáns sejtek valamelyest rezisztensek voltak az endoplazmás retikulum stressz kiváltotta apoptózisra. A teljes képhez azonban hozzátartozik, hogy a sejtek nem mutattak teljes mértékű endoplazmás retikulum stressz kiváltotta apoptózis rezisztenciát, amely alapján azt valószínűsíthetjük, hogy, kompenzálva a kaszpáz 12 hiányát, más jelátviteli útvonalak is hozzájárulhatnak az apoptózis kiváltásához.

7.8. ábra - Az endoplazmás retikulum kiváltotta UPR, illetve az UPR elbukását követő endoplazmás retikulum eredetű apoptózis folyamata

Az endoplazmás retikulum, a mitokondrium és a citoplazma Ca2+ koncentrációjának befolyásolása is feltehetően egy apoptózis-kiváltó jel lehet (7.8. ábra). A Ca 2+szint befolyásoló szerepét aláhúzza az a megfigyelés is, mely szerint a kaszpáz 12 aktivációja szintén bekövetkezhet a Ca2+-dependens proteáz kalpain általi hasítása révén is. Az endoplazmás retikulumból történő Ca2+ kiáramlást követően igen gyorsan bekövetkezik a Ca2+ mitokondriális felvétele, melyben különösen a mitokondrium azon részei játszanak szerepet,



amelyek szorosan és stabilan asszociálnak az endoplazmás retikulum membránnal. A Ca 2+ mitokondriális felvétele a mitokondriális membránpotenciál kollapszusához és így a mitokondriális citokróm c felszabadulásához, az intrinszik apoptotikus (erősítő) útvonal beindulásához vezethet.


8. fejezet - UtószóA Biokémia II. – Biokémiai szabályozás című tankönyvet igyekeztünk a legújabb kísérletes bizonyítékok felhasználásával, de érdekes, a mindennapi életből vett példákra alapozva elkészíteni. Célunk az volt, hogy az olvasó felejtse el, hogy egy tankönyvet tart a kezében, és észrevétlenül merüljön el a sejtben, kísérje nyomon az izgalmas biokémiai szabályozási folyamatokat. Reméljük, hogy izgalmas kalandokban volt része és észrevétlenül a tudás birtokába is került. Ha így van elértük célunkat.

A tankönyv a leggondosabb írás és többszöri korrektúrát, lektorálást követően is tartalmazhat hibákat. Ezúton arra szeretném kérni az olvasót, amennyiben hibát észlel, vagy bármilyen javaslata, észrevétele van a tankönyvvel kapcsolatban, tegye azt meg a következő e-mail címen: <[email protected]>.

Köszönettel,

Szarka András

Budapest, 2013. nyár


9. fejezet - ÁbraanyagA tankönyv ábraanyagát két részre oszthatjuk. Az első rész saját készítésű ábrákból áll. A második részbe tartozó ábrák, az interneten fellelhető ábraanyag direkt, vagy azok átalakított változatának felhasználásai. Ez utóbbi csoportba tartozó ábrák listája az eredeti linkkel együtt a következőkben található. A linkeket első ízben 2013. július, augusztus hónapban töltöttük le, majd ellőrzés céljából 2014. január 21-én.

Internetes forrású ábrajegyzék

2.4. ábra. Az enzimek legfontosabb katalitikus stratégiái http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26911/figure/A483/?report=objectonly

2.5. ábra. A lizozim katalitikus mechanizmusa http://www.bio.miami.edu/tom/courses/protected/ECB/CH05/5_28.jpg

3.1. A sejtben folyó biokémiai reakciók összessége http://biochemicalpathwayswallchart.blogspot.hu/2010/10/roche-biochemical-pathways-wall-chart.html

3.2. ábra. Feed-back gátlás. A metabolikus út egy korai szakaszán található enzimet a metabolikus út egy későbbi szakaszának terméke gátolja http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26911/figure/A490/?report=objectonly

3.3. ábra. Többszörösen elágazó (aminosav) metabolikus út szabályozása feed-back gátlással http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26911/figure/A491/?report=objectonly

3.4. ábra. Pozitív allosztérikus reguláció http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26911/figure/A494/?report=objectonly

3.5. ábra. Negatív allosztérikus reguláció http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26911/figure/A495/?report=objectonly

3.6. ábra. Egy- és több alegységes enzimek inhibitor koncentráció – relatív enzimaktivitás összefüggése http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26911/figure/A497/?report=objectonly

3.7. ábra. Két azonos alegységből álló enzim kooperatív-allosztérikus átmenete http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26911/figure/A498/?report=objectonly

3.8. ábra.A mioglobin monomer szerkezete http://www.fizyka.umk.pl/~wiesiek/HEMOHIS.JPG

3.9. ábra.A hemoglobin tetramer szerkezete http://www.fizyka.umk.pl/~wiesiek/HEMOHIS.JPG

3.15. ábra. Fehérje foszforiláció/defoszforiláció http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26911/figure/A504/?report=objectonly

3.17. ábra. Proteinkináz háromdimenziós szerkezete http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26911/figure/A505/?report=objectonly

3.19. ábra. Fehérjék aktivitásának befolyásolása foszforilációval/defoszforilációval http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26911/figure/A504/?report=objectonly

4.1. ábra. Fehérjék transzlációjával párhuzamosan zajló folding http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26829/figure/A1101/?report=objectonly

4.2. ábra. A hsp70-család munka közben http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26829/figure/A1104/?report=objectonly

4.3. ábra. A hsp60 család szerkezeti felépítése és működése http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26829/figure/A1105/?report=objectonly

4.5. ábra. A proteaszóma felépítése http://www.nature.com/nrm/journal/v6/n1/box/nrm1552_BX3.html


Ábraanyag

4.7. ábra. A fehérjék ubikvitinációja http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26829/figure/A1110/?report=objectonly

4.8. ábra. Az ubikvitin-ligáz szabályozása http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26829/figure/A1113/?report=objectonly

4.9. ábra. Degradációs szignálok kialakulása http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26829/figure/A1113/?report=objectonly

5.2. ábra. A sejtdifferenciáció a génexpresszió megváltozása, nem a nukleotidszekvenciáé. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26885/figure/A1210/?report=objectonly

5.4. ábra. A DNS-kötő fehérjék kapcsolódási helye a DNS-molekula külső felszínén http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26806/figure/A1235/?report=objectonly

5.7. ábra. A szimmetrikus DNS-regulációs szekvencia és hozzá kötődő DNS-felismerő fehérje dimer http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26806/figure/A1239/?report=objectonly

5.10. ábra. A leucin-cipzár fehérjerészlet szerkezete és kötődése a DNS-hez http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26806/figure/A1249/?report=objectonly

5.11. ábra. A hélix-loop-hélix fehérjerészlet szerkezete és kapcsolódása a DNS-hez http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26806/figure/A1255/?report=objectonly

5.12. ábra. Hélix-loop-hélix fehérjerészlet aktivitásának szabályozása heterodimerizációval http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26806/figure/A1256/?report=objectonly

5.13. ábra.A gél mobility shift assay (electrophoretic mobility shift assay, EMSA) működési elve http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26806/figure/A1261/?report=objectonly

5.14. ábra. A triptofán operon elemei http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26872/figure/A1271/?report=objectonly

5.15. ábra. A transzkripció lépései http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26887/figure/A988/?report=objectonly

5.16. ábra. A triptofán-represszor fehérje működése http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26872/figure/A1272/?report=objectonly

5.17. ábra. A triptofán-represszor fehérje szerkezetének és DNS-kötő képességének megváltozása a két bekötődő triptofánmolekula hatására http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26872/figure/A1273/?report=objectonly

5.18. ábra. A lac-operon kettős szabályozása a lac-represszor fehérje, illetve a CAP–cAMP-komplex által http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26872/figure/A1278/?report=objectonly

5.20. ábra. Az eukarióta gén szabályozási régiójának elemei http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26872/figure/A1287/?report=objectonly

5.21. ábra. Nukleoszóma-remodellezés http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26872/figure/A1293/?report=objectonly

5.22. ábra. Kovalens hisztonmódosítás http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26872/figure/A1294/?report=objectonly

5.23. ábra. A szabályozó fehérjeelemek összeszerelődése különböző funkciójú regulátorkomplexekké a DNS felületén http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26872/figure/A1301/?report=objectonly

5.24. ábra. Az enhanszoszóma felépítése http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26872/figure/A1302/?report=objectonly

5.25. ábra. Az inzulátorszekvenciák elhelyezkedése és funkciója http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26872/figure/A1316/?report=objectonly


Ábraanyag

5.26. ábra. Az X-kromoszóma inaktiválódása (kondenzálódása) a női embrionális testi sejtekben http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26854/figure/A1348/?report=objectonly

5.27. ábra. Az X-kromoszóma inaktiválódásának mechanizmusa http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26854/figure/A1349/?report=objectonly

5.28. ábra. A DNS-metiláció mechanizmusa, a fenntartó metilázok működése http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26854/figure/A1353/?report=objectonly

5.29. ábra. A genomi lenyomat hatása a génexpresszióra http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26854/figure/A1357/?report=objectonly

5.30. ábra. Az Igf2-gén metilációs lenyomata http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26854/figure/A1358/?report=objectonly

6.1. ábra. A celluláris jelátvitel szintjei http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21059/figure/A2741/?report=objectonly

6.2. ábra. Sejtfelszíni receptorok http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26813/figure/A2746/?report=objectonly

6.3. ábra. Intracelluláris magreceptorok http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26813/figure/A2746/?report=objectonly

6.4. ábra. A szignálmolekulák hatótávolsága http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26813/figure/A2748/?report=objectonly

6.5. ábra. Az extracelluláris jelre adott válasz természete, reakcióideje http://www.ebookfiles.org/molecular-biology-of-the-cell-5th-edition-pdf-free-full-download/

6.7. ábra. A G-fehérje mint jelátviteli kapcsoló http://www.ebookfiles.org/molecular-biology-of-the-cell-5th-edition-pdf-free-full-download/

6.8. ábra. A G-fehérjék szerkezeti felépítése http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26912/figure/A2797/?report=objectonly

6.9. ábra. A G-fehérjék működés közben http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26813/figure/A2767/?report=objectonly

6.14. ábra. A cAMP-mediátorrendszer működés közben http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26912/figure/A2806/?report=objectonly

6.15. ábra. A cAMP-dependens protein kináz (PKA) szerepe a génszintű szabályozásban http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26912/figure/A2806/?report=objectonly

6.16. ábra. A foszfolipáz-C aktiválása és működése http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26912/figure/A2811/?report=objectonly

6.17. ábra. Az IP3-jelátviteli útvonal http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26912/figure/A2812/?report=objectonly

7.4. ábra. A nekrotikus és az apoptotikus sejthalál közötti morfológiai és folyamatbeli különbségek http://www.springerimages.com/Images/RSS/1-10.1007_s10103-009-0723-y-0

7.5. ábra. A halálligandon – halálreceptoron– keresztül bonyolódó külsődleges (extrinszik), illetve a mitokondrium külső membrán sérülésén, a citokrom c felszabadulásán keresztül zajló, belsődleges (intrinszik) apoptotikus útvonalak http://www.nature.com/nrd/journal/v4/n5/fig_tab/nrd1717_F2.html

7.6. ábra. Az endoplazmás retikulum stresszt és a következményes sérült fehérjeválaszt kiváltó különböző fiziológiás, patológiás, illetve kísérleti tényezők http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892403002782


Ábraanyag

7.7. ábra. A sérült fehérjeválasz folyamatai http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892403002782

7.8. ábra. Az endoplazmás retikulum kiváltotta UPR, illetve az UPR elbukását követő endoplazmás retikulum eredetű apoptózis folyamata http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892403002782


10. fejezet - Felhasznált és ajánlott irodalomAndersen MH, Becker JC, Straten PT (2005) Regulators of apoptosis: suitable targets for immune therapy of cancer Nature Reviews Drug Discovery4:399–409.

Ciechanover A (2005) Proteolysis: from the lysosome to ubiquitin and the proteasomeNature Reviews Molecular Cell Biology6: 79–87.

Rutkowski DT, Kaufman RJ. (2004) A trip to the ER: coping with stress. Trends Cell Biol. 14:20–28.

Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, and Lubert Stryer:Biochemistry 5th editionNew York, W. H. Freeman, 2002. ISBN 0716730510

Robert K. Murray, Victor W. Rodwell, David Bender, Kathleen M. Botham, P. Anthony Weil, Peter J.: Kennelly Harper's Illustrated Biochemistry, 28th edition, McGraw-Hill Medical 2009. ISBN 0071625917

David L. Nelson and Michael M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry (5th Edition)

W. H. Freeman; 5th edition, 2008. ISBN 071677108X

Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter: Molecular Biology of the Cell (5th edition), Garland Science, 2008. ISBN 9780815341055

Ádám Veronika (szerk.): Orvosi Biokémia, Medicina Könyvkiadó 2006. ISBN 963242767X

Machovich Raymund, Mandl József (szerk.): Orvosi patobiokémia, Medicina, 2007.


tankonyvtar.hu · web viewegy ilyen modul az sh2-domén, amely foszfotirozint tartalmazó...

Documents